CN102762215A - Hbv反义抑制剂 - Google Patents

Abstract

公开了反义寡聚体，其可用于调节乙型肝炎病毒感染，和用于治疗动物（包括人类）的乙型肝炎病毒（HBV）和乙型肝炎病毒相关病症。更具体地，公开了用于治疗动物的HBV的具有修饰的核苷酸的反义寡聚体，更具体地，所述反义寡聚体包含2′O-4′C-亚甲基桥接的糖类和具有其它2’O-4’C桥接的糖类的核苷酸，也称作锁定的核酸（LNA），其用于治疗动物的HBV，更具体地，用于治疗人类的HBV。

Description

HBV反义抑制剂

技术领域

本发明涉及可用于调节基因表达并从而治疗疾病的反义寡核苷酸，特别是用于治疗动物（包括人类）的乙型肝炎病毒（HBV）和乙型肝炎病毒相关病症的反义寡聚体。更具体地，本发明的实施方案涉及用于治疗动物的HBV的具有修饰的核苷的反义寡聚体，更具体地，所述反义寡聚体包含具有2′O-4′C-亚甲基桥接的糖类的核苷和具有本文另外所述的其它桥接的糖类的核苷，也称作锁定的核酸（LNA），其用于治疗动物的HBV，更具体地，用于治疗人类的HBV。

背景技术

乙型肝炎是肠胃外地（通过污染物，诸如血液和血液制品、污染的针头）、性地传播的病毒病，并从受感染的或携带者母体垂直传播给她们的后代。在世界上该疾病通常是垂直传播的那些地区中，在低年龄时产生高比例的受感染个体，变成乙型肝炎的慢性携带者。据世界卫生组织估计，世界上超过20亿人已经被感染，每年有约400万急性病例，每年有100万人死亡，有3.5-4亿慢性携带者。大约25%的携带者死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌，几乎75%的慢性携带者是亚洲人。乙型肝炎病毒是仅次于烟草的第二最重要的致癌物，造成所有原发性肝癌中的60%-80%。HBV的传染性是HIV的100倍。

乙型肝炎病毒感染是一个持续的医学问题，这是因为，象任何快速复制的传染物一样，存在持续的突变，所述突变帮助HBV的一些亚群变成耐受现有的治疗方案。在目前，没有用于治疗受到HBV感染的人的有效治疗剂，它们在体内产生对病毒的血清转换，或它们在遭受乙型肝炎病毒感染的人中实现抗原的90%减少（与治疗之前的基线数目相比）。目前，美国肝脏病研究协会（AASLD）和欧洲肝脏研究协会（EASL）推荐的慢性HBV感染的治疗剂包括：干扰素α（INFα）、聚乙二醇化的干扰素α-2a（Peg-IFN2a）、恩替卡韦和替诺福韦。但是，典型的干扰素疗法是48周，并产生严重的且使人厌恶的副作用，且在已经停止治疗以后24周，HBeAg血清转换范围是仅27-36%。HBsAg的血清转换甚至更低——在治疗停止以后立即观察到仅3%，在5年后向上增加至12%。

核苷和核苷酸治疗剂恩替卡韦和替诺福韦可成功地减少病毒载量，但是HBeAg血清转换率和HBsAg损失率甚至低于使用IFNα治疗剂得到的相应值。也使用其它类似的治疗剂，包括拉米夫定（3TC）、替比夫定（LdT）和阿德福韦，但是对于核苷/核苷酸治疗剂，一般而言，抗药性的出现会限制治疗效果。

因而，本领域需要发现和开发新的抗病毒治疗剂。更具体地，需要新的抗-HBV治疗剂，其能够增加HBeAg和HBsAg血清转换率。这些血清标志物会指示HBV感染的免疫学控制，并导致提高的预后，即肝病的预防和向肝硬化的进展、肝衰竭的预防、肝细胞癌（HCC）的预防、肝病有关的移植的预防和死亡的预防。

最近的临床研究已经发现了血清转换与HBeAg的降低（Fried等人（2008）Hepatology 47:428）和HBsAg的降低（Moucari等人（2009）Hepatology 49:1151）之间的关联。抗原水平的降低可能已经允许HBV感染的免疫学控制，因为认为高水平的抗原会诱发免疫耐受性。目前用于HBV的核苷疗法能够急剧降低HBV的血清水平，但是对HBeAg和HBsAg水平几乎没有影响。反义疗法与核苷疗法的差别在于，它可以直接地靶向抗原的转录物，从而降低血清HBeAg和HBsAg水平。因为在HBV感染后产生多个重叠的转录物，也存在单个反义寡聚体减少HBV DNA（除了HBeAg和HBsAg二者以外）的机会。

反义疗法是遗传障碍或感染的一种治疗形式。当已知特定基因的遗传序列是特别疾病的原因时，无论所述基因是原始哺乳动物基因、癌基因，还是来自传染性生物体的基因（诸如来自细菌物种的基因、来自真菌的基因、来自寄生物的基因或来自病毒的基因），可能合成核酸（DNA、RNA或化学类似物）的链，所述链会结合由所述基因产生的信使RNA（mRNA）并灭活它，从而有效地将该基因“关闭”。这是因为，mRNA必须单链化才能被翻译。或者，所述链可能靶向结合前-mRNA上的剪接位点，并修饰mRNA的外显子内容物[1]。

如果具有相同序列（例外是，RNA中的U对应DNA中的T）的RNA形式被翻译成或可翻译成蛋白，DNA单链序列经常被称作有义链（或正（+）义链），互补链被称作反义链（或负（-）义链）。

在DNA双链内的有些区域编码基因（它们经常是指定表达的或翻译的蛋白中的氨基酸次序的指令）以及调节序列、剪接位点、非编码内含子和其它区域。对于要表达由DNA编码的蛋白的细胞，DNA的一条链充当用于合成RNA的互补链的模板。模板DNA链被称作转录链，它的序列与mRNA转录物互补或成反义，其具有与原始双链DNA的有义序列相同的序列。因为DNA是双链的，与反义序列互补的链被称作非转录链或有义链，且具有与mRNA转录物相同的序列（例外是，DNA序列中的T核苷碱基被RNA序列中的U核苷碱基替代）。

与从DNA转录的RNA互补的核酸被称作“反义”寡核苷酸，因为它的碱基序列与基因的信使RNA（mRNA，即“有义”序列）互补。因而，具有5’-AAGGTC-3'的有义序列的DNA编码区会被转录生成具有5'-AAGGUC-3'的有义序列的mRNA，所以所述有义序列的反义寡聚体会具有序列3'-UUCCAG-5'（如果它包含RNA核苷碱基）或3’-TTCCAG-5’（如果所述反义寡聚体包含DNA核苷碱基）。

目前，反义疗法的主要焦点涉及长度为大约20个核苷酸/核苷的寡聚体或寡核苷酸的应用，所述寡聚体或寡核苷酸合成为与负责靶蛋白的表达或翻译的特定“有义”（5’至3’方向）DNA或mRNA序列互补。

在导入细胞中以后，所述反义寡核苷酸会通过Watson-Crick结合与它的对应mRNA序列杂交，形成异源双链体。形成双链体以后，由结合的mRNA的序列编码的蛋白的翻译受到抑制。存在寡核苷酸/mRNA双链体阻碍后续翻译的几种机理。几种不同的反义剂的被最广泛地接受的解释涉及涉及遍在酶RNA酶H对异源双链体中的mRNA的降解。RNA酶H被吸引至异源双链体，并切割结合的mRNA，同时保持寡核苷酸序列完整，这允许所述寡核苷酸继续寻找和结合对应的mRNA序列。通过反义疗法（其可以单独地发生，或与RNA酶H活性结合地发生）实现的翻译抑制的一些其它被接受的解释包括、但不限于：阻断适当的核糖体装配（这使得核糖体复合物失去翻译能力）、阻断RNA剪接和/或阻碍mRNA的适当输出。

被生物体用于控制基因表达（通过限制翻译）的表面上单独的方式称作基因干扰，其涉及“沉默”靶基因的短RNA序列的采用。这些短RNA序列称作小干扰RNA或siRNA。RNA干扰是一个古老的遗传过程，其中可以关闭靶向的基因，即生产某些蛋白的“蓝图”。

已知称作Dicer的酶在RNA干扰中起关键作用。Dicer是一种核糖核酸酶，其识别双链RNA分子，并将它们切割成约20-25个核苷酸长的短dsRNA，所述短dsRNA通常具有在3'末端上的双碱基突出端。由Dicer产生的小dsRNA片段然后同化成大多蛋白复合物，它们引导dsRNA分子到达细胞中的目标地，在这里它们结合它们的靶mRNA序列并关闭基因。该复合物称作RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC具有一种催化组分argonaute，它是在mRNA的序列与siRNA引导链的序列互补的情况下能够降解信使RNA（mRNA）的内切核酸酶。因此，Dicer、RISC和siRNA基因沉默系统是许多基础性的生物学事件的必需步骤，所述事件包括基因组重排、干细胞分化、脑发育和病毒防御。

令人感兴趣地，已经确定，小dsRNA（siRNA）的大小是它们的功能的决定因素。如果dsRNA太大或太小，它们使它不能进入RISC复合物中，所以不会发生基因沉默。

反义寡聚体与siRNA的差别在于几个方面，最重要的是，反义寡聚体是单链的。它们也是合成的，通常沿着磷酸酯主链被修饰，且经常在选定的核苷碱基位置中。

在反义疗法领域，化学修饰的核苷向核酸分子中、特别是向核糖核酸分子（RNA）中的导入，会提供克服外源地递送的天然RNA或DNA分子固有的体内稳定性和生物利用度的潜在限制的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的应用，可以使更低剂量的特定核酸分子实现给定的治疗效果，因为化学修饰的核酸分子倾向于具有更长的血清半衰期。此外，某些化学修饰可以提高核酸分子的生物利用度，这通过靶向特定细胞或组织和/或提高核酸分子的细胞摄取来实现。因此，即使化学修饰的核酸分子的活性比天然核酸分子降低（例如当与所有RNA核酸分子相比较时），由于提高的分子稳定性和/或递送，修饰的核酸分子的总活性可以大于天然分子。

一种有用的化学修饰称作锁定的核酸（LNA），其会在一个或多个RNA或DNA核苷部分处导入2′O-4′C-亚烷基桥，其中所述亚烷基桥是C_1-6亚烷基桥，更具体地是2′O-4′C-亚甲基桥。在被宿主细胞摄取以后，当LNA掺入反义RNA或DNA寡聚体中时，已经证实，它们会极大地增加反义RNA或DNA分子的稳定性，并从而极大地增加反义RNA或DNA的生物利用度。可以导入反义RNA或DNA寡聚体中来增加反义寡聚体的稳定性和生物利用度的其它有用的化学修饰包括：硫代磷酸酯键或磷酸三酯键，它们取代单个RNA或DNA核苷酸之间的天然存在的磷酸二酯键。

发明内容

在本发明的第一个实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的RNA或DNA寡聚体或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯以及药学上可接受的稀释剂，所述RNA或DNA寡聚体与通过引用并入本文中的下述DNA序列的对应RNA转录物基本上互补：

；其中所述反义RNA或DNA分子包含多个修饰的核苷和/或核苷酸。

在本发明的第二个实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的RNA或DNA寡聚体或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯以及药学上可接受的稀释剂，所述RNA或DNA寡聚体与通过引用并入本文中的下述DNA序列的对应RNA转录物基本上互补：

；其中所述反义RNA或DNA分子包含多个修饰的核苷和/或核苷酸。

一个实施方案提供了一种反义寡聚体或其盐、溶剂化物、水合物或酯，其用于减少哺乳动物细胞或生物体中的乙型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反义寡聚体是长度为10-26个核苷的连续序列，且具有如式1所示的序列：

5’-LNA_n-P-LNA_p-P-N_m-P-N_l-P-LNA_r-P-LNA_q-3’（式1）

其中LNA是锁定的核酸；P是选自下述的核苷间连接：磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯连接，所述连接是在LNA和邻近的N之间，或在N和邻近的N之间，或在N和邻近的LNA之间，或在LNA和邻近的LNA之间，从式（1）序列的5’至3’方向；且其中N选自：G、C、A、T、U或Z核苷单元；n和r和p和q各自独立地是：选自1、2或3的整数；l和m各自独立地是：1-22的整数；且

其中Z选自：肌苷、N⁷-甲基肌苷、N⁷-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黄苷、二氢尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脱氮鸟苷、7-乙基-7-脱氮鸟苷、N4-甲基胞苷、N4-乙基胞苷。

特定实施方案提供了如本文所述的反义寡聚体，其中所述寡聚体的至少4个核苷单元可以是LNA单元。在有些实施方案中，所述LNA是具有2′-O-烷基-4′C连接的锁定的核酸单元，其中所述烷基可以是取代的或未取代的C_1-6烷基。在其它实施方案中，至少2个在连续核苷序列的核苷单元之间存在的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些有关的实施方案中，在反义寡聚体的连续核苷序列的核苷单元之间存在的所有核苷间连接都可以是硫代磷酸酯核苷间连接。

在一些具体的实施方案中，n、p、r和q各自独立地是：1或2，且l和m各自独立地是：2、3、4、5或6，且在一些具体的实施方案中，n、p、r和q各自独立地是：1，且l和m各自独立地是：6。在其它具体的实施方案中，提供了一种反义寡核苷酸，其中所述序列可以是SEQ ID NO 14、16、16或20中的任一个。

在具体实施方案中，上述的反义寡聚体可以与SEQ ID NO. 1-13中的任一个基本上互补，且所述乙型肝炎病毒可以是人乙型肝炎病毒，且所述细胞或生物体可以是人。在有关的具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

在具体实施方案中，上述的反义寡聚体可以具有与SEQ ID NO. 14-22中的任一个基本上互补的序列，且所述乙型肝炎病毒可以是人乙型肝炎病毒且所述细胞或生物体可以是人。在有关的具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

一个具体的实施方案提供了一种用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒感染的药物制剂，其包含有效量的如上所述的任意核酸反义寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯以及药学上可接受的稀释剂。这样的药物制剂的反义寡聚体可以与SEQ ID NO: 1-13中的任一个基本上互补，或可以具有与SEQ ID NO 14-22中的任一个基本上互补的序列，且可以另外包含药学上可接受的载体。

本发明的另一个实施方案提供了一种用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒相关病症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的如上所述的任意药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而治疗所述乙型肝炎病毒感染或所述乙型肝炎病毒相关病症。在有关的实施方案中，所述哺乳动物是人，所述乙型肝炎病毒感染或所述乙型肝炎病毒相关病症是来自人乙型肝炎病毒的乙型肝炎病毒感染。更具体地，所述人乙型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

有关的实施方案提供了一种用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒相关病症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的如上所述的任意药物组合物施用给如上所述的有此需要的哺乳动物，其中所述人乙型肝炎病毒相关病症可以是：黄疸、肝癌、肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征或血清性肝炎。

在有关的实施方案中，所述方法可以另外包括：与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在单一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。

在其它有关的实施方案中，所述额外治疗剂可以是HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎（NSAID）剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂或免疫抑制剂。

在特别有关的实施方案中，所述额外HBV剂可以是：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定（3TC）；恩替卡韦（ETV）；富马酸替诺福韦双索酯（TDF）；替比夫定（LdT）；阿德福韦；或HBV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

在其它特别有关的实施方案中，所述额外HCV剂可以是：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂（例如，ViroPharma的VP50406系列）；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。

另一个实施方案提供了一种用于减少受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括：将治疗有效量的如上所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，减少所述乙型肝炎病毒感染和所述乙型肝炎抗原。在有些实施方案中，所述哺乳动物可以是人，所述乙型肝炎病毒可以是人乙型肝炎病毒。更具体地，所述人乙型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

在具体实施方案中，提供了一种用于减少受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括：将治疗有效量的如上所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，减少所述乙型肝炎病毒感染和所述乙型肝炎抗原，其中与施用反义寡聚体之前的量相比，DNA的量减少了90%。在有关的方法中，所述HBV抗原可以是HBsAg，或可以是HBeAg，更具体地，可以充分地减少HBV抗原的量以导致血清转换，所述血清转换定义为：血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在（如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子），或者定义为：血清HBsAg不存在（如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子），所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。

在更具体的实施方案中，如上所述的方法可以另外包括：与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在单一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。在特别有关的实施方案中，所述额外治疗剂可以是HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎（NSAID）剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制剂。在更特别有关的实施方案中，所述额外HBV剂可以是：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定（3TC）；恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定（LdT）；阿德福韦；或HBV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的），且所述额外HCV剂可以是：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂（例如，ViroPharma的VP50406系列）；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；或HCV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

另一个实施方案提供了一种用于促进受HBV感染的哺乳动物的乙型肝炎病毒的血清转换的方法，所述方法包括：将治疗有效量的如上所述的药物组合物施用给受乙型肝炎感染的哺乳动物；监测HBeAg + HBeAb在哺乳动物血清样品中的存在，或监测HBsAg在哺乳动物血清样品中的存在，以致于血清样品中HBeAg的不存在+ HbeAb的存在（如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子）或血清样品中HBsAg的不存在（如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子）（所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前检测限确定），指示哺乳动物的血清转换。

对于本文所述的任意实施方案，所述实施方案提供了一种治疗乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒相关病症的方法、一种用于减少受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法或一种用于促进受HBV感染的哺乳动物的乙型肝炎病毒的血清转换的方法，其中所述方法包括：施用本文所述的反义寡聚体、施用反义寡聚体，无论是单独地还是组合地，也无论存在于药物制剂中还是简单地存在于稀释剂中，所述施用可以是口服的、口腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药。

附图说明

通过参照下面的详细描述，并参照附图，可以更容易地理解本发明的前述特征，在附图中：

图1是HBV感染的自然史的简图。

图2是被视作HBeAg阳性的具有代偿疾病的HBV患者的简图。

图3是被视作HBeAg阴性的具有代偿疾病的HBV患者的简图。

图4是HBV转录的示意图，它显示了由HBV基因组编码的主要转录物（包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依赖性的DNA聚合酶（逆转录酶活性）、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴）、转录物的相对长度以及大、中和小S蛋白转录物的重叠区。也指示了HBV DNA的+和-链。

图5显示了对比来自HBV的多个基因型的基因组DNA的序列之间的同一性百分比的计算生物学分析，其按照HBV基因组区域进行绘制。

图6是已经鉴别出的不同HBV地理学基因型的表。

具体实施方案的详细描述

定义. 如在本说明书和附随的权利要求书中所使用的，下述术语应当具有指出的含义，除非上下文另有要求：

本文使用的术语“有效量”是指，包括核酸寡聚体的药物或药品或药剂的量，其会引起组织、系统、动物或人的生物学或医学应答，所述应答是例如研究人员或临床医师所追求的。此外，术语“治疗有效量”是指，与尚未接受这样的量的对应受试者相比，导致下述效果的任意量：改善的治疗，愈合，预防或改善疾病、障碍或副作用，或疾病或障碍的进展速率降低。该术语在它的范围内也包括有效地增强正常生理功能的量。

本文使用的术语“基本上互补”是指，使用标准的Watson-Crick碱基对A-T、A-U和G-C，所述反义寡聚体序列具有与它的靶有义序列完全互补的序列。另外，术语基本上互补包括：使用非标准的Watson-Crick碱基对，反义寡聚体序列与它的靶有义序列完全互补，所述非标准的Watson-Crick碱基对包括、但不限于G:U、I:U、I:A、I:C、X:A、X:C、R:C、R:T、R:U、m7I:U、m7I-A、m7I:C、m7G:U、m7G:C、m5U:A、5-FU:A、5-FT:A、m5C:G、D:A、Ψ:A和Ψ:C。本文使用的G是鸟苷，I是肌苷，A是腺苷，C是胞苷，U是尿苷，T是胸苷，X是黄苷，R是利巴韦林，m7G是N7-甲基鸟苷，m7I是N7-甲基肌苷，5FU是5-氟尿苷，5FT是5-氟胸苷，D是二氢尿苷，m5U是5-甲基尿苷，m5C是5-甲基胞苷，和Ψ是假尿苷。

术语“基本上互补”也包括这样的反义寡聚体：其在序列中具有一个或多个合成的核苷碱基，所述核苷碱基表现出与DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷碱基的假互补性。导致与天然核酸序列的假互补性的核苷碱基的实例包括：2-氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷（nA）、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷（sT）、7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤或7-烷基-7脱氮鸟苷（7al-7daG）和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷（N4-alC；其中烷基= 甲基或乙基）。非Watson-Crick碱基对nA:T和A:sT是稳定的碱基对，7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤与C配对（7al-7daG:C）以及N4-烷基胞嘧啶与G配对（N4-alC:G）也是稳定的。当所有4个合成的核苷碱基nA、sT、7al-7daG和N4-alC都掺入给定的ASO中时，得到的ASO序列在很大程度上没有二级结构，且会结合具有假互补性的靶核酸。在本发明的实施方案中，一个或多个合成的核苷碱基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之间产生一个或多个非Watson-Crick“假互补的”碱基对。应当理解，具有一个或多个假互补的碱基从而与靶核酸序列上的核苷碱基形成一个或多个假碱基对的ASO，被视作与靶核酸序列基本上互补。

术语“基本上”，诸如当用于短语“基本上具有SEQ ID NO X的序列的寡核苷”中时，在本文中用于表示，可以与书写的SEQ ID NO X的互补序列碱基配对的任意序列，但是其可以在序列中含有一个或多个合成的核苷碱基，所述核苷碱基表现出与DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷碱基的假互补性。导致与天然核酸序列的假互补性的核苷碱基的实例包括：2-氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷（nA）、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷（sT）、7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤或7-烷基-7脱氮鸟苷（7al-7daG）和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷（N4-alC；其中烷基= 甲基或乙基）。非Watson-Crick碱基对nA:T和A:sT是稳定的碱基对，7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤与C配对（7al-7daG:C）以及N4-烷基胞嘧啶与G配对（N4-alC:G）也是稳定的。当所有4个合成的核苷碱基nA、sT、7al-7daG和N4-alC都掺入给定的ASO中时，得到的ASO序列在很大程度上没有二级结构，且会结合具有假互补性的靶核酸。在本发明的实施方案中，一个或多个合成的核苷碱基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之间产生一个或多个非Watson-Crick“假互补的”碱基对。应当理解，具有一个或多个假互补的碱基从而与靶核酸序列上的核苷碱基形成一个或多个假碱基对的ASO，被视作基本上具有书写的SEQ ID NO X的序列，其针对给定的靶核酸序列。

本文使用的术语“核酸寡聚体”是指，包含至少2个且不超过100个连贯地连接的共价结合的核苷或核苷酸单元的核酸分子。每个单独的核苷或核苷酸单元可以包含核糖或脱氧核糖，因而所述寡聚体可以包含核糖和脱氧核糖的组合。可以连接核酸寡聚体中的核苷酸或核苷，使得所述寡聚体包含传统的磷酸二酯连接，或者所述寡聚体可以包含一个或多个磷酸三酯连接、膦酸酯连接、烷基膦酸酯连接、硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。另外，所述核酸寡聚体可以包含一个或多个修饰的核苷，包括2’O-4’C连接的核苷，且额外地或替代地，所述核酸寡聚体可以包含一个或多个具有在2’-位的其它修饰的核苷，所述其它修饰包括2’-O-烷基修饰诸如2’-O-甲基修饰、2’-O-乙基修饰或其它2’-修饰。

本文使用的术语LNA（锁定的核酸）包括具有在核苷糖单元的2’-位和4’-位之间的化学连接的核酸单体（即如果根据普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法进行描述，核酸单体的呋喃糖具有2’O-4’C连接或4’C-2’O连接），包括但不限于如下描绘的：(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’) LNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’) LNA、(C)亚乙基氧基(4’-(CH₂)₂-O-2’) LNA、(D)氨基氧基(4’-CH₂-O-N(R)-2’) LNA和(E)氧基氨基(4’-CH₂-N(R)-O-2’) LNA。

本文使用的LNA化合物包括、但不限于：在糖的4'和2’位之间具有至少一个桥的化合物，其中每个桥独立地包含1个或2-4个连接的基团，所述基团独立地选自：-[C(R₁)(R₂)]_n-、-C(R₁)=C(R₂)-、-C(R₁)=N-、-C(=NR₁)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(R₁)₂-、-S(=O)_x-和-N(R₁)-; 其中：x是0、1或2；n是1、2、3或4；每个R₁和R₂独立地是：H、保护基、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、杂环基团、取代的杂环基团、杂芳基、取代的杂芳基、C₅-C₇脂环基团、取代的C₅-C₇脂环基团、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基(C(=O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(=O)₂-J₁)或sulfoxyl(S(=O)-J₁)；且每个J₁和J₂独立地是：H、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、酰基（C(=O)-H）、取代的酰基、杂环基团、取代的杂环基团、C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保护基。

在LNA的定义内包括的具体4’C- 2’O桥的实例包括：-[C(R₁)(R₂)]_n-、-[C(R₁)(R₂)]_n-O-、-C(R₁R₂)-N(R₁)-O-或-C(R₁R₂)-O-N(R₁)- 桥。在LNA的定义内包括的其它桥是：4'-CH₂-2'、4'-(CH₂)₂-2'、4'-(CH₂)₃-2'、4'-CH₂-O-2'、4'-(CH₂)₂-O-2'、4'-CH₂-O-N(R₁)-2'和4'-CH₂-N(R₁)-O-2'- 桥，其中每个R₁独立地是：H、保护基或C₁-C₁₂烷基。

根据本发明，在LNA的定义内还包括这样的LNA：其中，核糖基糖环的2'-羟基连接至所述糖环的4' 碳原子上，从而形成亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）连接，以形成二环糖部分。所述连接可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基（-CH₂-）基团，术语亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA用于二环部分上；在亚乙基在该位置的情况下，使用术语亚乙基氧基（4’-CH₂CH₂-O-2’）LNA。在本文使用的LNA的含义内，也包括α-L- 亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’），即亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA的一种异构体。

本文使用的术语“2′-O-烷基-4′C连接”表示，在锁定的核酸（LNA）中的2’-O-4’-C（或4’C-2’O，如果根据普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法进行描述）化学连接或桥。所述烷基连接可以是取代的或未取代的烷基，其中本文使用的“烷基”表示-[C(R₁)(R₂)]_n-，其中n是1、2、3、4、5或6；每个R₁和R₂独立地是：H、保护基、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基（C(=O)-H），且每个J₁和J₂独立地是：H、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保护基。

本文使用的术语“HBV”是指哺乳动物乙型肝炎病毒，包括人乙型肝炎病毒。该术语包括乙型肝炎病毒（特别是人乙型肝炎病毒）的地理学基因型以及乙型肝炎病毒的地理学基因型的变异株。

本文使用的“乙型肝炎相关病症”或“HBV相关病症”是指，乙型肝炎感染、暴露或疾病会恶化、造成、有关、伴随或引起的任意疾病、生物学状况、医学状况或事件。术语乙型肝炎相关病症包括：黄疸、肝癌、肝炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎、HBV病毒血症和具有症状的病症，所述症状可以包括下述的任一项或全部：流感样疾病、虚弱、疼痛、头痛、发热、食欲缺乏、腹泻、黄疸、恶心和呕吐、在身体的肝区的疼痛、泥色或灰色大便、全身瘙痒和深色尿，并伴有乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒抗原存在的阳性检测，或对乙型肝炎病毒抗原特异性的抗体的存在的阳性检测。

本发明的反义寡核苷酸（ASO）可以以非溶剂化物形式和溶剂化物形式存在。术语‘溶剂化物’在本文中用于描述分子复合物，其包含本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子（例如乙醇）。当所述溶剂是水时，采用术语‘水合物’。药学上可接受的溶剂化物包括水合物和其它溶剂化物，其中结晶的溶剂可以同位素地替换，例如D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO。

在本发明要求保护的化合物的范围内，包括式（I）化合物的所有立体异构体、几何异构体和互变异构形式，包括表现出超过一类异构现象的化合物和它们中的一种或多种的混合物。

本发明的ASO可以作为前药施用。因而，本文所述的ASO的某些衍生物（它们本身可能几乎不具有或不具有药理学活性）在施用到身体中或上时，通过例如水解裂解，可以转化成具有希望的活性的、与SEQ ID NO: 1-13基本上互补的ASO。这样的衍生物称作‘前药’。

根据具体反义核酸寡聚体的性质，可以使用任意常规方法将ASO施用给宿主，所述方法能够导致希望的靶细胞中靶病毒转录物、病毒基因组量或载量的减少。因而，可以将反义寡聚体掺入到用于治疗性施用的多种制剂中。更具体地，本发明的反义寡聚体可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合制成药物组合物，且可制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。如此，反义寡聚体的施用可以以多种方式完成，包括口服的、口腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药等。

在药物剂型中，ASO可以单独地施用，或与其它药学活性剂适当结合地以及联合地施用。下述的方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝不是限制性的。本文所述的ASO可以与常规的药用载体、赋形剂等（例如，甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、交联羧甲纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等）联合施用。如果需要的话，所述药物组合物也可以含有小量无毒的辅料，诸如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等（例如，醋酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸盐、三乙醇胺油酸盐等）。

对于口服制剂，ASO可单独应用，或与适当添加剂联合应用，以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与下述添加剂联合应用：常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁；和如果需要的话，稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和矫味剂。

可以如下将ASO制成注射用制剂：通过将ASO溶解、悬浮或乳化在水性溶剂或非水溶剂（如植物油或其它相似油、合成脂族酸甘油酯、高等脂族酸酯或丙二醇）中，并且如果需要的话，使用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。例如，可以如下制备药学上可施用的液体组合物：将至少一种ASO和任选的药学佐剂溶解、分散或以类似方式分布在载体（例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、二醇类、乙醇等）中，以形成溶液或混悬液。可以制备常规形式的注射剂，作为液体溶液或混悬液，作为乳剂，或呈适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。在这样的肠胃外组合物中含有的ASO的百分比高度地依赖于其具体性质以及ASO活性和受试者的需要。但是，可以采用活性成分占溶液的0.01%至10%的百分比，如果所述组合物是将在以后稀释至上述百分比的固体，则可以更高。在某些实施方案中，所述组合物包含在溶液中的约0.2-2%的活性剂ASO。

ASO剂可以用于通过吸入来施用的气雾剂制剂中。本发明的ASO可配制到加压的可接受的推进剂中，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。对于吸入递送，可以将ASO配制为液体溶液, 混悬液, 气雾喷射剂或干粉，并装载到合适的给药用分配器中。存在几种类型的药物吸入装置——喷雾器吸入器、计量剂量吸入器（MDI）和干粉吸入器（DPI）。喷雾器装置会产生高速空气流，其造成治疗剂（它们配制成液体形式）喷洒为雾，所述雾被递送至患者的呼吸道中。MDI通常是包装了压缩气体的制剂。在致动后，所述装置通过压缩气体释放出量过的量的治疗剂，从而提供施用一定量药剂的可靠方法。在通过DPI装置呼吸过程中，DPI会分配自由流动的粉末形式的治疗剂，所述粉末可以分散在患者的吸气气流中。为了实现自由流动的粉末，用诸如乳糖等赋形剂配制治疗剂。量过的量的治疗剂以胶囊的形式储存，并在每次致动时分配。

此外，ASO剂可通过与多种基质（如乳化基质或水溶性基质）混合而制成栓剂。本发明的ASO可通过栓剂经直肠施用。栓剂可包括在体温融化、但在室温固化的赋形剂，如可可脂、碳蜡及聚乙二醇。

一般而言，通过用于类似用途的ASO剂的被接受的给药模式中的任一种，施用治疗有效量的提供的ASO剂。反义寡聚体（即，活性成分）的实际量取决于多种因素，诸如要治疗的疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康、使用的ASO的功效、给药途径和形式、以及其它因素。所述药物组合物可以每天施用超过1次，诸如每天1次或2次。在具体实施方案中，所述ASO药物制剂每周施用1次或2次，根据需要持续24、36或48周或更长的疗程，以有效地治疗HBV感染，包括减少病毒载量、减少病毒抗原、产生血清转换、支持受试者免疫应答和/或降低HBV DNA水平和正常化丙氨酸转移酶（ALT）水平。

可提供用于口服或直肠给药的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和混悬液，其中每个剂量单元（例如一茶匙、一汤匙、一个片剂或一粒栓剂）含有预定量的组合物，所述组合物含有一种或多种抑制剂。类似地，用于注射或静脉内给药的单位剂型可包含在组合物中的抑制剂，所述组合物作为在无菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载体中的溶液。

本文使用的术语“单位剂型”是指，适合作为用于人及动物受试者的单元剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，其计算为与药学上可接受的稀释剂、携带者或媒介物联合足可产生希望的作用的量。本发明的新颖单位剂型的规范取决于应用的具体化合物及欲达到的效果和在宿主中与每种化合物相关的药效学。

药学上可接受的赋形剂（如媒介物、佐剂、载体或稀释剂）是公众易于获得的。此外，药学上可接受的辅料（如pH调节剂及缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、湿润剂等）是公众易于获得的。

本领域技术人员会容易地理解，剂量水平可随具体的ASO剂、递送媒介物的性质等而变化。本领域技术人员通过多种方法易于确定给定的ASO的优选剂量。

用于施用本文所述的ASO治疗剂的递送方法的实例，以及药物制剂、溶剂化物、水合物、盐和酯的细节，是本领域技术人员众所周知的，且描述在文献中。

使用将ASO剂导入靶细胞中的任意方便的方法，可以将有效量的ASO抑制剂导入靶细胞中。方法包括：根据本领域可得到的标准方案，使用诸如lipofectamine、聚阳离子胺（诸如精胺、精脒）等试剂，以及包括电穿孔、显微注射、脂质体包囊和更多的方法。在有些情况下，对于ASO向靶细胞中的摄入而言，没有外源剂是必需的。将有效量的ASO剂导入哺乳动物细胞中，会导致HBV靶基因表达的调节（即降低），导致HBV载量的减少、HBV DNA的减少、正常化的ALT活性、血清转换、治愈和提高的免疫应答。

最后，制剂和剂量的选择取决于多种因素，诸如给药模式和药品的生物利用度。

本发明的方法可以在任意哺乳动物细胞中起作用，其中代表性的目标哺乳动物细胞包括，但不限于下述动物的细胞：有蹄类动物(ungulates)或有蹄(hooved)动物，例如，牛、山羊、猪、绵羊等；啮齿类动物，例如，仓鼠、小鼠、大鼠等；兔形目动物，例如，兔；灵长类动物，例如，猴、狒狒、人等；和类似的动物。

所述ASO组合物可以有利地与其它抗病毒剂联合地和/或替代地组合和/或使用，所述其它抗病毒剂是治疗剂或预防剂，且不同于主题化合物。所述组合物也可以有利地与药剂联合地组合和/或使用，所述药剂治疗经常与病毒感染（其对本发明的化合物敏感）有关的病症，诸如抗-HCV剂或免疫抑制剂。在某些实施方案中，与主题组合物的联合施用会增强这样的药剂的效能。因此，当与其它抗病毒剂联合地组合或施用时，本发明的化合物在某些实施方案中的使用剂量可以小于当单独使用时预期的量，或小于联合治疗的计算量。

本发明的ASO和ASO组合物也可以与增强身体的免疫系统的药剂一起使用，包括低剂量的环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补剂（例如，抗氧化剂，包括维生素A、C、E、β-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10和紫锥花属）和疫苗，例如，免疫刺激复合物（ISCOM），其包括组合了抗原的多聚体呈现和佐剂的疫苗制剂。

如本领域技术人员会理解的，剂量取决于要治疗的疾病状态的严重性和应答性，和持续数天至数月的疗程，或直到实现治愈或实现疾病状态的减少。通过测量患者体内的ASO活性剂积累，可以计算出最佳剂量方案。最佳剂量可以随单个寡核苷酸的相对功效而变化。一般而言，可以基于在体外和在体内动物模型中发现有效的EC50来估测它。一般而言，剂量是0.01 μg至1 g/kg体重，可以每天给药1次或多次，每周1次，每月1次，或每年1次，或甚至每2-10年1次，或连续输注数小时至数个月。基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度，可以估测给药的重复率。在成功的治疗以后，可能希望使患者经历维持疗法，以预防疾病状态的复发。更具体地，疗程会持续大约48周，每周给药1次，作为皮下注射，剂量为约0.01 μg/kg体重至约1 g/kg体重。

本发明的实施方案涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的反义寡聚体作为活性成分。应当理解，根据本发明的药物组合物包括稀释剂，并任选地包含药用载体，且所述药物组合物任选地包含其它化合物，诸如化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、镇痛药、NSAID、麻醉品、抗生素、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物和/或免疫调节化合物。

本发明的寡核苷酸可以“原样”使用，或以多种药学上可接受的盐的形式使用。本文使用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐：所述盐保留本文鉴别出的寡核苷酸的希望的生物活性，并表现出微小的不希望的毒理学效应。这样的盐的非限制性实例可以用有机氨基酸和用金属阳离子（诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等）或用从氨、N,N-二苄基亚乙基-二胺、D-葡糖胺、四乙基铵或亚乙基二胺得到的阳离子形成的碱加成盐形成。

在本发明的一个具体实施方案中，所述寡核苷酸可以是前药形式。寡核苷酸（在它们的天然形式时，其通常具有通过磷酸二酯主链连接的单个核苷酸）通常与基本上去质子化的磷酸根氧一起在pH 7存在，所以是带负电荷的分子。因为细胞膜在性质上是亲脂的，与中性的或亲脂的等效物相比，寡核苷酸的细胞摄取经常会减少。一种解决方案是，使用前药方案（参见例如Crooke, R. M. （1998），Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131,第103-140页）。

药学上可接受的粘合剂和佐剂也可以构成配制的药物的一部分。

本发明的药物组合物包括、但不限于：溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从多种组分制备，所述组分包括、但不限于：预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。通过载体介导的递送，可以增强ASO组合物向组织的递送，所述载体包括、但不限于：阳离子型脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球（Dass, C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54（1）:3-27）。根据制药工业众所周知的常规技术，可以制备本发明的药物制剂，其可以方便地呈现在单位剂型中。这样的技术包括使活性成分与药用载体或赋形剂相缔合的步骤。一般而言，如下制备制剂：使活性成分与液体载体或粉碎的固体载体或二者均匀地且密切地缔合，然后，如果必要的话，使产物成形。本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任一种，例如，但不限于、片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂和栓剂。

本发明的组合物也可以配制为在水性介质、非水性介质或混合介质中的混悬液。水性混悬液可以另外含有增加混悬液粘度的物质，所述物质包括，例如：羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。所述混悬液也可以含有稳定剂。本发明的化合物也可以与活性药品相缀合，所述活性药品例如：阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗细菌药或抗生素和抗癌药。另外，本发明的ASO序列可以与药品一起施用，或与药品联合地单独地施用，作为联合治疗，所述药品可用于治疗癌症、炎症、疼痛、细菌、真菌感染和/或寄生物感染、酒精中毒、物质滥用、糖尿病，或者所述药品可用于治疗其它病毒感染诸如HIV、HCV等。

乙型肝炎病毒感染存在两种一般类型：急性的和慢性的。已经经历HBV感染的受试者也可以恢复，并变成无症状的携带者。当暴露于乙型肝炎病毒的人开始出现病毒性肝炎的征象和症状时，发生急性乙型肝炎。称作潜伏期的该时段平均是90天，但是可以短至45天，或长至6个月。对于大多数人而言，该感染会造成轻度至中度的不适，但是会自行消失，因为身体的免疫应答会成功地战胜病毒。但是，有些人，特别是免疫系统受损的人，诸如遭受AIDS、接受化学疗法、服用免疫抑制药物或服用类固醇的人，具有非常严重的问题（作为急性HBV感染的结果），并发展成更严重的病症，诸如暴发性肝衰竭。

当人最初遭受急性感染、但是随后不能战胜感染时，发生慢性乙型肝炎。该疾病变成慢性还是完全消退，主要取决于受感染的人的年龄。约90%的在出生时受到感染的婴儿会发展成慢性疾病。但是，随着人老化，慢性感染的风险降低，所以20%-50%的儿童和小于10%的少年或成年人会从急性感染发展成慢性感染。慢性HBV感染是本发明的实施方案的主要治疗目标，尽管本发明的ASO组合物也能够治疗HBV相关病症，诸如炎症、纤维化、肝硬化、肝癌、血清性肝炎和其它。

如图1所示，总结了HBV感染的自然史，如果患者在幼童时期接触HBV，该儿童在将来形成免疫耐受性的机会是95%，且所述病症会发展成慢性肝炎；然而，如果成年患者接触HBV，所述病症将来变成慢性的机会仅是5%。

慢性HBV感染存在4个阶段。第一阶段是免疫耐受期，这时表现出微小的肝脏纤维化和炎症，伴有高HBV DNA和正常的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。第二阶段是免疫清除期，这时肝脏的活动性炎症可通过组织学检查观察到，其还可以包括波动的ALT活性水平和波动的HBV DNA水平。随后可能是第三个不活动的带病原状态阶段，这时受感染的受试者可能在组织学检查中表现出轻度肝炎和微小纤维化。也报道了第四个阶段，称作HBV的复活。该最后一个阶段的特征在于，肝脏的活动性炎症，这通过活组织检查观察到，尽管乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性和抗-HBeAg阳性。

慢性HBV疾病具有几种类型。第一种类型称作HBeAg阳性的或“野生型”HBV感染，其被表征为抗-HBeAg阴性的，且表现出> 20,000 IU/mL（> 10⁵拷贝/mL）的HBV DNA的量。第二种类型称作HBeAg阴性的或“突变型核心”HBV感染，其被表征为抗-HBeAg阳性的，且表现出>2,000 IU/mL（> 10⁴拷贝/mL）的HBV DNA的量。在图2和3中，显示了这两类慢性HBV感染和历史上推荐的治疗方案。

图2显示了表现出HBeAg阳性的或“野生型”HBV感染的患者的分类和历史上推荐的治疗。在左边，是具有小于20,000 IU/mL（<10⁵拷贝/mL）的HBV病毒DNA水平的患者，其中没有推荐治疗，但是进行监测，以确保HBV DNA水平没有增加。在右边，是具有≥20,000 IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。对于这些患者，每3-12个月监测具有正常丙氨酸转移酶（ALT）活性的患者的ALT活性的任何变化，并考虑进行活组织检查（取决于年龄）。治疗表现出升高的ALT活性的患者至血清转换，尽管实际上，现有的HBV治疗剂使小于20-30%的患者实现了血清转换。目前推荐的HBV治疗剂包括：恩替卡韦（ETV）和富马酸替诺福韦双索酯（TDF）和peg-干扰素，作为首选。

图3显示了表现出HBeAg阴性的或“突变型核心”HBV感染的患者的分类和历史上推荐的治疗。在左边，是具有小于2,000 IU/mL（<10⁴拷贝/mL）的HBV病毒DNA水平的患者，其中没有推荐治疗，但是进行监测，以确保HBV DNA水平没有增加。在右边，是具有≥2,000 IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。对于这些患者，监测具有正常丙氨酸转移酶（ALT）活性的患者的ALT活性的任何变化，并考虑进行活组织检查。治疗表现出升高的ALT活性的患者至HBsAg血清转换，如果可能的话，使用目前推荐的HBV治疗剂，包括恩替卡韦（ETV）和富马酸替诺福韦双索酯（TDF）和peg-干扰素，作为首选。

遭受急性HBV感染的患者会针对病毒抗原产生剧烈的、多克隆的和多特异性的细胞毒性的T淋巴细胞（CTL）应答，而慢性感染的患者具有弱的或不可检测的CTL应答。当活化弱的HBV-特异性的免疫应答（其强度足以破坏HBV感染的肝细胞）时，发生肝炎。关于引起T细胞低应答性或耐受性的机理知之甚少，但是有人认为，它可能涉及下述机理：阴性选择（新生儿）；免疫学忽略；诸如调节性T细胞（Tregs）等共刺激分子的周边无反应性或缺少；耗尽（PD-1的增量调节）。所有这些提议的机理的一个共同因素是，在患者中持续的高抗原水平。

HBV抗原HBeAg是一种分泌型、非颗粒形式的HBV核心蛋白。HBV抗原HBeAg和HbcAg共有基本氨基酸序列，所以表现出在T细胞水平的交叉反应性。病毒装配或复制不需要HBeAg，尽管研究表明，慢性感染的建立可能需要它们。

HBeAg-阴性突变体对新生儿的感染经常导致暴发性急性感染，而不是慢性HBV感染（Terezawa等人(1991) Pediatr. Res. 29:5），而WHeAg-阴性突变体对幼土拨鼠的感染会导致远远更低的慢性WHV感染率（Cote等人(2000) Hepatology 31:190）。HBeAg可能通过灭活核心特异性的T细胞（通过删除或克隆无反应）而起耐受原的作用（Milich等人(1998) J. Immunol. 160:8102）。在抗病毒疗法和HBeAg血清转换以后，在HBV病毒载量和抗原的减少与T细胞对抑制性受体程序化死亡-1（PD-1；也称作PDCD1，是活化的T细胞的一种负调节剂）的表达的降低之间存在正相关（Evans等人(2008) Hepatology 48:759）。

HBV表面抗原或HBsAg是传染性的HBV病毒颗粒的包膜蛋白，但是也作为非传染性的颗粒分泌，其血清水平是HBV病毒颗粒的1000倍。受感染的人或动物中的HBsAg的血清水平可以高达1000 μg/mL（Kann和Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 第9版. 745）。在急性HBV感染中，HBsAg在血清中的半衰期（或血清t_½）是8.3天（Chulanov等人(2003) J. Med. Virol. 69: 313）。骨髓树突细胞对HBsAg的内化，会抑制共刺激分子（即B7）的增量调节，并抑制T细胞刺激能力（den Brouw等人(2008) Immunology 126:280），在HBsAg存在下，来自慢性感染的患者的树突细胞也表现出共刺激分子的表达、IL-12的分泌和T细胞的刺激中的缺陷（Zheng等人(2004) J. Viral Hepatitis 11:217）。

来自CHB患者的HBsAg特异性的CD8细胞表现出改变的四聚体结合。这些CD8细胞不是无反应性的，但是可能具有赋予部分耐受性或忽略的TCR拓扑学（Reignat等人(2002) J. Exp. Med. 195:1089）。此外，在Peg-IFNα2a治疗期间，在第24周时> 1 log的血清HBsAg降低，具有持久的病毒学应答（SVR——定义为在治疗后1年时通过PCR不可检测的HBV DNA）的高预测值（92%）（Moucari等人(2009) Hepatology 49:1151）。

由于重叠的传播途径，许多人已经暴露于乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV），更少的人群是两种病毒的慢性感染者，特别是在诸如亚洲等HBV地方性流行的地区。据估测，多达10%的HCV感染者也可能具有HBV，同时20%的HBV感染者可能受到HCV的共同感染。但是，尚未较好地研究在HBV-HCV共同感染的个体中的乙型肝炎或乙型肝炎的治疗。

HCV和HBV似乎抑制彼此的复制（尽管并非所有研究都已经观察到该相互作用）的事实，使得治疗复杂化。因此，完全抑制HBV的治疗可能潜在地允许HCV再度出现，或反之亦然。

因此，本发明的ASO化合物可以有利地用于治疗被HBV和HCV感染的患者。丙型肝炎（HCV）的示例性的治疗选项包括：干扰素，例如，干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1。使用聚乙二醇化的干扰素（连接到聚乙二醇部分上的干扰素，所述部分会显著改善它的药代动力学特性），可以实现更低频率的干扰素给药。还已经证实，干扰素α-2b（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）和利巴韦林的联合治疗对于某些患者群体而言是有效的。目前处于开发中的其它药剂包括：HCV RNA复制抑制剂（例如，ViroPharma的VP50406系列）、HCV反义剂、HCV治疗疫苗、HCV蛋白酶抑制剂、HCV解螺旋酶抑制剂和HCV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

本发明的实施方案提供了与SEQ ID NO: 1-13中的任一个基本上互补的ASO化合物，它们用于治疗被HBV和HCV感染的受试者，其中所述ASO化合物与HCV剂联合施用。所述HCV剂可以在与ASO化合物相同的药物制剂中施用，或可以在单独的制剂中施用。此外，所述HCV化合物可以与ASO HBV化合物同时地施用，或可以单独地施用，使得HBV ASO化合物和HCV剂各自的剂量在患者体内在时间上重叠。在有关的实施方案中，所述HCV剂可以选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂（例如，ViroPharma的VP50406系列）；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

在另一个实施方案中，本发明的HBV ASO化合物可以与第二种HBV治疗剂联合地施用给被HBV感染的患者，其中所述第二种HBV治疗剂可以在与HBV ASO化合物相同的药物制剂中施用，或可以在单独的制剂中施用。所述第二种HBV治疗剂可以可以与ASO HBV化合物同时地施用，或可以单独地施用，使得HBV ASO化合物和HBV治疗剂各自的剂量在患者体内在时间上重叠。在有关的实施方案中，所述HBV治疗剂可以选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种HBV反义化合物；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定（3TC）；恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定（LdT）；阿德福韦；和HBV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

图4是HBV转录的示意图，它显示了由HBV基因组编码的主要转录物（包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依赖性的DNA聚合酶（逆转录酶活性）、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴）、转录物的相对长度以及大、中和小S蛋白转录物的重叠区。也指示了HBV DNA的+和-链。

图5显示了对比来自HBV的多个基因型的基因组DNA的序列之间的同一性百分比的计算生物学分析，其按照HBV基因组区域进行绘制。如图5所示，鉴别出了在所述序列中具有100%同一性的多个区域，特别是聚合酶和大、中和小S蛋白转录的区域。

图6是不同地理学HBV基因型的表。如该表所示，存在8个已经分类的不同的地理学HBV基因型，它们的基因组DNA相差大约8%。除了它们的地理学分布差异之外，HBV基因型也可以在临床史和它们对干扰素疗法的应答方面存在差异。

使用扩展的计算生物学分析，与在图5中所例证的类似，分析了约2300个序列，并令人惊讶地鉴别出13个在不同基因型之间具有>95%同一性的序列。该分析已经允许设计单个反义寡聚体序列，它们各自靶向在多种转录产物和HBV基因组区域（在基因型之间）中具有>95%同一性的保守序列。因而，发明人已经令人惊讶地且意外地鉴别出单个ASO序列关闭多种转录产物的方法，且相同的单个ASO也在所有地理学HBV基因型之间具有增加的活性。这样的方案考虑到一种药物组合物，所述组合物包含单个ASO序列作为活性化合物，且所述组合物具有比现有HBV疗法极大增加的效能，将严重地限制HBV株的形成抗性的能力，并将导致90%或更大的病毒载量减少，这通过HBV DNA和HBV抗原HBeAg和HBsAg的存在予以证实。本发明的药物组合物因而将为遭受慢性HBV感染的患者提供一种改善的治疗性处理，所述处理能够提供完全血清转换，并最终导致慢性HBV感染的完全治愈。这样的方案也会减轻HBV相关肝病，诸如肝硬化、肝细胞癌（HCC）和纤维化和炎症，导致更少的肝移植需求，并帮助预防死于肝病。

另外，除了极大提高的病毒载量减少以外，本发明的ASO会提供其它益处。认为HBeAg具有免疫抑制作用，认为HBsAg会促进T细胞耗竭。因此，使用本发明的ASO的治疗，会通过降低HBeAg和HBsAg水平来支持患者的免疫应答，允许免疫系统更好地控制感染。也预见到，肝中HBV抗原呈递的减少，将有助于使HBV感染发作（flare-up）的程度最小化（免疫系统恢复的结果），它们都会增加完全治愈慢性HBV感染的机会。

提供了用于减少靶细胞中的乙型肝炎病毒基因组量的方法和组合物。在主题方法中，以足以减少靶细胞中病毒基因组的量的方式，抑制几种特异性HBV靶蛋白中的任一种的表达，例如，通过将反义RNA抑制剂导入靶细胞中。也提供了用于实践主题方法的药物组合物。主题发明的实施方案可以用于多种用途，包括治疗遭受病毒介导的疾病状况（例如，HBV介导的疾病状况）的受试者。这样的病症包括、但不限于：肝的纤维化和炎症、肝硬化和肝细胞癌（肝癌）。

本发明的一个实施方案提供了一种反义寡聚体（ASO），其用于治疗哺乳动物（包括人类）的HBV感染，其中所述ASO与SEQ ID NO: 1-13中的任一个基本上互补，且可以有效地降低病毒载量或抗原水平至少40%、更优选至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选80%和最优选90%。所述ASO可以包含至少2个修饰的核苷，包括锁定的核酸（LNA）单元，其中所述LNA单元具有2’O-烷基-4’C连接，导致在修饰的LNA核苷掺入ASO序列中的ASO位置处的二环糖。

本发明的反义寡聚体是单链寡核苷酸，其包含核苷类似物（诸如LNA）或核苷酸类似物（诸如硫代磷酸酯），它们形成反义寡核苷酸的连续核酸序列的一部分。反义寡聚体的序列由连续的核苷酸或核苷序列组成。

本文使用的术语“反义”是指这样的核酸寡核苷酸序列：当从5’-端至3’-端看时，其包含与DNA的有义链基本上互补的序列，即，所述反义寡核苷酸具有与DNA的有义链（也称作编码链）相反的序列朝向（从5’至3’-），所以所述反义寡聚体与给定的DNA编码区或基因的有义链基本上互补。

在本发明的上下文中，与术语“寡聚体”可互换地使用的术语“寡核苷酸”（或简称“寡物”）表示，通过2个或更多个核苷酸的共价连接形成的分子。当用于本发明的寡核苷酸（也称作单链寡核苷酸）的上下文中时，在一个实施方案中，术语“寡核苷酸”可能具有例如10-26个核苷酸, 更具体地，本发明的寡核苷酸可能具有12-20个核苷酸，或更具体地14-18个核苷酸。

术语“核苷酸”表示这样的分子：其具有3种组分，即杂环含氮碱基（有时称作核苷碱基，包括嘧啶和嘌呤碱基）、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酰基（磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯等），实例包括但不限于：DNA核苷酸诸如脱氧腺苷-5’-单磷酸（dAMP）、脱氧鸟苷-5’-二磷酸（dGDP）、脱氧胸苷-5’-三磷酸（dTTP）和脱氧胞苷-5’-三磷酸（dCTP），和RNA核苷酸诸如腺嘌呤-5’-单磷酸（AMP）、胞苷-5’-二磷酸（CDP）、肌苷-5’-单磷酸（IMP）、尿苷-5’-三磷酸（UTP）和鸟苷-5’-三磷酸（GTP）。

本文使用的核苷酸包括：磷酸酯类似物诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯类似物。应当认识到，在某些方面，术语核苷碱基也可以用于表示天然存在的或非天然存在的核苷酸——在这方面，术语核苷碱基和核苷酸可以在本文中可互换地使用。核苷碱基包括、但不限于：鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胸腺嘧啶、N7-甲基鸟嘌呤、N7-甲基肌苷、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶以及其它。

本文提供的寡聚体化合物可以包含一种或多种单体，包括核苷或核苷酸，其具有修饰的糖部分。例如，可以以许多方式修饰核苷的呋喃糖基糖环，所述方式包括、但不限于：添加取代基、桥接2个未成对的环原子以形成锁定的核酸（LNA）。

在某些实施方案中，寡聚体化合物包含一个或多个单体，所述单体是LNA。在某些这样的实施方案中，LNA包括、但不限于如下描绘的：(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’) LNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’) LNA、(C)亚乙基氧基(4’-(CH₂)₂-O-2’) LNA、(D)氨基氧基(4’-CH₂-O-N(R)-2’) LNA和(E)氧基氨基(4’-CH₂-N(R)-O-2’) LNA。

在某些实施方案中，LNA化合物包括、但不限于：具有至少一个在糖的4'和2’位之间的桥的化合物，其中每个桥独立地包含1个或2-4个独立地选自下述的连接基团：-[C(R₁)(R₂)]_n-、-C(R₁)=C(R₂)-、-C(R₁)=N-、-C(=NR₁)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(R₁)₂-、-S(=O)_x-和-N(R₁)-；

其中：

x是0、1或2；

n是1、2、3或4；

每个R₁和R₂独立地是：H、保护基、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、杂环基团、取代的杂环基团、杂芳基、取代的杂芳基、C₅-C₇脂环基团、取代的C₅-C₇脂环基团、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基（C(=O)-H）、取代的酰基、CN、磺酰基（S(=O)₂-J₁）或sulfoxyl（S(=O)-J₁）；和

每个J₁和J₂独立地是：H、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、酰基（C(=O)-H）、取代的酰基、杂环基团、取代的杂环基团、C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保护基。

在一个实施方案中，LNA化合物的每个桥独立地是：-[C(R₁)(R₂)]_n-、-[C(R₁)(R₂)]_n-O-、-C(R₁R₂)-N(R₁)-O-或-C(R₁R₂)-O-N(R₁)-。在另一个实施方案中，每个所述桥独立地是：4'-CH₂-2'、4'-(CH₂)₂-2'、4'-(CH₂)₃-2'、4'-CH₂-O-2'、4'-(CH₂)₂-O-2'、4'-CH₂-O-N(R₁)-2'和4'-CH₂-N(R₁)-O-2'-，其中每个R₁独立地是：H、保护基或C₁-C₁₂烷基。

已经制备了某些LNA，并公开在专利文献中以及在科学文献中（参见例如: 授权的美国专利号7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,696,345、7,569,575、7,314,923、7,217,805和7,084,125，特此通过引用整体并入本文）。

本文也提供了LNA，其中核糖基糖环的2'-羟基与糖环的4' 碳原子相连，从而形成亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）连接，以形成二环糖部分（综述见：Elayadi等人 , Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch等人 , Chem. Biol., 2001, 8 1-7；和Orum等人 , Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；也参见美国专利: 6,670,461）。所述连接可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基（-CH₂-），对它而言，术语亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA用于二环部分；在亚乙基存在于该位置的情况下，使用术语亚乙基氧基（4’-CH₂CH₂-O-2’）LNA（Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita等人 , Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226）。亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA和其它二环糖类似物表现出非常高的与互补DNA和RNA的双链体热稳定性（Tm = +3至+10 ℃）、对3'-核酸外切降解的稳定性和良好溶解度性质。已经描述了有效的且无毒的包含LNA的反义寡核苷酸（Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638）。

已经讨论过的亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA的一种异构体是α-L- 亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA，其已经被证实具有抗3'-外切核酸酶的优良稳定性。α-L- 亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA被掺入表现出有效反义活性的反义gapmer和嵌合体中（Frieden等人 , Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372）。

已经描述了亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备、以及它们的寡聚化和核酸识别性质（Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。LNA及其制备也描述在WO 98/39352和WO 99/14226中，它们通过引用并入本文。

还已经制备了亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA、硫代磷酸酯- 亚甲基氧基（4’-CH₂-O-2’）LNA和2'-硫代-LNA的类似物（Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222）。还已经描述了锁定的核苷类似物的制备，所述锁定的核苷类似物包含寡脱氧核糖­核苷酸双链体作为核酸聚合酶的底物（Wengel等人, WO 99/14226）。此外，本领域已经描述了2'-氨基-LNA的合成，所述2'-氨基-LNA是一种新颖的构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物（Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039）。另外，已经制备的2'-氨基-和2'-甲氨基-LNA，以前已经报道了它们与互补的RNA和DNA链的双链体的热稳定性。

在一个实施方案中，所述反义寡聚体可以包含至少2个LNA单体, 更具体地，所述反义寡聚体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA单体。如下所述，所述连续核苷酸序列可以由LNA和DNA单元（包括连接基团，诸如硫代磷酸酯连接）组成，或可以由LNA和其它核苷和核苷酸类似物组成。在有些实施方案中，所述连续核苷酸序列可以包含6、7、8、9、10、11、12、13或14个DNA核苷酸，剩余的核苷酸包含核苷类似物，诸如LNA单元。

某些实施方案提供了长度为10-100个核苷酸的ASO，其具有掺入序列中的LNA核苷酸。某些实施方案提供了具有4-8-4模式的ASO，其对应从5’至3’-方向连贯的4个LNA核苷酸、8个非-LNA间隙核苷酸（nt）、4个LNA核苷酸。因而，4LNA-8nt-4LNA基序包含中央核苷酸（nt）间隙段，该段具有8个连贯地连接的2’-脱氧核苷酸。在4LNA-8nt-4LNA 16-聚体ASO中的nt间隙段在两侧（5’和3'）侧接翼段。在每个ASO中的每个翼段具有4个连贯地连接的核苷酸。在每个ASO中的每个翼段的每个核苷酸具有锁定的核酸（LNA）糖修饰。遍布于每个LNA反义寡核苷酸中的每个核苷酸间连接是硫代磷酸酯（P=S）连接，尽管预见到，在本发明的某些ASO上的某些核苷酸间连接可以是除了硫代磷酸酯以外的连接，包括磷酸二酯连接。给定的ASO的LNA基序可以在4LNA-8nt-4LNA至其它基序（包括具有更长或更短总核苷酸序列的LNA-nt-LNA基序的其它组合）的范围内变化，这也在本发明的范围内。某些实施方案提供了不同的其它“翼-间隙-翼”模式的ASO。所述“翼-间隙-翼”模式经常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”代表5’翼区的长度，“Y”代表间隙区的长度，“Z”代表3’翼区的长度。在有些实施方案中，X和Z是相同的，在其它实施方案中，它们是不同的。在某些实施方案中，X和Z的长度独立地是1-5个核苷。在某些实施方案中，Y的长度是8-12个核苷酸。本发明的ASO的长度也可以是10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体、19-聚体或20-聚体（即分别具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸的寡聚体）或更长，最多达100个核苷酸。其它具体实施方案提供了长度为10-100个核苷酸的ASO，其具有以如上所述的其它可能的替代模式掺入序列中的LNA。在其它具体的实施方案中，在给定的序列中可能存在超过一个LNA-nt-LNA基序，所以本文所述的通式5’-LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-Nl-P-LNAr-P-LNAq-3’（式1）可能是在总长度为10-20个核苷酸的特定ASO内。

在一个具体实施方案中，在反义寡聚体序列中的核苷酸间连接选自：磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯连接。在另一个具体实施方案中，所有核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。

在一个更具体的实施方案中，在反义寡聚体序列中的核苷酸间连接选自：磷酸二酯连接和硫代磷酸酯连接。

在一个更具体的实施方案中，所述反义寡聚体包含至少2个修饰的核苷酸，更具体地至少2个锁定的核酸（LNA）单元，其中所述LNA单元具有2’O-烷基-4’C连接。

一个具体的实施方案提供了一种反义寡聚体，其包含至少2个朝向ASO的3’-端和5’-端安置的LNA单元，更具体地，所述ASO包含至少3个朝向ASO的3’-端和5’-端安置的LNA单元，更具体地，所述ASO包含至少4个LNA单元，更具体地，所述至少4个LNA单元朝向ASO的3’-端和5’-端安置，所以所述ASO包含下式1所述的序列：

5’-LNA_n-P-LNA_p-P-N_m-P-N_l-P-LNA_r-P-LNA_q-3’（式1）

其中

LNA是具有2’-O-Me-4’C连接的锁定的核酸单元；

P选自：磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯连接，所述连接是在LNA和邻近的N之间，或在N和邻近的N之间，或在N和邻近的LNA之间，或在LNA和邻近的LNA之间，从式（1）序列的5’至3’方向；且其中

N选自：G、C、A、T、U或X核苷酸单元；

n和r和p和q各自独立地是：选自1、2或3的整数；

l和m各自独立地是：1-22的整数；且

其中X选自：肌苷、N⁷-甲基肌苷、N⁷-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胸苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷。

在一个有关的具体实施方案中，所述反义寡聚体包含至少6个硫代磷酸酯连接。在另一个有关的具体实施方案中，所述反义寡聚体包含所有硫代磷酸酯连接。

在另一个实施方案中，提供了一种治疗哺乳动物（包括人）的HBV感染的方法，其中治疗包括：施用有效剂量的本发明的反义寡聚体，所述反义寡聚体与SEQ ID NO: 1-13中的任一个基本上互补，从而在哺乳动物（包括人）中治疗HBV感染，并促进血清转换。所述有效剂量可以在0.01 mg/kg体重至大约100 mg/kg体重范围内，每周施用1次或2次，持续24、36或48周或更久，这由医师决定。使用病毒载量的量化或其它感染证据，诸如通过测量HBeAg、HBsAg、HBV DNA水平、ALT活性水平、血清HBV水平等，可以确定治疗效能，从而允许调节治疗剂量、治疗频率和治疗持续时间。

实施例

寡聚体的制备

如在公开的专利申请和文献中所述（包括在WO2007/112754中提及的方法，在公开为US20090143326的美国专利申请中所述的方法，它们二者特此通过引用并入本文），制备LNA单体和寡核苷酸合成。如本文所述的LNA ASO也可以购自，例如，Exigon。

使用在WO2007/112754（通过引用并入本文）中提及的和在本文中描述的方法，可以用LNA反义寡核苷酸（靶向人HBV基因组的SEQ ID NO: 1-13）处理体外细胞。使用在WO2007/112754（通过引用并入本文）中提及的和在本文中描述的方法，也可以在体外和体内模型中通过RNA特异性的实时定量PCR，分析HBV感染的反义寡核苷酸抑制。另外，使用例如在WO2007/112754中或在J. Virol (1998）vol. 71, 第2630-2637页中或在Yonsei Medical Journal (1995）, col. 36, 第527-533页中（它们都通过引用并入本文）公开的方法，可以进行使用靶向HBV表达的长度为10至100个核苷酸的本发明反义寡聚体（针对人HBV基因组的SEQ ID NO 1-13）的体内实验，并随后分析。还已经开发了HBV的土拨鼠模型，其中可以用土拨鼠肝炎病毒（WHV）感染土拨鼠（Marmoto monax），导致慢性或急性感染，其模拟人HBV感染的许多方面[Menne S和Cote PJ（2007）World J Gastroenterol 13, 104-124和Menne S等人（2002）Intervirology 45, 237-250，通过引用并入本文]。由Menne和Cote以及Menne等人描述的土拨鼠模型可以用于检查慢性感染，测量血清中的病毒DNA（其中使用DNA印迹杂交），并通过ELISA测量血清中的病毒抗原。

生物活性

（A）人乙型肝炎结果

实施例 1: LNA 反义寡核苷酸对 HepG2 2.2.15 细胞中的乙型肝炎病毒表达的反义抑制

锁定的核酸寡核苷酸购自Exiqon。测试的LNA反义寡核苷酸的总长度是16个核苷酸，各自具有4LNA-8nt-4LNA基序，且各自包含中央核苷酸（nt）间隙段，该段具有8个连贯地连接的2’-脱氧核苷酸。在每个16-聚体ASO中的nt间隙段在两侧（5’和3'）侧接翼段。在每个ASO中的每个翼段具有4个连贯地连接的核苷酸。在每个ASO中的每个翼段的每个核苷酸具有锁定的核酸（LNA）糖修饰。遍布于每个LNA反义寡核苷酸中的每个核苷酸间连接是硫代磷酸酯（P=S）连接，尽管预见到，在本发明的某些ASO上的某些核苷酸间连接可以是除了硫代磷酸酯以外的连接，包括磷酸二酯连接。给定的ASO的LNA基序可以在4LNA-8nt-4LNA至本文所述的其它基序（包括具有更长或更短总核苷酸序列的LNA-nt-LNA基序的其它组合）的范围内变化，这也在本发明的范围内。在人肝胚细胞瘤细胞系HepG2.2.15中评价了16-聚体LNA ASO的抑制乙型肝炎病毒表达的能力，这通过测量HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平来测定。

所有寡核苷酸含有硫代磷酸酯连接，长度是16个核苷酸，且含有在4-8-4基序中的锁定的核酸，包括具有在5’-端处的4个核苷酸和在3’-端处的4个核苷酸的LNA。反义寡核苷酸的序列（作为SEQ ID NO 14-23通过引用并入本文中）如表1所示。

在37℃、5% CO₂，在RPMI（Invitrogen #22400-089）、10% FBS、庆大霉素（10µg/ml）中，培养用具有HBV基因的头至尾二聚体的质粒稳定地转染的HepG2 2.2.15细胞（人肝胚细胞瘤细胞系）的单层，当汇合时，1:3分裂。

在无菌水中制备反义寡核苷酸的储备溶液，并稀释至4.25µM的浓度用于转染。将10µL寡核苷酸与130µL Opti-Mem（Invitrogen）混合。将100µL该寡核苷酸混合物与100µL Lipofectamine 2000（Invitrogen）混合，并在室温温育20分钟。通过将70µL稀释进140µL Opti-Mem中，进行系列稀释。将50µL稀释的混合物加入96-孔板中，并加入100µL处于2.8 X 10⁵/mL浓度的HepG2 2.2.15细胞。在37℃、5% CO₂温育转染的细胞4天，在第2天更换培养基。在第4天取出上清液，用于评价分泌的HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并根据生产商的说明书，使用CellTiter-Glo（Promega），在剩余的细胞单层上测定细胞生存。根据生产商的说明书，使用Abazyme HBV s Ag试剂盒（目录号EL10018），测量HBsAg水平。根据生产商的说明书，使用BioChain HBV e Ag试剂盒（目录号KO31006096），测量HBeAg水平。

为了分析上清液中的HBV DNA，根据生产商的说明书，使用QiaAmp 96 DNA Blood试剂盒（Qiagen），从50µL上清液中提取DNA。将5µL DNA用于TaqMan分析，其中使用[Thimme R等人（2003）J. Virol. 77, 68-76]所述的引物和条件。使用基于已知量的HBV DNA的质粒克隆的标准曲线，计算分泌到培养基中的HBV基因组当量。

使用来自在没有寡核苷酸存在下接受转染操作的细胞的值，标准化细胞生存、HBV DNA和分泌的抗原的抑制。通过非线性回归来分析数据，并使用GraphPad Prism5拟合至对数（抑制剂）相对于响应的曲线。

在表1中显示了用反义寡聚体处理HepG2 2.2.15细胞的结果。针对HBV序列的所有反义寡聚体抑制了HBsAg和HBeAg的生成和分泌，其效力大于对照寡聚体的效力。对照寡聚体也抑制抗原的生成和分泌，但是这可能是由于细胞毒性，因为在抗原抑制的IC50值和细胞毒性之间仅存在3倍差异。针对HBV序列的反义寡聚体具有抗原抑制的IC50值和细胞毒性之间的更大倍数差异。反义寡聚体RH1、RH3、RH4和RH7具有最大的倍数差异，并也表现出分泌的HBV DNA的一致抑制。HBV DNA的抑制没有增加超过50%，所以没有计算IC50值。在表1中显示了在0.6 nM寡聚体浓度（没有观察到任何寡聚体的细胞毒性时的浓度，且接近抑制HBsAg和HBeAg的IC50值）时HBV DNA的% 抑制。

实施例 2: LNA 反义寡核苷酸对 HepAD38 （ Tet-HBV ）细胞中乙型肝炎病毒或 SV40 T 抗原表达的反义抑制

用序列GAGGCATAGCAGCAGG（SEQ ID NO: 16）设计了靶向HBV的LNA反义寡核苷酸，其与在SEQ ID NO: 4和GENBANK登记号U95551.1中描绘的DNA序列互补，并入本文中作为SEQ ID NO: 16。所述LNA反义寡核苷酸的总长度是16个核苷酸，具有4-8-4 LNA基序，其中所述ASO具有中央间隙段，该段具有8个连贯地连接的2’-脱氧核苷酸。所述间隙段在两侧（5’和3'）侧接翼段。每个翼段具有4个连贯地连接的核苷酸。每个翼段的每个核苷酸具有锁定的核酸（LNA）糖修饰。遍布于LNA反义寡核苷酸中的每个核苷酸间连接是硫代磷酸酯（P=S）连接。LNA反义寡核苷酸的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。评价了LNA反义寡核苷酸的减少HepAD38细胞中的HBV mRNA的能力。

使用741 nM、2, 222 nM、6, 667 nM和20, 000 nM反义寡核苷酸电穿孔大约24小时的时段，转染HepAD38细胞。从细胞分离出RNA，并通过定量实时PCR，测量HBV mRNA水平。根据通过RIBOGREEN测得的总RNA含量，调节HBV mRNA水平。使用引物探针集合RTS3372（正向序列ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT，在本文中命名为SEQ ID NO: 24；反向序列CGACGCGGCGATTGAG，在本文中命名为SEQ ID NO: 25，探针序列AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG，在本文中命名为SEQ ID NO: 26），测量mRNA水平。数据显示在表2中，表示为与未处理的细胞相比mRNA水平的抑制百分比。LNA反义寡核苷酸以剂量依赖性的方式降低HBV mRNA水平。

还在相同条件下，用引物探针集合RTS3373MGB（正向序列CCGACCTTGAGGCATACTTCA，在本文中命名为SEQ ID NO：27；反向序列AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA，在本文中命名为SEQ ID NO：28，探针序列TTAAAGACTGGGAGGAGTTG，在本文中命名为SEQ ID NO：29），测试了LNA反义寡核苷酸。数据显示在表3中，表示为与未处理的对照细胞相比HBV的抑制百分比。如表3所示，所述LNA反义寡核苷酸以剂量依赖性的方式降低HBV mRNA水平。

表2使用RTS3372测量的HepAD38细胞中的HBV mRNA的剂量依赖性的反义抑制

表3使用RTS3373MGB测量的HepAD38细胞中的HBV mRNA的剂量依赖性的反义抑制

实施例 3: LNA 反义寡核苷酸对 THT1 细胞中的乙型肝炎病毒或 SV40 T 抗原表达的反义抑制

评价了在实施例3中所述的LNA反义寡核苷酸的减少THT1细胞（也称作HepG2 2.2.15细胞）中的HBV mRNA的能力。使用741 nM、2, 222 nM、6, 667 nM和20, 000 nM反义寡核苷酸电穿孔大约24小时的时段，转染这些细胞。从细胞分离出RNA，并通过定量实时PCR，测量HBV mRNA水平。根据通过RIBOGREEN测得的总RNA含量，调节HBV mRNA水平。数据显示在表4中，表示为与未处理的细胞相比mRNA水平的抑制百分比。如表4所示，所述LNA反义寡核苷酸以剂量依赖性的方式降低HBV mRNA水平。

表4 HepG2细胞中HBV mRNA的剂量依赖性的反义抑制

（B）反义寡聚体在动物模型中的评估

实施例 4: 评估 ASO 的减少转基因小鼠中的 HBV 载量的有效性

使用HBV转基因小鼠谱系1.3.32（正式命名, Tg[HBV 1.3基因组]Chi32）来评估反义寡聚体的减少动物模型中的HBV载量的有效性。转基因小鼠在肝和肾中以高水平复制HBV，没有任何细胞病理学证据。如下繁殖谱系1.3.32：针对C57BL/6亲本品种重复回交，然后针对B10D2小鼠繁殖一代，以生成要在所有描述的试验中使用的F1杂种。关于年龄（6-10周）、性别（雄性）和血清中的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平（使用可从Abbott Laboratories（Abbott Park, IL）商业得到的试剂盒测定），配对小鼠。

（A）通过静脉内的或皮下的施用，用HBV DNA寡聚体处理HBV转基因小鼠7-21天，然后处死。然后分析小鼠肝中HBV DNA和RNA水平的降低。使用DNA印迹法或实时QPCR来测定DNA水平，使用RNA印迹法或实时QPCR方法来测定HBV RNA转录物水平。也使用可商业得到的HBeAg和HBsAg的ELISA试剂盒，分析了小鼠血清中HBeAg和HBsAg的生产水平。

通过DNA印迹来分析DNA，并根据下述规程，用³²P标记的HBV DNA探针进行探测。使用本领域技术人员常见的方法，从HBV感染的肝细胞提取DNA，通过在琼脂糖凝胶中的电泳进行分离，并转移到硝酸纤维素滤器上。使用³²P-切口平移的-HBV DNA探针。在病毒对照组中，在第2、6、8、10、14、18和20天收获肝。在药物治疗组中，在第8、14和20天收获肝。在含有裂解缓冲液的微量离心管中，用非常匹配的研杵研磨肝样品。在室温温育5-10 min以后，将试管在液氮中快速冷冻贮存。使用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，纯化DNA。通过琼脂糖凝胶电泳，分级分离用Hind III（其不在转基因内切割）切割的肝DNA，然后使用碱性转移方法，使用硝酸纤维素或其它适当的膜，进行DNA印迹杂交。

通过RNA印迹来分析RNA，并根据下述规程，用³²P标记的HBV DNA探针进行探测。按照生产商的方案，使用Trizol试剂，加工肝样品用于RNA提取。简而言之，使用玻璃-特氟隆或功率匀浆器（例如Polytron, Tekmar的TISSUEMIZER），在1 ml TRIZOL试剂（每50-100 mg组织）中匀浆化组织样品。在室温温育匀浆化的样品5分钟，然后离心以去除细胞碎片。将上清液转移至新试管。每1 ml TRIZOL试剂加入0.2 ml氯仿。给样品试管安全地盖上帽。剧烈地涡旋样品15秒，并在室温温育它们2-3分钟。在2-8℃在不超过12,000 x g离心样品15分钟。不扰动中间相，小心地转移上层水相到新试管中。测量水相的体积（水相的体积是用于匀浆化的TRIZOL试剂的体积的约60%）。通过与异丙醇混合，从水相中沉淀出RNA。对于每1 ml用于初步匀浆化的TRIZOL试剂，使用0.5 ml异丙醇。在15-30℃温育样品10分钟，并在2-4℃在不超过12,000 x g离心10分钟。RNA沉淀物（在离心之前经常不可见）在试管的侧壁和底部形成凝胶样沉淀。完全去除上清液。用75% 乙醇洗涤RNA沉淀物1次，对于每1 ml用于初步匀浆化的TRIZOL试剂，加入至少1 ml 75% 乙醇。通过涡旋来混合样品，并在2-8℃在不超过7,500 x g离心5分钟。重复上述洗涤操作一次。去除所有残余的乙醇。风干或真空干燥RNA沉淀物5-10分钟。通过使溶液穿过吸液管尖头几次，将RNA溶解于DEPC处理过的水中。在甲醛琼脂糖凝胶中分离RNA，并转移至硝酸纤维素或其它适当的膜。使用³²P-切口平移的-HBV DNA探针，检测HBV转录物。

在0（无活性）至++++ （高活性）的评分表上，评分测试的药物。

实施例 5: 使用受 WHV 感染的土拨鼠评估反义寡聚体

可以用土拨鼠肝炎病毒（WHV）感染土拨鼠（Marmoto monax），导致慢性或急性感染，其模拟人HBV感染的许多方面[Menne S和Cote PJ (2007) World J Gastroenterol 13, 104-124]。通过用WHV7P1感染新生儿，可以建立慢性感染。通过斑点印迹DNA杂交，可以测量血清中的病毒DNA，并通过ELISA测量血清中的病毒抗原[Menne S等人(2002) Intervirology 45, 237-250]。

WHV的DNA序列不同于HBV，所以需要为WHV优化反义寡聚体，存在用于该目的的体外系统，其以前已经被用于评价siRNA [Meng Z等人(2009) Virology 384, 88-96]。

通过静脉内的或皮下的施用，用反义寡聚体处理被WHV慢性感染的土拨鼠。给药方案取决于以前测定的反义寡聚体在土拨鼠中的肝内半衰期，但是将是每周1次或2次。治疗持续时间将是≥6个月。在治疗过程中以及治疗后至少3个月，定期测量病毒DNA、病毒抗原和针对病毒抗原的抗体的血清水平。在整个随访期中持续的病毒DNA和病毒抗原减少，指示阳性的结果。用有效的核苷类似物长期治疗被WHV慢性感染的土拨鼠，导致在治疗停止的1-2个月内病毒再发作。WHV DNA和血清转换的减少（定义为病毒抗原的损失和针对抗原的抗体的出现），也指示阳性的治疗结果。

意图在HBV感染的患者中测试的反义寡核苷酸化合物与下面显示的SEQ:ID NO: 1-13中的任一个基本上互补。这些序列在超过95%的HBV人地理学基因型A-H（在图6中列出）中是保守的。

对于人类，治疗方案通常是48周，这类似于用于Peg-IFN的方案（每周皮下注射，持续48周），但是没有INF-样全身副作用，这基于使用用于治疗丙型肝炎病毒（HCV）的LNA反义寡聚体进行的类似疗法（其中没有观察到全身副作用）（未公布的结果）预见到。预期的结果包括：HBV DNA和血清抗原的减少、大于使用Peg-IFN的治疗在HBeAg阳性患者中所看到的HBeAg血清转换、和大于使用Peg-IFN的治疗在HBeAg阴性患者中所看到的不可检测的HBV DNA和/或HBsAg血清转换。

上述的本发明的实施方案意图仅仅是示例性的；许多变化和修改是本领域技术人员显而易见的。所有这样的变化和修改意图落入任意所附权利要求限定的本发明范围内。

序列表

<110> Hamatake, Robert K.

<120> HBV 反义抑制剂

<130> PR63959WO

<150> 61/252380

<151> 2009-10-16

<160> 29

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 1

cctgctggtg gctccagttc 20

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 2

agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gg 42

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 3

tggatgtgtc tgcggcgttt tatcat 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 4

catcctgctg ctatgcctca tcttctt 27

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 5

caaggtatgt tgcccgt 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 6

tgtattccca tcccatc 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 7

cctatgggag tgggcctcag 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 8

tggctcagtt tactagtgc 19

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 9

gggctttccc ccactgt 17

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 10

tcctctgccg atccatactg cggaactcct 30

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 11

cgcacctctc tttacgcgg 19

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 12

ggagtgtgga ttcgcac 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 13

gaagaagaac tccctcgcct 20

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 14

gagagaagtc caccac 16

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 15

tgagagaagt ccacca 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 16

gaggcatagc agcagg 16

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 17

tgaggcatag cagcag 16

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 18

gatgaggcat agcagc 16

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 19

gatgggatgg gaatac 16

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 20

ggcccactcc catagg 16

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 21

aggcccactc ccatag 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 22

ctgaggccca ctccca 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 23

gtgtaacacg tctata 16

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

atcctatcaa cacttccgga aact 24

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgacgcggcg attgag 16

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 26

aagaactccc tcgcctcgca gacg 24

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ccgaccttga ggcatacttc a 21

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

aatttatgcc tacagcctcc tagtaca 27

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 29

ttaaagactg ggaggagttg 20

Claims (37)

1.一种反义寡聚体或其盐、溶剂化物、水合物或酯，其用于减少哺乳动物细胞或生物体中的乙型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反义寡聚体是长度为10-26个核苷的连续序列，且包含如式1所示的序列：

5’-LNA_n-P-LNA_p-P-N_m-P-N_l-P-LNA_r-P-LNA_q-3’（式1）

其中

LNA是锁定的核酸；

P是选自下述的核苷间连接：磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯连接，所述连接是在LNA和邻近的N之间，或在N和邻近的N之间，或在N和邻近的LNA之间，或在LNA和邻近的LNA之间，从式（1）序列的5’至3’方向；且其中

N选自：G、C、A、T、U或Z核苷单元；

n和r和p和q各自独立地是：选自1、2或3的整数；

l和m各自独立地是：1-22的整数；且

其中Z选自：肌苷、N⁷-甲基肌苷、N⁷-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黄苷、二氢尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脱氮鸟苷、7-乙基-7-脱氮鸟苷、N4-甲基胞苷、N4-乙基胞苷。

2.根据权利要求1或2所述的反义寡聚体，其中所述寡聚体的至少4个核苷单元是LNA单元，且其中存在于连续核苷序列的核苷单元之间的至少2个核苷间连接P是硫代磷酸酯核苷间连接，且所述LNA是具有2′-O-烷基-4′C连接的锁定的核酸单元，其中所述烷基是取代的或未取代的C_1-6烷基。

3.根据权利要求1或2所述的反义寡聚体，其中存在于连续核苷酸序列的核苷酸单元之间的所有核苷酸间连接是硫代磷酸酯核苷酸间连接。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体包含与SEQ ID NO. 1-13中的任一个基本上互补的序列。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体基本上包含SEQ ID NO. 14-22中的任一个的序列。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体包含与SEQ ID NO. 1-13中的任一个基本上互补的序列，且其中所述乙型肝炎病毒是人乙型肝炎病毒，且所述细胞或生物体是人。

7.根据权利要求5所述的反义寡聚体，其中n、p、r和q各自独立地是1或2，且l和m各自独立地是2、3、4、5或6。

8.根据权利要求7所述的反义寡核苷酸，其中n、p、r和q各自独立地是1，且l和m各自独立地是6。

9.根据权利要求5、7或8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述序列进一步选自SEQ ID NO 14、16、16或20中的任一个。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡聚体，其中所述HBV抗原是HBsAg。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡聚体，其中所述HBV抗原是HBeAg。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡聚体，其中所述乙型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

13.一种用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒感染的药物制剂，其包含有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的核酸寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯和药学上可接受的稀释剂。

14.一种用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒的药物制剂，其包含有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的核酸寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯和药学上可接受的稀释剂。

15.一种根据权利要求1-14中任一项所述的用于治疗哺乳动物的乙型肝炎病毒感染的药物制剂，其另外包含药学上可接受的载体。

16.一种用于治疗具有乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒相关病症的哺乳动物的方法，所述方法包括：将治疗有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而治疗所述乙型肝炎病毒感染或所述乙型肝炎病毒相关病症。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述哺乳动物是人，其中所述乙型肝炎病毒感染或所述乙型肝炎病毒相关病症是来自人乙型肝炎病毒的乙型肝炎病毒感染。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的用于治疗具有乙型肝炎病毒感染的哺乳动物的方法，其中所述人乙型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人，且其中所述乙型肝炎病毒感染或所述乙型肝炎病毒相关病症是人乙型肝炎病毒相关病症。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述人乙型肝炎病毒相关病症选自下述的任一种：黄疸、肝癌、肝炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征或血清性肝炎。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，所述方法另外包括：与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在单一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述额外治疗剂选自：HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎（NSAID）剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述额外HBV剂选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定（3TC）；恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定（LdT）；阿德福韦；和HBV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述额外HCV剂选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。

25.一种用于减少受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在的方法，所述方法包括：将治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸或有效量的根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在相比，减少所述乙型肝炎病毒感染和所述乙型肝炎抗原。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物是人，且其中所述乙型肝炎病毒是人乙型肝炎病毒。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述人乙型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任一种：A（欧洲西北部、北美洲、中美洲）；B（印度尼西亚、中国、越南）；C（东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南）；D（地中海地区、中东、印度）；E（非洲）；F（美洲土著人、波利尼西亚）；G（美国、法国）；或H（中美洲）。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中与施用反义寡聚体之前的量相比，DNA的量减少了90%。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述HBV抗原是HBsAg。

30.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述HBV抗原是HBeAg。

31.根据权利要求25-27或29-30中任一项所述的方法，其中HBV抗原的存在被充分地减少以导致血清转换，所述血清转换定义为：如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子，血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在，或者定义为：如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子，血清HBsAg不存在，所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。

32.根据权利要求25所述的方法，所述方法另外包括：与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在单一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。

33.根据权利要求28所述的方法，其中所述额外治疗剂选自：HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎（NSAID）剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制剂。

34.根据权利要求29所述的方法，其中所述额外HBV剂选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定（3TC）；恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定（LdT）；阿德福韦；和HBV抗体治疗剂（单克隆的或多克隆的）。

35.根据权利要求29所述的方法，其中所述额外HCV剂选自：干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1（聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的）；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。

36.一种用于促进受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物的血清转换的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给受乙型肝炎病毒感染的哺乳动物；

监测HBeAg + HBeAb在哺乳动物血清样品中的存在；或

监测HBsAg在哺乳动物血清样品中的存在，

以致于，如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子，则血清样品中HBeAg的不存在+ HbeAb的存在，或者，如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子，则血清样品中HBsAg的不存在，指示哺乳动物的血清转换，所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。

37.根据权利要求16、25或36中任一项所述的方法，其中施用选自：口服、口腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药。

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