CN101579312B - 替尼泊甙脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可用于注射或口服的替尼泊甙脂质体。它的特点是用磷脂类物质包封替尼泊甙，制得粒径小、包封率高、稳定性好、毒副作用低的替尼泊甙脂质体。本发明制备的替尼泊甙脂质体提高了替尼泊甙的溶解度和稳定性，并降低其毒性，延长药物在血液中的循环时间，从而提高了药物的疗效，使本脂质体制成的制剂在临床应用上具有低毒性、低过敏性和高效性的特点。本发明还涉及替尼泊甙脂质体的制备方法，该制备工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。

Description

替尼泊甙脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域，具体涉及含有抗肿瘤活性成分替尼泊甙的脂质体，以及该脂质体的制备方法。

背景技术

肿瘤是一种常见病与多发病，对人民的生命健康威胁很大，在医学领域中是越来越受到重视的研究课题。全世界每年死于癌症者700万以上，现在癌症患者约3700万。在我国，每年约有130万人死于肿瘤，估计发病率在180-200万之间，总的发病率在不断上升。在我国多个大城市中，恶性肿瘤已超过心脑血管疾病，排在所有疾病死亡原因的第一位，而在35-59岁年龄段，肿瘤一直是第一杀手。由于过去许多威胁人民生命健康的烈性传染病得到了控制，人均寿命逐渐延长，诊断技术不断提高，但是人类环境中的致癌因素日渐增多，因此在很多国家，癌症居死亡原因首位或第二位。

目前肿瘤的治疗有手术、放疗、化疗，很大程度上以化疗为主。手术与放疗的顺应性差，而化疗又会给患者带来极大的毒副作用，在抑制和毒害增生活跃的肿瘤细胞的同时，对骨髓细胞、肠上皮细胞、毛发细胞、生殖细胞也同样产生抑制作用，同时容易产生耐药性而失去治疗作用。随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对生命、生活质量的要求也在不断提高，高效低毒抗肿瘤药物的出现也是众望所归。

替尼泊甙(teniposide，VM-26)是一种鬼臼毒素的半合成衍生物，属于植物来源的抗肿瘤药物。它是周期特异性细胞毒药物，抑制DNA拓扑异构酶II，导致双链或单链破坏使细胞有丝分裂停于S晚期或G2前期，从而阻碍肿瘤细胞分裂，抑制肿瘤生长。替尼泊甙疗效显著，其生物活性是同类型药物依托泊甙的5-10倍，且临床资料表明替尼泊甙副作用少，毒性较小，对肝、肾功能无影响。由于在临床具有广泛的抗肿瘤活性，替尼泊甙现广泛地应用于神经系统肿瘤、恶性淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、进展期胃癌等疾病的治疗，更因其中性亲脂特性，能透过血脑屏障，目前已成为治疗脑瘤的首选化疗药物。

然而，替尼泊甙在水中溶解度极低，因此在制备成制剂时存在一定困难。目前上市的替尼泊甙注射液，是50mg替尼泊甙溶解于5ml有机溶剂：二甲基甲酰胺、苯甲醇、聚氧乙烯蓖麻油、马来酸和乙醇，该注射液中含有大量聚氧乙烯蓖麻油，使用后可引起严重的过敏反应。因此替尼泊甙注射液说明书中明确标注使用本品期间或用药后可发生过敏样的反应，主要表现为寒战、发热、心动过速、支气管痉挛、呼吸困难以及低血压，它们可能是由于溶媒中的聚氧乙烯蓖麻油组分或替尼泊甙本身引起的。为此，医生在医嘱前必须了解病人的过敏史，如是否对替尼泊甙或聚氧乙烯蓖麻油过敏；在临床使用时，医务人员需密切观察病人的情况，必要时使用抗组胺药物以减轻过敏反应，结果是临床上使用十分不便，而且给病人带来极大痛苦。因此，迫切需要改变替尼泊甙的剂型，以增加替尼泊甙的水溶性，避免溶媒聚氧乙烯蓖麻油引起的过敏反应和替尼泊甙自身的毒副作用。

为减少因聚氧乙烯蓖麻油及替尼泊甙自身带来的不良反应，提高替尼泊甙的抗肿瘤疗效，国内外药学工作者致力于替尼泊甙新的给药系统的研究。中国专利文献(CN200610107688.8)将替尼泊甙制成稳定的注射用微乳制剂，该制剂保证替尼泊甙达到药效浓度的同时，基本消除了聚氧乙烯蓖麻油带来大的过敏反应；中国专利文献(CN200710099846.5)公开了采用吐温、二甲基乙酰胺、聚乙二醇、无机盐制备的替尼泊甙的注射剂，显著提高了替尼泊甙在水中的溶解度，避免或降低了临床使用中的过敏反应。尽管对替尼泊甙的制剂的研究取得了明显的进展。但目前这些新剂型多数处于实验室的研究阶段，大都不符合用药的安全性和工业化生产的要求，至今未见上临床、上市的报道。因此，急需寻求一种有效的制剂，可以在不增加药物剂量的情况下，延长药物的半衰期，提高药物的抗肿瘤效果，减少药物的毒副作用，增强药物的临床应用性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的替尼泊甙脂质体。本发明增加了替尼泊甙的水溶性，阻止药物析出晶体，既能消除现有制剂因聚氧乙烯蓖麻油引起的过敏反应，又能减少替尼泊甙自身的毒性反应，还能提高替尼泊甙的生物利用度及其治疗指数。

本发明的另一目的是提供上述替尼泊甙脂质体的制备方法，且制备方法灵活多样，均采用常规的工艺设备，可工业化规模、高效率生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

本发明的又一目的是提供一种替尼泊甙脂质体固体制剂，该固体制剂是上述替尼泊甙脂质体加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

本发明的再一目的是提供一种替尼泊甙注射剂或口服制剂，其是由上述的替尼泊甙脂质体制备而成的。

本发明所述的替尼泊甙脂质体，由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊甙       1-10份

磷脂类物质     1-100份

固醇           0-50份

附加剂         0-50份。

优选地，上述的替尼泊甙脂质体，由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊甙       1份

磷脂类物质     2-30份

固醇           0-10份

附加剂         0-10份。

进一步地，上述替尼泊甙脂质体的原料还可包含修饰材料0.1-50重量份。当脂质体原料中含有上述的修饰材料时，即为替尼泊甙长循环脂质体。

上述的磷脂类物质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、氢化卵磷脂、氢化大豆磷脂、心磷脂和脑磷脂及其混合物，其中优选卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂和脑磷脂及其混合物。

所述的固醇选自胆固醇、二氨胆固醇、大豆甾酰糖苷、大豆甾醇和麦角固醇，其中优选胆固醇。

所述的附加剂包括抗氧剂、表面活性剂和稳定剂。

其中所述的抗氧剂选自维生素E、维生素E酯、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、半胱氨酸和蛋氨酸中的一种或多种。

其中所述的表面活性剂选自脱氧胆酸盐、胆酸盐、脱氧胆酸、牛磺胆酸盐、胆酸、吐温-80、泊洛沙姆、汴泽和司盘中的一种或多种；

其中所述的稳定剂选自硬脂胺、磷脂酸、十四酸、油酸和甘油中的一种或多种。

所述的修饰材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、神经节鞘酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚乙二醇-磷脂衍生物或它们的混合物；其中聚乙二醇-磷脂衍生物可选用聚乙二醇-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱；其中所述的聚乙二醇的平均分子量为200-20000，优选平均分子量为2000-5000。

所述的替尼泊甙脂质体的粒径小于1000nm，优选粒径小于500nm。

本发明所述的替尼泊甙脂质体的制备方法，可以采用下述方法中的任意一种：

方法一：薄膜分散法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂按上述比例溶解于适量有机溶剂中，20-60℃下减压蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜，加入适量含水溶性附加剂的水相介质溶解脂膜，水合、超声或高压均质处理，即得替尼泊甙脂质体。

方法二：注入法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂溶于适量有机溶剂中制成脂质溶液，吸取该溶液缓缓注入含水溶性附加剂的水相介质中，注入完毕去除有机溶媒，然后可进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体。这里水相介质的温度为20-60℃。

方法三：逆向蒸发法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂按比例溶于有机溶剂，滴入含水溶性附加剂的水相介质，通过超声或高速剪切使形成稳定的W/O型乳剂，减压蒸去有机溶剂，滴加水相介质，旋转帮助器壁上的凝胶脱落，然后在减压下继续蒸发，制得水性混悬液，然后可进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体。

方法四：熔融法：按比例称取替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂于60-80℃加热熔融，加入含水溶性附加剂的水相介质混合，然后可进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体。

上述制备方法中，所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷及其混合物；所述的水相介质可以为纯水、磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、生理盐水溶液、甘露醇溶液或葡萄糖溶液，其中上述缓冲液的pH为4-8。

为进一步延长替尼泊甙脂质体的血液循环时间，提高替尼泊甙脂质体的靶向性和生物利用度，降低毒副作用，可进一步在上述制备脂质体的过程中(最好在磷脂类物质溶解熔融或水相介质配制过程)加入修饰材料，采用同样的工艺条件，制备成替尼泊甙长循环脂质体。

为延长替尼泊甙脂质体的存放时间，便于运输，可将本发明的替尼泊甙脂质体或其长循环脂质体通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成固体制剂；为防止干燥工艺中脂质体的聚集需加入支架剂，可以选择的支架剂为甘氨酸、丝氨酸、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖、右旋糖苷、氯化钠和白蛋白及其混合物，其用量按磷脂类物质重量比计算为1份磷脂加0.1-4份。

本发明制得的替尼泊甙脂质体加一定量的注射用水、生理盐水或葡萄糖注射液振荡水合后，即得本发明替尼泊甙脂质体注射剂。当然，也可以采用常规方法制备成口服制剂。

本发明的替尼泊甙脂质体能够以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉输注、静脉注射，优选静脉输注方式给予患者。

脂质体属于超微粒药物载体，具有淋巴系统定向性，属于靶向给药系统的一种新剂型。它具有类细胞结构，或是通过内吞作用进入溶酶体，然后被酶消化释放药物，或是通过细胞融合作用，即脂质膜材与细胞膜构成物相似而融合进入细胞内，继而被消化释放药物，使药物在靶区组织中维持较高浓度，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减小药物的给药剂量和降低药物的毒性；经脂质体携带后，可保护药物活性基团在内环境中不被降解，还可延长药物血中循环时间。

本发明将替尼泊甙包封于类脂双分子层中，制成一种超微球状脂质体，增加了药物的水溶性和稳定性，使包裹的替尼泊甙具有靶向性，能选择性到达病变部位、组织和细胞，且在更长时间内维持有效血药浓度，提供持续的治疗效果，从而增加替尼泊甙的疗效，降低不良反应。对替尼泊甙脂质体修饰得到的替尼泊甙长循环脂质体，缓慢释放药物，在体内可以逃匿MPS的捕获，延长脂质体在血液中的循环时间，达到缓释、靶向、长效的作用，从而提高替尼泊甙抗肿瘤活性。

采用本发明方法所制备的替尼泊甙脂质体和替尼泊甙长循环脂质体不含聚氧乙烯蓖麻油，能消除过敏反应；其平均粒径在1000nm以下，包封率大于80％；所得制剂稳定性好；且该制剂制备工艺成熟，方法简便易行，材料来源广，成本低，便于工业化生产。

具体实施方式

实施例1：

取替尼泊甙50mg、卵磷脂500mg、胆固醇40mg于50ml茄形瓶中，加入20ml乙醇∶丙酮(2∶1)超声使其充分溶解。茄形瓶置于40℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶内壁上形成一层脂质薄膜，缓慢加入10ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)，水合，涡旋振荡，使茄形瓶上的脂质薄膜完全溶解下来。混合液经室温超声分散(超声功率600W)30min，即制得替尼泊甙脂质体。其平均粒径为257nm，全部粒子均在500nm以下，粒径分布狭窄，表明脂质体大小较为均一；该脂质体可在室温下稳定数天并在4℃下稳定至少3个月，贮存期间观察不到沉淀。

实施例2

精密称取50mg替尼泊甙、200mg大豆磷脂、50mg脑磷脂、20mg大豆甾酰糖苷、10mg维生素E，用10ml乙醚将之溶解。然后将此溶液用注射器缓慢注入30ml含0.5％胆酸钠的生理盐水(40℃)中，用电子恒速搅拌器以2000r/min的转速搅拌至乙醚除尽，混合液高压均质(均质压力10000psi)5次，即得替尼泊甙脂质体，置4℃冰箱中保存备用。

实施例3

准确称取100mg替尼泊甙、2000mg氢化卵磷脂、800mg大豆甾醇、50mg 心磷脂、50mg硬脂胺于三角烧瓶中，加热熔融，置于75℃水浴中备用。将100mg泊洛沙姆188、400mg甘油、100mg维生素C溶于20ml 5％葡萄糖溶液中，加热至75℃，加入脂质熔融液中，高速剪切混合，经高压均质(均质压力15000psi)3次，即得替尼泊甙脂质体。

实施例4

准确称取100mg替尼泊甙、1500mg氢化豆磷脂、200mg二硬脂酰磷脂酰胆碱、300mg麦角固醇、50mg油酸溶于30ml氯仿∶甲醇(1∶1)混合溶剂中使完全溶解成澄明溶液，得有机相；另称取100mg吐温-80、100mg焦亚硫酸钠溶于10ml醋酸盐缓冲液(pH6.0)中，得水相；再将有机相与水相混合，经高速剪切(Fluko，12000rpm)5min得W/O初乳，然后于旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂，即得替尼泊甙脂质体。

实施例5

准确称取100mg替尼泊甙、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱1800mg、二棕榈酰磷脂酸100mg、二氨胆固醇400mg、十四酸100mg溶于30ml二氯甲烷得有机相。另称取500mg脱氧胆酸钠、100mg亚硫酸钠溶于10ml枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)中得水相；再将有机相与水相混合，经水浴式超声处理8min，直至形成稳定的W/O型乳剂(水浴温度控制在20℃)，然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去有机溶剂，达到胶态后滴加5ml枸橼酸盐缓冲液，水化，继续短时减压蒸发，经超声处理20min后，即得替尼泊甙脂质体。

实施例6

取替尼泊甙100mg、卵磷脂1000mg、二硬脂酰磷脂酰甘油100mg、胆固醇100mg、叔丁基对羟基茴香醚50mg于梨形瓶中，用10ml乙酸乙脂溶解后，旋转蒸发，30℃减压除去有机溶剂。真空干燥2-3天得恒重薄膜。加入10ml含10％蔗糖、10％甘露醇的tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH7.0，含0.15mol/L NaCl)，旋转摇动梨形瓶，得到脂质体悬液。经高压均质处理(均质压力12000psi)5次，药液于-40℃预冻24小时，于冷冻干燥机中冻干，冻干程序为：-40℃，8小时；-30℃，6小时；-20℃，6小时；-10℃，5小时；0℃，5小时；15℃，5小时。所得替尼泊甙脂质体冻干制剂加水复溶后平均粒径为136±31nm，全部粒子均在300nm以下。

实施例7

精密称取100mg替尼泊甙、1500mg大豆磷脂、150mg聚乙二醇(平均分子量4000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₄₀₀₀-DSPE)、50mg没食子酸丙酯，用10ml乙醇将之溶解。然后将此溶液用注射器缓慢注入30ml含0.5％牛磺胆酸钠溶液(60℃)中，用电子恒速搅拌器以1000r/min的转速搅拌至乙醇除尽，混合液经高压均质(均质压力10000psi)5次，即得替尼泊甙长循环脂质体，置4℃冰箱中保存备用。

实施例8

称取替尼泊甙100mg、卵磷脂1000mg、聚乙二醇(平均分子量200)-氢化大豆磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀-HSPE)100mg、胆固醇100mg、叔丁基对羟基茴香醚50mg于梨形瓶中，用10ml乙酸乙脂溶解后，旋转蒸发，30℃减压除去有机溶剂。真空干燥2-3天得恒重薄膜。加入10ml含10％山梨醇、5％右旋糖苷、5％白蛋白的溶液，旋转摇动梨形瓶，得到脂质体悬液。经超声处理(超声功率600W)20min，药液于喷雾干燥机中干燥，喷雾干燥条件为：进风温度120℃，进料速度50mL/min，旋风分离器压差50mm水，雾化盘转速2500r/min，收集得到替尼泊甙长循环脂质体固体制剂。

实施例9

准确称取100mg替尼泊甙、氢化卵磷脂1600mg、聚乙二醇(平均分子量1000)-二棕榈酰磷脂酰胆碱(PEG₁₀₀₀-DPPC)160mg溶于30ml二氯甲烷得有机相。另称取100mg硫代硫酸钠溶于10ml水中得水相；再将有机相与水相混合，经水浴式超声处理10min，直至形成稳定的W/O型乳剂(水浴温度控制在20℃)，然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去有机溶剂，加入1000mg乳糖、500mg葡萄糖、500mg海藻糖超声溶解，即得替尼泊甙长循环脂质体混悬液。该混悬液于微型喷雾干燥器中减压干燥，进口温度130～140℃，出口温度50～60℃，空气压力1.2Atm，加料速度60mL/min，即得替尼泊甙长循环脂质体喷雾干燥制剂。

实施例10

准确称取100mg替尼泊甙、2000mg卵磷脂、200mg聚乙二醇(平均分子量4000)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG₄₀₀₀-DPPE)于三角烧瓶中，加热熔融，置于80℃水浴中备用。将1000mg甘氨酸、500mg麦芽糖、1000mg甘露醇溶于20ml水中，加热至80℃，加入脂质熔融液中，高速剪切混合，经高压均质(均质压力15000psi)3次，即得替尼泊甙长循环脂质体。该混悬液于-80℃预冻10小时，于冷冻干燥器中冻干(冻干程序为-40℃，10小时；-20℃，8小时；0℃，8小时；20℃，5小时)，即得替尼泊甙长循环脂质体冻干制剂。

实施例11

取替尼泊甙50mg、卵磷脂1200mg、聚乙二醇(平均分子量3350)-二硬脂酰磷脂酰胆碱(PEG₃₃₅₀-DSPC)50mg溶于10ml乙醇，混合溶液在旋转蒸发器内40℃减压除去溶媒，形成薄膜。然后加入含1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的水溶液10ml，超声处理30min，制得替尼泊甙长循环脂质体悬液。加入8％乳糖和8％甘露醇作支架剂，经冷冻干燥得替尼泊甙长循环脂质体的冻干制剂。

替尼泊甙长循环脂质体的冻干制剂临用前只需充分水化短时振荡，就能重新形成脂质体。

实施例12

将聚乙二醇(平均分子量5000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₅₀₀₀-DSPE)50mg、氢化大豆磷脂200mg、胆固醇100mg、a-生育酚20mg和替尼泊甙50mg溶于30ml氯仿，置梨形瓶内，在氮气流下旋转蒸发，减压除去溶媒。真空干燥2～3天，得恒重薄膜。加入含0.5％PEG4000水溶液10ml，旋转摇动梨形瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温下平衡1天，探针超声处理15min，然后在10000psi均质压力下高压均质处理3次，使脂质体粒径逐渐减小。然后加入5％葡萄糖、5％甘露醇、6％海藻糖，冷冻干燥得替尼泊甙长循环脂质体。

实施例13

取实施例1中的替尼泊甙脂质体进行形态观察、并测定粒径及其分布。

取脂质体适量，加入适量注射用水稀释，用2％磷钨酸染色，透射电镜下观察粒子形态。

取脂质体悬液适量，加入适量水稀释，以Zetamaster光子相关光谱仪测定脂质体的粒径大小和分布以及Zeta电位。

结果：电镜下观察替尼泊甙脂质体呈均匀规则的球形粒子，无聚集和粘联。

实验测得的替尼泊甙脂质体粒径分布均匀，平均粒径为257nm，多分散指数为0.158，zeta电位为-26.4mv。

实施例14

取实施例1中的替尼泊甙脂质体进行包封率的测定。

包封率利用RP-HPLC方法测定，替尼泊甙脂质体溶液经透析法分离未包裹的替尼泊甙，用RP-HPLC测定游离替尼泊甙含量。色谱条件：用苯基-己基硅烷键合硅胶为填充剂(PhenomenexR LUNAPhenyl-Hexyl，250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈-水(20∶80)为流动相A，乙腈-水(56∶44)为流动相B，流速为1.25mL/min。先以流动相A 100％维持4min，流动相B以每分钟约3％的速率增加至35.5％，维持20min，流动相B再以每分钟约2.7％的速率增加至100％，维持30min，进样量10μl，220nm检测，按下列公式计算包封率。

包封率(％)＝(脂质体中替尼泊甙总量-游离替尼泊甙量)/替尼泊甙总量

结果：测得包封率为87.32％。

实施例15

取实施例6中的冻干品适量，密封，于冰箱4℃放置，于0、1、2、3、6月取样，对粒径、包封率、渗漏率、含量等指标进行测定，评价替尼泊甙脂质体冻干品的稳定性。结果见表1。

表1

表1说明，替尼泊甙脂质体冻干品在冰箱4℃放置6个月，其粒径、包封率、含量等质量指标基本不变，表明替尼泊甙脂质体冻干品稳定性好。

实施例16

取上述实施例中的替尼泊甙脂质体或长循环脂质体制剂进行刺激性实验。

(1)对家兔耳缘静脉血管刺激试验：

将替尼泊甙注射液的两种不同剂型按临床用药量(50mg/次)进行体表面积换算得出实验兔用剂量(2.5mg/kg)。实验前按1ml/kg的给药量用无菌生理盐水注射液新鲜配制。选用体重2.5-3.0kg的健康新西兰白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，3只白兔于右耳耳缘静脉注射替尼泊甙注射液，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照；另3只白兔于右耳耳缘静脉注射替尼泊甙脂质体，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照，注射速度为2.8ml/min(相当于人临床注射速度)。每日一次，连续3天，末次给药24小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，肉眼观察注射部位的反应情况，并解剖兔耳血管及周围组织作石蜡切片(注射部位下向心段1cm及5cm处)，染色，光镜检查。肉眼观察注射部位反应情况。结果见表2。

表2

结果，如表2所示，替尼泊甙脂质体血管刺激性明显弱于替尼泊甙注射液。

(2)肌肉刺激性试验

替尼泊甙注射液的剂量换算、药物配制、新西兰白兔的选择同上(共4只，每种剂型2只)。剪去白兔两侧股四头肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分别在右侧股四头肌注射替尼泊甙脂质体和替尼泊甙注射液1ml，左侧股四头肌注射等量无菌生理盐水注射液作对照，注射48小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应情况，确定反应级数。

0级：无变化

1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下

2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上

3级：重度充血，伴有肌肉变性

4级：出现坏死，有褐色变性

5级：出现广泛性坏死

然后算出4块股四头肌反应级数总和，如果股四头肌反应级数的最高值与最低值之差大于2，则应另取2只白兔重新实验。得到结果后，若四块股四头肌反应级数总和小于10，则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。

表3

结果(见表3)表明，替尼泊甙脂质体的肌肉刺激性明显弱于替尼泊甙注射液。

实施例17过敏试验

给药方法取适量替尼泊甙注射液用生理盐水稀释一定倍数，为样品A；取自制替尼泊甙脂质体用生理盐水稀释一定倍数，为样品B。替尼泊甙给药剂量为2.5mg/kg。取豚鼠12只，分成A、B两组，分别供样品A和B进行过敏性试验用。每组豚鼠6只，体重250～350g。隔天ip供试品0.5mL，连续3次。然后将A、B组豚鼠再分别平均分成A1、A2及B1、B2组，其中A1、B1组于首次注射后的第14天由后脚掌外侧静脉注入供试品1mL进行攻击，观察注射后动物有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克、死亡等反应，A2、B2组于首次注射后的第21天同样由后脚掌外侧静脉注入供试品并进行观察。

结果：替尼泊甙注射液：多次抓鼻、多次颤抖、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，两例动物出现大小便失禁；替尼泊甙脂质体：竖毛、少数动物颤抖。

根据豚鼠过敏反应级数标准表，对本试验进行评定，反应级数达2级以上(包括2级)时，可认为该供试品过敏反应试验阳性。

结果：A组为3级，B组为1级。即A组(市售替尼泊甙注射液)可导致明显的过敏反应，为阳性，而B组(自制替尼泊甙脂质体)过敏试验为阴性。

实施例18溶血实验

自新西兰白兔的颈总动脉取血20ml，置于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动数分钟后，除去纤维蛋白，取出血液，加等量生理盐水注射液，离心(1500rpm，10min)，除去上清液；沉淀的红细胞再加生理盐水注射液清洗。如此反复直到上清液透明，按红细胞的容量用生理盐水配成2％的混悬液。

取干净试管7支，分别编号，依次加入各液，第6管不加供试品作空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理盐水，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5、1、2、3小时观察是否有溶血现象发生。

结果表明，替尼泊甙注射液和替尼泊甙脂质体都未见溶血发生，两种剂型的溶血性实验均合格。

实施例19

取实施例10中的替尼泊甙脂质体冻干制剂溶于蒸馏水中，制成1mg/ml的溶液，在4℃，25℃和36℃放置四周，于8、12、16、20、24和28天高速离心收集沉淀，用HPLC法测定替尼泊甙含量，结果见表4。

表4

结果(表4)表明，替尼泊甙脂质体在4℃放置一个月，基本无渗漏；在25℃存放两周基本无渗漏；在35℃放置8天，浓度仅下降3％左右，放置12天，浓度变化10％；在环境温度不高于35℃的情况下，该脂质体能保持8天以上的稳定性，表明替尼泊甙脂质体稳定性好。

实施例20

利用实施例10中所述的制剂评价替尼泊甙脂质体的毒性。

取体重18～22g性别一致的昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，分别尾静脉注射替尼泊甙脂质体和替尼泊甙注射液，组间剂量按等比级数排列，比值1∶0.8，观察并记录给药10天内各组动物的反应和死亡率，用简化机率单位法计算LD₅₀，其95％的可信限为：

替尼泊甙注射液    LD₅₀＝18.2±1.2mg/kg，

替尼泊甙脂质体    LD₅₀＝38.4±1.6mg/kg。

LD₅₀毒性实验结果表明，替尼泊甙脂质体与替尼泊甙注射液相比，毒性明显降低。

实施例21药动学实验

将12只SD大鼠随机分成2组，实验前禁食一夜。甲组为对照组，于右后股静脉注射替尼泊甙注射液(1mg/ml)；乙组为受试组，于右后股静脉注射替尼泊甙脂质体，分别于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24小时眼眶取血0.5ml，置预先肝素化的尖底离心试管中，离心，分离出血浆。按一定方法处理后，取20μl进样，测定各血浆样品中替尼泊甙的浓度。

将实验所得血药浓度-时间数据用kinetita软件包处理，判断房室模型，同时进行统计矩分析，并将所得药动学参数经spss统计软件进行t检验。其中AUC_0-24和AUC_0-∞均为梯形法计算结果，C_max为实测值。结果见表5。

表5

^*P＜0.05；^**P＜0.01。

结果：替尼泊甙脂质体的MRT、AUC_0-24和AUC_0-∞分别是参比制剂替尼泊甙注射液的3.8、5.94和5.95倍，具有极显著差异；CL是参比制剂的0.38倍，具有极显著差异；这说明在同样剂量条件下，药物被脂质体包裹后延长了药物在血液中的滞留时间，使药物在体内消除速度变慢并保持了较高的血药浓度，从而有可能发挥长效作用。替尼泊甙脂质体改变了替尼泊甙在大鼠体内的药动学性质，具有一定的缓释和长循环特征。

Claims (10)

1.一种替尼泊甙脂质体，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊甙     1份

磷脂类物质   2-30份

固醇         0-10份且不为0份

附加剂       0-10份且不为0份，

其中，所述脂质体的粒径小于500nm；

所述的磷脂类物质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、氢化卵磷脂、脑磷脂和心磷脂及其混合物；

所述的固醇选自胆固醇、二氨胆固醇、大豆甾酰糖苷、大豆甾醇和麦角固醇；

所述的附加剂包括抗氧剂、表面活性剂和稳定剂；其中所述抗氧剂选自维生素E、维生素E酯、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、半胱氨酸和蛋氨酸中的一种或多种，所述表面活性剂选自脱氧胆酸盐、胆酸盐、脱氧胆酸、牛磺胆酸盐、胆酸、吐温-80、泊洛沙姆、苄泽和司盘中的一种或多种，所述稳定剂选自硬脂胺、磷脂酸、十四酸、油酸和甘油中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的替尼泊甙脂质体，其特征在于，所述原料进一步包含0.1-50重量份的修饰材料。

3.根据权利要求1所述的替尼泊甙脂质体，其特征在于，所述的磷脂类物质选自卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂和心磷脂及其混合物；所述的固醇为胆固醇。

4.根据权利要求2所述的替尼泊甙脂质体，其特征在于，所述的修饰材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、神经节鞘酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖和聚乙二醇-磷脂衍生物或它们的混合物；其中所述的聚乙二醇-磷脂衍生物选自聚乙二醇-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱；其中所述聚乙二醇的平均分子量为200-20000。

5. 根据权利要求4所述的替尼泊甙脂质体，其特征在于，所述的聚乙二醇平均分子量为2000-5000。

6.权利要求1所述的替尼泊甙脂质体的制备方法，其特征在于，采用下述不同方法中的任意一种：

1）薄膜分散法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂按比例溶于有机溶剂，并在20-60℃下减压挥去有机溶剂，形成薄膜，然后加入含水溶性附加剂的水相介质水合，超声或高压均质后即得替尼泊甙脂质体；或

2）注入法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂溶于适量有机溶剂中制成脂质溶液，吸取该溶液缓缓注入20-60℃含水溶性附加剂的水相介质，注入完毕继续搅拌去除有机溶剂，然后进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体；或

3）逆向蒸发法：将替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂按比例溶于有机溶剂，加入含水溶性附加剂的水相介质，进行超声或高速剪切使形成稳定的W/O型初乳，减压蒸去有机溶剂，加入水相介质，旋转帮助器壁上的凝胶脱落，然后在减压下继续蒸发，制得水性混悬液，然后进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体；或

4）熔融法：按比例称取替尼泊甙、磷脂类物质、固醇、脂溶性附加剂于60-80℃加热熔融，加入含水溶性附加剂的水相介质混合，然后进行超声或高压均质处理得到替尼泊甙脂质体；

上述制备方法中，所述的水相介质为纯水、磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、生理盐水溶液、甘露醇溶液或葡萄糖溶液，且上述缓冲液的pH为4-8；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷及其混合物。

7.根据权利要求6所述的替尼泊甙脂质体的制备方法，其特征在于，在磷脂类物质的溶解或熔融过程或水相介质的配制过程中进一步加入修饰材料。

8.一种替尼泊甙脂质体固体制剂，其特征在于，该固体制剂是权利要求1-2中任一项所述的替尼泊甙脂质体加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

9.根据权利要求8所述的替尼泊甙脂质体固体制剂，其特征在于，所述的支架剂选自甘氨酸、丝氨酸、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖、右旋糖苷、氯化钠和白蛋白及其混合物，并且其用量按磷脂类物质重量比计算为1份磷脂加0.1-4份。

10.一种替尼泊甙注射剂或口服制剂，其特征在于，是由权利要求1-2中任一项所述的替尼泊甙脂质体制备而成的。