CN102888402A - 玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该启动子含有1个ARE、1个GARE、1个GC motif、2个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF2启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用。
背景技术
我国每年受洪涝灾害的农田面积平均为956万公顷，其中严重的年份，受灾面积达1500万公顷以上。在亚洲地区，洪涝灾害给玉米的生产造成了很大的损失，仅南亚，每年超过15％的玉米种植面积遭受不同程度的危害。在印度，洪涝灾害造成玉米每年减产25-30％。我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10％-40％。涝渍害已成为我国南方玉米高产、稳产的主要制约因子之一。因此，克隆玉米淹水胁迫响应基因及其启动子，对阐明玉米淹水胁迫响应形成的分子机理以及玉米和其他旱生作物耐涝渍的遗传改良，具有十分重要的理论价值和实践意义。
ERF基因是参与植物非生物胁迫响应的关键基因之一，是水稻、深水稻和拟南芥淹水胁迫响应的关键基因。因此，克隆玉米ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐渍性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐渍遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF启动子的克隆，目前，尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用，含有1个ARE、1个GARE、1个GC motif、2个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF2启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
其技术方案如下：
1、玉米zmERF2基因的获得
根据已知的玉米基因组信息，使用烟草ERF2蛋白的AP2/ERF结构域高度保守的蛋白质序列，进行同源比对分析，电子克隆出121个ERF基因。通过与拟南芥、水稻、烟草等其他植物ERF基因的比较分析，剔除48个假阳性，获得了73个ERF基因，分别命名为zmERF1--zmERF73。玉米自交系Hz32的耐渍性较强，而Mo17耐渍性较弱，在玉米3叶1心期，分别对Hz32和Mo17进行0、4、12h的淹水处理，并利用real-time PCR对73个ERF基因在各处理根系的表达进行了分析，结果发现zmERF2基因在Hz32根系受淹水诱导高效表达，而在Mo17中表达量低，结果暗示zmERF2基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导型启动子。
2、玉米自交系Hz32叶片总DNA的提取
取玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加预热至95℃的CTAB缓冲液(1.17MNaCL、0.0016M EDTA-8.0，0.835M Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)10ml，混匀。在65℃水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入等体积氯仿∶异醇(24∶1)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另一50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml70％乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70％乙醇，将DNA晾干，加入1ml TE溶解。待DNA完全溶解后，转入2.0ml离心管中，加入10μl10mg/ml RNaseA，混匀；在37℃下，温育2小时。再用1ml苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2.0ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(PH5.2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA。将棉絮状DNA转入2.0ml离心管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T.E溶液，完全溶解DNA，于-20℃长期保存。
3、zmERF2基因启动子的克隆
根据玉米自交系B73zmERF2基因的启动子序列，设计一对特异引物，左引物：5-′ATGGTCGGTGCCTGCTGCGTGGG-3'，右引物：5′-GCACAAATCCTTTCCCTTTCCTT-3′。以Hz32的DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：2.5μl10×PCR缓冲液，2μl10mM dNTPs，1μl10mM特异引物，1μl10mM特异右引物，1单位Taq酶，40ng模板DNA，总体积25μl。PCR扩增程序为：95℃3分钟；95℃1分钟，61℃1分钟，72℃2分钟30秒，循环35次；72℃7分钟；4℃30分钟。PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分钟，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，并将该DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，进行DNA测序。
4、转化载体的构建
使用带酶切位点的引物(左引物加HindIII酶切位点，右引物加BamHI酶切位点)，以玉米自交系Hz32的DNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物与pGEM-T easy载体连接，转化Escherichia coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳性克隆进行DNA测序，提取所克隆zmERF2启动子序列正确的质粒DNA。使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切质粒，1％琼脂糖凝胶电泳，回收zmERF5启动子片段。使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切pBI121质粒载体，并回收载体片段。将zmERF2启动子片段与pBI121载体片段在体外进行链接，构建成pBI121-zmERF2-GUS载体，转化到农杆菌GV3101菌株中。
5、转zmERF2启动子拟南芥植株的获得
将含pBI121-zmERF2-GUS载体的GV3101农杆菌接种于LB液体培养基，加入利福平和卡那霉素至终浓度为100mg/L，28℃振荡培养。离心收集菌体，用ddH2O稀释至OD＝0.8，每100ml菌液加入5.0g蔗糖和50μl Silweet L-77。使用floral dip方法对拟南芥进行浸染，成熟后收获种子，将种子播在含100mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基上。从筛选培养基中长出的抗性植株，经PCR检测后确定为转zmERF2启动子阳性植株。
6、zmERF2启动子活性的检测
将转zmERF2拟南芥于苗期进行淹水处理，将正常生长和淹水处理的转基因拟南芥幼苗进行GUS组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERF2启动子拟南芥植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERF2启动子拟南芥的根呈现较强的GUS蓝色，叶片未见GUS蓝色。研究表明zmERF2启动子既是一个在根中表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：1)zmERF2启动子直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下快速高效(4h)启动外源基因在植株根部的大量表达，可以提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；2)zmERF2启动子直接驱动外源基因的转基因植物，由于外源基因只在淹水条件下诱导表达，且表达部位仅局限于根部，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题。
具体地说，本发明的优点：1)淹水条件下诱导表达的诱导型启动子；2)只在根部特异表达的组织特异性启动子；3)该启动子的启动能力较强，是强启动子；4)为玉米及其他旱生作物的耐渍性遗传改良提供了新的根部特异表达、淹水诱导型的启动子资源；5)对该启动子中所含顺式元件的分析，可进一步阐明玉米耐渍性形成的分子机制。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
把zmERF2启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终止子，构建成一个转化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到zmERF2启动子与Tnos终止子之间，构建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌法介导法将目的基因转化到受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植株。在涝渍、淹水条件下，zmERF2启动子可以启动目的基因在植株根部大量表达。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.一种含有权利要求1所述绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的植物表达载体。
3.如权利要求1所述绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子在植物耐渍遗传改良中的应用。
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| CN101864416A (zh) * | 2009-04-17 | 2010-10-20 | 长江大学 | 玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启动子 |
| CN101974537A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-02-16 | 华中农业大学 | 玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ及分子标记与应用 |
-
2012
- 2012-06-29 CN CN2012102187456A patent/CN102888402A/zh active Pending
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