CN102844442B - 用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型多肽和包含所述多肽的细胞。所述多肽和细胞用于鉴定和/或分离产生具有特定生物功能的蛋白质的细胞的方法中。具体地，所述方法可用于鉴定、选择和分离产生抗原特异性单克隆抗体的细胞。

Description

用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法

交叉参考相关申请

本申请要求保护2010年2月12日提交的美国临时申请No.61/304,251和2011年1月31日提交的美国临时申请No.61/437,889(将所述每一个临时申请通过引用整体并入本文)的优先权。

发明领域

本发明的领域总体上涉及新型多肽和包含所述多肽的细胞。本发明还涉及在鉴定和/或分离表达多肽的细胞的方法中使用所述多肽。所述方法可用于鉴定和分离产生抗原特异性单克隆抗体的细胞。

发明背景

自1970年代单克隆抗体技术发展以来，单克隆抗体已成为日益重要的治疗剂种类。杂交瘤技术仍然是用于生成单克隆抗体的最常用方法。单克隆抗体从通过将正常抗体生成B-细胞与永生化骨髓瘤细胞或其它永生化细胞融合产生的杂交瘤细胞分泌。单克隆抗体产生的过程通常包括几轮筛选上清液以鉴定生成结合目标抗原的抗体的杂交瘤。

生成针对目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤的鉴定通常通过ELISA筛选来完成。可筛选由来自杂交瘤文库的随机杂交瘤克隆的混合物生成的上清液。该方法具有局限性，因为其接着必须通过有限稀释阳性混合物(positive pool)以分离单个克隆，随后所有克隆需要进行再筛选。在一些情况下，通过作为生成非常大量单一克隆的第一步骤进行有限稀释来克隆杂交瘤文库，以进行筛选。包括有限稀释步骤的任何方法是有问题的，因为其是极其费时费力的。此外，在一些情况下，期望的克隆可代表杂交瘤文库的极低百分比，这使得稀少克隆的鉴定十分困难。此外，ELISA筛选法鉴定对单个抗原的结合活性。为了确定单克隆抗体是否结合超过一种抗原，必须利用不同的个别抗原进行多个连续ELISA筛选。

如果生成抗体的细胞以允许抗体生成细胞本身被直接鉴定的形式(例如，在细胞的表面上)保留抗体，则这是有利的。该策略是噬菌体展示技术一直如此成功的原因之一。事实上，正常B-细胞产生膜结合免疫球蛋白并且该分子是响应与抗原的结合发出信号的B-细胞受体复合物的核心组分。天然膜结合抗体的存在先前已被用于试图直接分离杂交瘤(参见，Parks等人1979，PNAS，76:1962-1966)。然而，极低水平的膜结合抗体限制了方法的使用。已开发了几个其它技术来进一步完成该目标。一个方法是“分泌捕获报告网(secretion capture report web)”(SCRW)，其将细胞封装在生物素化的琼脂糖微滴中，随后将微滴悬浮物与抗生物素蛋白和生物素化的抗-小鼠IgG继续温育。抗生物素蛋白用作生物素化的琼脂糖与生物素化的抗-小鼠抗体之间的桥梁以在微滴内形成捕获位点来捕获由细胞分泌的抗体。可筛选此类含抗体的微滴结合报道分子(例如，荧光标记的抗原)的能力并且可利用流式细胞术分离所述微滴。(参见，Kenney等人，1995，Nature Biotechnology 8:787-90；Gray等人，1995，J.Immunol.Methods 182:155-63)。其它方法基于瞬时捕获分泌的蛋白质或细胞表面上的抗体的能力。可通过报道分子(例如，荧光标记抗原)的结合检测细胞表面上的“捕获的”蛋白质或抗体并且例如通过流式细胞术(参见，例如，美国专利No.6,919,183和7,166,423；美国专利申请No.2010/0009866)进行分离。

此类技术的每一个技术具有局限性。琼脂糖微滴技术在技术上存在困难并且需要专门的设备来产生琼脂糖微滴。此外，细胞可能对封装过程敏感。细胞表面捕获法不能完全区分由目标杂交瘤细胞生成的抗体与由其它杂交瘤细胞生成的抗体。相邻细胞之间的目标抗体或蛋白质的扩散可以是个问题。例如，抗体可与与生成其的细胞上的捕获分子分离并且扩散至生成不同抗体的细胞并且被该细胞“捕获”。因此，在一些情况下，所述方法需要高度粘稠的培养基来减少蛋白质或抗体从表达细胞的扩散。此外，实际上，并非所有由杂交瘤生成的抗体都被捕获在细胞表面上，该过量抗体被分泌入培养基中，在培养基中其容易结合其它随机杂交瘤细胞上的捕获分子。因此，需要用于鉴定和选择生成抗原特异性单克隆抗体的细胞的新型和/或改进的方法。

发明概要

本发明描述了新型多肽和包含所述多肽的细胞以及使用所述多肽、细胞和细胞文库鉴定和/或分离生成所述多肽的细胞的方法。具体地，所述方法可用于鉴定和分离生成抗原特异性单克隆抗体的细胞。本发明提供了其中包含单个抗原结合位点的膜结合的异二聚体分子在细胞表面上表达的方法。单个抗原结合位点代表了由细胞生成的抗体的结合特异性。异二聚体分子不“结合”分泌的抗体，因此，对于由一个细胞生成的结合在或存在于另一个细胞的表面上的抗体问题有限或无问题。本文中描述的方法和构建体称为“膜-MAb”或“膜-MAb技术”和“膜-MAb构建体”。新型多肽构建体包含多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的二聚化结构域和跨膜区。在一些实施方案中，新型多肽构建体包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区和来自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，新型多肽构建体包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区和GPI(糖基磷酯酰肌醇)-膜锚着点。当细胞表达多肽和例如免疫球蛋白重链时，多肽缔合以生成包含在细胞表面上表达的单价抗体的异二聚体分子。异二聚体分子不是抗体结合蛋白，这样其不结合或捕获分泌的抗体。膜-MAb策略的非限定性实例描述于图1C中。可将这与常规杂交瘤技术(图1A)和表面捕获法的实例(图1B)相比较。

在一个方面，本发明提供了能够与第二多肽形成异二聚体分子的多肽，其中首先多肽是膜结合的并且异二聚体分子在细胞表面上表达。在一些实施方案中，多肽包含(a)含有二聚化结构域的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，二聚化结构域可包括但不限于Fc区域、免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链。在一些实施方案中，二聚化结构域可获自受体、整联蛋白或通常形成二聚化或多聚化结构的任何分子。二聚化结构域可获自例如免疫球蛋白、LFA-1、GPIIIb/IIIa)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白细胞介素-8(IL-8)、IL-8受体、血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、Fos、Jun、NFkB、Ras、Raf、CD4、Bcl-2、Myc和Met。

在一些实施方案中，多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含：(a)细胞外部分，其包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和(b)非-免疫球蛋白跨膜部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含铰链区、CH2和CH3结构域的至少一部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含Fc区域。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体或其亚型。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区来自IgG1或IgG2抗体。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区为小鼠免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区为人免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜部分包含来自免疫球蛋白或非-免疫球蛋白的跨膜结构域的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜部分来自人蛋白质。在某些实施方案中，跨膜部分来自小鼠蛋白质。在一些实施方案中，跨膜部分来自B-细胞免疫球蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分来自小鼠B-细胞免疫球蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分来自人B-细胞免疫球蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分来自选自：CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD19、T-细胞受体α链和β链、CD3、ζ链、ICAM1(CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b和CD2的蛋白质。在某些实施方案中，跨膜部分来自CD4蛋白。在某些实施方案中，跨膜部分来自小鼠CD4蛋白。在某些实施方案中，跨膜部分来自人CD4蛋白。在某些实施方案中，跨膜部分包含SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:16。在一些实施方案中，跨膜部分还包含细胞内结构域(ICD)。在一些实施方案中，跨膜部分包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含GPI-膜锚着点(membrane anchor)。在一些实施方案中，GPI-膜锚着点获自选自CD52、CD55、CD58和CD59的蛋白质。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含检测或“报道”分子。在一些实施方案中，检测或报道分子是荧光蛋白、生物发光蛋白或其变体。在某些实施方案中，检测或报道分子是绿色荧光蛋白(GFP)或其变体。

因此，在一些实施方案中，本发明的多肽包含IgG CH2CH3抗原和跨膜结构域。在某些实施方案中，多肽包含IgG CH2CH3恒定区、跨膜结构域和GFP。

在一些实施方案中，本发明的多肽是膜结合的并且免疫球蛋白重链恒定区在细胞表面上表达。在一些实施方案中，多肽不包含免疫球蛋白重链可变区。在某些实施方案中，多肽不包含抗原结合位点。在一些实施方案中，多肽能够与第二多肽形成异二聚体分子。在某些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白Fc区域。在某些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，第二多肽还包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，多肽能够与第二多肽形成至少一个二硫键。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:28。在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:26。在某些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQID NO:29的序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的序列编码。在一些实施方案中，宿主细胞表达本文中描述的多肽的任何多肽。在一些实施方案中，宿主细胞产生本文中描述的多肽的任何多肽。

在另一个方面，本发明提供了异二聚体多肽分子。在一些实施方案中，异二聚体多肽分子包含(a)第一多肽，其包含(i)含有二聚化结构域的细胞外部分和(ii)跨膜部分，和(b)第二多肽，其包含二聚化结构域。在一些实施方案中，异二聚体分子包含含有免疫球蛋白重链的第一多肽。在一些实施方案中，异二聚体分子包含含有免疫球蛋白重链的第二多肽。在一些实施方案中，第二多肽还包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，第一多肽与第二多肽形成至少一个二硫键。

在另一个方面，本发明提供了包含本文中描述的多肽的任何多肽的抗体分子。在一些实施方案中，抗体分子为异二聚体分子。在某些实施方案中，抗体分子还包含：(a)免疫球蛋白重链和(b)免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，抗体分子还包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，抗体分子的多肽与免疫球蛋白重链-轻链对的Fc区域形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，抗体分子包含单个抗原结合位点(例如，为单价的)。

在一个方面，本发明提供了编码本文中描述的任何多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:l1或SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，载体包含多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸或载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文中描述的任何多肽或抗体分子。

在一个方面，本发明提供了宿主细胞和生成包含本文中描述的多肽的宿主细胞的方法。在一些实施方案中，生成宿主细胞的方法包括用编码多肽的多核苷酸转染细胞，所述多肽包含：(a)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分，和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，转染的细胞表达多肽。在一些实施方案中，瞬时转染细胞。在其它实施方案中，稳定地转染细胞。在一些实施方案中，方法还包括检测多肽的表达。在一些实施方案中，方法还包括检测多肽在细胞表面上的表达。在其它实施方案中，方法还包括分离在细胞表面上表达多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞(例如，人或小鼠细胞)。在一些实施方案中，细胞为融合伴侣细胞系。

在一些实施方案中，本发明提供了通过本文中描述的方法生成的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞包含编码本文中描述的多肽的任一多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，细胞包含本文中描述的多肽的任一多肽。在某些实施方案中，细胞表达多肽，其中多肽包含：(a)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分，和(b)跨膜部分。

在另一个方面，本发明的细胞可用于生成膜结合的异二聚体分子。在一些实施方案中，细胞包含：(a)编码膜结合的多肽的多核苷酸，所述多肽包含：(i)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分，和(ii)跨膜部分；和(b)至少一种额外的多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种额外的多肽，在一些实施方案中，所述额外的多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，额外的多肽包含Fc结构域。在一些实施方案中，额外的多肽包含免疫球蛋白重链和/或轻链。在一些实施方案中，额外的多肽包含抗体。在一些实施方案中，额外的多肽包含单链抗体。在一些实施方案中，至少一种额外的多肽包含随机化的多肽。在一些实施方案中，至少一种额外的多肽包含随机化的多肽。在一些实施方案中，至少一种额外的多肽包含多肽的文库。在一些实施方案中，从细胞分泌额外的多肽。在其它实施方案中，膜结合多肽与额外的多肽形成至少一个二硫键以形成膜结合的异二聚体分子。

在一个方面，本发明提供了生成在细胞表面上表达膜结合的异二聚体分子的杂交瘤细胞的方法。在一些实施方案中，生成杂交瘤细胞的方法包括将细胞与抗体生成细胞融合，其中所述细胞包含编码膜结合多肽的多核苷酸，所述多肽包含：(a)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分，和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，融合杂交瘤细胞在细胞表面上表达异二聚体抗体分子。在一些实施方案中，抗体生成细胞是抗体生成细胞群体。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自首次接触实验的动物。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自免疫动物。在一些实施方案中，抗体生成细胞包括但不限于B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤和重组细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞包含多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种多肽。在一些实施方案中，多种多肽包含免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，多种多肽包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，多种多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，多种多肽包含随机化的多肽文库。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物产生DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，DNA文库为cDNA文库。在一些实施方案中，融合细胞包含表达多种异二聚体抗体分子的杂交瘤细胞群体。

在一个方面，本发明提供了通过本文中提供的方法的任一方法制备的杂交瘤或杂交瘤文库。

在另一个方面，本发明提供了细胞文库和生成包含本文中描述的多肽的细胞文库的方法。在一些实施方案中，生成细胞文库的方法包括用多种多核苷酸转染细胞，其中所述细胞包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，转染的细胞在多种转染的细胞的表面上表达异二聚体分子。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种多肽。在一些实施方案中，多种多肽的每一种多肽包含免疫球蛋白Fc区域。在一些实施方案中，多种多肽包含多种随机化的多肽。在一些实施方案中，多种多肽的每一种多肽包含：(a)免疫球蛋白Fc区域和(b)随机化的多肽。在其它实施方案中，多种多肽包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链。在其它实施方案中，多种多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在其它实施方案中，DNA文库编码多种随机化的多肽。在其它实施方案中，DNA文库编码多种多肽，其中每一种多肽包含：(a)免疫球蛋白Fc区域和(b)随机化的多肽。

在一个方面，本发明提供了通过本文中描述的方法的任一方法制备的细胞文库。

在另一个方面，本发明提供了鉴定生成特异性抗体的细胞的方法。在一些实施方案中，鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括将细胞与抗体生成细胞融合以生成杂交瘤细胞群体，其中所述细胞包含多肽，所述多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，杂交瘤细胞在细胞表面上表达异二聚体分子。在一些实施方案中，方法包括将杂交瘤细胞的群体与检测分子(例如，目标靶)接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的杂交瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自首次接触实验的动物。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自免疫动物。在一些实施方案中，抗体生成细胞为人细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为小鼠细胞。在某些实施方案中，抗体生成细胞为B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤或重组细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞包含多种多肽。在一些实施方案中，抗体生成细胞包含多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种多肽，所述多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在其它实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。

在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体或其亚型。

在一些实施方案中，检测分子(例如，目标靶)为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，标记检测分子。在某些实施方案中，利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选术(FACS)分离被检测分子结合的细胞。

在一些实施方案中，鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括用至少一种多核苷酸转染细胞，其中所述细胞包含多肽，所述多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，转染的细胞在细胞表面上表达异二聚体分子。在一些实施方案中，方法包括将转染的细胞与检测分子(例如，目标靶)接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸包含多种多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的多肽。在其它实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。

在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体或其亚型的多肽。

在一些实施方案中，检测分子(例如，目标靶)为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，标记检测分子。在某些实施方案中，利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，通过FACS分离被检测分子结合的细胞。

在一些实施方案中，用于鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括用编码多肽的多核苷酸转染细胞文库，所述多肽包含(a)含有免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分，其中细胞文库包含抗体生成细胞。在一些实施方案中，转染的细胞在细胞表面上表达异二聚体分子。在一些实施方案中，方法包括将转染的细胞与检测分子(例如，目标靶)接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，细胞文库为杂交瘤文库。在一些实施方案中，细胞文库包括来自首次接触实验的动物的细胞。在一些实施方案中，细胞文库包含来自免疫动物的细胞。在一些实施方案中，细胞文库包含人细胞。在一些实施方案中，细胞文库包含小鼠细胞。在某些实施方案中，细胞文库包含B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤或重组细胞。在一些实施方案中，细胞文库包含多种多肽。在一些实施方案中，细胞文库包含多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的多肽。在其它实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。

在一些实施方案中，由细胞文库制备的抗体为重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，由细胞文库制备的抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体或其亚型。

在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，标记检测分子。在某些实施方案中，利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，通过FACS分离被检测分子结合的细胞。

在一个方面，本发明提供了细胞文库，每一个细胞包含：(a)包含本文中描述的膜结合多肽的任一种的第一多肽，和(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽。在一些实施方案中，两种多肽能够形成异二聚体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子在细胞表面上表达。在一些实施方案中，每一个细胞还包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，异二聚体分子包含单个抗原结合位点。

在一些实施方案中，本发明提供了细胞文库，每一个细胞包含：(a)包含本文中描述的膜结合多肽的任一种的第一多肽和(b)包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区的第二多肽。在一些实施方案中，两种多肽能够形成异二聚体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子在细胞表面上表达。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白Fc区域。在一些实施方案中，第二多肽包含：(a)免疫球蛋白Fc区域和(b)随机化的多肽。在一些实施方案中，第二多肽包含：(a)能够形成二硫键的区域和(b)随机化的多肽。在一些实施方案中，第二多肽包含：(a)能够形成二硫键的区域和(b)诱变产生的多肽。

在另一个方面，本发明提供了用于筛选本文中描述的细胞文库的任一文库的方法。在一些实施方案中，筛选细胞文库的方法包括将细胞文库与检测分子(例如，目标靶)接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，检测分子为小分子化合物。在某些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，利用流式细胞术鉴定细胞。在某些实施方案中，通过FACS分离细胞。

在另一个方面，本发明提供了筛选抗体的方法。在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括将本文中描述的细胞或细胞文库与检测分子(例如，目标靶)接触。在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括从被检测分子鉴定的细胞分离抗体。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，检测分子为小分子化合物。在某些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，利用流式细胞术鉴定细胞。在某些实施方案中，通过FACS分离细胞。

在另一个方面，本发明提供了通过本文中描述的方法的任一方法生成、鉴定和/或分离的抗体。

附图简述

图1.与其它杂交瘤策略相比较的膜-MAb技术的示意图。图1A描述了显示从杂交瘤分泌的单克隆抗体的典型杂交瘤。图1B描述了在其细胞表面上表达抗体结合蛋白或“捕获蛋白”(例如，Fc受体或蛋白A)的杂交瘤。示意图显示单克隆抗体从杂交瘤分泌。然而，杂交瘤在细胞表面上具有抗体结合蛋白，其可结合抗体，即由细胞分泌的抗体而且还结合由其它细胞生成的抗体。图1C描述了膜-MAb策略的一个非限定性实施方案。杂交瘤表达包含与免疫球蛋白重链-轻链对共价缔合的膜结合多肽的异二聚体分子。免疫球蛋白重链-轻链对形成代表由细胞生成的单克隆抗体的单个抗原结合位点。

图2.用于融合的表达膜-MAb多肽的细胞的产生。用膜-MAb(mIgG1)构建体稳定地转染鼠杂交瘤融合伴侣细胞系SP2/0-Ag14。所得的细胞系命名为SP2/0-MT。图2A显示使用同种型阴性对照抗体(左图框)和抗-FLAG抗体(右图框)进行的膜-MAb(mIgG1)构建体在SP2/0-MT细胞上的细胞表面表达的流式细胞术的结果。膜-MAb(mIgG1)构建体具有允许多肽被抗-FLAG抗体检测的FLAG标签。图2B显示膜-MAb(mIgG1)构建体在SP2/0-MT细胞系的5个亚克隆上的细胞表面表达的流式细胞术的结果。

图3.膜-MAb技术用于鉴定生成结合多个靶的抗体的杂交瘤的用途。显示的是通过SP-2/0细胞与从用鼠FZD5和FZD8免疫的小鼠分离的细胞融合制备的膜-MAb杂交瘤文库的流式细胞术曲线(flow cytometry plot)。将细胞与标记的FZD5和FZD8蛋白一起温育，然后进行分析。用Alexa Fluor 488标记重组FZD5蛋白并且用AlexaFluor 647标记重组FZD8蛋白。鉴定展示与FZD5和FZD8的结合的杂交瘤细胞。(在加框的区域中，标记“FZD5/8DP”；DP=双重阳性)。

图4.膜-MAb技术用于鉴定生成针对DDR2的抗体的细胞的用途。显示的是通过将膜-MAb(mIgG1)构建体转染入现有DDR2杂交瘤文库制备的膜-MAb杂交瘤文库的流式细胞术曲线。用标记的DD2蛋白和抗-FLAG抗体温育细胞，然后进行分析。重组DDR2蛋白用Alexa Fluor 488来标记并且抗-FLAG抗体用藻红蛋白(PE)来标记。在加框的区域中，标记的“DDR2Pos”为展示与DDR2和抗-FLAG抗体结合的杂交瘤细胞。

图5.293-hMT稳定克隆的流式细胞术分析。用膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体稳定地转染HEK-293细胞。筛选14个克隆的GFP表达。

图6.使用膜-MAb构建体进行的基于细胞的抗体展示的示意图。图6A描述了膜-MAb(hIgG2)和膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体。图6B描述了在本文中称为MAbLib构建体的单链抗体载体。为了帮助产生抗体文库，通过唯一限制性位点侧翼连接重链可变区和轻链可变区。图6C描述了在HEK-293细胞表面上表达的膜-MAb(hIgG2)-GFP分子。图6D描述了HEK-293细胞的表面上的异二聚体分子的非限定性实施方案。异二聚体分子为与单链抗体分子结合的膜-MAb(hIgG2)-GFP蛋白。

图7.异二聚体抗体分子在HEK-293细胞表面上表达的分析。将不同浓度的抗-DLL4抗体sc21M18质粒DNA用于与膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体(-X-)组合转染HEK-293细胞。对照为未转染细胞(-◆-)、仅用sc21M18 DNA转染的细胞(-▲-)和仅用膜-MAb(hIgG2)-GFP DNA转染的细胞(-■-)。将细胞温育48小时，收获，然后通过FACS利用抗体特异性抗原(hDLL4-Fc)进行筛选。结果显示为平均荧光强度(MFI)。

图8.使用载体质粒调节抗体分子的展示的分析。以不同的比率将抗-DLL4抗体质粒DNA与过量无关抗体质粒DNA(sc 18R5)混合，将其用于转染HEK-293细胞。将细胞温育48小时，收获，然后通过FACS筛选。为了筛选细胞表面上的抗-DLL4抗体，将hDLL4-rFc用作抗原(-◆-)，将hJag-rFc蛋白用作对照(-■-)。结合的抗原利用PE-标记的抗-兔Fc抗体来检测，并且也可单独用作对照(-▲-)。通过FACS测定在表面上表达抗-DLL4抗体的细胞的百分比。

图9.表达抗-DLL4抗体的细胞的选择和富集。用比率为1∶100,000(sc21M18∶sc18R5)的抗-DLL4抗体质粒DNA与无关抗体质粒DNA的混合物转染HEK-293细胞。将细胞经历4轮分选，在每一轮上通过FACS测定在表面上表达抗-DLL4抗体的细胞的百分比。

详细描述

本发明提供新型膜结合多肽，包括能够在细胞表面上形成异二聚体分子的多肽。还提供了相关多肽和多核苷酸以及包含所述多肽和多核苷酸的细胞和细胞文库。还提供了生成包含多肽的宿主细胞和使用此类细胞鉴定和分离特定单个细胞的方法。还提供了由细胞生成的抗体或通过方法生成、分离和/或鉴定的抗体。

产生包含编码新型膜结合多肽包括膜-MAb(mIgG1)、膜-MAb(hIgG2)和膜-MAb(hIgG2)-GFP的核苷酸的构建体(实施例1)。生成表达新型膜结合多肽的细胞。通过将膜-MAb(mIgG1)构建体转染入SP2/0-Ag14细胞、鼠融合伴侣细胞系产生细胞系SP2/0-MT(实施例2)。通过将膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体转染入HEK-293细胞、人胚胎肾来源的细胞系来产生细胞系293-hMT(实施例5)。将SP2/0-MT细胞用于与来自免疫动物的细胞融合以生成在细胞表面上表达异二聚体抗体分子的杂交瘤文库。将此类膜结合的抗体分子用于检测和分离生成特异性结合靶抗原的抗体的细胞(实施例3)。将编码新型多肽膜-Mab(mIgG1)的多核苷酸转染入已建立的杂交瘤文库，所得的细胞经显示在它们的表面上表达异二聚体抗体分子。将膜结合的抗体分子用于检测和分离产生特异性结合靶抗原的抗体的细胞(实施例4)。通过使用杂交瘤融合法和转染法，膜-MAb技术导致与随机选择的克隆(0.6%和8%阳性)相比较分离的抗原特异性阳性克隆的百分比的显著增加(91%和84%阳性)。将膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体转染入具有编码抗-DLL4抗体的DNA的HEK-293细胞。利用流式细胞术的分析显示异二聚体分子存在于结合DLL4抗原的转染的细胞的表面上(实施例7)。使用膜MAb技术进行的验证研究显示可从其中大量过表达不同抗体的细胞群体中选择出表达包含抗-DLL4抗体的异二聚体分子的细胞(实施例9)。

I.定义

为了帮助理解本发明，下面定义了许多术语和短语。

如本文中所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点或抗原结合位点识别并且特异性结合靶例如蛋白质、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或上述物质的组合。如本文中所用，术语“抗体”包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、以其整体包括免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白、多特异性抗体例如从至少两个完整抗体产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原识别位点的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体展示期望的生物活性。此外，术语“抗体”包括只具有一个结合位点的单价抗体分子。抗体可以是5大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)的任一种，这基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的它们的重链恒定结构域的同一性。

如本文中所用，术语“Fc区域”是指免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区域”可以是天然序列Fc区域或变异Fc区域。虽然免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可变化，但免疫球蛋白的Fc区域通常包含两个恒定结构域CH2和CH3和至少一部分铰链区。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。

术语抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区和抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为“高可变区”)连接的4个构架区组成。每一条链中的CDR与来自另一条链的CDR通过构架区紧密地保持在一起，促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两个用于确定CDR的技术：(1)基于种间序列变异性的方法(即，Kabat等人，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda Md.)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-Lazikani等人，1997，J.Molec.Biol.273:927-948)。此外，这两种技术的组合可在本领域中用于确定CDR。

术语“单克隆抗体”是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的均一抗体群体。这与通常包括针对不同抗原决定簇的多种抗体的混合物的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段)、scFv变体、包含抗体部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。“单克隆抗体”是指利用许多技术制备的此类抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤生成、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。

术语“人源化抗体”是指为包含最小非人(例如，鼠)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白、或其片段的非人(例如，鼠)抗体的形式。

术语“人抗体”是指由人生成的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有相应于由人生成的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链多肽和人重链多肽的抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。通常地，轻链和重链的可变区相应于来源于哺乳动物的一个物种(例如，小鼠、大鼠、兔)的抗体的可变区，所述抗体具有期望的特异性、亲和力和/或能力同时恒定区与来源于另一物种(通常人)的抗体的序列同源以避免在该物中引发免疫反应。

术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，是指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位可从连续氨基酸(通常称为“线性表位”)形成以及从通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常称为“构象表位”)形成。从连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时得到保持，然而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性时通常失去。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更常见地至少5个或8-10个氨基酸。

如本文中所用，术语“非免疫球蛋白”是指不为抗体免疫球蛋白链的多肽。如本文中所用，“非免疫球蛋白”包括免疫球蛋白超家族的其它成员。

术语“特异性结合”和“特异结合”意指结合剂或抗体更频繁地、更快速地、以更长的持续时间、以更大的亲和力或以上述方面的一些组合与表位或蛋白质(与可选择的物质(包括无关蛋白质)相比较)反应或缔合。在某些实施方案中，“特异性结合”意指例如抗体以约0.1mM或更小，但更常见地小于约1μM的K_D结合蛋白质。在某些实施方案中，“特异性结合”意指抗体以至少约0.1μM或更小，至少约0.01μM或更小，或至少约1nM或更小的K_D结合蛋白质。由于不种物种的同源蛋白质之间的序列同一性，特异结合可包括识别超过一个物种(例如，小鼠FZD和人FZD)的特定蛋白质的抗体。同样地，由于不同蛋白质之间在多肽序列的某些区域中的同源性，因此特异性结合可包括识别超过一种蛋白质(例如，人FZD5和人FZD8)的抗体(或其它多肽或试剂)。应理解，特异性结合第一靶的抗体或结合部分可以特异性或可以非特异性结合第二靶。这样，“特异性结合”不一定需要(虽然其可包括)唯一结合，即结合单个靶。因此，在某些实施方案中，抗体可特异性结合超过一个靶。在某些实施方案中，多个靶可被抗体上的相同抗原结合位点结合。例如，在某些情况下，抗体可包含两个相同的抗原结合位点，其每一个位点特异性结合两种或更多种蛋白质上的相同表位。一般地，但不一定地，结合意指特异性结合。

术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分枝的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。所述术语还包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如利用标记组分的缀合。还包括在该定义内的是例如包含一个或多个氨基酸的类似物(包括，例如非天然氨基酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应理解，因为至少一些本发明的多肽基于抗体，所以在某些实施方案中，多肽可以以单链或缔合的链存在。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用并且是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可被DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，可在多核苷酸的装配之前或之后，赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸还可在装配之后被进一步修饰(例如通过与标记组分缀合)。

“高严格度的条件“可由下列方面来鉴定：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如，在50℃下，0.015M氯化钠/0.0015M醋酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂例如甲酰胺，例如，在42℃下，50%(v/v)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%蔗聚糖(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下，使用50%甲酰胺，5x SSC(0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖，在42℃下于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中洗涤，然后在55℃下进行高严格度洗涤(由包含EDTA的0.1x SSC组成)。

在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或“百分比同一性”是指为相同的或具有相同的指定百分比的核苷酸或氨基酸残基(当就最大对应比较和对齐(必要时引入缺口)时)而不将任何保守氨基酸置换当作序列同一性的部分的两个或更多个序列或子序列。可使用序列比较软件或算法或通过目测测量“同一性%”。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件对于本领域技术人员来说是公知的。此类软件或算法包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit和GCG程序。在一些实施方案中，本发明的两个核酸或多肽是大体上同一的，意指当就最大对应性进行比较和对齐时，它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%以及在一些实施方案中至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过目测测量的。在一些实施方案中，同一性存在于在长度上为至少约10、至少约20、至少约40-60、至少约60-80个残基或其间任何整数值的残基的序列的区域范围内。在一些实施方案中，同一性存在于超过60-80个残基，例如至少约90-100个残基的更长区域范围内，在一些实施方案中，序列在待比较的序列例如核苷酸序列的编码区的全长范围内大体上同一。

“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基用另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的置换。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝酰酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对酪氨酸的置换被认为是保守置换。优选地，本发明的多肽或抗体的序列中的保守置换不消除包含所述氨基酸序列的多肽或抗体对抗原(即，所述多肽或抗体结合的一种或多种蛋白)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域中是公知的。

术语“载体”是指能够递送和优选在宿主细胞中表达一个或多个基因或目标序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体以及封装在脂质体中的DNA或RNA表达载体。

如本文中所用，术语“转染”用于指细胞对外源DNA的摄取。当外源DNA已被引入细胞膜内侧时，细胞已被“转染”。

作为“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为以未在自然界中发现的形式存在的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化至它们不再以其中它们在自然界中被发现的形式存在的程度的所述物质。在一些实施方案中，作为分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是大体上纯的。

如本文中所用，“大体上纯的”是指具有至少50%的纯度(例如，不含污染物)，更优选至少90%的纯度，更优选至少95%的纯度，更优选至少98%的纯度，更优选至少99%的纯度的材料。

如本文中所用，“动物”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、其它啮齿类动物、兔、山羊、犬科动物、猫科动物、非人灵长类动物、人等。

如在短语例如“A和/或B”中使用的，术语“和/或”在本文中意指包括A和B；A或B；A(单独的)和B(单独的)。

如本公开内容和权利要求中所用，除非上下文中另外明确地指出，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数形式。

应理解，还提供了用语言“包含”根据术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外的类似实施方案来在本文中描述无论任何地方的实施方案。

II.多肽和多核苷酸

本发明提供了为膜结合的并且包含在细胞表面上表达的细胞外部分的新型多肽。在一些实施方案中，多肽包含：(a)包含二聚化结构域的细胞外部分和(b)跨膜部分。如本文中所用，二聚化结构域是可帮助两个多肽之间相互作用的任何结构域。适当的二聚化结构域包括具有两亲性α螺旋的蛋白质的二聚化结构域，其中疏水性残基有规律地间隔并且允许通过每一个蛋白质的疏水性残基的相互作用形成二聚体。适当的二聚化结构域包括具有半胱氨酸残基的蛋白质的二聚化结构域，其允许通过二硫键的形成来形成二聚体。二聚化结构域可包括但不限于免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链、异亮氨酸拉链和GCN4拉链。在一些实施方案中，多肽包含：(a)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含：(a)含有二聚化结构域的细胞外部分和(b)GPI锚定的部分。在一些实施方案中，多肽包含：(a)包含免疫球蛋白重链恒定区的细胞外部分和(b)GPI锚定的部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含至少一个选自CH2、CH3和/或CH4的恒定结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含铰链区的至少一部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含铰链区、CH2和CH3。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区包含Fc区域。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区获自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM抗体或其亚型。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区获自IgG1或IgG2。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区获自IgG2。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区获自人免疫球蛋白重链区域。在其它实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区获自小鼠免疫球蛋白重链恒定区。

在一些实施方案中，多肽不包含抗体可变区。在一些实施方案中，多肽不具有抗原结合位点。

多肽至少部分地通过多肽的跨膜部分或GPI-膜锚着点锚定在细胞膜中。在一些实施方案中，跨膜部分获自I型跨膜蛋白。I型跨膜蛋白以使它们的N端在膜的外侧的方式定位。I型跨膜蛋白可以是单通过的，意指它们仅穿过膜1次，或多通过的，意指它们可穿过膜数次。跨膜部分可获自多种来源，包括但不限于免疫球蛋白和非免疫球蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分获自作为免疫球蛋白超家族的部分的蛋白质，包括但不限于CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD19、T-细胞受体α链和β链、CD3、ζ链、ICAM1(CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b和CD2。在一些实施方案中，跨膜部分获自人蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分获自鼠蛋白。在一些实施方案中，跨膜部分获自人CD4。

在一些实施方案中，多肽还包含至少一部分细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域获自与跨膜部分所获自的蛋白质相同的蛋白质。在一些实施方案中，细胞内结构域获自与跨膜部分所获自的蛋白质不同的蛋白质。在一些实施方案中，修饰细胞内结构域。在一些实施方案中，修饰细胞内结构域以便除去或使结构域的正常功能失活。修饰可包括但不限于：蛋白质结合位点的去除、活化位点的去除或抑制以及磷酸化位点的去除或抑制。在一些实施方案中，多肽包含来自人CD4的跨膜和细胞内结构域区域。在其它实施方案中，多肽包含来自人CD4的跨膜和细胞内结构域，其中细胞内结构域已被修饰。在一些实施方案中，细胞内结构域已被修饰除去了lck蛋白结合位点。

在一些实施方案中，跨膜部分或具有细胞内结构域的跨膜部分选自：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，具有细胞内结构域的跨膜部分为SEQ ID NO:15。

在一些实施方案中，多肽通过GPI-膜锚着点被锚定至细胞膜。在一些实施方案中，多肽被其中从前肽切除了典型的疏水性C末端氨基酸残基的GPI连接锚定至细胞膜，并且多肽的C末端被共价连接至糖基磷脂酰肌醇。GPI的疏水性脂质部分在细胞膜上保留多肽。在一些实施方案中，负责GPI连接的分子的疏水性C末端部分获自CD52、CD55、CD58、CD59和其它相似蛋白质。

本发明的多肽是膜结合的并且包含在细胞表面上表达的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，多肽能够与第二多肽缔合以形成异二聚体分子。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链作为单链分子。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链与免疫球蛋白重链缔合。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白重链-轻链对。如本文中所用，“免疫球蛋白重链-轻链对”包括在一个多肽中含有免疫球蛋白重和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链-轻链对包含单个抗原结合位点。在一些实施方案中，膜结合多肽与免疫球蛋白重链-轻链对结合以形成异二聚体抗体分子，其中异二聚体抗体分子包含一个单个抗原结合位点。在一些实施方案中，异二聚体抗体分子为单价抗体。

本发明的多肽可通过许多方式(包括但不限于非共价结合或共价结合)与第二多肽结合。在一些实施方案中，多肽通过非共价键例如离子键与第二多肽结合。在一些实施方案中，多肽与第二多肽通过共价键例如二硫键结合。在一些实施方案中，多肽能够与第二多肽形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，多肽与第二多肽形成一个二硫键。在其它实施方案中，多肽与第二多肽形成两个二硫键。在其它实施方案中，多肽与第二多肽形成3或4个二硫键。在其它实施方案中，多肽能够与免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白重链恒定区形成至少一个二硫键来形成异二聚体抗体分子。

在一些实施方案中，本发明的多肽能够与第二多肽形成二硫键来形成异二聚体分子。根据它们的设计，多肽通常不能与已作为异二聚体或同二聚体分子的部分的多肽形成二硫键。多肽通常不能与分泌的抗体分子形成二硫键。在一些实施方案中，多肽不结合分泌的抗体。在一些实施方案中，包含本发明的多肽的异二聚体分子不结合抗体。在某些实施方案中，包含本发明的异二聚体分子不结合分泌的抗体。

在一些实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含：(a)包含CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区；和(b)跨膜部分。在某些实施方案中，多肽包含：(a)包含CH2和CH3的人IgG2重链恒定区；和(b)人CD4跨膜部分。在某些实施方案中，多肽包含：(a)包含CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区；(b)跨膜部分；和(c)荧光分子。在某些实施方案中，多肽包含：(a)包含CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区；(b)CD4跨膜部分；和(c)荧光分子。在某些实施方案中，多肽包含：(a)包含CH2和CH3的人IgG2重链恒定区；(b)人CD4跨膜部分；和(c)荧光分子。在某些实施方案中，荧光分子为GFP。

在一些实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含：(a)包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的免疫球蛋白重链恒定区；和(b)包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQID NO:2的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:16的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:2的免疫球蛋白重链恒定区和包含SEQ ID NO:17的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:2的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:13的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ IDNO:2的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ ID NO:15的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:4的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:16的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:4的免疫球蛋白重链恒定区和SEQED NO:17的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:4的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:13的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ D NO:4的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ ED NO:15的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:6的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ED NO:16的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:6的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ ID NO:17的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ED NO:6的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:13的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ED NO:6的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ ID NO:15的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:8的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ED NO:16的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ED NO:8的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ ED NO:17的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ID NO:8的免疫球蛋白重链恒定区和含有SEQ ID NO:13的跨膜部分。在一些实施方案中，多肽包含含有SEQ ED NO:8的免疫球蛋白重链恒定区和SEQ IDNO:15的跨膜部分。

在一些实施方案中，本发明提供了包含如下序列的多肽：与SEQ ID NO:2、SEQED NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ED NO:8具有至少约80%序列同一性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽具有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ED NO:8具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列，和与SEQ ED NO:13、SEQ ED NO:14、SEQ ED NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ED NO:17具有至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约95%同一性的氨基酸序列和与SEQED NO:14或SEQ ED NO:15具有至少约95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少约95%同一性的氨基酸序列和与SEQ ED NO:14或SEQ ID NO:15具有至少约95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少约95%同一性的氨基酸序列和与SEQ ED NO:14或SEQ ID NO:15具有至少约95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少约95%同一性的氨基酸序列和与SEQ ED NO:14或SEQ IDNO:15具有至少约95%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:28具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:28具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:28的多肽。

本发明的多肽包含指导蛋白质的运输的信号序列。信号序列(也称为信号肽或前导序列)位于新生多肽的N端。它们将多肽靶向内质网并且蛋白质被分选至它们的目标地，例如分选至细胞器的内部空间，分选至内膜，分选至细胞的外膜，或通过分泌分选至细胞外部。大多数信号序列在蛋白质被运输至内质网后被信号肽酶从蛋白质切除。信号序列从多肽的切除通常在氨基酸序列的特定位点发生，并且取决于信号序列内的氨基酸残基。虽然通常存在一个特定的切割位点，但超过一个切割位点可被信号肽酶识别和/或使用，从而导致多肽的非均一N端。例如，信号序列内的不同切割位点的使用可导致表达的多肽具有不同的N末端氨基酸。因此，在一些实施方案中，本文中描述的多肽可包含具有不同N末端的多肽的混合物。在一些实施方案中，N末端在长度上相异1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中，多肽是大体上均一的，即多肽具有相同的N末端。在一些实施方案中，多肽的信号序列包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸置换和/或缺失。在一些实施方案中，多肽的信号序列包含允许一个切割位点占优势，从而导致大体上均一的具有一个N末端的多肽的氨基酸置换和/或缺失。可用于预测信号肽酶的切割位点的各种算法和软件在本领域内是已知的并且是可公共获得的(例如，SignalP软件)。

在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(在信号肽切割之前)包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26。

在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ED NO:32。在一些实施方案中，多肽基本上由SEQ ID NO:32组成。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，多肽基本上由SEQ ID NO:30组成。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，多肽基本上由SEQ ID NO:31组成。“基本上由某些氨基酸组成”的或为基本上由某些氨基酸组成的多肽在一些实施方案中可包括一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)额外的氨基酸，只要额外的氨基酸实质上不影响多肽的功能。“基本上由某些氨基酸组成”的或为基本上由某些氨基酸组成的多肽在一些实施方案中可减少一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)氨基酸，只要失去的氨基酸实质上不影响多肽的功能。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本文中描述的多肽的任何多肽的抗体分子。在一些实施方案中，抗体分子还包含含有免疫球蛋白重链的第二多肽。在一些实施方案中，抗体分子还包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，抗体分子还包含含有具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的第二多肽。在某些实施方案中，抗体包含单个抗体结合位点(即，单价抗体)。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本文中描述的多肽的任何多肽的异二聚体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子还包含含有二聚化结构域的第二多肽。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在某些实施方案中，异二聚体分子包含单个抗体结合位点(即，单价抗体)。在某些实施方案中，本发明提供了异二聚体分子，其包含：(a)第一多肽，其包含含有二聚化结构域的细胞外部分和跨膜部分，和(b)包含二聚化结构域的第二多肽。在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域相同。在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域不同。

在一些实施方案中，异二聚体分子包含(a)第一多肽，其包含(i)含有第一二聚化结构域的细胞外部分；和(ii)跨膜部分；和(b)包含第二二聚化结构域的第二多肽。在一些实施方案中，异二聚体分子包含为免疫球蛋白恒定区的第一二聚化结构域。在一些实施方案中，异二聚体分子包含为免疫球蛋白重链恒定区的第一二聚化结构域。在一些实施方案中，异二聚体分子包含为免疫球蛋白恒定区的第二二聚化结构域。在一些实施方案中，异二聚体分子包含为免疫球蛋白重链恒定区的第二二聚化结构域。在某些实施方案中，异二聚体分子包含含有本文中描述的多肽的任何多肽的第一多肽。

本文中描述的多肽可通过本领域已知的任何适当的方法生成。此类方法范围从直接蛋白质合成法至构建编码多肽序列的DNA序列和在适当的宿主中表达此类序列。在一些实施方案中，使用重组技术，通过分离或合成编码野生型目标蛋白的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可通过定点诱变来诱变序列以提供其功能变体。

在一些实施方案中，编码目标多肽的DNA序列可使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建。可基于期望的多肽的氨基酸序列和通过选择其中将生成目标重组多肽的宿主细胞偏爱的密码子来设计寡核苷酸。可将标准方法用于合成编码目标多肽的多核苷酸序列。例如，可将完全氨基酸序列用于构建回译(back-translated)基因。在一些实施方案中，可合成含有编码特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成几个编码期望的多肽的部分的小寡核苷酸，随后将其连接。单个寡核苷酸通常包含5'或3'悬突以用于互补装配。

当装配(通过重组技术、化学合成或另一种方法)时，可将编码特定目标多肽的多核苷酸序列插入表达载体并且有效地连接于适合用于在期望的宿主中表达多肽的表达控制序列。适当的装配可通过核苷酸测序、限制酶切作图和/或生物活性多肽在适当的宿主中的表达来确认。如在本领域是公知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染的基因，必须将基因有效地连接于在选择的表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。

在某些实施方案中，将重组表达载体用于扩增和表达编码本文中描述的多肽的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制的DNA构建体，其具有编码多肽的合成的或cDNA-来源的DNA片段，该片段有效地连接于来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适当的转录或翻译调控元件。转录单位通常包含如下部分的装配体：(1)在基因表达中具有作用的调控元件例如转录启动子和/或增强子、(2)转录成mRNA并且翻译成蛋白质的结构或编码序列和(3)适当的转录和翻译起始及终止序列。调控元件可包括控制转录的操纵子序列。在宿主中的复制能力通常由复制起始点赋予，并且可额外地整合帮助识别转化体的选择基因。当DNA区域彼此功能相关时，所述DNA区域是“有效连接的”。例如，信号肽(分泌性前导序列)有效地连接于多肽的DNA，如果其表达为参与多肽的分泌的前体的话；如果启动子控制序列的转录，则其有效地连接于编码序列；或如果核糖结合位点以允许翻译的方式定位，则其有效地连接于编码序列。期望用于酵母表达系统的结构元件包括使得翻译的蛋白质能够被宿主细胞分泌至细胞外的前导序列。或者，当在前导序列或转运序列下表达重组蛋白时，其可包括N末端甲硫氨酸残基。该残基可任选地随后从表达的重组蛋白切除以提供最终的产物。

表达载体和控制元件的选择取决于宿主的选择。可使用许多种表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，包括pCRl、pBR322、pMB9以及其衍生物和更广宿主范围的质粒，例如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。

用于真核宿主的一些表达载体可具有整合入宿主基因组的能力，并且用于真核宿主的一些表达载体可作为染色体外实体存在于细胞核中。在一些实施方案中，附加型载体可提供有利方面，例如每细胞转染多个拷贝，从而导致目标多核苷酸的高表达和/或更高的转染效率。

用于表达本文中描述的多肽的适当的宿主细胞包括在适当的启动子控制之下的原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰阴性或革兰阳性生物例如大肠杆菌或杆菌(Bacilli)。高等真核细胞包括已建立的哺乳动物来源的细胞系，如下文中描述的。还可使用无细胞翻译系统。

将各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统用于表达重组多肽。在一些实施方案中，重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达是优选的，因为此类蛋白质通常正确地折叠，被适当地修饰并且具有完全的功能。适当的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7(猴肾来源的)、L-929(鼠成纤维细胞来源的)、C127(鼠乳房肿瘤来源的)、3T3(鼠成纤维细胞来源的)、CHO(中国仓鼠卵巢来源的)、HEK-293(人胚胎肾来源的)、HeLa(人子宫癌来源的)和BHK(仓鼠肾成纤维细胞来源的)细胞系。在一些实施方案中，可使用细胞系的变体。例如，293T细胞是表达SV40大T抗原的HEK-293细胞，其允许包含SV40复制起始点的转染的质粒进行附加型复制。哺乳动物表达载体可包含非转录元件例如复制起始点、与待表达的基因连接的适当的启动子和增强子，以及其它5'或3'侧翼连接的非转录序列和5'或3'非翻译序列，例如必需核糖结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。在一些实施方案中，杆状病毒系统用于在昆虫细胞中生成异源蛋白质。此类方法和技术对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如，Luckow和Summers，1988，Bio/Technology，6:47)。

在某些实施方案中，分离本文中描述的多肽。在某些实施方案中，本文中描述的多肽是大体上纯的。

可按照任何适当的方法纯化由宿主细胞表达的蛋白质。此类方法包括层析法(例如，离子交换层析、亲和层析和尺寸柱层析(sizing column chromatography))、离心、差异溶解度或利用用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。可将亲和标签例如六-组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感包衣序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽S-转移酶连接于蛋白质以允许通过在适当的亲和柱通过来进行容易的纯化。可使用这样的技术如蛋白质水解、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振和X射线晶体学在物理上表征分离的蛋白质。

在一些实施方案中，可首先使用商购可得的蛋白质浓缩滤器例如Amicon或Milhpore Pellicon超滤单位浓缩来自表达系统的上清液，所述表达系统将重组蛋白分泌入培养基中。在浓缩步骤后，可将浓缩物用于适当的纯化基质。在一些实施方案中，可使用阴离子交换树脂，例如，具有悬挂的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白质纯化的其它种类。在一些实施方案中，可使用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换器包括各种不溶性的包含磺丙基或羧甲基基团的基质。在一些实施方案中，可使用羟基磷灰石(CHT)介质，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石。在一些实施方案中，可将一种或多种利用疏水性RP-HPLC介质例如具有悬挂甲基或其它亲水基团的硅胶的反相HPLC步骤用于进一步纯化蛋白质。可将一些或所有上述纯化步骤以不同的组合用于提供均一的重组蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了包含编码包含免疫球蛋白重链恒定区和跨膜部分的多肽的多核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，本发明提供了包含编码包含免疫球蛋白重链恒定区和GPI-膜部分的多肽的多核苷酸的多核苷酸。短语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包括多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以以RNA的形式存在或以DNA的形式存在。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，如果是单链，其可以是编码链或非编码(反义)链。

在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:12的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:28的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26的的多肽(具有或不具有信号序列)的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:30的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:31的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码包含SEQID NO:32的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码SEQ ID NO:30的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码SEQ ID NO:31的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码SEQ ID NO:32的多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:29的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:24、SEQ ED NO:25或SEQID NO:27的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:9、SEQ EDNO:11、SEQ ED NO:24、SEQ ED NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29的多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少约90%同一性、至少约95%同一性，以及在一些实施方案中至少90%、97%、98%或99%同一性的序列的多核苷酸。

还提供了包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29杂交的多核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，杂交是在高严格度的条件下。

在某些实施方案中，多核苷酸包含于相同读框中融合至多核苷酸(所述多核苷酸帮助例如多肽从宿主细胞表达和/或分泌)的成熟多肽的编码序列。例如，前导序列或信号序列用作用于控制多肽至细胞表面的转运以及从细胞分泌(如果所述多肽是分泌性蛋白质的话)的序列。具有前导序列(或信号序列)的多肽是前蛋白并且可具有被宿主细胞切割(以生成多肽的成熟形式)的前导序列。多核苷酸还可编码为成熟蛋白+额外的5'氨基酸残基的前蛋白。具有前序列(prosequence)的成熟蛋白是前蛋白并且是蛋白质的无活性形式。一旦前序列初切割，则活性成熟蛋白保留。

在某些实施方案中，多核苷酸包含于相同读框中融合至标志或标签序列(所述序列允许例如纯化和/或鉴定表达的多肽)的成熟多肽的编码序列。在一些实施方案中，当使用细菌宿主时，标志序列可以是由pQE-9载体提供的六-组氨酸标签，以提供成熟多肽的纯化。在其它实施方案中，当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，标志序列可以是来源于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。在一些实施方案中，标志序列是“FLAG”，还可与其它亲和标签结合使用的序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:17)的肽。

本发明还涉及在上文中描述的编码例如多肽的片段、类似物和/或衍生物的多核苷酸的变体。

在某些实施方案中，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有与编码本文中描述的多肽的多核苷酸具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性以及在一些实施方案中至少96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。

如本文中所用，短语具有与参照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸意指除多核苷酸序列可包括最多每参照核苷酸序列的每100个核苷酸5个点突变外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可缺失或用另外的核苷酸置换最多参照序列的5%的核苷酸，或可将最多参照序列的5%的总核苷酸的许多核苷酸插入参照序列。参照序列的这些突变可存在于参照核苷酸序列的5'或3'末端位置上或这些末端位置之间的任何地方，单个分散在参照序列的核苷酸之间或参照序列内的一个或多个连续组中。

多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含生成“沉默”置换、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含因遗传密码子的简并性而产生的“沉默”置换。可因多个原因生成多核苷酸变体，例如以最优化用于特定宿主的密码子表达(例如，将人mRNA中的密码子改变成由细菌宿主例如大肠杆菌偏爱的密码子)。

在某些实施方案中，分离本文中描述的多核苷酸。在某些实施方案中，本文中描述的多核苷酸是大体上纯的。

还提供了包含本文中描述的多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含含有多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含由多核苷酸分子编码的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞生成由多核苷酸分子编码的多肽。

III.细胞

本发明还提供了表达本文中描述的多肽的细胞和提供了生成所述细胞的方法。用于制备本文中描述的细胞的细胞(例如，宿主细胞)包括所有哺乳动物细胞、细胞系和细胞培养物。在一些实施方案中，细胞来源于哺乳动物例如小鼠、大鼠或其它啮齿类动物，或来源于灵长类动物例如人或猴。在一些实施方案中，细胞为鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为人细胞。在其它实施方案中，细胞为哺乳动物精细胞或体细胞。在其它实施方案中，细胞是原代细胞培养物或永生化细胞系。通常在细胞培养中培养哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞附着至固体表面。在其它实施方案中，悬浮培养细胞。

可用包含编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸和/或载体转染许多种宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以是永生化真核细胞，包括但不限于SP2/0、SP2/0-Ag14、NS/0、YB2/0、K6H6/B5、NS-1、FO、Y3/Ag 1.2.3、P3X63Ag8.653、其它骨髓瘤、杂交瘤、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、CV-1细胞、3T3细胞、L细胞、TC7细胞和人胚胎肾细胞(HEK-293和293T)。在一些实施方案中，细胞是已知的融合伴侣细胞系。在一些实施方案中，细胞是高效融合，支持高水平抗体表达并且对选择培养基敏感的永生化细胞。此类细胞系可包括但不限于Sp2/0、SP2/0-Ag14、YB2/0、K6H6/B5、NS-1、FO、Y3/Ag 1.2.3和P3X63Ag8.653。在一些实施方案中，细胞为不表达免疫球蛋白链的骨髓瘤细胞，在一些实施方案中，细胞为杂交瘤或杂交瘤文库。在某些实施方案中，细胞为人细胞。在某些实施方案中，细胞为HEK-293细胞或其变体(例如，293T细胞)。在某些实施方案中，细胞为CHO细胞。在某些实施方案中，细胞为鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为SP2/0或其变体(例如，SP2/0-Ag14)。

表达本发明的多肽的细胞可通过本领域技术人员已知的许多方法来制备。可通过许多方法将本文中描述的多核苷酸、载体和/或构建体引入适当的宿主细胞。一般地，将利用载体的转染或感染用于获得表达本发明的多肽的哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，通过转染将多核苷酸引入细胞。在一些实施方案中，转染是瞬时表达，通常导致转染的多肽表达有限的时期。在其它实施方案中，转染是稳定转染，导致转染的多肽永久性表达。在一些实施方案中，稳定转染通过将输入DNA整合入细胞基因组来实现。在一些实施方案中，稳定转染导致输入DNA的附加型维持和复制。

可通过常规转染技术将DNA引入真核细胞。术语“转染”是指本领域技术人员已知的用于将外源多核苷酸(例如，DNA)引入宿主细胞的多种技术。此类技术包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔和显微注射。用于转染宿主细胞的此类和其它方法可见于许多标准实验室手册中。在一些实施方案中，使用脂质体介导的转染或“脂转染”转染细胞。脂转染是基于脂质的转染技术，其中核酸与基于脂质的试剂结合，从而导致核酸的紧密压缩和保护。脂转染的主要有利方面是高效，将所有类型的核酸转染入广泛的细胞类型的能力、使用的容易性、重现性和低毒性。此外，脂转染适用于所有转染应用，包括但不限于瞬时转染、稳定转染、共转染、相继转染或多重转染。

在一些实施方案中，用表达本文中描述的多肽的多核苷酸稳定地转染细胞。关于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于使用的表达载体和转染技术，只有少部分细胞可将DNA整合入其基因组。在利用附加型载体对哺乳动物细胞的转染中，更大部分的细胞可整合和维持DNA。为了鉴定和选择这些细胞，通常可将编码可选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因连同目标基因一起引入宿主细胞。各种可选择标记包括赋予对药物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的标记。可将编码可选择标记的多核苷酸于与编码多肽的载体相同的载体上引入宿主细胞或可将其于单独的载体上引入宿主细胞。用引入的多核苷酸稳定转染的细胞可通过药物选择(例如，已整合了可选择标记的基因的细胞将存活，然而其它细胞将死亡)来鉴定。

在一些实施方案中，通过载体将多核苷酸引入细胞。载体可来源于产生病毒体或病毒样颗粒的病毒基因组，所述基因组可以作为或可以不作为染色体外元件独立地复制。可通过感染将包含编码期望的多肽的多核苷酸的病毒体颗粒引入宿主细胞。在一些实施方案中，病毒载体被整合入细胞基因组。用于转化哺乳动物细胞的病毒载体包括但不限于SV40载体和基于乳头瘤病毒、腺病毒、EB病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)和逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒或小鼠白血病病毒例如Moloney小鼠白血病病毒的载体。

还提供了生成表达本文中描述的多肽的细胞的方法。在一些实施方案中，本文中提供了生成细胞的方法，包括用编码本文中描述的多肽的多核苷酸或载体转染细胞。在一些实施方案中，转染的细胞表达多肽。在一些实施方案中，瞬时转染细胞。在一些实施方案中，稳定地转染细胞。在一些实施方案中，将编码多肽的多核苷酸整合入细胞的基因组。在一些实施方案中，在细胞中稳定地表达编码多肽的转染的多核苷酸。在其它实施方案中，在转染的细胞的表面上表达多肽。

在一些实施方案中，方法还包括检测多肽的表达。可通过本领域已知的任何方法测定转染的细胞的多肽表达。可使用的测定法但不限于使用技术例如Biacore分析、流式细胞术、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹分析、放射免疫测定法、ELISA、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射分析、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法的竞争性和非竞争性测定系统。此类测定法是常规的并且在本领域是公知的(参见，例如，Ausubel等人编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York)。

在一些实施方案中，方法包括检测多肽在细胞表面上的表达。在一些实施方案中，将细胞与检测分子接触。在一些实施方案中，检测分子为针对免疫球蛋白重链恒定区的抗体。在一些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，用荧光基团或生色团标记检测分子。在一些实施方案中，方法包括使用流式细胞术检测多肽的表达。在一些实施方案中，方法包括利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。如本文中所用，短语“检测分子”包括但不限于检测分子的群体。例如，检测分子可以是抗体溶液或蛋白质或蛋白质片段的溶液。类似地，短语“被检测分子结合的分子”包括但不限于许多检测分子结合的细胞。

流式细胞术和FACS为本领域技术人员已知的技术。流式细胞术使用光散射、荧光分子的光激发和发射的原理来产生细胞的特异性多参数数据。当细胞在液流中流动一个接一个地通过检测点(sensing point)时，仪器对每一个细胞进行了测量。流式细胞术可用于纯化细胞群体或通过荧光激活细胞分选术或FACS分离单个细胞。在一些实施方案中，以10-20,000个细胞/秒分析细胞。在一些实施方案中，以1,000-10,000个细胞/秒分析细胞。在某些实施方案中，以100-1000个细胞/秒分析细胞。在一些实施方案中，分析约1x 10⁶至1x 10⁸个细胞。在一些实施方案中，分析约1x 10⁶个细胞。在某些实施方案中，分析约5x 10⁶个细胞。在一些实施方案中，分析约1x 10⁷个细胞。在一些实施方案中，分析约2.5x 10⁷个细胞。在一些实施方案中，分析和分选细胞。例如，可将约2.5x 10⁷个细胞运行通过FACS仪并且进行分析。可将靶细胞分选至约8个96孔的孔中，可分离600至700个单独的克隆。因此，流式细胞术的使用允许快速筛选大量细胞。类似地，FACS的使用允许检测和分选大量细胞并且以快速方式分离单个细胞。

在一些实施方案中，生成细胞的方法包括用编码本文中描述的多肽的多核苷酸或载体转染细胞。在一些实施方案中，转染的细胞表达所述多肽。在一些实施方案中，方法包括检测多肽在细胞表面上的表达。在一些实施方案中，方法包括选择表达多肽的细胞。在一些实施方案中，将细胞与检测分子接触。在一些实施方案中，检测分子为针对免疫球蛋白重链恒定区的抗体。在一些实施方案中，检测分子为目标靶(例如，蛋白质或其片段)。在一些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，用荧光基团或生色团标记检测分子。在一些实施方案中，方法包括利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，方法包括通过FACS分离被检测分子结合的细胞。

因此，本发明提供了包含编码本文中描述的多肽的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，通过本文中描述的方法的任何方法生成细胞。在一些实施方案中，细胞包含含有编码本文中描述的多肽的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，细胞包含本文中描述的多肽。在一些实施方案中，细胞包含含有免疫球蛋白重链恒定区和非-免疫球蛋白跨膜部分的多肽。在一些实施方案中，多肽是膜结合的并且在细胞表面上表达。

本发明还提供了生成异二聚体分子的细胞。异二聚体分子是膜结合的，在细胞表面上表达并且不从细胞分泌。在一些实施方案中，异二聚体分子包含本文中描述的多肽并且还包含至少一种额外的多肽。在一些实施方案中，额外的多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，额外的多肽包含免疫球蛋白Fc区域。在一些实施方案中，额外的多肽包含免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，至少一种额外的多肽包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在某些实施方案中，至少一种额外的多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，额外的多肽为抗体。

在一些实施方案中，异二聚体分子为与第二多肽共价结合的膜结合多肽，其中所述膜结合的多肽包含：(a)免疫球蛋白重链恒定区和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，所述膜结合的多肽通过形成二硫键与第二多肽结合。在一些实施方案中，膜结合的多肽与第二多肽形成至少一个二硫键以形成异二聚体分子。

在一些实施方案中，异二聚体分子为与免疫球蛋白重链共价结合的膜结合的多肽，其中所述膜结合的多肽包含：(a)免疫球蛋白重链恒定区和(b)跨膜部分。在一些实施方案中，膜结合的多肽通过形成二硫键与免疫球蛋白重链结合。在一些实施方案中，膜结合的多肽与免疫球蛋白重链形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链配对，以便重链可变区和轻链可变区形成单个抗原结合位点。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链为具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的部分。在一些实施方案中，异二聚体分子为单价抗体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子在细胞表面上表达并且不结合分泌的抗体。

因此，在一些实施方案中，细胞包含：(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区和非-免疫球蛋白跨膜部分；和(b)至少一种编码至少一种额外的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，至少一种额外的多肽包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，所述至少一种额外的多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，至少一种额外的多肽为抗体。在一些实施方案中，额外的多肽为可从细胞分泌的抗体。在某些实施方案中，在细胞的表面上表达的本发明的多肽不结合分泌的抗体。

本发明还提供了杂交瘤细胞和生成杂交瘤的方法，其中所述杂交瘤表达本文中描述的多肽和/或异二聚体分子。在一些实施方案中，用于生成杂交瘤细胞的方法包括将表达本发明的多肽的细胞与抗体生成细胞融合。在一些实施方案中，融合的杂交瘤细胞在细胞表面上表达异二聚体抗体分子。抗体生成细胞为能够生成或正在生成抗体分子的任何细胞，包括但不限于B-细胞、浆细胞、骨髓瘤、杂交瘤和重组细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞将免疫球蛋白重链赋予给融合细胞，其中免疫球蛋白重链与由细胞表达的多肽形成异二聚体分子。在一些实施方案中，抗体生成细胞将免疫球蛋白轻链赋予融合细胞，其中免疫球蛋白轻链与免疫球蛋白重链结合以形成抗原结合位点。在一些实施方案中，抗体生成细胞将具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白赋予融合细胞，其中单链免疫球蛋白与由细胞表达的多肽形成异二聚体分子。在一些实施方案中，抗体生成细胞为小鼠细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为人细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为抗体生成细胞的群体。在一些实施方案中，抗体生成细胞为从免疫动物分离的细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为从首次接触实验的动物分离的细胞。在其它实施方案中，抗体生成细胞包含多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物产生DNA文库。在其它实施方案中，DNA文库为天然文库。在一些实施方案中，DNA文库为cDNA文库。在一些实施方案中，方法生成表达多种异二聚体抗体分子的杂交瘤细胞的群体(例如，文库)。还提供了通过本文中描述的方法生成的杂交瘤或杂交瘤文库。

本发明还提供了生成表达包含本文中描述的多肽的异二聚体分子的细胞文库的方法。在一些实施方案中，生成细胞文库的方法包括用多种编码多种多肽的多核苷酸转染表达本发明的多肽的细胞。在一些实施方案中，转染的细胞表达异二聚体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子在转染的细胞的表面上表达。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种多肽，所述多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白Fc区域的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种多肽，其中每一种多肽包含：(a)免疫球蛋白Fc区域和(b)随机化的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在其它实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，文库为首次接触实验的文库。在一些实施方案中，DNA文库为cDNA文库。在某些实施方案中，DNA文库编码随机多肽文库。还提供了由本文中描述的任何方法制备的细胞文库。

本发明还提供了表达本发明的新型多肽以及还生成抗体的细胞。还提供了生成此类细胞的方法，其中所述细胞表达本发明的多肽、本文中描述的抗体和/或异二聚体分子。在一些实施方案中，用编码本文中描述的新型多肽的任何多肽的多核苷酸转染抗体生成细胞。在一些实施方案中，转染的细胞表达所述多肽。在一些实施方案中，转染的细胞在细胞表面上表达异二聚体分子。在一些实施方案中，异二聚体分子包含多肽和免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链结合以形成单个抗原结合位点。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链为单链免疫球蛋白部分。在一些实施方案中，抗体生成细胞为杂交瘤文库。在一些实施方案中，抗体生成细胞为杂交瘤。

本发明还提供了包含本文中描述的新型多肽的细胞文库。在一些实施方案中，细胞文库中的每一个细胞包含：(a)第一多肽，其包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和跨膜部分；和(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽，其中两个多肽能够形成异二聚体分子。在一些实施方案中，两种多肽共价缔合。在一些实施方案中，两种多肽形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，异二聚体分子在细胞表面上表达。在一些实施方案中，每一个细胞还包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，第二多肽为单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，异二聚体分子包含单个抗原结合位点。

本发明还提供了鉴定和/或选择不为抗体的多肽的方法。多肽可包括但不限于细胞表面受体或其片段、可溶性受体或其片段、细胞表面配体或其片段以及可溶性配体或其片段。多肽可包括蛋白质的诱变或衍生形式。多肽可包括随机化的多肽例如随机化的多肽文库。

在一些实施方案中，细胞文库中的每一个细胞包含：(a)第一多肽，其包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和跨膜部分；以及(b)第二多肽。在一些实施方案中，两种多肽共价结合。在一些实施方案中，两种多肽形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，第二多肽包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区，其中两种多肽能够形成异二聚体分子。在一些实施方案中，第二多肽包含免疫球蛋白Fc区域。在一些实施方案中，第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。在一些实施方案中，第二多肽包含随机化的多肽。在一些实施方案中，第二多肽包含：(a)免疫球蛋白Fc区域和(b)随机化的多肽。

随机化的多肽或随机多肽文库(以及编码其的多核苷酸)可以是完全随机化的或它们可在它们的随机化中偏移。本领域技术人员已知的任何方法可用于产生随机化多肽或随机肽文库，包括但不限于核苷酸和/或肽的化学合成。(参见，例如，美国专利申请No.2003/0170753和国际申请No.WO 00/20574)。

可筛选本文中描述的细胞文库的生成特异性多肽的细胞。因此，本文中提供了筛选细胞文库的方法，包括将本文中描述的细胞文库与检测分子接触。在一些实施方案中，方法还包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，方法还包括分离被检测分子结合的细胞。检测分子可包括但不限于蛋白质、糖类、小分子及其变体。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，检测分子为细胞表面受体、抗体、配体或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，用荧光基团、生色团或磁性化合物标记检测分子。在一些实施方案中，利用流式细胞术鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，通过FACS分离被检测分子结合的细胞。

IV.鉴定、选择和/或分离抗体或多肽的方法

通常通过细胞上清液的ELISA筛选来鉴定生成针对目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞。上清液可由通过单细胞(有限稀释)克隆技术分离的随机细胞生成。或者上清液可由来自杂交瘤文库的杂交瘤细胞的混合物生成，其中来自任何ELISA-阳性混合物的细胞必须通过单细胞克隆来进行亚克隆和分离。这些方法具有许多局限性。在第一种情况下，必须筛选大量含有“单细胞”培养物的板以发现ELISA阳性克隆。在杂交瘤混合物筛选的情况下，每一个ELISA阳性混合物必须通过有限稀释克隆进一步分离来分离目标杂交瘤的纯克隆。这两种方法既费力又费时。此外，在一些情况下，期望的克隆可代表极低百分比的杂交瘤文库，这使得稀有克隆的鉴定变得十分困难。此外，ELISA筛选法鉴定对单个抗原的结合活性。为了评估单个杂交瘤克隆是否产生能够结合超过一种抗原的单克隆抗体，需要进行多个连续的ELISA。

本发明的新型多肽、细胞和细胞文库可用于鉴定和分离产生特异于目标抗原或靶的抗体的细胞的方法。在一些实施方案中，鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括将包含本文中描述的新型多肽的细胞与抗体生成细胞融合以生成杂交瘤细胞的群体。在一些实施方案中，杂交瘤细胞在细胞的表面上表达异二聚体抗体分子。在一些实施方案中，方法包括杂交瘤细胞群体与检测分子接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的杂交瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，检测分子是目标靶。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。

在一些实施方案中，使用对于本领域技术人员来说称为“淘选”的亲和选择的形式来鉴定生成抗体分子的杂交瘤细胞。将细胞与检测分子(例如，目标抗原)一起温育，分离由检测分子鉴定的细胞。扩增来自分离的细胞的免疫球蛋白DNA，将其重新引入细胞。再次将细胞与检测分子一起温育，分离被检测分子结合的细胞。一轮或多轮选择可以富集具有对目标靶的期望的特异性的抗体或其片段。因此，可从大的高度多样的群体选择稀有的表达期望的抗体分子的细胞。

如本文中所描述的，在一些实施方案中，本发明的多肽包含含有CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区和跨膜部分。多肽能够与由抗体生成细胞表达的免疫球蛋白重链-轻链对共价缔合以形成在细胞表面上表达的异二聚体抗体分子。在一些实施方案中，异二聚体抗体分子包含单个抗原结合位点并且为单价抗体。单个细胞上的异二聚体分子的单个抗原结合位点代表由单个细胞生成和分泌的抗体的结合特异性。因此鉴定具有结合特定目标抗原的异二聚体抗体分子的细胞允许分离也生成具有相同结合特异性的分泌的抗体的细胞。

抗体生成细胞可以生成抗体的任何细胞，无论细胞天然地(例如，B-细胞)生成抗体还是细胞通过重组方法(例如，转染的细胞)生成抗体。因此，在一些实施方案中，抗体生成细胞为B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤或重组细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为小鼠细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为人细胞。在一些实施方案中，抗体生成细胞为抗体生成细胞的群体。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自免疫动物。在一些实施方案中，抗体生成细胞来自首次接触实验的动物。

在一些实施方案中，抗体生成细胞包含多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种还包含免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，DNA文库为天然文库。在其它实施方案中，DNA文库为cDNA文库。

本文中提供的方法不限制由抗体生成细胞生成的抗体的类型。因此，在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或抗体片段。在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为单特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体或其亚型。在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为IgG1或IgG2抗体。在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为IgG2抗体。在一些实施方案中，抗体为鼠抗体。在一些实施方案中，由抗体生成细胞制备的抗体为人源化抗体。在其它实施方案中，抗体为人抗体。

在一些实施方案中，鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括用至少一种编码至少一种额外的多肽的多核苷酸转染包含本文中描述的新型多肽的细胞。在一些实施方案中，转染的细胞在细胞表面上表达异二聚体抗体分子。在一些实施方案中，方法包括将转染的细胞与检测分子接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的转染的细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，检测分子是目标靶。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。

在一些实施方案中，至少一种多核苷酸包含多种编码多种多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含免疫球蛋白重链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种还包含免疫球蛋白轻链的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸编码多种包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白的多肽。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从首次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，DNA文库为天然文库。在其它实施方案中，DNA文库为cDNA文库。

在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或抗体片段的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为单特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体或其亚型的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为IgG1或IgG2抗体的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为IgG2抗体的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为鼠抗体的多肽。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸编码为人源化抗体的多肽。在其它实施方案中，至少一种多核苷酸编码为人抗体的多肽。

在一些实施方案中，鉴定生成特异性抗体的细胞的方法包括用编码本文中描述的新型多肽的任何多肽的多核苷酸或载体转染细胞文库，其中所述细胞文库包含抗体生成细胞。在一些实施方案中，转染的细胞在细胞表面上表达异二聚体抗体分子。在一些实施方案中，方法包括将转染的细胞与检测分子接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的转染的细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，检测分子为目标靶。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。

在一些实施方案中，细胞文库为B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤或重组细胞。在一些实施方案中，细胞文库为杂交瘤文库。在一些实施方案中，细胞文库包含小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞文库包含人细胞。

在一些实施方案中，本文中提供的方法生成分泌特异性抗体而且还在其细胞表面上表达单价异二聚体抗体分子(包含代表分泌的抗体的结合特异性的单个抗原结合位点)的细胞或杂交瘤。该异二聚体抗体分子，和从而抗体生成细胞可使用检测分子来鉴定。在一些实施方案中，检测分子为目标抗原。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。在一些实施方案中，用荧光基团、生色团或磁性化合物标记检测分子。在一些实施方案中，利用流式细胞术鉴定与检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，通过FACS分离与检测分子结合的细胞。

可将本发明的新型多肽、细胞和细胞文库可用于筛选对于目标抗原或靶是特异性的抗体的方法，在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括将筛选本文中描述的细胞或细胞文库。在一些实施方案中，细胞(例如，细胞文库)在细胞表面上表达异二聚体分子。如本文中所描述的，在细胞表面上表达的异二聚体分子包含与由细胞生成的抗体的结合位点相同的结合位点。在一些实施方案中，筛选特异性抗体的方法包括将细胞与检测分子接触。表达被检测分子结合的异二聚体分子的细胞表达对于检测分子是特异性的抗体分子。在一些实施方案中，筛选方法包括鉴定被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，筛选方法包括分离被检测分子结合的细胞。在一些实施方案中，筛选方法包括分离由被检测分子结合的细胞生成的抗体。在一些实施方案中，检测分子为目标靶。在一些实施方案中，检测分子为蛋白质或其片段。在一些实施方案中，标记检测分子。

在一些实施方案中，使用膜-MAb技术筛选特异性抗体包括反复轮的选择，然后进行扩增。例如，用文库DNA转染细胞(例如，293-hMT细胞或293T-hMT细胞)。用于任一转染的DNA的量和细胞的数目将取决于文库和/或文库多样性。转染后，温育细胞，使其生长24-48小时。随后收获、洗涤细胞，然后利用靶分子(例如，目标抗原)进行筛选。可直接标记筛选分子或可通过已标记的第二分子检测筛选分子。使用本领域技术人员已知的方法例如通过FACS或通过使用磁性珠粒分析和/或分选标记的细胞。从分选的细胞提取质粒DNA，并且进行扩增。可利用任何公知的方法提取和纯化质粒DNA。例如，可使用酚/氯仿混合物提取质粒DNA，随后用乙醇沉淀。随后将纯化的质粒DNA用于转化细菌，扩增分离的DNA。或者可从细胞分离DNA，利用本领域技术人员已知的PCR法扩增特定区域。将PCR产物亚克隆回用于转化细菌和扩增质粒的宿主质粒内。通过使用任一方法，将从第一选择输出的所得的扩增文库用于转染新鲜细胞(例如，293-hMT或293T-hMT细胞)，进行随后轮的利用相同靶或抗原的选择。这样，进行多轮选择直至特异性结合目标靶或抗原的抗体群体被富集。

一旦富集了文库的特异性抗体分子的群体，就立即分离DNA，将其用于转化细菌。挑拣单个克隆，分离质粒DNA。将克隆质粒用于转染哺乳动物细胞(例如，亲代HEK-293或亲代293T细胞)以生成可溶性抗体。随后利用ELISA、FACS和/或Biacore测试所得的抗体的对期望的靶的特异性结合。

利用质粒对哺乳动物细胞的瞬时转染通常导致每细胞多个拷贝的质粒。每细胞的拷贝数可从100个变化至10,000个。每细胞的绝对数目取决于多个因素，包括但不限于转染方案、转染试剂、质粒质量、质粒大小和细胞密度。在产生细胞表面展示抗体的文库中，期望调节被引入细胞的编码抗体的质粒(或Ab文库质粒)的量。在一些实施方案中，为了调节Ab文库质粒在细胞中的质粒拷贝数，可使用单独的“载体”质粒。将载体质粒与Ab文库质粒混合，其可占据一些可用“质粒空间”。因此，在一些实施方案中，为了调节被细胞占据的Ab文库质粒的数目，将载体质粒与Ab文库质粒以不同的比率混合，随后转染入细胞。

在一些实施方案中，调节多肽在宿主细胞表面上的表达的方法包括将(a)编码多肽的DNA和(b)过量的无关DNA转染入宿主细胞。在一些实施方案中，多肽为异二聚体抗体分子。因此，在一些实施方案中，调节异二聚体抗体分子在宿主细胞表面上的表达的方法包括将(a)编码免疫球蛋白的DNA和(b)过量的无关DNA转染入宿主细胞。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白的DNA对无关DNA的比率为1∶10至1∶1,000,000。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白的DNA对无关DNA的比率为1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10,000、1∶100,000、1∶1,000,000或其间的任何比率。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白的DNA为质粒DNA并且无关DNA为质粒DNA。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文中描述的多肽或多核苷酸的任何多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，免疫球蛋白包含免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，抗体包含免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，免疫球蛋白为具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链抗体分子。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白的DNA为DNA文库。在一些实施方案中，从免疫动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，从初次接触实验的动物的细胞产生DNA文库。在一些实施方案中，DNA文库为cDNA文库。在一些实施方案中，方法还包括将宿主细胞与检测分子接触。在一些实施方案中，方法包括鉴定被检测分子结合的宿主细胞。在一些实施方案中，方法包括分离被检测分子结合的的宿主细胞。

本发明还提供了由通过本文中描述的方法的任何方法鉴定的、选择的和/或分离的细胞生成的抗体。本发明中还提供了通过本文中描述的方法的任何方法分离的细胞生成的抗体。

V.抗体

如本文中所描述的，本发明的新型多肽和细胞可用于鉴定、选择和/或分离特异性结合目标靶(例如，抗原)的抗体。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的异二聚体抗体分子包含形成单个抗原结合位点的免疫球蛋白重链-轻链对。单个抗原结合位点与由细胞生成和分泌的抗体上的抗原结合位点相同和/或代表所述抗原结合位点。

本文中提供的多肽、细胞和方法不限制生成的抗体的类型。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。可使用本领域技术人员已知的杂交瘤法制备单克隆抗体(参见例如，Kohler和Milstein，1975，Nature 256:495)。在一些实施方案中，通过相关抗原(例如，纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)的多次皮下、腹膜内或静脉内注射免疫小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物。任选地可将抗原缀合至载体蛋白例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白。将抗原(利用或不利用载体蛋白)稀释于无菌盐水并且通常与佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)组合以形成稳定的乳剂。在一些实施方案中，免疫抗原可以是人蛋白质或其部分。在一些实施方案中，免疫抗原可以是小鼠蛋白或其部分。在一些实施方案中，用人抗原免疫小鼠。在一些实施方案中，用小鼠抗原免疫小鼠。在一些实施方案中，可体外免疫分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，可非特异性激活分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，分离的淋巴细胞为小鼠淋巴细胞。在一些实施方案中，分离的淋巴细胞为人淋巴细胞。

在免疫和/或激活后，分离淋巴细胞，使用例如聚乙二醇将其与适当的细胞系融合以生成杂交瘤。用于生成杂交瘤的细胞系可包括表达本文中描述的新型多肽的任何细胞系。在一些实施方案中，使用本领域已知的专门化的培养基选择杂交瘤细胞，并且未融合的淋巴细胞和融合细胞都不能活过选择过程。在一些实施方案中，可利用多种技术鉴定生成针对选择的抗原的单克隆抗体的杂交瘤，包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹法和体外结合测定法(例如，流式细胞术(FACS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA))。在其它实施方案中，使用本文中描述的任何方法，基于在细胞表面上作为异二聚体抗体分子的部分表达的抗原结合位点直接选择细胞。可使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986)在体外培养中或在动物中在体内作为腹水扩增杂交瘤。可按照本领域的标准方法从培养基或腹水流体纯化单克隆抗体，所述方法包括但不限于亲和层析、离子交换层析、凝胶电泳和透析。

或者，可使用本领域技术人员已知的重组DNA技术(参见例如，美国专利No.4,816,567)制备单克隆抗体。在一些实施方案中，使用技术例如RT-PCR从成熟B-细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核苷酸，所述RT-PCR利用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物。可使用常规测序技术市场测定分离的多核苷酸的序列。可将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆入适当的表达载体。此类表达载体，当转染入宿主细胞例如大肠杆菌、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK)或不另外生成免疫球蛋白的骨髓瘤细胞时生成单克隆抗体。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的分离的多核苷酸转染入本发明的细胞，所述细胞表达包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链区域和跨膜部分的多肽。

重组单克隆抗体或其片段还可从表达期望的物种的CDR的噬菌体展示文库分离(参见例如，McCafferty等人，1990，Nature，348:552-554；Clackson等人，1991，Nature，352:624-628；和Marks等人，1991，J.Mol.Biol，222:581-597)。

可使用重组DNA技术进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸以产生可选择的抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以1)取代例如人抗体的所述区域以产生嵌合抗体或2)取代非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方案中，恒定区被截断或除去以产生单克隆抗体的期望的抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可用于最优化单克隆抗体的特异性、亲和力和/或其它生物特征。在一些实施方案中，CDR的定点诱变可用于最优化单克隆抗体的特异性、亲和力和/或其它生物特征。

在一些实施方案中，抗体为人源化抗体。通常，人源化抗体为其中通过使用本领域技术人员已知的方法，用具有期望的特异性、亲和力和/或能力的来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的残基取代来自互补决定区(CDR)的残基的人免疫球蛋白。在一些实施方案中，用具有期望的特异性、亲和力和/或能力的非人免疫球蛋白的相应构架区残基替代人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基。在一些实施方案中，人源化抗体还可通过Fv构架区中和/或替代的非人残基内的另外残基的置换来进一步修饰以改进和最优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般地，人源化抗体可包含大体上所有至少一个，通常两个或三个可变结构域，所述可变结构域包含所有或大体上所有相应于非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或大体上所有构架区为具有人免疫球蛋白共有序列的构架区。在一些实施方案中，人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)(通常地人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或结构域)的至少一部分。在某些实施方案中，此类人源化抗体在治疗上是有用的，因为当给人受试者施用时，它们可减小抗原性和HAMA(人抗-小鼠抗体)反应。按照已知的技术(参见例如美国专利No.5,225,539；5,585,089；5,693,761和5,693,762)，本领域技术人员能够获得具有减小的免疫原性的功能性人源化抗体。

在某些实施方案中，抗体为人抗体。人抗体可使用本领域内已知的各种技术直接制备。可产生体外免疫的或从免疫的个体分离的永生化人B淋巴细胞，所述人B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体。或者，人抗体可选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(参见例如，Vaughan等人，1996，Nat.Biotech.，14:309-314；Sheets等人，1998，PNAS，95:6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J Mol.Biol，227:381；以及Marks等人，1991，J Mol.Biol，222:581)。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术也描述于美国专利No.5,969,108；6，172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484和7,264,963；以及Rothe等人，2008，J.Mol.Bio.，376:1182-1200中。亲和力成熟策略和链改组策略在本领域是已知的并且可用于产生高亲和力人抗体。(Marks等人，1992，Bio/Technology，10:779-783)。

还可在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人抗体，所述转基因小鼠在免疫后能够在内源免疫球蛋白产生不存在的情况下产生完全人抗体库。该方法描述于美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016中。

在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体。双特异性抗体能够特异性识别并且结合至少两种不同的表位。不同的表位可在相同分子内或在不同分子上。在一些实施方案中，抗体可特异性识别并且结合第一抗原靶，以及第二抗原靶，例如淋巴细胞上的效应分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受体(例如，CD64、CD32或CD16)，以将细胞防御机制集中至表达第一抗原靶的细胞。在一些实施方案中，抗体可用于将细胞毒素剂导向表达特定靶抗原的细胞。此类抗体具有抗原结合臂以及结合细胞毒素剂或放射性核素螯合剂例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。

用于制备双特异性抗体的技术对于本领域技术人员来说是已知的，参见例如，Millstem等人，1983，Nature，305:537-539；Brennan等人，1985，Science，229:81；Suresh等人，1986，Methods in Enzymol，121:120；Traunecker等人，1991，EMBOJ.，10:3655-3659；Shalaby等人，1992，J.Exp.Med.，175:217-225；Kostelny等人，1992，J.Immunol，148:1547-1553；Gruber等人，1994，J.Immunol.，152:5368；以及美国专利No.5,731,168)。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。还设想具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等人，1991，J.Immunol，147:60)。因此，在某些实施方案中，抗体是多特异性的。

在一些实施方案中，本文中描述的抗体是从单基因构建体生成的单链免疫球蛋白(参见例如，Lee等人，1999，Molecular Immunology，36:61-71)。单链免疫球蛋白以其整体性包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。例如，将轻链的羧基末端通过Gly-Ser接头肽连接至重链的氨基末端，其中轻链包含可变区和恒定区并且重链包含可变区和CH1、CH2和CH3。此类单链免疫球蛋白形成二聚化抗体分子。

在某些实施方案中，本文中描述的抗体或其它多肽可以单特异性的。

在某些实施方案中，抗体为抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力；例如，抗体片段可具有增强的肿瘤透入性(tumor penetration)。用于生成抗体片段的各种技术是已知的，包括但不限于，完整抗体的蛋白质水解。在一些实施方案中，抗体片段包括通过抗体分子的胃蛋白酶降解生成的F(ab')₂片段。在一些实施方案中，抗体片段包括通过还原F(ab')₂片段的二硫桥产生的Fab片段。在其它实施方案中，抗体片段包括通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。在某些实施方案中，重组地生成抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达和从其分泌，从而允许产生大量此类片段。在一些实施方案中，从本文中论述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。例如，方法可用于构建Fab表达文库(Huse等人，1989，Science，246:1275-1281)以允许快速有效地鉴定具有期望的对于蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物的特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方案中，抗体片段为美国专利No.5,641,870中描述的线性抗体片段。在某些实施方案中，抗体片段是单特异性或双特异性的。在某些实施方案中，抗体为scFv。各种技术可用于生成对于给定的靶抗原是特异性的单链抗体(参见，例如，美国专利No.4,946,778)。

还可希望(特别是在抗体片段的情况下)修饰抗体以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体(salvage receptor)结合表位整合入抗体片段(通过抗体片段中的适当区域的突变或通过将所述表位整合入肽标签，随后将所述肽标签在任一末端或在中间融合至抗体片段(例如，通过DNA或肽合成))来实现。(参见例如，美国专利No.6,096,871和6,121,022.)

为了本发明的目的，应当理解经修饰的抗体或其片段可包含任何类型的可变区，所述可变区提供了抗体与其结合的特异性抗原的缔合。在这一点上，可变区可来源于任何类型的哺乳动物，所述哺乳动物可被诱导引发体液反应和产生针对期望的抗原的免疫球蛋白。这样，经修饰的抗体的可变区可以例如为人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、短尾猿等)或兔来源。在一些实施方案中，经修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区为人。在其它实施方案中，可对相容性抗体的可变区(通常来源于非人来源)进行改造或专门定制以增强结合性质或减小分子的免疫原性。在这一点上，可人源化或另外地通过包含引入的氨基酸序列改变本发明中有用的可变区。

在某些实施方案中，可通过至少部分地替代一个或多个CDR以及必要时，通过部分构架区替代和序列修饰改变重链和轻链中的可变结构域。虽然CDR可来源于相同种类或甚至亚类的抗体，如构架区所源自的抗体，但预期CDR可来源于不同种类的抗体，优选来自不同物种的抗体。可以不必用所有来自供体可变区的CDR替代所有CDR来将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域。相反，可能转移是维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基仅是必需的。

虽然对可变区的改变，本领域技术人员将理解，本发明的修饰的抗体将包含这样的抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，在所述抗体中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被缺失或另外地改变以提供期望的生物化学特征，例如当与具有大致相同的免疫原性的包含天然或未改变的恒定区的抗体相比较增加的肿瘤定位、增加的肿瘤透入性、减少的血清半衰期。在一些实施方案中，经修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。恒定区的修饰包括一个或多个氨基酸在一个或多个结构域中的添加、缺失或置换。本文中公开的经修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施方案中，从经修饰的抗体的恒定区部分或完整地缺失一个或多个结构域。在一些实施方案中，完整的CH2结构域已被除去(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，省略的恒定区结构域被短氨基酸间隔区(例如，10个氨基酸残基)替代，所述间隔区提供了一些通常由不存在的恒定区赋予的分子柔性。

在某些实施方案中，对经修饰的抗体改造以将CH3结构域直接融合至抗体的铰链区。在其它实施方案中，将肽间隔区插入铰链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达其中将已缺失CH2结构域并且将剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)通过5-20个氨基酸间隔区连接至铰链区的构建体。可添加这样的间隔区以确保恒定结构域的调控元件保持自由和可及或铰链区保持柔性。然而，应当指出，在一些情况下，氨基酸间隔区经证明具有免疫原性并且引发针对构建体的不希望的免疫反应。因此，在某些实施方案中，添加至构建体中的任何间隔区将是相对无免疫原性的，以维持经修饰的抗体的期望的生物性质。

在一些实施方案中，经修饰的抗体可以仅具有恒定结构域的部分缺失或少数或甚至单个氨基酸的置换。例如，在CH2结构域的选择的区域中单个氨基酸的突变可足以大体上减弱Fc结合，从而增强肿瘤定位和/或肿瘤透入性。类似地，可能期望仅缺失控制待调节的特异性效应子功能(例如，补体C1q结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分。恒定区的此类部分缺失可改善选择的抗体特征(血清半衰期)同时保留与受试恒定区结构域完整性相关的其它期望的功能。此外，如对于上文所提及的，公开的抗体的恒定区可通过一个或多个氨基酸的突变或置换来进行修饰，所述突变或置换增强所得构建体的特征。在这方面，可能破坏由保守结合位点(例如，Fc结合)提供的活性，同时大体上维持经修饰的抗体的构型和免疫原性特征。在某些实施方案中，经修饰的抗体包括一个或多个氨基酸至恒定区的添加以增强期望的特征例如，减弱或增强效应子功能或提供更多细胞毒性或糖类附着位点。

在本领域已知恒定区介导几个效应子功能。例如，补体的C1组分与IgG或IgM抗体的Fc区域(结合至抗原)的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理素作用和裂解中是重要的。补体的激活也刺激了炎症反应并且也可参与自身免疫过敏症。此外，抗体的Fc区域可结合表达Fc受体(FcR)的细胞。存在许多对于不同种类的抗体包括IgG(γ受体)，IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)是特异性的Fc受体的成员。抗体对细胞表面上的Fc受体的结合触发了许多重要的且多样的生物反应，包括抗体-包被的颗粒的吞食和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体-包被的靶细胞的裂解(ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生成的控制。

在某些实施方案中，提供提供了改变的效应子功能，这反过来影响了施用的抗体的生物特征。例如，在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或灭活(通过点突变或其它方法)可减少Fc受体对循环修饰的抗体的结合，从而增加肿瘤定位和/或透入性。在其它实施方案中，恒定区修饰增加或减少抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，恒定区经修饰以消除二硫键或寡糖部分，从而允许增强的肿瘤定位和/或透入性。

在某些实施方案中，抗体不具有一个或多个效应子功能，在一些实施方案中，抗体不具有抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)活性和/或无补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，抗体不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，抗体不具有效应子功能。

本发明还包括与本文中所示的嵌合、人源化和人抗体或其抗体片段大体上同源的变体和等同物。此类变体和等同物可包含例如保守置换突变，即一个或多个氨基酸被相似氨基酸的置换。

实施例

实施例1

免疫球蛋白恒定区-CD4构建体的产生

构建体经设计包含信号序列、FLAG表位标签、鼠IgG1的铰链区以及CH2和CH3结构域和人CD4的跨膜结构域(TM)和细胞内结构域(ICD)，称为膜-MAb(mIgG1)。第二构建体经设计包括信号序列、FLAG表位标签、人IgG2的铰链区以及CH2和CH3结构域和人CD4的跨膜结构域(TM)和细胞内结构域(ICD)，称为膜-MAb(hIgG2)。第三构建体经设计包括信号序列、FLAG表位标签、人IgG2的铰链区以及CH2和CH3结构域、人CD4的跨膜结构域(TM)和细胞内结构域(ICD)以及在C末端上的绿色荧光蛋白(GFP)，称为膜-MAb(hIgG2)-GFP(图6A)。

每一个构建体中使用的铰链区的部分经设计包括参与轻链配对的半胱氨酸的残基C末端。膜-MAb(mIgG1)构建体按下列顺序设计，信号序列-FLAG-mIgG1(铰链-CH2-CH3)-hCD4(TM/ICD)并且示于SEQ ID NO:24(核苷酸序列)和SEQ ID NO:22(具有信号序列的氨基酸序列)中。膜-MAb(hIgG2)构建体按下列顺序设计，信号序列-FLAG-hIgG2(铰链-CH2-CH3)-hCD4(TM/ICD)并且示于SEQ ID NO:25(核苷酸序列)和SEQ ID NO:23(具有信号序列的氨基酸序列)。膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体按下列顺序设计，信号序列-FLAG-hIgG2(铰链-CH2-CH3)-hCD4(TM/ICD)-GFP并且示于SEQ ID NO:27(核苷酸序列)和SEQ ID NO:26(具有信号序列的氨基酸序列)。膜-MAb(hIgG2)和膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体经设计在CD4细胞内结构域内具有修饰以除去lck蛋白质结合位点。通过化学合成产生构建体，利用标准技术将其克隆入哺乳动物表达载体质粒。

实施例2

细胞系的产生

用实施例1中描述的膜-MAb(mIgG1)构建体稳定转染鼠杂交瘤融合伴侣细胞系SP2/0-Ag14。按照制造商的程序L-013的说明书，使用 Nucleofection试剂盒V(Lonza)利用2ug膜-MAb(mIgG1)构建体转染2x 10⁶个SP2/0细胞。24小时后，将细胞置于0.8mg/ml G418选择下，并且进行培养扩增。转染后2周，通过FACS分析表征细胞的膜-MAb(mIgG1)构建体的细胞表面表达。此类细胞命名为SP2/0-MT。将5 x 10⁶个转染的细胞与荧光基团标记的抗-FLAG抗体或同种型阴性对照抗体(10μg/ml)一起在冰上温育30分钟。洗涤细胞，将其重悬浮于DMEM/10%FBS，利用流式细胞术分析其。图2A显示阴性对照抗体(左图框)的流式细胞术结果和如利用抗-FLAG抗体(右图框)检测的表达膜-MAb(mIgG1)多肽的细胞的数目。

利用FACS以1个细胞/孔将表达膜-MAb(mIgG1)构建体的细胞分选至96孔板中并且在利用0.5mg/ml G418的选择下进行培养生长。10天后，如上所述，利用流式细胞术分析来自每一个孔的细胞克隆的膜-MAb(mIgG1)构建体的表达，并且选择5个亚克隆。如图2B中显示的，观察到亚克隆SP2/0-MT.3具有最高水平的膜-MAb(mIgG1)构建体的表达。

实施例3

使用膜-MAb技术分离杂交瘤

产生鼠Frizzled 5(FZD5)和鼠Frizzled 8(FZD8)的fri-结构域的重组多肽片段以用作用于抗体生成的抗原。将标准重组DNA技术用于分离编码FZD5的氨基酸27-157(SEQ ID NO:19)和FZD8的氨基酸28-158(SEQ ID NO:20)的多核苷酸。将多核苷酸于读框中以N末端连接于组氨酸-标签，然后克隆入转移质粒载体以用于在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。使用标准转染、感染和细胞培养方案生成表达相应的FZD多肽的重组昆虫细胞。

使用标准技术，用FZD5和FZD8抗原蛋白免疫小鼠(n=3)。在初始免疫后约70天使用ELISA和FACS分析筛选个体小鼠血液的抗原识别。选择两只具有最高抗体滴度的动物进行终抗原加强，之后分离脾细胞。使用标准杂交瘤融合技术将分离的脾细胞与实施例2中描述的SP2/0-MT细胞系融合。所得的杂交瘤文库命名为54L1。

利用标记的FZD5和标记的FZD8多肽筛选文库54L1。对于标记的FZD5，按照制造商的方案(InVitrogen/Molecular Probes)，将鼠His-标记的fri-结构域FZD5以15∶1的染料∶蛋白质比率缀合至Alexa Fluor^TM 488染料。对于标记的FZD8，按照制造商的方案(InVitrogen/Molecular Probes)，将鼠His-标记的fri-结构域FZD8以15∶1的染料∶蛋白质比率缀合至Alexa Fluor^TM 647染料。将杂交瘤细胞以1x 10⁷个细胞/ml与AlexaFluor^TM 488-标记的FZD5(10μg/ml)和Alexa Fluor 647-标记的FZD8(10μg/ml)一起在室温下温育30分钟。洗涤细胞，将其重悬浮于DMEM/10%FBS中，利用流式细胞术分析所述细胞(图3)。通过FACS以1个细胞/孔将被Alexa Fluor 488-标记的FZD5和Alexa Fluor 647-标记的FZD 8结合的单个杂交瘤细胞分选入96孔组织培养板。作为对照，将来自54L1文库的单个细胞以1个细胞/孔随机分选入96孔组织培养板。将板温育10天以使杂交瘤细胞增殖，筛选来自每一个孔的上清液的可结合FZD5和FZD8蛋白的抗体的存在。

对于通过FACS的筛选，用编码FZD5或FZD8和转染标记GFP的全长cDNA克隆的表达载体共转染HEK-293细胞。转染后24至48小时，收集HEK-293细胞，将其与抗-FZD5/8杂交瘤上清液或对照IgG一起在冰上温育。洗涤细胞，利用缀合至荧光生色团的抗小鼠第二抗体检测结合的一抗。随后利用FACS分析标记的细胞以鉴定特异性识别天然FZD5和/或FZD8的细胞表面表达的抗体。

SP2/0-MT融合伴侣细胞系和膜-MAb技术的使用导致从576个克隆中选出526个能够结合FZD5和FZD8的克隆(91%)。相反地，随机克隆的对照文库筛选导致从1705个克隆中仅选出11个能够结合FZD5和FZD8的克隆(0.6%)(参见表1)。因此，膜-MAb技术的使用导致对于FZD5和FZD8是特异性的杂交瘤的鉴定显著增加。

表1

	FACS阳性/测试的总克隆	亲代细胞阳性
			随机克隆	11/1705	0.6%
分选的克隆	526/576	91%

如图3中显示的，文库54L1中仅有小百分比的细胞展示对FZD5、FZD8或FZD5和FZD8的结合。膜-MAb技术使得能够直接鉴定和选择生成结合FZD5和FZD8的抗体的细胞。对于本领域技术人员来说应当很清楚，生成仅结合FZD5或仅结合FZD8的抗体的细胞还可通过膜-MAb技术来选择。

实施例4

使用膜-MAb技术分离杂交瘤

产生人DDR2的细胞外结构域的重组多肽片段以用作抗体产生的抗原。将标准重组DNA技术用于分离编码DDR2的氨基酸1-399(SEQ ID NO:21)的多核苷酸。将该多核苷酸于读框中以N末端连接至组氨酸-标签，然后克隆入转移质粒载体以用于在昆虫细胞中进行杆状病毒介导的表达。可将标准转染、感染和细胞培养方案用于产生表达相应的DDR2多肽的重组昆虫细胞。

使用标准技术利用纯化的DDR2抗原蛋白免疫小鼠(n=3)。在初始免疫后约70天使用ELISA和FACS分析筛选个体小鼠的血液的抗原识别。选择了两只具有最高抗体滴度的动物用于终抗原加强，之后分离脾细胞，利用标准杂交瘤融合技术将其用于生成DDR2杂交瘤文库。

用膜-MAb(mIgG1)构建体(实施例1中描述的)转染DDR2文库的一部分。按照制造商的程序L-013的说明书，使用 Nucleofection试剂盒V(Lonza)转染文库。使用30μg膜-MAb(mIgG1)构建体(“膜-MAb文库”)转染3x 10⁷个细胞。24小时后，利用标记的DDR2多肽筛选转染的细胞。对于标记的DDR2，按照制造商的方案(InVitrogen/Molecular Probes)，将DDR2肽(如上所述制备的)以15∶1的染料∶蛋白质比率缀合至Alexa Fluor^TM 488羧酸琥珀酰亚胺酯染料。将膜-MAb文库以1x 10⁷个细胞/ml与Alexa Fluor 488-标记的DDR2(20μg/ml)和PE-标记的抗-FLAG抗体一起在冰上温育30分钟。洗涤细胞，将其重悬浮于DMEM/10%FBS中，利用流细胞术进行分析。如图4中显示的，在文库中仅有小百分比的细胞展示对DDR2和抗-FLAG抗体的结合。

通过FACS以1个细胞/孔将被Alexa Fluor 488-标记的DDR2和PE-标记的抗-FLAG抗体结合的单个杂交瘤细胞分选入96孔组织培养板。将来自相同文库的随机个体细胞沉积在96孔组织培养板的孔中用作对照。将板温育10天以使杂交瘤细胞增殖，随后筛选来自每一个孔的上清液的可结合全长DDR2蛋白的抗体的存在。

对于利用FACS的筛选，用编码DDR2和转染标记GFP的全长cDNA克隆的表达载体共转染HEK-293细胞。转染后24至48小时，收集HEK-293细胞并且将其与抗-DDR2杂交瘤上清液或对照IgG一起在冰上进行温育。洗涤细胞，利用缀合至荧光生色团的抗小鼠第二抗体检测结合的一抗。随后利用FACS分析标记的细胞以鉴定特异性识别天然DDR2的细胞表面表达的抗体。

膜-MAb技术的使用导致从168个克隆中选出141个能够结合DDR2的克隆(84%)。相反地，随机克隆的对照文库筛选导致从202个克隆中仅选出16个能够结合DDR2的克隆(8%)(参见表2)。因此，膜-MAb技术的使用导致生成特异性抗体的细胞的鉴定显著增加。

表2

	FACS阳性/测试的总克隆	亲代细胞阳性
			随机克隆	16/202	8%
分选的克隆	141/168	84%

实施例5

293-hMT细胞系的产生

用膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体稳定地转染HEK-293细胞以产生稳定地表达膜-MAb(hIgG2)-GFP多肽的细胞系(实施例1中描述的和图6C中描述的)。按照制造商的说明书，使用FuGENE转染剂(Roche，Indianapolis，IN)，用8ug的膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体转染5x 10⁶个HEK-293细胞。24小时后，将细胞置于0.8mg/ml G418选择下，于培养中增殖。转染后2周，通过FACS分析表征细胞的膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体的表达。筛选转染的细胞的亚克隆的GFP表达，图5显示10个克隆的流式细胞术结果。

实施例6

单个基因抗体构建体和文库

将亲代抗体支架命名为单个蛋白质或单链抗体(scAb)构建体，其中将抗体轻链的恒定区的羧基末端经(GGGGS)₆肽接头连接于重链可变区的氨基端。保留铰链区中的半胱氨酸残基以允许两条重链之间或一条重链与膜-MAb构建体之间的二硫键。单个基因抗体的轻链编码可变区和人恒定区。单个基因抗体的重链编码可变区和人IgGCH1、CH2和CH3结构域。表达载体被构建来产生单链抗体并且在本文中称为MAbLib构建体。这样设计载体以便轻链可变区和重链可变区各自被唯一的限制酶切位点侧翼连接，所述限制酶切位点允许除去轻链可变区和/或重链可变区以及插入新的和不同的可变区(如图6B中描述的)。可将MAbLib构建体用于产生许多单链抗体(scAb)文库。

利用本领域技术人员公知的方法，从人cDNA PCR扩增轻链和重链可变区。将包含限制酶切位点EcoRv或BsiWI的引物用于轻链可变区的PCR反应。将包含限制酶切位点MfeI或BlpI的引物用于重链可变区的PCR反应。纯化包含轻链可变区的PCR产物，用EcoRv和BsiWI降解，将其克隆入类似降解的亲代MAbLib载体(上文中描述的)。这产生了在轻链可变区中具有多样性的scAb文库。随后，纯化含重链可变区的PCR产物，用MfeI和BlpI降解，然后将其克隆入类似降解的含有多种轻链可变区的scAb文库。这产生了在轻链和重链可变区中具有多样性的scAb文库。本领域技术人员将理解可在插入轻链可变区之前将重链可变区插入亲代MAbLib载体。

实施例7

异二聚体抗体分子在HEK-293细胞表面上的表达

为了验证异二聚体抗体分子在细胞表面上的形成，用编码抗-DLL4单链抗体的DNA和编码膜-MAb(hIgG2)-GFP蛋白的DNA转染HEK-293细胞。设计编码21M18轻链、(GGGGS)₆接头、21M18可变重链和CH1结构域的合成多核苷酸。多核苷酸利用DNA2.0(Menlo Park CA)来合成并且被克隆入MAbLib以产生编码在实施例6中如上所述的单链21M18抗体(sc21M18)(sc21M18 SEQ ID NO:33，核苷酸序列；SEQ IDNO:34，氨基酸序列)的载体。抗-hDLL4抗体21M18先前已描述于美国专利No.7,750,124中。以一系列浓度(25、250、2500和25000ng/ml)转染sc21M18质粒DNA，48小时后收获细胞。作为对照，仅用sc21M18DNA(-▲-)，仅用膜-MAb(hIgG2)-GFPDNA(-▲-)转染细胞，或不转染细胞(-◆-)。为了检测细胞表面上的功能抗-DLL4抗体分子，将转染的细胞与hDLL4-rFc融合蛋白一起温育。利用PE-标记的抗-兔Fc抗体检测结合的hDLL4-rFc。通过FACS分析细胞，测定细胞群体的平均荧光强度(MFI)。如图7中显示的，仅有用抗-DLL4sc21M18 DNA和膜-MAb(hIgG2)DNA(-X-)转染的细胞表达具有特异性结合DLL4-rFc蛋白的功能性结合位点的膜结合的分子。

实施例8

使用载体质粒调节抗体分子的展示

用质粒瞬时转染哺乳动物细胞通常导致每细胞多个拷贝的质粒。每细胞拷贝数可从100个变化至10,000个。每细胞绝对数目取决于多个因素，包括但不限于转染方案、转染剂、质粒质量、质粒大小和细胞密度。在一些实施方案中，在产生细胞表面展示抗体的文库中，期望调节被引入细胞的编码抗体的质粒(或Ab文库质粒)的量。为了调节Ab文库质粒在细胞中的质粒拷贝数，可使用单独的“载体”质粒。将载体质粒与Ab文库质粒混合，其可占据一些可用“质粒空间”。为了调节被细胞占据的Ab文库质粒的数目，将载体质粒与Ab文库质粒以不同的比率混合，随后转染入细胞。

测试载体质粒对Ab-编码质粒的转染和展示的影响。用不同比率的载体质粒转染上述单链抗-DLL4抗体(sc21M18)。在本研究中，载体质粒编码无关单个蛋白质抗体(sc18R5)。也用膜-MAb(hIgG2)-GFP构建体转染细胞。Ab文库质粒在细胞中的浓度可从抗-DLL4抗体分子的细胞表达的水平推断出来。用质粒DNA转染约5x 10⁶个HEK-293细胞，48小时后收获。质粒DNA为sc21M18和sc18R5的混合物，其中sc21M18对sc18R5的比率从sc18R5的1倍过量变化至10,000倍过量(1、10、100、1000或10,000倍过量)。为了检测细胞表面上的功能性抗-DLL4抗体分子，用hDLL4-rFc融合蛋白温育转染的细胞。利用PE-标记的抗-兔Fc抗体检测结合的hDLL4-rFc。通过FACS分析测定表达抗-DLL4抗体的细胞的百分比。还用对照抗原(hJag-rFc，-■-)或仅用PE-标记的抗-兔Fc抗体(-■-)温育细胞。如图8中显示的，载体质粒DNA的量对在转染的细胞表面上表达抗-DLL4抗体的细胞的百分比具有显著影响。

实施例9

筛选抗体文库的方法

使用抗-DLL4抗体sc21M18质粒DNA进行研究以验证膜-MAb技术和选择方法。将sc21M18质粒DNA与无关抗体sc18R5质粒DNA混合，其中sc18R5DNA以100,000倍过量。用7.5x l0^-6μgsc21M18质粒DNA、0.75μgsc18R5质粒DNA、14.3μg载体质粒(卡那霉素质粒)和15μg编码膜-MAb(hIgG2)-GFP的质粒转染HEK-293细胞。48小时后收获细胞。为了检测细胞表面上的功能性抗-DLL4抗体，用hDLL4-rFc融合蛋白温育转染的细胞。用PE-标记的抗-兔Fc抗体检测结合的hDLL4-rFc。通过FACS分析和分选标记的细胞以鉴定和分离表达抗-DLL4抗体的细胞。将hJag-rFc用作对照，因为该抗原将不被抗-DLL4抗体识别。分离来自FACS分选的细胞的质粒DNA，将其在细菌中进行扩增。将扩增的质粒DNA(与载体质粒和编码膜-MAb(hIgG2)-GFP的质粒组合)用于转染新鲜HEK-293细胞，进行另一轮选择。重复该扩增和选择过程4次，FACS结果示于图9中。表3显示在每一轮选择后对于抗-DLL4抗体的表达为阳性的细胞的百分比。该研究证明表达抗-DLL4抗体的细胞被鉴定并且在4轮选择中被富集，尽管sc21M18 DNA已在无关抗体DNA的背景中被高度稀释。

表3

实施例10

抗-VEGF抗体文库的产生和至293-hMT细胞内的转染

使用实施例6和7中描述的表达sc21M18的MAbLib构建体和来自用人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)免疫的小鼠的免疫球蛋白cDNA产生抗体文库。通过hVEGF的腹膜内注射免疫3只Balb/c小鼠。初始注射包含完全弗氏佐剂中的hVEGF。随后的注射包含不完全弗佐剂中的hVEGF。在3个月的过程中进行总共4次腹膜内注射。小鼠通过静脉内尾静脉注射接收最终的PBS中的hVEGF的注射。终注射后1周，从免疫的小鼠收集脾和淋巴结。分离RNA，产生cDNA。利用PCR扩增编码鼠重链可变区的DNA，分离和纯化所述DNA。利用Mfel和BlpI降解PCR产物，将其克隆入类似降解的sc21M18构建体，从而用来自hVEGF免疫的小鼠的多个鼠重链可变区替代SEQ ID NO:33的重链可变区。对于该文库，使21M18轻链保持恒定。

构建与上文库描述相似(除了用多个人κ链可变区替代21M18轻链外)的文库的第二VEGF文库。使用人κ链特异性引物从混合的人cDNAPCR扩增人κ链可变区。分离、纯化PCR产物，利用EcoRV和BsiWI降解所述产物，将其克隆入类似降解的来自第一VEGF文库的质粒DNA，从而替代21M18轻链可变区。

用两个抗-VEGF抗体文库转染293-hMT细胞。

应理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且根据其的各种变动或改变对于本领域技术人员是理解的，并且包括在本申请的精神和范围内。

本文所提及的全部公开、专利和专利申请为了所有目的都通过引用以其整体并入，其引用程度就如同将每一个别公开、专利或专利申请明确且个别地通过引用如此并入。

Claims (20)

1.一种鉴定生成目标异二聚体分子的哺乳动物细胞的方法，包括：

(a)用编码至少一种第二多肽的多核苷酸转染表达第一多肽的哺乳动物细胞，

其中，所述第一多肽包含：(i)细胞外部分，所述细胞外部分包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和(ii)非免疫球蛋白跨膜部分；且所述第一多肽不包含免疫球蛋白可变区；

其中，所述第二多肽包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链结合并形成抗原结合位点；并且

其中，包含所述第一多肽和所述第二多肽的异二聚体分子在所述哺乳动物细胞的表面上表达；

(b)将所述哺乳动物细胞与检测分子接触，其中，所述检测分子结合所述异二聚体分子；和

(c)鉴定被所述检测分子结合的哺乳动物细胞。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括用编码所述第一多肽的多核苷酸转染所述哺乳动物细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述第一多肽的所述多核苷酸被瞬时转染或稳定转染到所述哺乳动物细胞中。

4.如权利要求1所述的方法，其中，编码至少一种第二多肽的所述多核苷酸包含DNA文库。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述DNA文库从初次接触实验的动物的哺乳动物细胞或从免疫动物的哺乳动物细胞产生。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二多肽包含具有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的单链免疫球蛋白。

7.一种鉴定生成目标异二聚体分子的哺乳动物细胞的方法，包括：

(a)将第一哺乳动物细胞与抗体生成哺乳动物细胞融合，

其中，所述第一哺乳动物细胞表达第一多肽，所述第一多肽包含：(i)细胞外部分，所述细胞外部分包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区；和(ii)非免疫球蛋白跨膜部分；且所述第一多肽不包含免疫球蛋白可变区；

其中，来自所述抗体生成哺乳动物细胞的第二多肽包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链结合并形成抗原结合位点；并且

其中，包含所述第一多肽和所述第二多肽的异二聚体分子在融合的细胞的表面上表达；

(b)将融合的细胞与检测分子接触，其中，所述检测分子结合所述异二聚体分子；和

(c)鉴定被所述检测分子结合的融合的细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体生成哺乳动物细胞选自由B-细胞、浆细胞、杂交瘤、骨髓瘤和重组细胞组成的组。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体生成哺乳动物细胞来自初次接触实验的动物或来自免疫动物。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述第一多肽的非免疫球蛋白跨膜部分包含至少一部分选自由CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD19、T-细胞受体α链和β链、CD3、ζ链、ICAM1(CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b和CD2组成的组的跨膜结构域。

11.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述第一多肽选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQID NO:30、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:31。

12.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述第一多肽与所述第二多肽形成至少一个二硫键以形成所述异二聚体分子。

13.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，其中标记所述检测分子。

14.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，鉴定被所述检测分子结合的哺乳动物细胞包括利用流式细胞术或荧光激活细胞分选术(FACS)。

15.如权利要求1～9中任一项所述的方法，所述方法还包括：

(d)分离被所述检测分子结合的哺乳动物细胞。

16.一种用权利要求1～15中任一项所述的方法鉴定的哺乳动物细胞。

17.一种产生细胞文库的方法，所述细胞文库在哺乳动物细胞表面上表达异二聚体分子，所述方法包括：

用编码多种第二多肽的多种多核苷酸转染表达第一多肽的一群哺乳动物细胞，

其中，所述第一多肽包含：(i)细胞外部分，所述细胞外部分包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链恒定区，和(ii)非免疫球蛋白跨膜部分；且所述第一多肽不包含免疫球蛋白可变区；

所述第二多肽包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链结合并形成抗原结合位点；并且

其中，包含所述第一多肽和一种所述第二多肽的异二聚体分子在所述哺乳动物细胞的表面上表达。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述第一多肽的非免疫球蛋白跨膜部分包含至少一部分选自由CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD19、T-细胞受体α链和β链、CD3、ζ链、ICAM1(CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b和CD2组成的组的跨膜结构域。

19.如权利要求17所述的方法，其中，所述第一多肽选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:31。

20.一种哺乳动物细胞文库，每一个哺乳动物细胞包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含：

(i)细胞外部分，所述细胞外部分包含含有CH2和CH3结构域的免疫球蛋

白重链恒定区，和

(ii)非免疫球蛋白跨膜部分；

且所述第一多肽不包含免疫球蛋白可变区；

和

(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽，所述免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链结合并形成抗原结合位点；

其中所述第一多肽和第二多肽形成异二聚体分子。