CN102805730A - 神经酰胺脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及神经酰胺脂质体及其制备方法和用途。所述神经酰胺脂质体包括治疗有效量的活性成分和类脂双分子层薄膜，其特征在于：所述活性成分的重量份为0.5-20份，活性成分为神经酰胺；所述类脂双分子层薄膜的重量份为10-350份，包括下述重量份的组分：磷脂类物质5-100份，胆固醇0.5-10份，表面活性剂0-100份，附加剂0-20份，有机溶剂0.5-10份。所述制备方法是将神经酰胺、磷脂类物质、胆固醇和附加剂充分溶解在有机溶剂中，将表面活性剂溶解在分散介质中，制得神经酰胺脂质体，然后将制得的神经酰胺脂质体的平均粒径降低至500nm以下且均匀分布。本发明还公开该神经酰胺脂质体在肿瘤治疗中的新用途。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体是涉及靶向给药制剂短链神经酰胺脂质体及其制备方法，以及其在肿瘤治疗中的新用途。
背景技术
恶性肿瘤已成为疾病死亡率排名第一的疾病，化疗是最主要的治疗手段之一。绝大多数晚期肿瘤患者均需要化疗，化疗是全身癌细胞扩散患者较有效的方法。但目前临床中化疗总的有效率仍不到30％，而且几乎所有的化疗药在治疗中都会产生多药耐药现象，从而进一步降低了化疗有效率。因此，如何提高化疗药物的治疗效果是肿瘤治疗的关键问题。
短链神经酰胺(C2、C4、C6、C8，首选C6)是由细胞膜神经鞘磷脂水解产生的一种脂质分子，其以高浓度存在于细胞膜中，属脂类分子家族，构成了鞘氨醇和脂肪酸。近年来发现它能够发挥细胞内第二信使的作用，介导了多种细胞生物学效应，包括细胞分化、生长抑制、凋亡、免疫反应等。神经酰胺还参与了JNK、p53、bcl-2、p21等抗癌基因的活化表达调控。最近研究表明放射线、化疗药物（紫杉醇、多柔比星、柔红霉素等）、氧化应激等能激活肿瘤细胞内神经酰胺信号系统，诱导细胞体内合成神经酰胺，促进细胞凋亡。此外，任何增强细胞内神经酰胺积聚的刺激都会产生促凋亡作用，不能产生足够神经酰胺的肿瘤细胞通常不能有效的进行凋亡。对大多数的肿瘤细胞来讲，内源性的神经酰胺并不能有效诱导肿瘤细胞凋亡。因此，外源性添加神经酰胺作为化疗增敏剂，从而有效增加化疗药物敏感性，降低化疗耐药是一个有效的治疗途径。
尽管如此，全身运用神经酰胺仍受其物理、化学性质影响。由于神经酰胺为疏水脂溶性，体内输送形成大的聚集体，难以到达肿瘤细胞内。即使加入增溶剂聚氧乙基蓖麻油配制成注射液也易引起较多并发症，如过敏反应及生物利用度低。脂质体对机体毒副作用小，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相溶性，易于被组织吸收。脂质体包裹药物为物理过程，不改变药物分子结构，当药物被包裹后可降低药物毒性，减小药物使用量，具有缓释和控释作用。因此，开发靶向肿瘤部位、长循环缓释功能的神经酰胺脂质体，以满足临床给药需求显得尤为重要。
目前，国内外尚无可用于肿瘤治疗的神经酰胺脂质体（包括注射或口服剂型），因此，我们的发明具有极好的创新性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，研制一种性质稳定且可工业化生产的神经酰胺脂质体（包括注射或口服剂型），同时提供了神经酰胺脂质体的制备方法，并公开该神经酰胺脂质体在肿瘤治疗中的新用途。
本发明的第一个目的通过以下的技术方案实现：
神经酰胺脂质体，包括治疗有效量的活性成分和类脂双分子层薄膜，其特征在于：所述活性成分的重量份为0.5-20份，活性成分为神经酰胺；所述类脂双分子层薄膜的重量份为10-350份，包括下述重量份的组分：磷脂类物质5-100份，胆固醇0.5-10份，表面活性剂0-100份，附加剂0-20份，有机溶剂0.5-10份。
作为本发明的进一步改进，所述的磷脂类物质选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、合成磷脂、氢化大豆卵磷脂中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述胆固醇选用以蛋黄、动物脑髓、羊毛脂为原料生产的天然胆固醇。
作为本发明的进一步改进，所述表面活性剂选自脱氧胆酸盐、胆酸盐、脱氧胆酸、胆酸、吐温-80、牛磺胆酸盐、泊洛沙姆中的一种或几种的组合物。
作为本发明的进一步改进，所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、乙醚、异丙醇中的一种或几种的混合物。
作为本发明的进一步改进，所述附加剂选自L-异亮氨酸、苹果酸、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、维生素C、维生素E、没食子酸丙酯、反丁烯二酸、L-半胱氨酸或PH缓冲剂磷酸盐、EDTA中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体加入长循环辅料，进行表面修饰制成长循环脂质体，所述长循环辅料长循环辅料与磷脂类物质的摩尔比为1:10-1:200；所述长循环辅料选自聚乙二醇-磷脂衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基聚唑啉、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、壳聚糖或聚乙烯醇。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体加入磁性修饰材料，进行表面修饰制成磁性脂质体；所述磁性修饰材料为超细磁粉。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体加入热敏辅助材料，进行表面修饰制成热敏脂质体；所述热敏辅助材料是本身具有热敏性的磷脂，包括二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）；或是高分子热敏聚合物，包括聚丙烯酸、聚磷脂酸；或是一种能够使脂质体的相变温度适合于肿瘤热疗温度的油性药物，包括榄香烯或野鸭子油。
传统的脂质体粒径较大，包封率低、稳定性差，特别容易被网状内皮系统的吞噬细胞将其从血循环中清除，从而减少到达肿瘤组织的药量。本发明对脂质体进行表面修饰，制成的长循环脂质体、磁性脂质体、热敏脂质体等能够进一步延长神经酰胺脂质体的血循环时间，提高神经酰胺脂质体的靶向性和生物利用度，降低毒副作用。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体分散相的平均粒径小于500nm。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体以注射液或固体粉剂的形式存在。固体粉剂的形式可以大大延长神经酰胺脂质体的存放时间，便于运输。
本发明的神经酰胺脂质体能以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉滴注、静脉注射。皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等，优选静脉注射。
作为本发明的进一步改进，所述神经酰胺脂质体包封率大于80%。
本发明的第二个目的通过以下的技术方案实现：
神经酰胺脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将神经酰胺、磷脂类物质、胆固醇和附加剂充分溶解在有机溶剂中，将表面活性剂溶解在分散介质中，采用薄膜分散法或有机溶剂注入法制得神经酰胺脂质体，然后采用超声、高压均质或挤出的方法将制得的神经酰胺脂质体的平均粒径降低至500nm以下且均匀分布。
所述薄膜分散法的详细操作为：将神经酰胺、磷脂类物质、胆固醇和附加剂充分溶解在有机溶剂中，将此溶液置于旋转蒸发器内，在40℃下减压去除有机溶剂，形成薄膜，然后加入含有表面活性剂的pH值为3.0~10.0的分散介质，制得神经酰胺脂质体。
所述有机溶剂注入法的详细操作为：将神经酰胺、磷脂类物质、胆固醇和附加剂充分溶解在有机溶剂中，将此溶液缓慢注入50-60℃的含有表面活性剂的pH值为3.0~10.0的分散介质中，用电子恒速搅拌器搅拌至有机溶剂除尽，再用所述的分散介质稀释至要求浓度，制得神经酰胺脂质体。
作为所述制备方法的进一步改进，所述分散介质为Tris缓冲液、水、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、5%葡萄糖水溶液或0.9%NaCl溶液；所述分散介质中的表面活性剂的重量浓度为1%-30%。
作为所述制备方法的进一步改进，在制得的神经酰胺脂质体中添加冻干粉保护剂，通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成冻干粉；所述冻干粉保护剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、甘氨酸、乳糖、山梨醇、木糖醇、果糖、甘油、阿拉伯胶和赖氨酸中的一种或几种；冻干粉保护剂：神经酰胺脂质体的重量份数配比为（10-20）：（0.5-6.0）。
本发明的第三个目的在于：
提供所述的神经酰胺脂质体在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明与现有技术相比，优点在于：
本发明制备的神经酰胺脂质体可对肿瘤具有一定的靶向性，长循环脂质体可显著提高脂质体在体内的循环时间，使药物更长期有效地靶向于肿瘤部位，和化疗药物（如：紫杉醇类和吉西他滨类药物等）联合运用能更有效诱导肿瘤细胞凋亡，降低化疗药物浓度和避免化疗耐药，延长了生物存活时间。
附图说明
图1是不同的药物或药物组合给药后对接种胰腺癌细胞的裸鼠移植瘤的平均肿瘤体积的影响情况曲线图。
图2是不同的药物或药物组合给药后对接种胰腺癌细胞的裸鼠移植瘤的最终大小的抑制情况实物图。
图3是不同的药物或药物组合给药后对接种胰腺癌细胞的裸鼠的平均存活时间的影响情况曲线图。
图4是不同的药物或药物组合给药后对接种胰腺癌细胞的裸鼠移植瘤的平均肿瘤体积的影响情况曲线图。
图5是不同的药物或药物组合给药后对接种胰腺癌细胞的裸鼠的存活率的影响情况曲线图。
图6是MTT法测得的不同的药物或药物组合对人MIA胰腺癌细胞株的细胞存活率的影响情况柱形图。
图7是MTT法测得的不同的药物或药物组合对人CaOV3卵巢癌细胞株的细胞存活率的影响情况柱形图。
图8是MTT法测得的不同的药物或药物组合对L3.6胰腺癌细胞株的细胞存活率的影响情况柱形图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
神经酰胺 20mg
蛋黄卵磷脂 20mg
胆固醇 200mg
乙醚 10ml
牛磺胆酸盐 30mg
制法：将30mg牛磺胆酸盐溶解在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，牛磺胆酸盐在磷酸盐缓冲液中的重量浓度为15%；将20mg神经酰胺、20mg蛋黄卵磷脂和200mg胆固醇溶解在乙醚中，然后将此溶液缓慢注入50-60℃的磷酸盐缓冲液中，用电子恒速搅拌器以600r/min转速搅拌至乙醚除尽，再用上述的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，即得神经酰胺脂质体，置4℃保存。
实施例2
神经酰胺 30mg
大豆卵磷脂 120mg
胆固醇 250mg
甲醇 10ml
乙醇 10ml
脱氧胆酸钠 40mg
制法：将40mg脱氧胆酸钠溶解在适量的摩尔浓度为20mmol/L的 Tris-HCl（PH7.5，含0.15mol/LNaCl）缓冲液中，脱氧胆酸钠在Tris-HCl缓冲液中的重量浓度为10%；将30mg神经酰胺溶于10ml甲醇中，120mg卵磷脂、250mg胆固醇溶于10ml乙醇中，将该两种溶液共同置于旋转蒸发器内，在40℃减压去溶媒，形成薄膜，然后加入上述的，然后加入上述的溶解有脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液，超声处理30min，即得神经酰胺脂质体，经喷雾干燥制得神经酰胺脂质体的冻干制剂。冻干制剂使用前只需充分水化短时震荡，就能重新形成神经酰胺脂质体。
实施例3
神经酰胺 100mg
大豆卵磷脂 1200mg
氢化饱和磷脂 300mg
胆固醇 100mg
神经节苷脂 50mg
无水乙醇 50ml
维生素E 50mg
制法：将100mg神经酰胺、1200mg大豆卵磷脂、300mg氢化饱和磷脂、100mg胆固醇、50mg神经节苷脂和6.5mg维生素E超声溶解于50ml无水乙醇中，将此溶液在旋转蒸发器内40℃减压去溶媒，形成薄膜，然后加入20mmol/L Tris-HCl（PH7.5，含0.15mol/LNaCl）缓冲液，超声处理30min，高压均质机循环均质5-6次，然后过0.22μm微孔滤膜，分装灌封得神经酰胺脂质体，经干燥得神经酰胺脂质体的冻干制剂。冻干制剂使用前只需充分水化短时震荡，就能重新形成脂质体。
实施例4
C6神经酰胺 250mg
大豆卵磷脂 1500mg
氢化饱和磷脂 500mg
胆固醇 150mg
维生素E 7.2mg
油酸 50mg
泊洛沙姆 50mg
无水乙醇 10ml
制法：将50mg泊洛沙姆溶解在适量的摩尔浓度为20mmol/L的 Tris-HCl（PH7.5，含0.15mol/LNaCl）缓冲液中，泊洛沙姆在Tris-HCl缓冲液中的重量浓度为15%；将250mg C6神经酰胺、1500mg大豆卵磷脂、500mg氢化饱和磷脂、150mg胆固醇、7.2mg维生素E和50mg油酸和超声溶解于10ml无水乙醇中，将此溶液在旋转蒸发器内40℃减压去溶媒，形成薄膜，然后加入，然后加入上述的溶解有泊洛沙姆的Tris-HCl缓冲液，超声处理30min，高压均质机循环均质5-6次，然后过0.22um微孔滤膜，分装灌封得神经酰胺脂质体，经干燥得神经酰胺脂质体的冻干制剂。冻干制剂使用前只需充分水化短时震荡，就能重新形成神经酰胺脂质体。
实施例5 ：双重靶向肿瘤的神经酰胺脂质体
C6神经酰胺 250mg
大豆卵磷脂 1500mg
氢化饱和磷脂 500mg
胆固醇 150mg
维生素E 7.2mg
油酸 50mg
泊洛沙姆 50mg
无水乙醇 10ml
双重靶向肿瘤的多肽：采用9-FMOC固相合成法合成，采用高效液相色谱法纯化，采用质谱鉴定。
制法：将50mg泊洛沙姆溶解在适量的摩尔浓度为20mmol/L的 Tris-HCl（PH7.5，含0.15mol/LNaCl）缓冲液中，泊洛沙姆在Tris-HCl缓冲液中的重量浓度为15%；将250mg C6神经酰胺、1500mg大豆卵磷脂、500mg氢化饱和磷脂、150mg胆固醇、7.2mg维生素E、50mg油酸超声溶解于10ml无水乙醇中，将此溶液在旋转蒸发器内40℃减压去溶媒，形成薄膜，然后加入上述的溶解有泊洛沙姆的Tris-HCl缓冲液，超声处理30min，高压均质机循环均质5-6次，然后过0.22um微孔滤膜，制得神经酰胺脂质体，在该神经酰胺脂质体中加入双重靶向肿瘤的多肽，神经酰胺脂质体：双重靶向肿瘤的多肽的摩尔比为1:50，经干燥得双重靶向肿瘤的神经酰胺脂质体的冻干制剂。该冻干制剂使用前只需充分水化短时震荡，就能重新形成神经酰胺脂质体。
实施例6：神经酰胺长循环脂质体的制备
神经酰胺 20mg
氢化大豆卵磷脂 200mg
胆固醇 100mg
PEG-DSPE 50mg
氯仿 30ml
α-生育酚 20mg
制法：将20mg神经酰胺、50mg PEG-DSPE、200mg氢化大豆卵磷脂、100mg胆固醇和20mgα-生育酚溶于30ml氯仿，置梨形瓶中，在氮气流下旋转蒸发，减压除去溶媒，然后真空干燥2-3天，得恒重薄膜，再加入适量的20mmol/L 的Tris-HCl缓冲液（PH7.0，含0.15mol/L NaCl），旋转摇动梨形瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温下平衡1天，探针超声处理15min，然后在500Kpa压力下通过微流态化期混合室，经60-80冲程的微流态化处理，使脂质体粒径小于100nm。然后用5.4%葡萄糖溶液透析除盐，得神经酰胺长循环脂质体，再经冷冻干燥剂制成冻干制剂。该冻干制剂使用前只需充分水化短时震荡，就能重新形成神经酰胺脂质体。
实施例7：神经酰胺热敏脂质体的制备
神经酰胺 0.4g
注射用豆磷脂 20g
胆固醇 2.4g
二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC） 5.0g
十八胺 0.1g
维生素E 0.2g
乙醚 200ml
制法：将0.4g的神经酰胺、20g的注射用豆磷脂、2.4g的胆固醇、5.0g的二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.2g的维生素E溶解于乙醚溶液中并倒入梨形瓶，再加入含有十八胺的少量PH缓冲剂磷酸盐溶液，超声使成均匀乳，旋转蒸发仪上减压除尽有机溶剂，使成凝胶，漩涡震荡间隔减压蒸馏，得白色均匀脂质体溶液，再用缓冲液定溶至200ml。通过加压过膜（0.22um）整粒除热源，分装至西林瓶中冷冻干燥，重复3次，得神经酰胺热敏脂质体。
实施例8：神经酰胺磁性脂质体的制备
神经酰胺 20mg
大豆卵磷脂 100mg
胆固醇 100mg
双鲸蜡磷脂酸 20mg
α-生育酚 20mg
乙醚 20ml
制法：将超细磁粉溶解在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，超细磁粉在磷酸盐缓冲液中的重量浓度为0.5%；将100mg卵磷脂、100mg胆固醇、20mg双鲸蜡磷脂酸、20mgα-生育酚和20mg神经酰胺溶于20ml乙醚中，减压蒸发去除有机溶剂至瓶内壁上形成一层脂质薄膜，加入上述的含有超细磁粉的磷酸盐缓冲液，在水溶型超声仪上超声至混合物形成单相体系，再减压蒸发至凝胶形成，继续减压蒸发至形成水性混浊液，充氮气，冰浴超声即得神经酰胺磁性脂质体，加入8%乳糖做支架剂，再经冷冻干燥剂制成冻干制剂。
实验例9：神经酰胺脂质体和化疗药物紫杉醇联合用药的抗胰腺癌作用。
实验动物：2个月龄的BALB/c雄性裸鼠（购自上海斯克莱实验动物公司），共40只。
试验方法：
我们选择实施例4和实施例5制得的神经酰胺脂质体，分别定义为神经酰胺脂质体1和神经酰胺脂质体2。
按以下方法建立在体裸鼠胰腺癌模型：裸鼠靠近右大腿皮下注射1×106的L3.6胰腺癌细胞株，2周后，待可见50mm3实体肿瘤后，根据静脉内给药量的不同，将裸鼠按每组10只分成4组，分别为不给药的对照组、紫杉醇组、紫杉醇+神经酰胺脂质体1组、紫杉醇+神经酰胺脂质体2组。
按前6天每天给药一次，后6天每2天给药一次的方式进行给药，共进行12天。每周2次记录肿瘤大小、裸鼠存活率和体重，共记录6周，记录结果见图1~图3。
图2中：a.对照，b.紫杉醇，c.紫杉醇+神经酰胺脂质体1，d.紫杉醇+神经酰胺脂质体2。
由图1~图3中可以看出：外源性单加紫杉醇，肿瘤大小、裸鼠存活率和不给药的对照组没有明显区别；但是联合或者组合给予紫杉醇和神经酰胺脂质体，却能够大幅抑制肿瘤生长，减少肿瘤体积，延长裸鼠存活时间，增加裸鼠存活率。此外该联合疗法对裸鼠体重影响不大，提示其对正常组织和细胞毒性作用有限。
以上的实验研究表明，短链神经酰胺紫杉醇和对接种胰腺癌细胞的裸鼠移植瘤均具有一定的抑瘤活性，但是单加外源性的短链神经酰胺或紫杉醇的抑瘤效果有限。短链神经酰胺及其药物制剂需要联合紫杉醇后才对接种胰腺癌细胞的裸鼠移植瘤具有显著的抑瘤活性。
实施例10：神经酰胺脂质体和化疗药物吉西他滨联合用药的抗胰腺癌作用。
实验动物：2个月龄的BALB/c雄性裸鼠（购自上海斯克莱实验动物公司），共30只。
试验方法：
吉西他滨是胰腺癌化疗的金标准药物。我们选择实施例6制得的神经酰胺脂质体。
按以下方法建立在体裸鼠胰腺癌模型：裸鼠靠近右大腿皮下注射1×106的L3.6胰腺癌细胞株，2周后，待可见50mm3实体肿瘤后，根据静脉内给药量的不同，将裸鼠按每组10只分成3组，分别为不给药的对照组、吉西他滨组、吉西他滨+神经酰胺脂质体组。
按前6天每天给药一次，后6天每2天给药一次的方式进行给药，共进行12天。每周2次记录肿瘤体积和裸鼠存活率，共记录6周，记录结果见图4、图5。
图4中： A.对照组（肿瘤双倍时间5.6天）； B.吉西他滨（肿瘤双倍时间5.4天）； C.吉西他滨+神经酰胺脂质体（肿瘤双倍时间是9.1天）；异体移植胰腺癌裸鼠肿痛生长曲线-吉西他滨5毫克/千克。
图5：异体移植胰腺癌裸鼠存活率
A.对照； B.吉西他滨； C.加吉西他滨+神经酰胺脂质体。
由图4、图5中可以看出：外源性单加吉西他滨，肿瘤体积、裸鼠存活率和不给药的对照组没有明显区别；但是联合或者组合给予吉西他滨和神经酰胺脂质体，却能够大幅抑制肿瘤生长，减少肿瘤体积，增加裸鼠存活率。
实施例11：神经酰胺脂质体对体外培养的人胰腺癌细胞株的增殖抑制试验。
试验细胞：人MIA胰腺癌细胞株，得自美国模式培养物集存库（ATCC）。
试验药品及试剂：神经酰胺（Avanti，USA），3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（sigma，USA）；胰蛋白酶（sigma，USA）；二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA）；DMEM细胞培养基（GIBCO，Invitragen，USA）；RPMI1640细胞培养液（GIBCO，Invitragen，USA）；胎牛血清（GIBCO，Invitragen，USA）；特级胎牛血清Fetal Bovine Serum（Hyclone）。
仪器：超低温冰箱（Nature，USA），倒置显微镜（NIKON,Japan），酶标仪（Bio-Tek Instruments， USA）；细胞培养箱（SANYO，Japan），超净工作台（FLC-哈尔滨东联仪器厂），PH计（Thermo orion，USA）。
实验方法：
按常规采用MTT法：将人MIA胰腺癌细胞株按常规方法传代培养，收集对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度为5*104个/ml左右。
将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180μl；置于37℃恒温培养箱培养24h。
将吉西他滨和神经酰胺脂质体（实施例6制得的神经酰胺脂质体）分别用DMEM细胞培养液配成梯度浓度（0.75μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml）的溶液。实验组加入各浓度的吉西他滨溶液（A）、神经酰胺脂质体+吉西他滨混合溶液（B），它们按上述浓度同时加入，每孔加入20μl，每组各设4个平行孔，并设空白孔（只加入DMEM细胞培养液）以调零。
在37℃培养箱培养48h，用移液枪将96孔培养板中的液体吸净，然后每孔加入30μl浓度为1mg/ml的MTT溶液，置37℃，5%CO2的培养箱继续培养4h。
弃上清，每孔加入二甲亚砜（DMSO）150μl，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm下检测每孔吸光度（A）值，然后用SPSS软件统计实验结果，具体如图6所示。
由图6可以看出，联合或者组合给予吉西他滨和神经酰胺脂质体大幅降低人MIA胰腺癌细胞株的存活率，导致人MIA胰腺癌细胞株大幅死亡，明显优于单用吉西他滨的抗胰腺癌作用。
实施例12：神经酰胺脂质体对体外培养的人卵巢癌细胞的增殖抑制试验。
试验细胞：人CaOV3卵巢癌细胞株，得自美国模式培养物集存库（ATCC）。
试验药品及试剂：神经酰胺（Avanti，USA），3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（sigma，USA）；胰蛋白酶（sigma，USA）；二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA）；DMEM细胞培养基（GIBCO，Invitragen，USA）；RPMI1640细胞培养液（GIBCO，Invitragen，USA）；胎牛血清（GIBCO，Invitragen，USA）；特级胎牛血清Fetal Bovine Serum（Hyclone）。
仪器：超低温冰箱（Nature，USA），倒置显微镜（NIKON,Japan），酶标仪（Bio-Tek Instruments，USA）；细胞培养箱（SANYO，Japan），超净工作台（FLC-哈尔滨东联仪器厂），PH计（Thermo orion，USA）。
实验方法：
按常规采用MTT法：将卵巢癌细胞株按常规方法传代培养，收集对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度为5*104个/ml左右。
将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180μl；置于37℃恒温培养箱培养24h。
将吉西他滨、神经酰胺脂质体1（实施例4制得的神经酰胺脂质体）和神经酰胺脂质体2（实施例5制得的神经酰胺脂质体）分别用DMEM细胞培养液配成梯度浓度（0.75μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml）的溶液。实验组加入各浓度的吉西他滨溶液（A）、神经酰胺脂质体1+吉西他滨混合溶液（B）、神经酰胺脂质体2+吉西他滨混合溶液（C）,它们按上述浓度同时加入，每孔加入20μl，每组各设4个平行孔，并设空白孔（只加入DMEM细胞培养液）以调零。
在37℃培养箱培养48h，用移液枪将96孔培养板中的液体吸净，然后每孔加入30μl浓度为1mg/ml的MTT溶液，置37℃，5%CO2的培养箱继续培养4h。弃上清，每孔加入二甲亚砜（DMSO）150μl，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm下检测每孔吸光度（A）值，然后用SPSS软件统计实验结果，具体如图7所示。
由图7可以看出，CaOV3人卵巢癌细胞株单加入外源性的吉西他滨溶液不同时间的细胞存活率有明显差别（细胞存活用通用的MTT方法检测）。联合或者组合给予吉西他滨和神经酰胺脂质体大幅降低了CaOV3人卵巢癌细胞的存活率，导致CaOV3人卵巢癌细胞株大幅死亡，明显优于单用吉西他滨的抗卵巢癌作用。
实施例13：神经酰胺脂质体与神经酰胺抗癌作用比较。
试验细胞：L3.6胰腺癌细胞株，得自美国模式培养物集存库（ATCC）。
试验药品及试剂：神经酰胺（Avanti，USA），3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（sigma，USA）；胰蛋白酶（sigma，USA）；二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA）；DMEM细胞培养基（GIBCO，Invitragen，USA）；RPMI1640细胞培养液（GIBCO，Invitragen，USA）；胎牛血清（GIBCO，Invitragen，USA）；特级胎牛血清Fetal Bovine Serum（Hyclone）。
仪器：超低温冰箱（Nature，USA），倒置显微镜（NIKON,Japan），酶标仪（Bio-Tek Instruments， USA）；细胞培养箱（SANYO，Japan），超净工作台（FLC-哈尔滨东联仪器厂），PH计（Thermo orion，USA）。
实验方法：
按常规采用MTT法：将L3.6胰腺癌细胞株按常规方法传代培养，收集对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度为5*104个/ml左右。
将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180μl；置于37℃恒温培养箱培养24h。
实验组共分为2大组，第一大组仅加神经酰胺或神经酰胺脂质体，第二大组在运用吉西他滨的基础上加神经酰胺或神经酰胺脂质体。A、B、C、D、E分别对应对照组、加神经酰胺脂质体1、加神经酰胺脂质体2、加C6神经酰胺（1μg/ml）、加C6神经酰胺（10μg/ml）。具体为：A组不加入神经酰胺，B组加1μg/ml的神经酰胺脂质体1（实施例4制得的神经酰胺脂质体），C组加1μg/ml的神经酰胺脂质体2（实施例5制得的神经酰胺脂质体），D组加游离态的1μg/ml的C6神经酰胺，E组加游离态的10μg/ml的C6神经酰胺；每孔加入20μl，每组各设4个平行孔，该五个实验组同时设对照组（只加入DMEM细胞培养液），以调零。
在37℃培养箱培养48h，用移液枪将96孔培养板中的液体吸净，然后每孔加入30μl浓度为1mg/ml的MTT溶液，置37℃，5%CO2的培养箱继续培养4h。弃上清，每孔加入二甲亚砜（DMSO）150μl，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm下检测每孔吸光度（A）值，然后用SPSS软件统计实验结果，具体如图8所示。
由图8可以看出：脂质体包裹的神经酰胺和吉西他滨联合用药后能更高效的促进胰腺癌细胞死亡。脂质体包裹的神经酰胺只需1μg/ml就可达到游离神经酰胺10μg/ml的效果，而同等低浓度的游离态神经酰胺对化疗药物诱导的癌细胞死亡几乎无影响（图8）。提示脂质体能有效促进神经酰胺进入细胞内，低浓度（游离浓度的10%）脂质体神经酰胺能大幅增加吉西他滨对胰腺癌的化疗敏感性。
Claims (10)
1. 神经酰胺脂质体，包括治疗有效量的活性成分和类脂双分子层薄膜，其特征在于：所述活性成分的重量份为0.5-20份，活性成分为神经酰胺；所述类脂双分子层薄膜的重量份为10-350份，包括下述重量份的组分：磷脂类物质5-100份，胆固醇0.5-10份，表面活性剂0-100份，附加剂0-20份，有机溶剂0.5-10份。
2.如权利要求1所述的神经酰胺脂质体，其特征在于：所述的磷脂类物质选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、合成磷脂、氢化大豆卵磷脂中的一种或几种；所述胆固醇选用以蛋黄、动物脑髓、羊毛脂为原料生产的天然胆固醇；所述表面活性剂选自脱氧胆酸盐、胆酸盐、脱氧胆酸、胆酸、吐温-80、牛磺胆酸盐、泊洛沙姆中的一种或几种的组合物；所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、乙醚、异丙醇中的一种或几种的混合物；所述附加剂选自L-异亮氨酸、苹果酸、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、维生素C、维生素E、没食子酸丙酯、反丁烯二酸、L-半胱氨酸或PH缓冲剂磷酸盐、EDTA中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的神经酰胺脂质体，其特征在于：所述神经酰胺脂质体加入长循环辅料，进行表面修饰制成长循环脂质体，所述长循环辅料长循环辅料与磷脂类物质的摩尔比为1:10-1:200；所述长循环辅料选自聚乙二醇-磷脂衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基聚唑啉、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、壳聚糖或聚乙烯醇。
4.如权利要求1所述的神经酰胺脂质体，其特征在于：所述神经酰胺脂质体加入磁性修饰材料，进行表面修饰制成磁性脂质体；所述磁性修饰材料为超细磁粉。
5.如权利要求1所述的神经酰胺脂质体，其特征在于：所述神经酰胺脂质体加入热敏辅助材料，进行表面修饰制成热敏脂质体；所述热敏辅助材料是本身具有热敏性的磷脂，包括二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）；或是高分子热敏聚合物，包括聚丙烯酸、聚磷脂酸；或是一种能够使脂质体的相变温度适合于肿瘤热疗温度的油性药物，包括榄香烯或野鸭子油。
6.如权利要求1所述的神经酰胺脂质体，其特征在于：所述神经酰胺脂质体分散相的平均粒径小于500nm；所述神经酰胺脂质体以注射液或固体粉剂的形式存在；所述神经酰胺脂质体包封率大于80%。
7.神经酰胺脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将神经酰胺、磷脂类物质、胆固醇和附加剂充分溶解在有机溶剂中，将表面活性剂溶解在分散介质中，采用薄膜分散法或有机溶剂注入法制得神经酰胺脂质体，然后采用超声、高压均质或挤出的方法将制得的神经酰胺脂质体的平均粒径降低至500nm以下且均匀分布。
8.如权利要求7所述的神经酰胺脂质体的制备方法，其特征在于：所述分散介质为Tris缓冲液、水、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、5%葡萄糖水溶液或0.9%NaCl溶液；所述分散介质中的表面活性剂的重量浓度为1%-30%。
9.如权利要求7所述的神经酰胺脂质体的制备方法，其特征在于：在制得的神经酰胺脂质体中添加冻干粉保护剂，通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成冻干粉；所述冻干粉保护剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐、甘氨酸、乳糖、山梨醇、木糖醇、果糖、甘油、阿拉伯胶和赖氨酸中的一种或几种；冻干粉保护剂：神经酰胺脂质体的重量份数配比为10-20：0.5-6.0。
10.权利要求1~6任一项所述的神经酰胺脂质体在制备抗肿瘤药物中的用途。
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