CN102863533B

CN102863533B - 抗体人源化改造方法

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Publication number: CN102863533B
Application number: CN2012101752798A
Authority: CN
Inventors: 肖卫华; 刘兢; 胡思怡; 常亮
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2030-06-21
Also published as: CN102863533A

Abstract

本发明公开了一种人源化抗体及其人源化改造方法。该抗体是如下任一所述蛋白质：a）由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。

Description

抗体人源化改造方法

技术领域

本发明涉及一种人源化抗体及其人源化改造方法。

背景技术

P185是由癌基因Her2/erbB-2编码的一种细胞表面的重要的受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族。P185/Her2受体与该家族其他成员类似，由胞外区，跨膜区和胞内区三个结构域组成，其中胞外区（ECD）又分为四个亚区，其中的I、III亚区为亮氨酸富含区，Ⅱ、Ⅳ亚区为半胱氨酸富含区（Carpenter G.(1987)Receptorsof epidermal growth factor and other polypeptide mitogens.Annu.Rev.Biochem.56:881-914）。表皮生长因子家族受体广泛地分布于多种组织，尤其在上皮组织、间质组织以及神经发生组织中表达，在调节细胞的增殖、分化、发育、黏附和迁移中起到了重要的作用。P185/Her2作为表皮生长因子受体家族的信号转导网络中最重要的一员，其表达水平的异常与细胞信号转导紊乱、肿瘤的发生和恶性发展紧密相关（Nancy EH,Heidi A,Lane N.(2005)ErbB receptors and cancer:the complexityof targeted inhibitors Nat.Rev.Cancer 5:341-354）。

近年来P185/Her2一直作为肿瘤治疗领域中的热点被广泛研究。1985年，Greene M.I.研究组发现，抗P185/Her2胞外区的单克隆抗体能够使已经转化的Her2高表达的NIH3T3表型逆转，使肿瘤细胞的表型趋于正常化，同时可以下调Her2受体的表达水平（Drebin JA,Link VC,Stern DF,Weinberg RA,Greene,MI.(1985)Down-modulation of an oncogene protein product and reversion of the transformedphenotype by monoclonal antibodies.Cell 41:695-706）。随后该实验室又发现，抗Her2的单克隆抗体能抑制移植入裸鼠体内的Her2转化的NIH3T3肿瘤细胞的生长，从而第一次通过体内实验证明了抗Her2单抗可能对Her2高表达肿瘤有临床治疗的价值（Drebin JA,Link VC,Weinberg RA,Greene MI.（1986）Inhibition of tumor growthby a monoclonal antibody reactive with an oncogene-encoded tumor antigen.ProcNatl Acad Sci USA 83:9129-9133）。这一发现大大促进了抗Her2单克隆抗体的抗肿瘤作用的研究，也揭示了抗体在肿瘤治疗上应用的前景。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体，应用于人体时会产生人抗鼠抗体（HAMA）反应，所以不能直接用于人体内的疾病治疗。因此必须对单克隆抗体进行人源化改造，以减少和消除鼠源蛋白的免疫原性。

最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体（Vaughan TJ,Osbourn JK,Tempest PR.（1998）Human antibodies by design.Nat.Biotechnol 6：535-539）。该方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比原始的鼠源抗体降低了2/3，所以可以应用于人体治疗（Davis TA.（1999）Final report on the safety and efficacy of retreatment with rituximabfor patients with non-Hodgkin’s lymphoma.Blood 94：88a）。但由于其分子中还保留了1/3的鼠源部分，用于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。

因此，为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行进一步的人源化改造，获得全人源化抗体。目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可变区内参与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体可变区中除高度可变的互补决定区（CDR）来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于抗体可变区中参与抗原结合的一般是其6个互补决定区（CDR），故此过程也被称为“CDR移植”，然后为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和力下降，需通过一系列对框架区残基的突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结合能力，从而得到人源化程度更高的重构抗体（Jones PT,Dear PH,Foote J.（1986）Replacing thecomplementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse，Riechmann L,Clark M,Waldmann H.（1988）Reshaping human antibodies fortherapy，Chothia C,Lesk AM,Tramontano.（1989）A Conformations of immunoglobulinhypervariable regions）。已报道的构建重构抗体的方法依照其人源化改造使用的模板的选择和回复抗体结合能力的方法，主要又可以分成两种。其一，通过序列对比，以序列相似性为标准分别选择相似性最高的抗体轻链和重链可变区的人源抗体为模板序列，在经过CDR移植后的轻、重链序列基础上，针对可能影响结合能力的框架残基分别构建一系列突变体，鉴别合适的突变组合。这些突变体需各自独立制备及测试其抗原结合能力，然后将较好的突变组合起来，即需要对各个可能的残基的突变、筛选的重复循环实验，所以步骤繁复，效率低，效果不理想。其二，也是目前抗体人源化的一种通用方法。具体的做法是，将非人源（例如鼠源）抗体的CDR移植于通用的人源抗体可变区模板VLκⅠ-VHⅢ的构架上，通过对一组选定的关键框架区残基进行随机诱变，构建抗体Fab的噬菌体文库，再通过噬菌体亲和力筛选鉴别出最佳框架序列。此方法相比第一种可以更快速地获得优化的框架序列，并可在此基础上进一步提高抗体的抗原亲和力；但是由于其选用的是通用模板，虽有普适性，但对不同抗体来讲可能不是最优的，另外通过构建噬菌体库筛选高亲和力抗体的方法也比较复杂，费时费力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。

本发明所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白质：

a）由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-2：V_L+Linker+V_H）

b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-2：V_L+Linker+V_H+Fc）

c）将a）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；

d）将b）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸和/或第254-489位（Fc片段）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；

e）由序列表中序列1中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-1：V_L+Linker+V_H）

f）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-1：V_L+Linker+V_H+Fc）

g）将e）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；

h）将f）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸和/或第254-489位（Fc片段）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；

i）由序列表中序列5中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-V1：V_L+Linker+V_H）

j）由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（H1-V1：V_L+Linker+V_H+Fc）

k）将i）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；

l）将j）限定的蛋白中自其N末端起第115-134位（linker）氨基酸和/或第254-489位（Fc片段）氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质。

所述编码基因为如下任一所述：

1）编码所述a）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列4自5′末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；

2）编码所述b）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；

3）编码所述e）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列2自5′末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；

4）编码所述f）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

5）编码所述i）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列6自5′末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；

6）编码所述j）所示蛋白的编码基因为：核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；

7）在严格条件下与1）-6）任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

8）与1）-6）任一限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体是在pSectag2A载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的。

本发明的另一个目的是提供一种抗体。

本发明所提供的抗体，由两个相同的上述任一所述蛋白组成；所述两个相同的蛋白通过二硫键连接。

上述任一所述蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述抗体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种抗体的人源化改造的方法。

本发明提供的抗体的人源化改造的方法包括如下步骤：

（1）、按照如下Ⅰ或Ⅱ所述方法选择得到人源化抗体模板：

Ⅰ、选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；

从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板；

Ⅱ、选择满足如下ⅰ）和ⅱ）所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；

ⅰ）重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；

ⅱ）重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；

所述可变区空间结构为如下a）和/或b）所示：a）重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构；b）重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构；

未知空间结构的抗体，可通过软件模拟出其空间结构，包括重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构，和重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构。

（2）、按照如下Ⅲ或Ⅳ所示方法获得被置换后的人源化抗体模板：

Ⅲ、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少一个CDR氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；

（未知CDR区的抗体，可通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义进行鉴定，将两种方法鉴定结果的综合值作为最终值，即取两鉴定结果中的最小值至最大值区段作为CDR区）。

Ⅳ、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的抗原结合区氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板；

（3）、将所述步骤（2）中的被置换后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化抗体；

（4）用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。

上述方法中，在所述步骤（2）后，所述步骤（3）前，包括如下回变步骤：将所述步骤（2）得到的抗体的框架区的至少一个氨基酸残基替换为所述待改造抗体中相应位置的氨基酸残基，至得到的抗体空间结构稳定，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。

（回变满足如下两个条件：1）人源化程度高，2）使得到的抗体结构稳定；所述可变区为重链可变区和/或轻链可变区；）

上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基为影响步骤（2）得到的抗体的CDR区结构稳定性或影响步骤（2）得到的抗体的抗原结合区结构稳定性的氨基酸残基；

上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基位于所述步骤（2）得到的抗体的游标区和/或被替换的氨基酸残基位于所述步骤（2）得到的抗体的侧链中距离所述CDR氨基酸残基3埃以内；

上述方法中，在所述回变后，所述步骤（3）前，包括如下人源突变步骤：将所述回变得到的抗体的框架区内非人源的且不同于所述待改造抗体中相应位置氨基酸的氨基酸残基突变为人源氨基酸残基，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。

由上述任一所述方法得到的人源化抗体也属于本发明的保护范围。

本发明的抗体是特异识别肿瘤表面抗原P185^Her2/erbB-2的嵌合抗体ChA21的人源化抗体变异体。

本发明所提供的ChA21的人源化抗体变异体包括原嵌合抗体ChA21中鼠源的单链抗体被完全人源化的scFv、铰链区和人源的Fc区。其中被人源化的scFv的氨基酸序列为：

DIVLTQSPDSLAVSLGERVTINC KSSQTLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIS WAFTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC QQYSNYPWT FGAGTKLEIKR

QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYSFTGYFIN WVKQNPGQRLEWIGHISSSYATSTYNQKFKG KATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVR SGNYEEYAMDYWGQGTLVTVS.

下划线部分分别为抗体的3个轻链和3个重链顺序排列的共6个互补决定区（CDRs），黑体部分为轻重链可变区之间的连接区（Linker）。

本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。

本发明的人源化抗体改造方法包括如下步骤：

基于目标抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择

首先，将需人源化的目标抗体（ChA21）轻、重链可变区的序列分别通过IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）进行序列相似性搜索，将轻、重链均有较高相似性（大于50%）且有晶体结构的若干个人源抗体作为候选的人源化模板；再通过分子叠合比较候选模板抗体和目标抗体框架区的结构相似性，选择结构相似度最高的一种作为抗体人源化的模板。如果目标抗体没有晶体结构数据，可以通过同源模拟获得模拟分子结构再进行比较。

抗原结合区的移植

首先，选择目标抗体的抗原结合区段。对于没有晶体结构数据的抗体，一般是选择其互补决定区（CDR）；（抗体的CDR序列可以通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义加以鉴定）对于有抗体和抗原复合物晶体结构的抗体，可以综合CDR序列和结构数据获得其抗原结合区域。

然后，将选择的区段残基替换人源模板抗体相应位置上的残基，得到最初版本的人源化抗P185/Her2抗体序列命名为为H1，并通过计算机同源模拟得到H1的模拟的空间结构。

框架区残基回复突变位点的选择

基于模拟的H1结构，采用计算生物学方法，对一些重要的框架区残基进行突变方向的筛选。这些残基包括所有游标残基（Vernier）和所有侧链距离CDR残基3埃以内的框架区残基，选择更符合抗体结构稳定性的位点为需要突变的方向。具体到本例中，最初人源抗体H1的轻链可变区VL的第4和49位残基以及重链可变区VH的第71和93位残基，被选择需突变为目标抗体上的相应残基，即VL第4残基甲硫氨酸被亮氨酸取代，第49位残基酪氨酸被丝氨酸取代；VH的第71残基丙氨酸被缬氨酸取代，第93位残基苏氨酸被缬氨酸取代。由此获得人源化的抗P185/Her2抗体序列H1-1。根据改造后亲和力分析结果和进一步提高人源化程度的需要，还可对一些CDR区以外的非抗原结合残基进行人化修饰，如具体到本例子为H1-1中VL区的残基5、21和106以及VH区的残基61、62、80和91，则选择数据库中人源抗体相应位置上出现频率较高的残基将它们分别替换，最终获得比最初版本人源化程度更高的抗P185/Her2抗体序列H1-2。

本发明所提供的方法与现有抗体人源化改造方法相比，有如下优点和特异性：

首先，本方法在人源化模板抗体的选择上，不同于以往方法分别选择与轻链和重链相似的的两个人源模板序列，而是选择轻重链均与目标抗体有较高相似度的一种人源抗体作为模版，且候选模板抗体尽量选择有晶体结构数据的，通过比较候选模版抗体和目标抗体的整体结构的相似性，最终决定出模板抗体。这种将抗体的轻重链作为一个整体来考虑，所选轻重链模板来自于同一个抗体，本身就是来自天然构架，相比以往人为组合轻重链的方法更有利于轻重链框架区结构的稳定性，而且在选择框架区残基突变时，可以不用再考虑是否需要突变轻重链界面残基来使轻重链相互作用更稳定的问题。

其次，按结构相似性选择模板相比以往单纯的通过序列相似性筛选模板更具有结构合理性。因为抗体与抗原的结合直接取决于抗体互补决定区的构象，而互补决定区又是搭建于框架区所构建的平台之上的，所以人源模板与目标抗体的空间结构相似性越高越利于移植后的互补决定区构象的维持，即越利于保持抗体结合抗原的能力。序列相似性虽然在一定程度上可以代表结构相似性，但并不很精确。例如本发明实施例一中，具有最高序列相似性的若干模板却不是结构相似性最好的。

再次，在选择框架区残基突变时，结合抗体结构数据分析，可以直观迅速的作出应突变位点的选择。根据结构稳定的需要来选择游标残基中的那些有可能影响CDR区结构的残基以及决定其他一些位于抗体分子表面且可以进一步人源化的残基是否突变以及突变的方向，将以往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突变选择集中在一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最终的突变方案。因此相比以往方法，本方法更加简捷明确。

最后，相比于现有人源化方法，本方法的改造效果也更高一些。通过本方法得到的ChA21抗体人源化的版本H1-2具有与原始抗体相当的抗原结合活性，相对亲和力约为原始抗体的93%左右。而已报道的通过通用抗体人化方法改造后的抗体的亲合力有高有低，水平很不稳定（Carter P,Presta L,Gorman CM,RidgwayJB,Henner D,Wong WL,Rowland AM,Kotts C,Carver ME,Shepard HM.（1992）Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.Proc NatlAcad Sci USA 89:4285-4289，Presta LG,Chen H,O Connor SJ,Chisholm V,MengYG,Krummen L,Winkler M,Ferrara N,(1997)Humanization of an anti-VEGFmonoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders,CancerRes.57:4593–4599）。为直接比较本方法和通用方法的改造效果，在本发明实施例中同时应用通用人源化方法中的通用人源模板VL κⅠ-VHⅢ对ChA21进行人源化改造，得到ChA21的另一个人源化版本H2-1，通过亲和力测定发现H2-1的亲和力相比原始抗体下降了一倍以上，说明就本例中的抗体ChA21而言，本发明中的人化方法的改造效果明显好于现有其他方法。

本领域已知有各种不同方法可用于表达和纯化人源化的抗体。如大肠杆菌表达系统，操作简单快速，成本低，但是可溶性抗体表达量低(100ug/L)，表达产物不能正确修饰，容易形成包含体，纯化困难，不同突变体克隆之间表达量差异很大，使下一步抗体亲和力的测定受抗体浓度影响，不易判断；酵母表达系统，如pPIC9K载体，分泌表达，可用His-tag柱纯化，纯化较方便，但需要构建稳定细胞株，周期长，表达量虽然比大肠杆菌系统高（一般在mg/L级别），但不同突变体克隆之间表达量差异也很大；而本发明中采用的293T真核瞬时表达系统，以pSectag2A为载体，可分泌表达，产物可用His-tag柱或蛋白A柱纯化，因此将设计好的人源化抗体的重组质粒DNA经脂质体瞬时转染293T细胞，表达产物能正确修饰，纯化简单，表达量较高（3－10mg/L)，且不同突变体克隆之间表达量差异小，虽然花费相对较高，但用此系统表达纯化的抗体性质测定结果明确、稳定。另外，应用ELISA法测定抗体表达量和相对亲和力，结果准确，重复性好，且无需对表达上清进行纯化，便于快速鉴定筛选出人源突变体。

附图说明

图1为抗体ChA21轻链和重链的可变区氨基酸序列，序列编号依照Kabat规则排序。下划线部分为综合Kabat和Chothia的序列定义划分出的互补决定区（CDRs）。

图2为抗体ChA21的单链可变区（scFv，PDB号：2GJJ）同选定的人源模板抗体huCC49（PDB号：1ZA6）的可变区的空间结构比对结果。

图3为抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物结构。

图4用于说明通过ChA21的抗原结合区移植获得的最初版本的人源化抗体H1的氨基酸序列，以及同原始鼠源抗体和人源模板抗体的可变区一级序列比对。

图5是通过计算机同源模拟得到的人源化抗体H1-1的分子模型。

图6用于说明在人源化抗体H1序列及结构基础上进行一系列的框架区残基突变的选择结果，以及和获得的新的人源化抗体变异体H1-1和H1-2的序列的比较。互补决定区用方框标出。

图7用于说明以基于通用模板VLκⅠ-VHⅢ获得的人源化抗体hu4D5（PDB号：1FVC）为人源模板对ChA21进行人源化改造，以及获得的人源化抗体H2-1的氨基酸序列。

图8为人源化抗体H1-1和H1-2重组表达载体的构建示意图。

图9为抗体ChA21和其各种人源化突变体的抗原结合曲线。将各种转染的293T细胞的上清中的抗体的起始浓度都配制成1ug/ml，再通过ELISA检测各种突变体与抗原的结合曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、嵌合抗体chA21的人源化改造

嵌合抗体chA21的序列早已由L.S.Cheng等人描述（Chen L.S.,Liu A.P.,Liu.J.Construction,expression and characterization of the engineeredantibody against tumor surface antigen P185^c-erbb-2.Cell Res.2003,13:35-48），如图1所示。嵌合抗体chA21的结构：两条相同的蛋白链通过在Fc区形成的二硫键结合。每条蛋白链依次由轻链可变区（V_L）、linker、重链可变区（V_H）和Fc区依次连接组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，其中，第1-114位为V_L，第115-134位为linker，第135-253位为V_H，第254-489位为Fc。

一、人源抗体模板的选择

序列相似性比对：将chA21的轻链可变区与人源化抗体的轻链可变区进行氨基酸序列相似性比对，将chA21的重链可变区与人源化抗体的重链可变区进行氨基酸序列相似性比对。通过IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）在蛋白数据库（PDB，Protein DataBank）中分别进行序列相似性搜索。具体选择搜索参数如下：程序：blastp；提交序列来源：mouse；数据库：pdb；比对序列来源：human。显示比对结果的数量可以根据比对结果来具体选择，其他参数可选择默认参数。

在搜索的结果中，选择与轻、重链均有较高序列相似性的抗体作为候选人源化抗体模板，一般选择相似性在50%以上作为选择阈值，也可以根据具体的搜索结果选择不同的阈值。在ChA21的比对结果中，由于序列相似性高于50%的候选模板太多，所以提高选择阈值，选择两条链相似性均高于60%的抗体作为候选人源化抗体模板；

结构相似性比对：再应用PyMOL软件通过分子叠合（align）比较候选人源化抗体模板和ChA21的可变区（scFv，PDB号：2GJJ）的整体空间结构相似性（即蛋白中重链可变区和轻链可变区一起组成的空间结构）和框架区空间结构相似性（即蛋白中重链可变区中框架区和轻链可变区中框架区一起组成的空间结构）（由RMS表示其结构间差异的大小），各候选模板的序列比对和空间结构比对结果见表1（所有表中的序列编号均采用Kabat序列编号）。

选择结构相似度最高的huCC49（PDB：1ZA6）（表中看应该是最低）作为嵌合抗体ChA21人源化的模板，两抗体空间结构的比对见图2。

其中模板1FVC是抗体4D5基于通用人源抗体模板VLκⅠ-VHⅢ进行人源改造而获得的已经人源化的抗体hu4D5，其框架区序列与VLκⅠ-VHⅢ基本一致，基于此通用模板结构对ChA21同时进行人源化改造，用以比较本发明方法和通用方法的人化改造效果。

表1、ChA21可变区与各候选模板序列和结构相似性比对

二、抗原结合区的移植

选择ChA21的抗原结合区段。抗体ChA21的CDR序列可以通过结合Kabat等人和Chothia等人的序列定义加以鉴定，CDR序列划分结果见表2。最终划定的各CDR区为

图1中带下划线的区段。

表2、ChA21的互补决定区（CDR）序列划分结果

CDR LOOP	Kabat	Chothia	Combine
				L1	L24-L34	L24-L34	L24-L34
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L56
				L3	L89-L97	L89-L97	L89-L97
H1	H31-H35B	H26-H32..34	H26-H35B
				H2	H50-H65	H52-H56	H50-H65
H3	H95-H102	H95-H102	H95-H102

由于抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物晶体结构数据已经获得解析，其抗原结合区段可以直观地从复合物结构上获得，如图3所示。可以看出重链CDR2的后半段位于抗体分子的表面，既不参与抗原结合，对其他CDR区结构也没有影响，也不参与抗体轻重链之间的相互作用，所以从提高序列人源化程度的要求考虑，将其作为非抗原结合区，而不移植ChA21的重链CDR2上的此段序列。将其余CDR区域的残基替换抗体huCC49（1ZA6）相应位置上的CDR区域的残基，得到最初版本的人源化抗体序列H1（序列比较结果见图4）,并应用蛋白结构模拟软件MODELLER通过同源模拟得到其模拟的空间结构。（表3中给出的H3为H95-H102，此序列编号为Kabat序号，而非序列实际顺序编号，如图1中所标识的CDR区H3序列为H95-H102（SGNYEEYAMDY），相对图4中其位置为101-111（SGNYEEYAMDY）这一段。）

三、H1框架区残基的突变选择（回变）

基于最初版本人源化抗体H1的模拟的空间结构，对一些重要的框架区残基进行突变方向的筛选：首先考虑的一类残基是可能影响互补决定区构象或结构的残基，或是可能直接影响抗原结合的残基，根据之前对于此类框架残基的研究，列出此类残基的清单（见表3），这些残基包括近30多种对CDR结构有潜在贡献的游标残基（Vernier）；另外，在模拟的H1结构中选择所有侧链距离CDR残基3埃以内的残基，从结构角度考虑这些残基也可能直接影响CDR区残基的构象，而且它们恰好都包括在表3所列的游标残基之中。通常需要将这些残基全部突变为原始抗体ChA21的相应位点的残基，称为“回变”，但这样做有可能会因为添加了非人源序列的元件而导致免疫原性增大的危险，因此，在对游标残基的回变选择过程中，可保留一些侧链位于抗体分子表面的游标残基，同时对于回变之后可能会导致回变的残基与其周围残基发生结构冲突的残基也应选择不回变,例如H69Leu->Phe。通过选择回变得到人源化序列H1-1，其模拟结构如图5所示。

表3、游标残基突变选择

游标残基	人源模板残基	鼠源ChA21残基	人源化H1-1序列
				L2	Ile	Ile	Ile
L4	Met	Leu	Leu
				L35	Trp	Trp	Trp
L36	Tyr	Tyr	Tyr
				L46	Leu	Leu	Leu
L47	Leu	Leu	Leu
				L48	Ile	Ile	Ile
L49	Tyr	Ser	Ser
				L64	Gly	Gly	Gly
L66	Gly	Gly	Gly
				L68	Gly	Gly	Gly
L69	Thr	Thr	Thr
				L71	Phe	Phe	Phe
L98	Phe	Phe	Phe
				H2	Val	Val	Val
H47	Trp	Trp	Trp
				H48	Ile	Ile	Ile
H49	Gly	Gly	Gly
				H67	Ala	Ala	Ala
H69	Leu	Phe	Leu
				H71	Ala	Val	Val
H73	Thr	Thr	Thr
				H78	Ala	Ala	Ala
H93	Thr	Val	Val
				H94	Arg	Arg	Arg
H103	Trp	Trp	Trp

四、人源突变

再对一些非抗原结合残基进行人化修饰。因为所选人源模板抗体huCC49为已经人源化的抗体，其框架序列上也存在一些其人源化过程中回变为亲代鼠源抗体的残基，这些残基包含一些鼠源抗体共有的残基和一些huCC49亲代鼠源抗体mCC49特有的残基，而后者对于其他鼠源抗体来讲不是必要的，因此从提高人源化程度的角度看，在不影响结构稳定的基础上，需要将这些残基突变为相应的人源残基。具体到H1-1的序列中，通过序列比对，找到框架序列中既不同于ChA21也不同于人源化抗体huCC49的人源模板序列（huCC49轻链模板序列LEN和huCC49重链模板序列21/28’CL)的位点，它们是VL中的残基5、21和106以及VH中的残基61、62、80和91，选择突变为人源模板序列LEN和21/28’CL相应位置上的残基（见表4）。最终获得人源化序列H1-2，所有序列的比对结果见图6。

表4、非抗原结合序列人化改造

另外，以人源化抗体hu4D5（PDB：1FVC，通常被视为通用模板）为模板，通过相同方法获得人源化序列H2-1（图7），该人源化的抗体作为对照，与本发明中人源化模板选择方法得到的人源抗体相互比较对抗体亲和力的影响。图7中，hu4D5为人源化模板（即通用模板），H2为CDR置换后得到的抗体（置换方法与上述步骤二中一致），HumanVL-KappaⅠ为抗体hu4D5的轻链可变区对应的人源序列,HumanVH-Ⅲ为抗体hu4D5的重链可变区对应的人源序列,H2-1为最终人源化后的序列。

实施例2、各种抗体的表达载体构建

一、pSectag2A-dFc载体构建

pSectag2A载体购自Invitrogen公司。利用PCR扩增Fc片段，设计引物在Fc片段N端和C端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，然后将Fc片段用EcoRI和XhoI双酶切，回收双酶切后片段；同时将pSectag2A质粒用EcoRI和XhoI进行双酶切，回收双酶切后片段；将双酶切后的Fc片段和pSectag2A载体用T4-DNA连接酶连接，将连接产物转化入Top10感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和测序验证，结果，pSectag2A的EcoRI和XhoI酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO:2中第760-1470位核苷酸所示（即Fc片段），表明构建的重组载体正确，将此载体记作pSectag2A-dFc，作为人源化抗体的表达载体。

以scFv-Fc/pEE14(中国专利CN1613873)为模板，用如下引物，PCR扩增，得到Fc片段。或者人工合成SEQ ID NO:2中第760-1470位核苷酸所示的Fc片段。

dFc-EcoRI:5’-AATGAATTCGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAA-3’（下划线为EcoRI和NotI位点）

dFc-XhoI:5’-TTTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’（下划线为XhoI位点）

二、人源化抗体H1-1重组表达载体的构建

人工合成SEQ ID NO:2中第1-759位核苷酸所示基因（即V_L+Linker+V_H），导入载体pMD-19T（由大连宝生物合成）,命名为pMD-19T-H1-1。以pMD-19T-H1-1为模板，在引物P0（PH1-Sfi1）:5’-ATATGGCCCAGCCGGCCGACATCGTTTTGTCTCAATCTCCAGACTCTTTG-3’和P7（H1-Rv-Not1）：5’-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3’的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带，命名为“H1-1”。用限制性内切酶SfiI和Not I对获得的H1-1基因片段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶酶切的质粒pSectag2A-dFc用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10或DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的SfiI和Not I位点间插入的基因序列如SEQ IDNO:2中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质粒命名为pSectag2A-dFc-H1-1。该重组载体中含有SEQ ID NO:2所示基因，该基因中第1-342位是V_L，第343-402位是Linker，第403-759位是V_H，第760-1470位是Fc；该基因编码的蛋白如SEQ ID NO:1所示，该蛋白中第1-114位是V_L，第115-134位是Linker，第135-253位是V_H，第254-489位是Fc。

三、人源化抗体H1-2重组表达载体的构建

（一）表达H1-V1的重组载体构建

在得到的H1-1的基因序列基础上通过点突变的方法获得H1-2的编码序列。具体方法如图8所示，分两轮点突变进行，先对H1-1进行第一轮点突变获得H1-V1中间突变体，再对H1-V1进行第二轮点突变获得H1-2的序列。

对人源化抗体H1-1的突变位点如表5所示：

表5、人源化抗体H1-V1基因的突变位点表

位点	L5	L21	L106	H80	H91
						H1-1	S(TCT)	L(TTG)	L(TTG)	V(GTT)	F(TTC)
H1-V1	T(ACT)	I(ATT)	I(ATT)	M(ATG)	Y(TAC)

采用定点突变法分三段扩增带有上述突变位点的序列，然后用搭桥PCR法，扩增得到人源化抗体H1-V1编码基因序列，具体方法包括以下步骤：

1）人源化抗体H1-V1编码基因的5’端序列的扩增

以pMD-19T-H1-1为模板，在引物P2（P5T-21I-Fw）:5’-ACTCAATCTCCAGACTCTTTGGCTGTTTCTTTGGGTGAAAGAGTTACTATTAACTGT-3’和P3（P112I-Rv）：5’-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGGTGGTGG-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1-5’”。

2）人源化抗体H1-V1编码基因的中间段序列的扩增

以pMD-19T-H1为模板，在引物P4（P112I-Fw）：5’-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGGTGGTGG-3’和P5（P215M-RV）：5’-GTCTTCCGATCTCAAAGAAGACAATTCCATGTAAGCAG-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1-m”。

3）人源化抗体H1-V1编码基因的3’端序列的扩增

以pMD-19T-H1为模板，在引物P6（P229Y-Fw）：5’-GTCTTCTTTGAGATCGGAAGACACTGCTGTTTACTACTGTG-3’和P7（H1-Rv-Not1）：5’-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1-3’”。

4）人源化抗体H1-V1编码基因的获得

以步骤1）扩增的H1-V1-5’、步骤2）扩增的H1-V1-m和步骤3）扩增的H1-V1-3’基因这三个片断为模板在引物P1（P5T-Sfi1）：ATATGGCCCAGCCGGCCGAC

ATCGTTTTGACTCAATCTCCAGACTCTTTG和P7的引导下进行搭桥PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-V1”

5）人源化抗体H1-V1编码基因的表达载体的获得

用限制性内切酶Sfi I和Not I对步骤4)获得的H1-V1基因片段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSectag2A-dFc连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的SfiI和Not I位点间插入的基因序列如SEQ ID NO:6中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质粒命名为pSectag2A-dFc-H1-V1。该重组载体中含有SEQ ID NO:6所示基因，该基因中第1-342位是V_L，第343-402位是Linker，第403-759位是V_H，第760-1470位是Fc；该基因编码的蛋白如SEQ ID NO:5所示，该蛋白中第1-114位是V_L，第115-134位是Linker，第135-253位是V_H，第254-489位是Fc。

（二）表达H1-2的重组表达载体的构建

对人源化抗体H1-V1的以下位点进行突变得到H1-2，突变位点如（表6）所示：

表6人源化抗体H1-2的突变位点

位点	H61	H62
			H1-V1	E(GAA)	R(AGA)
H1-2	Q(CAA)	K(AAA)

采用定点突变法扩增带有上述突变位点的人源化抗体H1-2编码基因，具体方法包括以下步骤：

1）人源化抗体H1-2编码基因的5’端序列的扩增

以pSectag2A-dFc-H1-V1为模板，在引物P1和P8（H1-2-Rv）：5’-GCCTTACCCTTGAATTTTTGGTTGTAAGTAGAAG-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2-5’”。

2）人源化抗体H1-2编码基因的3’端序列的扩增

以pSectag2A-dFc-H1-V1为模板，在引物P9（H1-2-Fw）:5’-CTTCTACTTACAACCAAAAATTCAAGGGTAAGGC-3’和P7：的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2-3’”。

3）人源化抗体H1-2编码基因的获得

以步骤1）扩增的H1-2-5’和步骤2）扩增的H1-2-3’基因片断为模板在引物P1和P7的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H1-2”。

4）人源化抗体H1-2编码基因的表达载体的获得

用限制性内切酶SfiI和Not I对步骤3）获得的H1-2基因片段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSectag2A-dFc连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选阳性重组子，抽提质粒DNA，测序，结果在pSectag2A-dFc的SfiI和Not I位点间插入的基因序列如SEQ ID NO:4中第1-759位核苷酸所示。将阳性重组质粒命名为pSectag2A-dFc-H1-2。该重组载体中含有SEQ ID NO:4所示基因，该基因中第1-342位是V_L，第343-402位是Linker，第403-759位是V_H，第760-1470位是Fc；该基因编码的蛋白如SEQ ID NO:3所示，该蛋白中第1-114位是V_L，第115-134位是Linker，第135-253位是V_H，第254-489位是Fc。

四、人源化抗体H2-1重组表达载体的构建

合成SEQ ID NO:8中自5′末端起第1-759位核苷酸所示基因，并导入载体pMD-19T,测序验证，将阳性重组子命名为pMD-19T-H2-1。以pMD-19T-H2-1为模板，在引物P10（PH2-Sfi1）:5’-ATAT GGCC CAGCC GGCC GACATCCAATTGACTCAATCTCCATCTTCTTTG-3’和P7（H1-Rv-Not1）：5’-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3’的引导下进行PCR扩增，回收目的条带，命名为“H2-1”。用限制性内切酶SfiI和Not I对获得的H2-1基因片段分别进行单酶切，再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pSectag2A-dFc连接，得到的阳性重组质粒，测序验证，结果在pSectag2A-dFc的SfiI和Not I位点间插入的基因序列如SEQ ID NO:8中自5′末端起第1-759位核苷酸所示，将阳性重组质粒命名为pSectag2A-dFc-H2-1。该重组载体中含有SEQ ID NO:8所示基因，该基因中第1-342位是V_L，第343-402位是Linker，第403-759位是V_H，第760-1470位是Fc；该基因编码的蛋白如SEQ ID NO:7所示，该蛋白中第1-114位是V_L，第115-134位是Linker，第135-253位是V_H，第254-489位是Fc。

五、嵌合抗体ChA21重组表达载体的构建

嵌合抗体ChA21的表达载体的构建方法与中国专利CN1613873中所述一致。

实施例3、瞬转293T细胞表达人源化抗体及表达产物的纯化

（一）抗体H1-1、H1-2、H2-1、H1-V1、ChA21的表达和纯化

293T细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-11268。

DMEM培养基购自GIBCO，产品目录号为11960。

提前培养足够量的293T细胞（DMEM/10%血清/1%双抗）（双抗为青霉素和链霉素，购自上海生工，货号BS732），当细胞达到80%左右满度，处于对数生长期时被用于转染重组抗体质粒DNA。

转染步骤如下：（1）在1ml DMEM中加入20ul Lipofectamine 2000，用手指弹匀或枪头混匀，室温静置5分钟。（2）然后在1ml DMEM中加入10ug准备好转染用的质粒DNA，混匀。（3）将（1）和（2）混合（需要转到一个4ml离心管），混匀，室温静置20-30分钟（混合物需要在1小时内做完转染）；（4）在20-30分钟等待时间，将293T细胞培养基吸掉，加入5-8ml PBS洗涤细胞一遍（尽量除去残余PBS），然后加入8ml DMEM，备用；（5）将（3）的混合液加入（4）中，轻轻晃动培养瓶混匀，并置于培养箱中培养过夜。转染时间一般为8-16小时。

转染16小时后换新鲜的DMEM培养基（加入1%双抗防止染菌）。每两天收集一次培养上清，上清用3000rpm离心10分钟，收集上清，置于4℃（一星期内使用）或者-80℃（长期）保存。

上清中含有抗体H1-1、H1-2、H2-1、H1-V1或ChA21。

（二）CHO表达并纯化的ChA21嵌合抗体（ChA21-CHO）的方法：

CHO表达并纯化的ChA21嵌合抗体（ChA21-CHO）的方法与中国专利CN1613873中所述一致。

抗体ChA21与抗体ChA21-CHO的序列无差别，不同的是抗体ChA21是由293T细胞表达出来的，抗体ChA21-CHO是由CHO-GS工程细胞株表达出来的。

实施例4、ChA21抗体的人源化突变体的亲和活性的测定

一、相对亲和活性测定

选择ELISA法测抗体相对亲和活性。ELISA法测抗体相对亲和活性步骤如下：

兔抗人Fc多抗购自Sigma，产品目录号为A9544。

抗原GST-EPI的制备方法如下：

Ⅰ.GST-EPI质粒构建：

人工合成Her2胞外I-II区基因（SEQ ID NO：10）。将合成基因使用EcoR I（购自Promega,货号R6011）和Xho I（购自Promega,货号R6161）进行双酶切，连接到经同样酶切的pGEX/4T-1（购自GE Healthcare，货号27-4580-01）载体后，挑克隆双酶切鉴定后和测序鉴定，结果在pGEX/4T-1的EcoR I和Xho I酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO：10中第1-603位核苷酸所示，测序正确的克隆命名为pGEX/4T-1-EPI。

Ⅱ．GST－EP Ⅰ的原核表达与纯化

将pGEX/4T-1-EPI转化至Origami B感受态（购自novagen，货号71408-3），挑选阳性表达克隆。将阳性克隆进行扩大培养，待培养瓶中的菌液OD600值达到约0.6左右后，加入IPTG（购自Merch,货号420291-5GM）至终浓度为1mM进行诱导表达，16℃，220rpm继续培养20h；5000g，10min，4℃离心收菌，液压破碎后以16000g，20min，4℃离心收集裂解液上清；用GSTrap FF（购自GE Healthcare，货号17-5131-02）纯化裂解上清中GST－EP Ⅰ，脱盐后放于-80℃冻存备用。

1）确定瞬时转染的抗体突变体的表达量：兔抗人Fc多抗稀释于NaHCO₃水溶液中（终浓度约1ug/ml）铺ELISA板，4℃冰箱过夜或者37℃烘箱2-3小时；5%脱脂奶粉溶于TPBS，37℃封闭1小时；加入不同浓度稀释的标准抗体和各293T表达上清，室温震荡温育1小时。对标准抗体（ChA21-CHO）：将CHO表达并纯化的ChA21嵌合抗体（ChA21-CHO），先用DMEM培养基稀释到1ug/ml，然后用封闭剂依次稀释到100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78ng/ml，总共8个浓度，用作标准曲线；对表达上清：直接用封闭剂稀释10，40，160，640倍。加入1：2000稀释的羊抗人/HRP二抗，室温震荡温育1小时，OPD底物显色，硫酸终止。根据标准曲线，计算每个突变体抗体表达量。

2）测定人源化抗体突变体的相对亲和力：这里使用的抗原为GST-EPI，EPI即膜抗原ErbB2胞外Ⅰ/Ⅱ区，它包含了ChA21及其人源化突变体的识别表位，以GST融合蛋白形式表达的EPI可代替全抗原ErbB2用于抗体变异体的亲和力测定。GST-EPI（1mg/ml储液），以1：4000稀释于NaHCO₃水溶液中（终浓度约0.25ug/ml）铺ELISA板，4℃冰箱过夜或者37℃烘箱2-3小时；5%脱脂奶粉溶于TPBS，37℃封闭1小时；加入不同浓度稀释的标准抗体（ChA21-CHO）和突变体转染293T的表达上清，室温震荡温育1小时。标准抗体（ChA21-CHO）和突变体表达上清：用封闭剂稀释到1000，333，111，37，12.33，4.11，1.37，0.46ng/ml。加入1：2000稀释的羊抗人/HRP二抗，室温震荡温育1小时。OPD底物显色，硫酸终止。根据曲线计算每个突变体EC50值，原始标准抗体与突变体的EC50值的比值即为突变体的相对亲和力。

原始抗体和各人源突变体的抗原结合曲线如图9所示，以293T表达的原始ChA21嵌合抗体（抗体ChA21）活性作为对照，计算出人源化突变体H1-1、H1-V1、H1-2和H2-1的相对亲和力分别为0.95、0.92、0.93、0.4。结果表明以抗体huCC49为模板进行人源化改造获得的人源化突变体H1-1、H1-V1、H1-2基本维持了ChA21的抗原结合能力，而基于通用人化模板进行人源化改造获得的人源化突变体H2-1的抗原结合能力降低了一倍以上。该实验也表明在293T细胞表达的ChA21嵌合抗体（抗体ChA21）与在CHO-GS工程细胞株表达的抗体（抗体ChA21-CHO）具有相当的亲和力。

二、表面胞质团共振法测突变体H1-2的结合常数Kd

抗原Her2为Recombinant Human ErbB2/Fc Chimera，购自R and D Systems，货号1129-ER

利用Biacore 3000（Malmqvist M.（1999）BIACORE: an affinity biosensor systemfor characterization of biomolecular interactions. Biochem Soc Trans.Feb;27(2):335-40）测人源化抗体H1-2与抗原的绝对亲和力。选用CM-5传感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。两个流通池（pathway）均以15μl/min的流速活化6min，将2μg抗原Her2溶于50μl pH7.0的磷酸溶液，以10μl/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度约为10K Ru，抗原标记后再用1M乙醇胺将芯片表面封闭。结合条件：各检测抗体原液浓度为10mg/ml，依次稀释成200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12μg/ml，0μg/ml，以10μl/min的速度注入芯片的两个流通池，上样3min；解离条件：流速10μl/min，解离3min。芯片再生条件：10mM NaOH，1M NaCl。用Biacore evaluation软件分析抗体亲和常数KD。

经计算，H1-2抗体亲和常数KD=10^-8M。