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CN107693788B - 一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途 - Google Patents

一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途 Download PDF

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CN107693788B CN201710718894.1A CN201710718894A CN107693788B CN 107693788 B CN107693788 B CN 107693788B CN 201710718894 A CN201710718894 A CN 201710718894A CN 107693788 B CN107693788 B CN 107693788B
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Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途，其包含：i)HBsAg、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，ii)HBcAg、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，iii)MONTANIDE ISA佐剂。本发明还涉及该组合物用于治疗HBV感染和HBV介导的疾病中的用途，以及治疗HBV感染和HBV介导的疾病的方法。本发明的组合物能介导较强的免疫应答，包括抗HBs抗体、抗HBc抗体，特别是介导Th1细胞免疫应答，产生与病毒清除相关的细胞因子IFN‑γ，促进抗HBs‑IgG2a抗体亚型的分化和成熟，实现体液免疫和细胞免疫的平衡。

Description

一种用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于免疫学领域，涉及预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物以及其在制备的药物中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围的严重公共卫生问题之一。HBV感染是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要原因(Fattovich G.J Hepatol 2008；48:335–352)。临床治疗慢性HBV感染的常用药物主要有核苷类似物和干扰素。核苷类似物无法完全清除肝细胞内的cccDNA，且长期使用易导致耐药突变株的出现以及停药后反弹(Kwon H,LokAS.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2011；8:275–284.)。干扰素不适合用于无症状的HBV携带者，在慢性HBV患者中，使用半年后HBeAg血清学转换发生率仅33％，而且干扰素副作用较大也限制其应用(Tang SX,Yu GL.Lancet 1990；335(8684):302)。
目前广泛应用的乙肝蛋白疫苗通过诱导体液免疫，产生保护性中和抗体，达到预防的目的。大量的研究发现中和抗体仅能够消除胞外病毒颗粒，而清除胞内感染的病毒则主要依赖特异性的细胞免疫反应，辅助性T细胞、CD4+T细胞产生的IFN-γ等Th1型细胞因子，尤其是病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)来清除(ChinR，Lacamini S.Rev Med Viorl.2003:13(4):255-72)。细胞免疫反应的强弱直接决定着乙肝的预后。因此，理想的治疗性乙肝疫苗需要同时诱导特异性的体液免疫和细胞免疫，突破乙肝的免疫耐受。
目前国内大多数乙肝治疗性疫苗的研发思路围绕着HBsAg，通过产生抗HBsAg的抗体(anti-HBs)达到免疫清除的效果，如闻玉梅的HBsAg-免疫球蛋白复合物(Xu D Z，ZhaoK,et al.PLoS ONE,2008,3:e2565)，张宜俊的高剂量乙肝表面抗原疫苗(曾滢，张宜俊等，广东医学，2003年24卷07期，740-706页)等均采用此思路，从其最新的临床数据来看，这两个疫苗的治疗效果不理想。
研究表明，慢性乙肝感染患者的anti-HBs的抗体亚型以IgG4为主，而乙肝感染治愈的患者的anti-HBs的抗体亚型为IgG1IgG4，说明在乙肝感染的清除过程中Th1型抗体亚型IgG1发挥着重要的作用，评价Th1型抗体亚型是否高于或者等于Th2型抗体亚型可能提示乙肝治疗的效果(S.Rath,et al.Clin.exp.Immunol.(1988)72,164-167)。同时，乙肝感染患者的抗HBc抗体(anti-HBc)亚型为IgG1﹥IgG3﹥IgG4，而乙肝感染治愈的患者的抗HBc亚型发生转变，为IgG3>IgG1>IgG4，说明抗HBc特别是抗HBc的抗体亚型的转变可能与乙肝的治疗息息相关(Chien-Fu Huang，et al.Cellular&Molecular Immunology.2006；3(2):97-106.)。
此外，研究表明，MONTANIDE ISA油包水佐剂除了对抗原具有缓释作用外，还能产生炎症反应并促进抗原递呈细胞(APC)的募集(如巨噬细胞、淋巴细胞)，通过表面活性剂与细胞膜的相互作用抗原被胞吞进APC，促进MHC II类分子表达和交叉递呈能诱导强的MHC I类分子的递呈，因此，可同时诱导抗原特异性的CD8+和CD4+细胞免疫应答和B细胞活化，产生抗体(Jerome Aucouturieret al.Expert Rev.Vaccines 1(1)(2002),111–118；ShizuoAkira.Phil.Trans.R.Soc.B(2011)366,2748–2755)。目前，已有应用MONTANIDE ISA类佐剂的肿瘤疫苗CIMAvax上市，并有大量的应用该类佐剂的临床试验正在进行，充分证明了其临床安全性和有效性。
专利US4547367A利用HBc颗粒治疗/预防HBV感染和HBV介导的疾病，HBc颗粒免疫黑猩猩可保护黑猩猩感染HBV。而且HBc颗粒联合HBs颗粒免疫乙肝携带者母亲生产的新生儿，产生高滴度的抗HBs和抗HBc抗体，且在18个月的监测中均未见HBV感染。但是该专利并无明确提出抗HBc抗体亚型转变的证据，且无治疗HBV感染和HBV介导的疾病的直接证据。
专利WO2007/031334A2公开了乙肝治疗性疫苗组分，其包含HBsAg、HBcAg和一种皂苷佐剂，而CpG-ODN可作为共用佐剂使用，但是，该乙肝治疗性疫苗在临床中需要联合核苷类似物进行联合治疗才能突破乙肝的免疫耐受，且e抗原转阴仅25％。
专利CN201310080863.X公开了一种乙肝治疗性疫苗，其包含HBsAg、HBcAg和特定序列的CpG-ODN佐剂，该乙肝疫苗能突破HBV转基因小鼠的免疫耐受，产生强的抗原特异性体液和细胞免疫反应。但是，目前并没有应用CpG-ODN佐剂的疫苗上市，而且从临床安全性考虑也存在可能的风险。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术中已知的用于治疗乙型肝炎感染的药物的缺陷，提供一种药物组合物，该组合物可以在慢性HBV感染患者中产生强烈的免疫应答，促进anti-HBs-IgG2a抗体亚型的分化，使IgG2a和IgG1趋近平衡；诱导抗HBc抗体亚型发生转变和/或突破HBV感染患者的免疫耐受。
本发明的另一目的是提供该组合物用于治疗HBV感染和/或HBV介导疾病的用途，以及治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种药物组合物，其包含：
i)乙肝表面抗原(HBsAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，
ii)乙肝核心抗原(HBcAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，
iii)MONTANIDE ISA佐剂，所述佐剂包含油和表面活性剂，优选MONTANIDEISA51VG或MONTANIDE ISA720。其中，MONTANIDE ISA51VG为包含矿物油(Drakeol 6VR)和表面活性剂二缩甘露醇单油酸脂的混合物；MONTANIDE ISA720为包含角鲨烯、角鲨烷和表面活性剂二缩甘露醇单油酸脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油的混合物。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：
i)乙肝表面抗原(HBsAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，
ii)乙肝核心抗原(HBcAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，
iii)MONTANIDE ISA佐剂，和
iv)可药用载体。
特别地，本发明的药物组合物用作乙肝治疗性疫苗。
在本发明的一些实施方案中，所述HBsAg具有SEQ ID NO:1所示序列。
在本发明的另一些实施方案中，所述HBcAg具有SEQ ID NO:2所示序列。
在本发明的又一些实施方案中，所述MONTANIDE ISA佐剂包含油和表面活性剂，优选MONTANIDE ISA 51VG或MONTANIDE ISA 720。
在本发明的又一些实施方案中，所述药物组合物中，所述组分i)和ii)的质量比为0.5-5:1，所述MONTANIDE ISA 51VG的体积与组分i)和ii)体积之和的比是1:1，优选是水相体积比1:1；所述MONTANIDE ISA 720的体积与组分i)和ii)体积之和的比是7:3，优选是水相体积比7:3。
本发明还涉及一种药盒，其包含根据本发明的药物组合物或含有根据本发明的药物组合物的乙型肝炎疫苗以及其使用说明。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病之药物中的用途，优选地所述HBV感染和/或HBV介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)之药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中使抗HBc抗体发生亚型转变之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于在对象中实现乙肝表面抗原Th1/Th2免疫应答平衡(例如，大致相当地诱导Th1和Th2型免疫应答)之药物中的用途。
在又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含：i)乙肝表面抗原(HBsAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的功能性变体，或者其至少两种的混合物，和iii)MONTANIDE ISA佐剂，其用于在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病、用于在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)、用于在对象中使抗HBc抗体发生亚型转变和/或用于在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中治疗HBV感染和/或HBV介导的疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中产生针对HBV的免疫应答(优选地，诱导Th1和Th2型免疫应答)的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中使抗HBc抗体发生亚型转变的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
在又一个方面，本发明涉及一种在对象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。
本发明的组合物实现了出乎意料的技术效果。与现有的市售乙肝预防疫苗(HBsAg+Al(OH)3)、乙肝增强性疫苗HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA疫苗和HBsAg+HBcAg+CpG疫苗相比，其在小鼠体内试验中可以介导更强的免疫应答，包括抗HBs抗体、抗HBc抗体，特别是介导Th1细胞免疫应答，产生与病毒清除相关的细胞因子IFN-γ，促进抗HBs-IgG2a抗体亚型的分化和成熟，实现体液免疫和细胞免疫的平衡。
现有技术中(参见专利CN101492672A)已公开了组合物HBsAg+CpG，而本发明人出人意料地发现根据本发明的药物组合物(HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA佐剂的组合)可产生显著优于HBsAg+CpG组合物的抗HBs特异性抗体，表现出出人意料的协同作用。
现有技术中(参见专利201310080863.X)已公开了组合物HBsAg+HBcAg+CpG，而本发明人出人意料地发现根据本发明的药物组合物(HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA佐剂的组合)可产生显著优于HBsAg+HBcAg+CpG组合物的抗HBs特异性抗体，和较强的细胞免疫反应。
另外，本发明提供的药物组合物在C57BL/6小鼠上能介导强的抗HBc的免疫应答，并且实现了抗HBc抗体亚型转变，即表现出的抗HBc抗体亚型关系为IgG2a抗体水平高于IgG1，与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。这一鼓舞人心的结果表明根据本发明的组合物可用作乙肝预防和/或治疗性疫苗，从而解决长期以来困扰人们的这一难题。
附图说明
图1为显示本发明组合物与HBsAg+Al(OH)3、HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA和HBsAg+HBcAg+CpG组比在增强小鼠对乙肝表面抗原IgG免疫应答的图。
图2为显示本发明组合物与HBsAg+Al(OH)3、HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA和HBsAg+HBcAg+CpG组比在增强小鼠对乙肝表面抗原Th2免疫应答的图。
图3为显示本发明组合物与HBsAg+Al(OH)3、HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA和HBsAg+HBcAg+CpG组比在增强小鼠对乙肝表面抗原Th1免疫应答的图。
图4为显示本发明组合物与HBsAg+Al(OH)3、HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA和HBsAg+HBcAg+CpG组比在增强小鼠对乙肝表面抗原中和抗体水平的图。
图5为显示本发明组合物产生的抗HBc抗体亚型为IgG2a>IgG1的图。
图6为显示本发明组合物与HBsAg+Al(OH)3、HBsAg+CpG、HBsAg+MONTANIDE ISA和HBsAg+HBcAg+CpG组比在细胞免疫水平具有促进HBsAg的Th1细胞分化的趋势图。
图7为显示本发明组合物与HBsAg+HBcAg+CpG组比在复制型HBV转基因小鼠上产生更高水平保护性抗体水平的图。
图8为显示本发明组合物与HBsAg+HBcAg+CpG组比在复制型HBV转基因小鼠上更能产生HBeAg/HBeAb血清学转换的图。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。
另外应注意，如本说明书中所使用的，术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文中使用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物，并且无具体的最少氨基酸数目限制。因此其同样包括肽、寡肽、二聚体、三聚体、低聚体、颗粒等。再者，术语“多肽”不仅包括在核糖体中翻译后得到的纯氨基酸聚合物，还包括经过翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化、硫代等)获得的多肽。
本发明使用的术语“抗原的片段”是指天然或合成多肽的片段，其保留了所述天然或合成多肽的抗原特性，即能够引发针对所述天然或合成多肽的免疫应答。
本文中使用的术语“乙肝表面抗原(HBsAg、HBs)”旨在涵盖天然HBsAg、HBsAg抗原的片段、HBsAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然HBsAg为含有226个氨基酸的天然HBsAg多肽。更特别地，所述HBsAg为来源于现今已知HBV标准基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBsAg多肽。在某些实施方案中，所述HBsAg具有SEQ ID NO:1所示的序列。
本文中使用的术语“HBsAg抗原的片段”旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然HBsAg中少于226个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然HBsAg的抗原性。
本文中使用的术语“HBsAg功能性变体”旨在表示下述多肽，即该多肽相对于天然HBsAg或HBsAg片段有至多30个、至多25个、至多20个、至多15个、至多10个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、至多1个氨基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然HBsAg的功能(例如抗原性)。
本文中使用的术语“乙肝核心抗原(HBcAg、HBc)”旨在涵盖天然HBcAg、HBcAg抗原的片段、HBcAg功能性变体及其任意组合。特别地，所述天然HBcAg为含有183个氨基酸的天然HBcAg多肽。更特别地，所述天然HBcAg为来源于现今已知HBV标准基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBcAg。在一些实施方案中，所述HBcAg选自HBcAg1-x多肽，其表示天然HBcAg的1-X位氨基酸的片段，特别地，X为149至183。在另一些实施方案中，所述HBcAg选自具有下述序列的多肽：SEQ ID NO:2的1-149位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-150位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-151位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-152位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-153位氨基酸、SEQ IDNO:2的1-154位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-155位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-156位氨基酸、SEQID NO:2的1-157位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-158位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-159位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-160位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-161位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-162位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-163位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-164位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-165位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-166位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-167位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-168位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-169位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-170位氨基酸、SEQ IDNO:2的1-171位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-172位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-173位氨基酸、SEQID NO:2的1-174位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-175位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-176位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-177位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-178位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-179位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-180位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-181位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-182位氨基酸和SEQ ID NO:2的1-183位氨基酸。在某些实施方案中，所述HBcAg具有SEQ ID NO:2所示的序列。
本文中使用的术语“HBcAg抗原的片段”旨在表示下述多肽，即该多肽具有天然HBcAg中少于183个氨基酸的连续或不连续的片段，并且所述多肽保留天然HBcAg的抗原性。
本文中使用的术语“HBcAg功能性变体”旨在表示下述多肽，即该多肽相对于天然HBcAg或HBcAg片段有至多30个、至多25个、至多20个、至多15个、至多10个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、至多1个氨基酸缺失、插入、添加或替换，并且所述多肽保留天然HBcAg的功能(例如抗原性)。
优选地，在本发明中，HBcAg以及HBsAg在根据本发明的组合物中都以颗粒形式存在。
本文使用的术语“药物组合物”、“组合药物”和“药物组合”可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用赋形剂或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA佐剂)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。
本发明使用的术语MONTANIDE ISA佐剂为包含油和表面活性剂的佐剂，优选MONTANIDE ISA 51VG和MONTANIDE ISA 720。其中所述MONTANIDE ISA 51VG为包含高纯度的矿物油(Drakeol 6VR)和表面活性剂二缩甘露醇单油酸脂的混合物；其中所述MONTANIDEISA 720为包含高纯度的角鲨烯、角鲨烷和表面活性剂(二缩甘露醇单油酸脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油)的混合物(Jerome.Aucouturier,et al.Montanide ISA 720and 51:a newgeneration of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines.ExpertRev.Vaccines(2002)1(1),111-118)。MONTANIDE ISA 51VG和MONTANIDE ISA 720均购自法国赛比克公司。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
本文使用的术语“HBV介导的疾病”旨在表示乙肝病毒(HBV)所导致、诱发、加重、提高其发生风险和/或与其有关的疾病，例如乙型肝炎、丁型肝炎、肝硬化、肝腹水、肝癌等。
本文使用的术语“抗HBc抗体亚型转变”旨在表示施用本发明的药物组合物后，对象中抗HBc抗体亚型关系转变为与乙肝治愈患者中的抗体亚型关系一致，即与乙肝感染患者痊愈的抗体亚型关系一致。特别地，在小鼠中，抗HBc抗体亚型由IgG1>IgG2a转变为IgG2a﹥IgG2b﹥IgG1或者IgG2b﹥IgG2a﹥IgG1，例如IgG2a>IgG1，在人中，抗HBc抗体亚型由IgG1﹥IgG3﹥IgG4转变为IgG3>IgG1>IgG4。
本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。
本发明组合物的另一个实施方案，其包含i)HBsAg或该抗原的变体，ii)HBcAg1-183，和iii)MONTANIDE ISA佐剂，包括MONTANIDE ISA 51VG和MONTANIDE ISA 720。
在一些实施方案中，本发明药物组合物中，所述组分i)和ii)的质量比为0.5-5:1，所述MONTANIDE ISA 51VG的体积与组分i)和ii)体积之和的比是1:1，优选是水相体积比1:1；MONTANIDE ISA 720的体积比与组分i)和ii)体积之和的比是7:3，优选是水相体积比7:3。
在另一些实施方案中，本发明组合物还可包含另外的添加剂，如药物载体或添加剂，尤其是当它以药物制剂形式存在时。
优选的药物载体尤其是水，缓冲水溶液，优选等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用药物载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
实施例1.乙肝表面抗原(HBsAg)与乙肝核心抗原(HBcAg)和MONTANIDE ISA51联用增强乙肝表面抗原总IgG的免疫应答。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
为了检测HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物的乙肝表面抗原总IgG免疫应答，本发明人分别将HBsAg、HBcAg与MONTANIDE ISA 51，HBsAg、HBcAg与CpG-ODG，HBsAg与CpG-ODG，HBsAg与MONTANIDE ISA 51，HBsAg与Al(OH)3佐剂混匀，用其免疫小鼠，通过测定血清中HBsAg特异性IgG水平，并进行统计学分析，来评价相对于HBsAg、HBcAg与CpG-ODG，HBsAg与CpG-ODG，HBsAg与MONTANIDE ISA 51，HBsAg与Al(OH)3联用，HBsAg、HBcAg与MONTANIDE ISA 51联用对HBsAg总IgG免疫应答的作用。
本实施例中使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例所使用的HBsAg抗原为本发明人制备，为汉逊酵母表达的天然HBsAg，adw亚型，纯度95％以上，4℃冰箱中保存备用，纯化制备工艺参见Protein Expression and Purification 56(2007)301-310中的报道，具体步骤如下：收集菌体后用高压匀浆机匀浆，4000g，4℃离心30min，去除细胞碎片；通过微孔过滤、14％硫酸铵沉淀和12％PEG10000(w/v)沉淀进行澄清；澄清后的上清调整pH值为7.0，经DEAE离子交换层析和疏水层析，收集蛋白峰；超滤浓缩后经凝胶过滤层析，收集目的蛋白峰；4℃冰箱中保存备用。本实施例使用的HBcAg抗原为本发明人制备，为大肠杆菌表达的天然乙肝核心蛋白，纯化制备工艺参见李计来，徐静等在《中国生物制品学杂志》2011，第24卷第1121-1125页中的报道，具体步骤如下：收集菌体后用10mmol/L磷酸钠缓冲液重悬，超声破碎，离心收集上清，加入饱和硫酸铵，使其终浓度为33％，充分混匀后4℃过夜；次日，离心，沉淀用10mmol/L磷酸钠缓冲液重悬，放入透析袋，在10mmol/L磷酸钠缓冲液中4℃透析24h；透析后的溶液经CHT层析，收集蛋白峰，浓缩，经Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析，收集目的蛋白峰；4℃冰箱中保存备用。本实施例所用的CpG-ODN序列为5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’，参照CN200810004736.0专利所述的固相亚磷酰胺三酯法化学合成制备，由3’端开始，1)脱保护基：先用三氯乙酸脱去连接在CpG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；2)活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体与CpG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；3)连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基；4)氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸；5)封闭：缩合反应后为了防止连在CpG上的未参与反应的5’羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基；经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就连到CpG的核苷酸上；重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基、纯化、定量等合成后处理即可得到符合的CpG-ODN；-20℃冰箱中保存备用。
将HBsAg直接用PBS(Gibco公司)稀释或吸附于1mg/ml的Al(OH)3(购自北京天坛生物制品有限公司)上，最终蛋白浓度为10μg/ml；将HBsAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1混匀后，至最终HBsAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1:2混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫C57BL/6小鼠，总体积为100μl，每组10只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg；HBsAg+CpG组每只小鼠注射1μgHBsAg和2μgCpG；HBsAg+MONTANIDE ISA51组每只小鼠注射1μgHBsAg和等体积MONTANIDE ISA 51佐剂；HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN；HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和等体积MONTANIDE ISA 51佐剂。每三周免疫一次，在三免后十天采血并分离出血清，按照常规方法用2％脱脂奶对该血清以1:30稀释倍数起始，再进行3倍系列稀释，用于检测抗原特异性IgG总抗体。
用HBsAg包被96孔酶标板(购自Nunc公司)，每孔25ng，4℃过夜；洗板2次后用5％脱脂奶37℃封闭1小时；洗板2次后加入上述3倍系列稀释的待检血清，37℃作用1小时；洗板3次后加入1:30000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(购自美国SIGMA公司)，每孔50μl，37℃作用40分钟；洗板3次后用TMB(购自美国Thermo公司)显色，每孔100μl，显色15分钟；2M硫酸终止反应，每孔100μl，用酶标仪测定450nm处吸光值OD450(以OD630校正)，并确定终点滴度。结果显示在图1中。
由图1可见，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组的免疫应答显著增强，特异性抗体滴度可达5.4个对数值，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性抗体滴度为5.1个对数值，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组比HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性抗体滴度(效价)可增加1倍以上；同时HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组与两组分的HBsAg+MONTANIDEISA 51组，HBsAg+CpG-ODN组和HBsAg+Al(OH)3组产生的特异性抗体滴度比较，均具有显著性差异(分别为P<0.05、P<0.001、P<0.001)，特异性抗体滴度(效价)分别增加31倍、25倍和10倍。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物疫苗不仅对于两组分只加CpG-ODN，Al(OH)3和MONTANIDE ISA 51佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原总IgG免疫应答，同样与三组分HBsAg+HBcAg+CpG-ODN疫苗比较也能增强乙肝表面抗原总IgG的免疫应答。
实施例2.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和MONTANIDE ISA 51联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th2免疫应答。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
根据实施例1所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物对小鼠Th2类免疫应答的影响，其中，实施例2的方法与实施例1的方法的不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG1(购自美国SouthernBiotech公司)，稀释倍数为1:20000。结果显示在图2中。
抗原特异性免疫应答分为Th1和Th2两种类型，其中Th2类应答与高水平的抗原特异性IgG1抗体滴度相对应。Al(OH)3是一种极强的Th2类疫苗佐剂，能够抑制Th1类免疫应答，表现为免疫后诱生高水平的特异性IgG1抗体。CpG-ODG是一种强的Th1类疫苗佐剂，能产生较强的Th1类免疫应答。MONTANIDE ISA 51能产生强的Th1和Th2类免疫应答。在本实施例中，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物产生的抗原特异性IgG1抗体滴度可达6.0个对数值，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性IgG1抗体滴度为4.2个对数值，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组比HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性IgG1抗体滴度(效价)可增加63倍，具有显著性差异(P<0.001)；同时HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组与两组分的HBsAg+MONTANIDE ISA 51组，HBsAg+CpG-ODN组，HBsAg+Al(OH)3组产生的特异性IgG1抗体滴度比较，具有极显著性差异(均为P<0.001)，特异性抗体滴度(效价)分别增加79倍、50倍和63倍。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物疫苗不仅对于两组分只加CpG-ODN、Al(OH)3和MONTANIDE ISA 51佐剂乙肝疫苗能显著增强乙肝表面抗原特异性IgG1免疫应答，同样与三组分的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组比较也能显著增强乙肝表面抗原特异性IgG1抗体，说明可明显增强乙肝表面抗原Th2的免疫应答。
实施例3.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和MONTANIDE ISA 51联用在体液免疫水平增强乙肝表面抗原Th1免疫应答。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
根据实施例1所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物对小鼠Th1类免疫应答的影响，其中，实施例3的方法与实施例1的方法的不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG2a(购自美国SouthernBiotech公司)，稀释倍数为1:6000。结果显示在图3中。
实施例2中提到，Al(OH)3是一种极强的Th2类疫苗佐剂，能够抑制Th1类免疫应答，表现为免疫后诱生极低水平的特异性IgG2a抗体。CpG-ODG是一种强的Th1类疫苗佐剂，能够增强Th1类免疫应答，表现为免疫后有升高水平的特异性IgG2a抗体。MONTANIDE ISA 51能产生强的Th1和Th2类免疫应答，表现为免疫后诱生高水平的特异性IgG1和IgG2a抗体。在本实施例中，Al(OH)3作为HBsAg佐剂诱生的特异性IgG2a抗体滴度仅为1.57个对数值，而MONTANIDE ISA 51作为HBsAg佐剂诱生的特异性IgG2a抗体滴度高达3.4个对数值。而用本发明的HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物免疫时，产生的IgG2a抗体滴度高达4.7个对数值，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性IgG1抗体滴度为4.2个对数值，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组比HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的特异性IgG2a抗体滴度(效价)可增加1.6倍；同时HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组与两组分的HBsAg+Al(OH)3组有极显著差异(P<0.001)；与HBsAg+CpG-ODN组和HBsAg+MONTANIDE ISA51组比较，产生的特异性IgG1抗体滴度(效价)分别可增强4倍和20倍。上述结果表明，本发明的HBsAg+HBcAg+MONTANIDEISA 51联用极强地刺激针对乙肝表面抗原的Th1免疫应答。
实施例4.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和MONTANIDE ISA 51联用能增强小鼠对乙肝表面抗原中和抗体水平。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
检测乙型肝炎病毒表面抗体的作用是监测乙肝疫苗的接种是否成功。乙肝疫苗刺激免疫系统产生相当于中和抗体的乙型肝炎病毒表面抗体，其效价与疫苗的保护力直接相关，所述抗体的产生对防止HBV感染具有显著效果。因此，本发明人选用了国际通用的ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)来检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBsAg)的浓度，并进行统计学分析，从而评价HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51的组合相对于HBsAg+MONTANIDE ISA 51，HBsAg+CpG-ODN，HBsAg+Al(OH)3和HBsAg+HBcAg+CpG-ODN联用对增强保护性抗体水平的保护力效果。
本实施例中使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司。本实施例中所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN、Al(OH)3和MONTANIDE ISA 51佐剂如实施例1中所述。
将HBsAg直接用PBS稀释或吸附于1mg/ml的Al(OH)3上，最终蛋白浓度为10μg/ml；将HBsAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1混匀后，至最终HBsAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1:2混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫C57BL/6小鼠，总体积为100μl，每组10只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg；HBsAg+CpG组每只小鼠注射1μgHBsAg和2μgCpG；HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN；HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和等体积MONTANIDE ISA 51佐剂。每三周免疫一次，在三免后十天采血并分离出血清。将每只小鼠的个血血清用PBS溶液稀释(对于250<IU<1000，500倍稀释个血送样；对于IU>1000，5000倍稀释每只小鼠的个血送样)送至东南大学第二附属医院进行检测，用ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(ABBOTT公司ARCHITECT系统检测)，结果显示在图4中。
由图4可见，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组可显著增强保护性抗体水平，特异性保护抗体滴度可达4.4个对数值，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的保护性抗体滴度为4.3个对数值，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组比HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组产生的保护性抗体滴度(效价)可增加1.2倍；同时HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组与两组分的HBsAg+Al(OH)3组，HBsAg+MONTANIDE ISA 51组和HBsAg+CpG-ODN组比较，产生的保护性抗体滴度(效价)分别增加10倍、2.5倍和2.5倍。上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物疫苗能显著增强乙肝表面抗原保护性抗体水平，增强疫苗保护力。
实施例5.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和MONTANIDE ISA 51联用产生的抗HBc抗体亚型IgG2a>IgG1。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
乙肝感染患者治愈人群的抗HBc抗体亚型为IgG3>IgG1>IgG4，其在小鼠中对应的抗体亚型关系为IgG2a﹥IgG2b﹥IgG1或者IgG2b﹥IgG2a﹥IgG1。根据实施例2和实施例3所述的方法，测定本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物对小鼠抗HBc抗体亚型IgG2a和IgG1滴度，考察本组合物是否可促进小鼠抗HBc抗体亚型转变为IgG2a>IgG1，不同之处在于检测时所使用的包被抗原为1μg/ml HBcAg。结果显示在图5中。图5结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物产生的抗HBc抗体亚型IgG2a>IgG1，且具有显著性差异(P<0.01)。说明该组合物可促进小鼠抗HBc抗体亚型转变为乙肝感染治愈患者的抗体亚型。
实施例6.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)与MONTANIDE ISA 51联用在细胞免疫方面显著促进HBsAg的Th1细胞分化。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
为了阐明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组合物联用在细胞免疫方面的作用，本发明人分别将HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA51，HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和MONTANIDE ISA 51，HBsAg和CpG-ODN、HBsAg和Al(OH)3佐剂混匀，免疫小鼠，通过ELISPOT实验检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平，并进行统计学分析，即可评价HBsAg、HBcAg、与MONTANIDE ISA51联用相对于HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和CpG-ODN，HBsAg和MONTANIDE ISA51，HBsAg与Al(OH)3联用的促Th1细胞分化作用。
本实施例中所使用的为C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，购自上海斯莱克公司；所使用HBsAg抗原、HBcAg抗原、MONTANIDE ISA 51、CpG-ODN和Al(OH)3同实施例1中所述。
将HBsAg直接用PBS(Gibco公司)稀释或吸附于1mg/ml的Al(OH)3(购自北京天坛生物制品有限公司)上，最终蛋白浓度为10μg/ml；将HBsAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1混匀后，至最终HBsAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，CpG-ODN用PBS稀释至40μg/ml，1:1:2混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml，CpG-ODN浓度为20μg/ml；将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫C57BL/6小鼠，总体积为100μl，每组5只小鼠。HBsAg+Al(OH)3组每只小鼠注射1μg经Al(OH)3吸附的HBsAg；HBsAg+CpG组每只小鼠注射1μgHBsAg和2μgCpG；HBsAg+MONTANIDE ISA51组每只小鼠注射1μgHBsAg和等体积MONTANIDE ISA 51佐剂；HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和2μg CpG-ODN；HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA 51组每只小鼠注射1μgHBsAg、1μg HBcAg和等体积MONTANIDE ISA 51佐剂。每三周免疫一次，在三免后十天取脾，按常规方法制备脾淋巴细胞，具体如下：无菌操作取脾脏：用无菌镊子及剪刀剪取脾脏，放于70μm尼龙网筛(购自BD公司)中，置于含有5ml预冷处理的2％FBS(购自GIBCO公司)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾脏，脾脏细胞通过筛目进入平皿中，得到细胞悬液，用巴氏吸管将悬液放入经40μm尼龙网筛过滤(购自BD公司)的50ml无菌离心管；300×g，4℃离心10分钟；弃去上清，加入5ml 1×破红剂(购自BD公司)重悬细胞，室温作用5分钟，以破碎红细胞；加入5ml 2％FBS-PBS终止破红反应；300×g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入2ml2％FBS-PBS重悬细胞备用。用Mouse IFN-γ/IL-4ELISPOT试剂盒(BD公司)检测IFN-γ和IL-4，刺激物为HBsAg的肽库，该肽库为表1所示序列组成的混合物，用ImmunoSPOT Series3自动读板机上读取斑点数。
用PBS稀释Mouse IFN-γ/IL-4(1：200稀释，BD公司)，100μl/孔加至ELISPOT板，4℃包被过夜；弃去包被抗体，用封闭液(含10％FBS RPMI-1640培养液)洗孔1次，加入封闭液200μl/孔，室温孵育2h；采用10％FBS-1640培养基稀释肽至10μg/ml；采用10％FBS-1640培养基稀释ConA至20μg/ml；弃去封闭液，将1×107细胞/ml的脾淋巴细胞悬液与配置好的刺激物按100μl/孔分别加入96孔板中，一式两孔重复；于37℃5％CO2培养箱孵育24h；弃去细胞悬液，用去离子水洗板2次，3-5m/次，用PBST洗涤3次，200μl/孔，加入用10％FBS PBS稀释的Mouse IFN-γ/IL-4ELISPOT detection Antibody(1：250稀释，BD公司)，100μl/孔，室温孵育2h；弃去检测抗体，用PBST洗板4次，200μl/孔，加入用10％FBS PBS稀释Streptavidian-HRP(1：100稀释，BD公司)，100μl/孔，室温孵育1h；弃去酶结合物，用PBST洗4次，再用PBS洗3次，加入AEC底物100μl/孔显色，肉眼观察斑点形成，加去离子水终止反应；在ImmunoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数。结果显示在图6中。
Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。IFN-γ可诱导Th1细胞分化，但抑制Th2细胞增殖；IL-4诱导Th2细胞分化。本实施例中，用ELISPOT检测免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平，结果Al(OH)3作为HBsAg佐剂分泌IL-4水平高于IFN-γ，说明Al(OH)3佐剂主要刺激B细胞增殖产生抗体；用CpG-ODN作为HBsAg佐剂分泌IFN-γ高于IL-4水平，说明CpG-ODN促进Th1分化；用MONTANIDE ISA 51作为HBsAg佐剂IFN-γ高于IL-4水平，说明MONTANIDE ISA51促进Th1分化。而用本发明的HBsAg+HBcAg+MONTANIDEISA51组合物分泌IFN-γ水平远高于IL-4水平，且IFN-γ水平可达600SFC/106脾细胞(spot-forming cells，简称SFC)，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组分泌的IFN-γ水平为250SFC/脾细胞左右，统计学分析表明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物和HBsAg+HBcAg+CpG-ODN组分泌产生的IFN-γ水平具有显著性差异(p<0.001)；同时HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组分泌产生的IFN-γ水平明显高于两组分的HBsAg+Al(OH)3组和HBsAg+CpG-ODN组，均具有显著性差异(p<0.001)；本实施例进一步说明本发明组合物主要参与细胞免疫，促进Th1细胞分化，因此具有杀伤感染HBV的肝细胞的潜能。
表1：所用HBsAg肽库序列信息
肽段编号 序列
1 FFLLTRILTI(SEQ ID NO：3)
2 FIIFLFIL(SEQ ID NO：4)
3 LVLLDYQGML(SEQ ID NO：5)
4 FLFILLLCLIFLLVLLD(SEQ ID NO：6)
5 SSWAFAKYL(SEQ ID NO：7)
6 ASVRFSWL(SEQ ID NO：8)
7 FAKYLWEWASVR(SEQ ID NO：9)
8 FVQWFVGL(SEQ ID NO：10)
9 WLSLLVPFVQWFVGLSPTVW(SEQ ID NO：11)
10 MWYWGPSL(SEQ ID NO：12)
11 IVSPFIPLL(SEQ ID NO：13)
12 WGPSLYSIVSPF(SEQ ID NO：14)
实施例7.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)与MONTANIDE ISA51联用能突破复制型HBV转基因小鼠的免疫耐受。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
检测乙型肝炎病毒表面抗体的作用是监测乙肝疫苗的接种是否成功。乙肝疫苗刺激免疫系统产生相当于中和抗体的乙型肝炎病毒表面抗体，其效价与疫苗的保护力直接相关，所述抗体的产生对防止HBV感染具有显著效果。因此，本发明人选用了国际通用的ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)来检测免疫HBV转基因小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBsAg)的浓度，并进行统计学分析，从而评价HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA51的组合相对于HBsAg、HBcAg和CpG联用对增强保护性抗体水平的保护力效果。
本实施例中所使用复制型HBV转基因小鼠，为HBV全基因转基因小鼠，含1.3倍HBV基因组，可进行复制，基因型为D型，雌雄各半，6-8周，购自广州458医院；所使用的HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA51同实施例1中所述。
将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml；HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫复制型HBV转基因小鼠，总体积为100μl，每组9只小鼠；PBS作为对照组进行免疫，100ul/只。每三周免疫一次，每次免疫后两周采血，共免疫6次，将血清进行原倍混血或个血用PBS溶液稀释(对于250<IU<1000，500倍稀释每只小鼠的个血送样，对于IU>1000，5000倍稀释每只小鼠的个血送样)送至东南大学第二附属医院进行检测，用ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)检测免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(ABBOTT公司ARCHITECT系统检测)，结果显示在图7中。
由图7可见，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物组可突破复制型HBV转基因小鼠的免疫耐受，保护性抗体水平可达40000IU/ml；HBsAg+HBcAg+CpG组合物产生的保护性抗体在30000IU/ml左右；上述结果表明，本发明HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物组疫苗比HBsAg+HBcAg+CpG组合物在免疫复制型HBV转基因小鼠上产生更高的保护性抗体水平，更能有效的突破免疫耐受。
实施例8.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)与MONTANIDE ISA51联用在复制型HBV转基因小鼠中使HBeAg/HBeAb转换。
本实施例中所使用的HBsAg氨基酸序列为SEQ ID NO：1，HBcAg氨基酸序列为SEQID NO：2。
对于HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者而言，HBeAg/HBeAb血清学转换即HBeAg消失、抗HBe转为阳性，是一个重要的临床观测指标，HBeAg/HBeAb血清学转换的出现标志着长期预后的改善，如肝硬化发生率降低和疾病进展减慢。因此，本发明人用国际认可的PEI(Paul-Ehrlich-Institue)HBeAg和HBeAb标准品，选用国际通用的ARCHITECT乙型肝炎病毒测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)检测免疫HBV转基因小鼠血清中的HBeAg和HBeAb的浓度，并进行统计学分析，从而评价HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA51的组合相对于HBsAg、HBcAg和CpG联用对HBeAg/HBeAb血清转换的影响。
本实施例中所使用复制型HBV转基因小鼠，为HBV全基因转基因小鼠，含1.3倍HBV基因组，可进行复制，基因型为D型，雌雄各半，6-8周，购自广州458医院；所使用的HBsAg、HBcAg和MONTANIDE ISA51同实施例1中所述。
将HBsAg和HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与MONTANIDE ISA 51(购自法国赛比克公司)佐剂按体积比1:1混匀后，至HBsAg浓度为10μg/ml，HBcAg浓度为10μg/ml；HBsAg和HBcAg用PBS稀释至10μg/ml；CpG-ODN用PBS稀释至20μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫复制型HBV转基因小鼠，总体积为100μl，每组9只小鼠；PBS作为对照组进行免疫，100ul/只。每三周免疫一次，共免疫6次，免疫终点后两周采血，将血清用PBS溶液稀释，HBeAg和HBeAb PEI标准品做梯度稀释，送至东南大学第二附属医院进行检测，用ARCHITECT乙型肝炎病毒国际单位测试系统(化学发光微粒子免疫测定法，CMIA)检测免疫小鼠血清中的HBeAg和HBeAb水平(ABBOTT公司ARCHITECT系统检测)，结果显示在图8中。
由图8所示，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物组相对于PBS组HBeAg水平明显降低(P<0.05)，HBeAb抗体水平相对于PBS组明显升高(P<0.001)，与HBsAg+HBcAg+CpG组合物比较，HBsAg+HBcAg+MONTANIDE ISA51组合物组HBeAg水平较低，说明本发明组合物发生了HBeAg/HBeAb血清学转换，抑制了HBV病毒的复制，且效果优于HBsAg+HBcAg+CpG组合物。表明该组合物具有抑制病毒复制，使HBeAg/HBeAb血清学转换的趋势，为慢性乙肝治疗性疫苗打下坚实的基础。
在本申请中，多个出版物在括号中被引用。由此，这些出版物的公开以整体通过引用并入本申请，以更完整的描述与本发明相关的技术的状态。
尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。
Figure IDA0001472206380000011
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Figure IDA0001472206380000031
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Figure IDA0001472206380000051
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Claims (7)

1.一种药物组合物，其包含：
i)乙型肝炎病毒表面抗原，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
ii)乙型肝炎病毒核心抗原，所述乙型肝炎病毒核心抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
iii)MONTANIDE ISA佐剂，和
iv)可药用载体；
其中所述MONTANIDE ISA佐剂为MONTANIDE ISA 51 VG；
其中，所述组分i)和ii)的质量比为1:1，所述MONTANIDE ISA 51 VG的体积与组分i)和ii)体积之和的比是1:1，而且所述组分i)和ii)的浓度均为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述MONTANIDE ISA 51 VG为包含矿物油和二缩甘露醇单油酸脂的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于在对象中治疗乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病之药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
5.根据权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于在对象中产生针对乙型肝炎病毒的体液免疫和细胞免疫应答之药物中的用途。
6.根据权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于在对象中使抗乙型肝炎病毒核心抗体发生亚型转变之药物中的用途。
7.根据权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于在对象中使乙型肝炎病毒e抗原/乙型肝炎病毒e抗体转换之药物中的用途。
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