CN102759628B

CN102759628B - 检测转基因作物的微流体蛋白质芯片及其试剂盒

Info

Publication number: CN102759628B
Application number: CN201210232841.6A
Authority: CN
Inventors: 郑晓冬; 沙莎; 殷赟; 高晓莲; 周小川
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: CN102759628A

Abstract

本发明公开了一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，包括基于μParaflo^TM微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1Ac）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1c）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1F）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1Ab）、大豆胰蛋白酶（SBTI）和新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因（NPTⅡ）这6种转基因蛋白的同时检测。本发明还同时提供了一种转基因检测试剂盒，包括含6种探针的μParaflo^TM微流体DNA芯片、6种抗体-寡核苷酸复合物探针和6种检测抗体等。

Description

检测转基因作物的微流体蛋白质芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及转基因成分检测和微流体蛋白质芯片的技术领域，具体涉及一种用于检测多种转基因成分的高通量微流体蛋白质芯片和相关试剂盒。

背景技术

近十年来，转基因技术得到广泛发展。研究人员利用转基因技术培育出了抗除草剂、抗干旱、耐盐碱、抗重金属和抗病虫害、营养价值高的品种，对提高粮食产量、减少收获后损失以及增加农产品营养价值具有重要作用。随着人们对转基因的不断研究、吸收、推广，转基因作物的多样性越趋丰富。多个国家和地区相继批准了转基因作物进入商业化生产，同时转基因作物的种植面积也大幅增加。转基因作物的发展为社会带来了巨大的经济效益。

然而，转基因技术同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。人们对转基因的态度褒贬不一。因此，在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了保护消费者自由选择食品的权益，全球有40多个国家设定了转基因含量的上限，在欧盟，其标准为0.9%，韩国为3%，德国为0.5%，日本为5%。

转入基因表达蛋白质是转基因监测的重要对象，其不但作为转基因测定的主要标志物，而且能够反映转基因物种的功能特性，因此对转基因蛋白的检测对转基因安全控制具有重要的意义。转基因蛋白质检测目前常用的方法是酶联免疫吸附法（ELISA）, 但是这种方法具有低通量的局限性，不能对多种蛋白进行同时检测。随着转基因技术的发展及技术应用的扩散，含多种转基因成分的品种逐渐增多，并且在转基因产品的流通过程中逐渐出现“未知”样本，即来源于田间污染或违规种植。例如我国多省市场上发现了未允许商业化的转基因作物产品，在我国出口欧洲的产品中也被检出了转基因成分。不能被及时检测和发现的未知转基因产品的存在极大地损害了贸易信誉，并对人们的健康安全带来威胁。因此，对转基因蛋白的高通量检测方法，即实现在同一次试验中检出并判断所有“潜伏”的转基因蛋白成分，对中国的农作物贸易和人类的健康安全具有重要的意义。

微流体蛋白质芯片是一项国内外先进的生物芯片技术，其采用特殊的流体构造，使生物芯片中的反应能够在液态环境中进行。微流体芯片系统一般包括泵、封闭的反应腔、流路等，负责微量流体的传感、输送、检测和控制，并结合扫描仪等成像系统对反应结果进行定量、全面的分析。微流体式相较点样式芯片具有众多的优点，如具有稳定、不易污染、检测样品用量小、微型、自动化等特性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测转基因作物的微流体蛋白质芯片及其试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，包括基于μParaflo^TM微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1Ac）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1c）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1F）、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白（Cry1Ab）、大豆胰蛋白酶（SBTI）和新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因（NPTⅡ）这6种转基因蛋白的同时检测。

作为本发明的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的改进：

六种核酸序列为：

A：3' CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T 5'

B：3' CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA 5'

C：3' TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A 5'

D：3' TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG 5'

E：3' AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C 5'

F：3' TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T 5' ；

6种抗体-寡核苷酸复合物探针中的核酸序列和相应的检测抗体为：

a： 5' GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A 3'，抗Cry1Ac兔单抗；

b：5' GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT 3'，抗Cry1c兔多抗；

c： 5' ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T 3'，抗Cry1Ab兔单抗；

d：5' ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC 3'，抗Cry1F兔多抗；

e： 5' TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G 3'，抗SBTI兔多抗；

f： 5' AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A 3'，抗NPTⅡ兔单抗。

作为本发明的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的进一步改进：

抗体-寡核苷酸复合物探针，其合成方法是按照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联。

按照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联所得的复合物具备以下特征：1）核酸的3’端与抗体上赖氨酸的自由氨基端相连；2）平均每个抗体上连有2-4条寡核苷酸；3）抗体具有良好的活性。

本发明还同时提供了一种转基因检测试剂盒，包括以下成分：

①、含6种探针的μParaflo^TM微流体DNA芯片（即，基于μParaflo^TM微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片）；

②、6种抗体-寡核苷酸复合物探针；

③、6种检测抗体；

④、封闭缓冲液；

⑤、洗涤缓冲液；

⑥、反应缓冲液；

所述成分①②④⑤用来即时生成如上所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片。

作为本发明的转基因检测试剂盒的改进：

成分③的6种检测抗体为：生物素标记抗Cry1Ac兔多抗、生物素标记抗Cry1c兔单抗、抗Cry1Ab鼠抗、抗Cry1F鼠抗、抗SBTI鼠抗和抗NPTⅡ鼠抗。

作为本发明的转基因检测试剂盒的进一步改进：

封闭缓冲液的制备方法为：

①准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8；

②取75mL上述①所得的调节pH后的6×SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合；

③准备 BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中；

④ 制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合；

⑤常规灭菌；

洗涤缓冲液的制备方法为：将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入1mg的SDS均匀混合；常规灭菌；

反应缓冲液的制备方法为：每475μL的PBS缓冲液（PH=7.4）中加入25μL的质量浓度为20% 的BSA溶液；常规灭菌。

本发明还同时提供了上述转基因检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）、即时生成微流体蛋白质芯片；

2）、在生成的蛋白质芯片（即微流体蛋白质芯片）上进行样品检测，具体步骤如下：

将转基因检测样品（转基因作物）经蛋白提取和纯化后得到样品检测液；将50μL样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μL/min，在4℃条件下过夜孵育；反应结束后，用PBST缓冲液在30℃下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品；

3）、检测固定抗原：

涉及6种检测抗体；

涉及2种显色物质包括：①Cy3标记链霉亲和素；②Cy3标记的羊抗鼠抗体；

准备检测溶液：取500 μL反应缓冲液，将6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质均以1000倍稀释至反应缓冲液中；

4）、将上述检测溶液接入循环系统，室温下反应2小时，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，从而洗去多余的检测抗体和显色物质；

5）扫描：取出芯片，用芯片扫描仪Genepix^TM4000B对芯片结果进行提取，扫描参数选择PMT500，焦距190；观察芯片各位点上的信号。

作为本发明的转基因检测试剂盒的使用方法的改进：

步骤1）包括以下步骤：

Ⅰ、芯片循环系统的清洗；

Ⅱ、芯片表面的封闭：

将作为成分①的含6种探针的μParaflo^TM微流体DNA芯片置入微流体杂交室中进行芯片表面的封闭；

Ⅲ、探针在芯片表面的固定：

将作为成分②的6种抗体-核酸复合物探针以各50nM浓度混合稀释在封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30℃下以流速20μL/分钟循环孵育2h；探针固定反应完成后，将洗涤缓冲液移入样品管中，30℃下以20μL/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去。

本发明的第一个目的是提供一种可即时生成的转基因微流体蛋白质芯片，该芯片具有特异性强、灵敏度高、通量高、试剂用量少、操作方便的特点。

本发明的另一个目的是开发与该芯片检测技术相关的试剂盒，提供准确、有效、便于结果判定的检测转基因样品的方法。

本发明中使用的微流体系统是基于μParaflo^TM芯片系统（LC SCIENCES, 美国），创新点是在于芯片部分。

本发明的微流体蛋白质芯片，芯片的构成通过将6种抗体-寡核苷酸复合物探针在微流体核酸芯片表面反应，借助核酸的杂交将抗体固定到核酸芯片的表面。在检测需要前即时合成，以保证抗体探针的活性和检测的高灵敏度。每种探针合成6个重复位点，以保证检测结果的可靠性。芯片上需要的试剂和反应样品的体积只需20-50μL。

本发明的优点是：

(1)提供一种高通量（可同时检测6种转基因物质）的蛋白质芯片检测技术。

(2)采用即时合成蛋白质芯片的方法，避免了蛋白质芯片在长期储存过程中探针活性下降，保证了芯片的高灵敏度。在试剂盒基础上，芯片合成过程只需2小时，且无需任何繁琐的步骤。

(3)芯片中包含6个重复，使检测结果更可靠。

(4)芯片的合成只需要50-100μL的50nM抗体-寡核苷酸复合物探针，试剂耗量小。

(5)反应只需20-50μL样品检测液。

(6)结合微流体装置，操作方便，节省了检测劳动量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是微流体蛋白质芯片用于单一转基因物质的检测结果；

左图为Cry1Ac转基因叶片检测结果，右图为非转基因叶片检测结果。

图2是微流体蛋白质芯片用于六种转基因物质的检测结果。

具体实施方式

备注说明：以下所用到的各种缓冲液均需要进行常规灭菌。

实施例1、一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的制备方法，依次进行以下步骤：

第一步：基于μParaflo^TM微流体生物芯片原位合成六种不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连。对每种探针（即单链寡核苷酸）位置分别作A-F编号，每种探针重复6个位点，对每个位点编号，例如A种探针计为A1，A2，…A5，A6，其他种类探针类同。故，芯片上一共有36个探针位点。每种探针的序列及编号如下表1：

表1、探针的序列及编号

将此步合成的核酸芯片置于常温长期稳定保存（保存期一般可长达2年），为下述试剂盒中的①号材料。

第二步：合成针对6种转基因蛋白的抗体-寡核苷酸链复合物探针，步骤具体如下：

1）、准备6种转基因作物蛋白的抗体探针种类：（1）Bt Cry1Ac兔单抗；（2）Bt Cry1c 兔多抗；（3）Bt Cry1Ab 兔单抗；（4）BtCry1F 兔多抗；（5）大豆胰蛋白酶（SBTI）兔多抗；（6）新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因（NPTⅡ）兔单抗。

上述(1)~(6)例如可购自宜康（杭州）生物技术有限公司。

2）、合成六种核酸序列，3’端作NH₂修饰，由上海生工生物公司合成，核酸的序列以及待与其交联的抗体种类具体如下表2：

表2

备注说明：序列a与第一步中的A互补，b与B互补，c-C互补，d-D互补，e-E互补，f-F互补。

3）、参照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体（步骤1）所述）和寡核苷酸链（表2所述）进行交联；复合物的特征为：1）核酸的3’端与抗体上赖氨酸的自由氨基端相连；2）平均每个抗体上连有2-4条寡核苷酸；3）抗体具有良好的活性。

例如可采用具体如下的步骤：

SoluLink^TM交联试剂盒提供了反应所需的所有试剂盒缓冲液，但抗体脱盐（即脱去多余的S-HyNiC修饰剂）、寡核苷酸脱盐（即脱去多余的S-4FB修饰剂）和纯化（即最后脱去多余的寡核苷酸）需另外用到Millipore公司生产的超滤膜（分子截留量为10000,3000,100000 kDa）和冷冻离心机。具体步骤如下：

①、抗体（步骤1）所述）按照试剂盒说明书的要求用S-HyNiC进行修饰；得修改后抗体；

②、抗体脱盐：

将修饰后抗体转移到分子截留量10,000离心超滤膜上，在过滤膜上加入300μL交联缓冲液（试剂盒中），4℃，5000×g离心20分钟，至膜上液体少于100μL；再次加入300μL交联缓冲液进行离心。重复上述操作多次，对滤出液用NanoDrop 1000进行UV/vis监测，直至滤出液中没有任何吸收峰检出。将膜上方的液体（即脱盐后修饰抗体）转移至洁净的离心管中。

③、寡核苷酸链（表2所述）按照试剂盒说明书的要求用S-4FB进行修饰，得修饰后寡核苷酸。

④、寡核苷酸脱盐：将修饰后寡核苷酸转移到分子截留量3,000离心超滤膜上，膜上加入300μL交换缓冲液（试剂盒中），4℃，13000×g离心至膜上液体约为50μL。重复上述操作多次，并收集滤管下方的滤出液，用UV/vis方法监测滤出液中修饰剂的残留情况，直至滤出液中没有任何吸收峰检出。将膜上方的液体（即脱盐后修饰寡核苷酸）收集至干净的离心管中。

⑤、交联：将脱盐后修饰抗体和脱盐后修饰寡核苷酸按照试剂盒说明书的要求进行交联。

⑥、纯化（去寡核苷酸）：将交联后的产物移至分子截留量为100,000的离心超滤膜上，加入300μL PBS缓冲液（PH=7.4），用冷冻离心机4℃，5000×g离心数分钟，至膜上液体不超过50μL。重复上述操作多次，用UV/vis方法监测滤出液中修饰剂的残留情况，直至滤出液中没有任何吸收峰检出。此时在干净的离心管中收集到脱去游离寡核苷酸的交联体。

备注说明1：每个抗体上连接几条寡核苷酸是由抗体与修饰剂S-HyNic反应时添入的摩尔量比例决定的，通过UV/vis吸收峰结果及比尔-朗伯定律计算得到（根据试剂盒的介绍说明）。本发明中n（S-HyNic）/n（抗体）=20。

交联过程均在一致的n（S-HyNic）/n（抗体）条件下进行，不同抗体上连接的寡核苷酸数的波动可能由于抗体个体差异或实验操作引起，但本发明经实验证明只要在2-4这个范围里就不影响后续步骤。

备注说明2：本发明的实验表明按照试剂盒的要求操作就可得到抗体具有良好活性，若希望确定，可用ELISA方法对交联后的抗体进行活性检测（为常规方法）。

生成的6种抗体-寡核苷酸复合物探针分别置于-20℃短期保存（1年）或-80℃长期保存（保存期一般可长达2-3年），为下述试剂盒中的②号材料。

第三步：即时生成微流体蛋白质芯片，“即时性”指在检测进行前再合成蛋白质芯片，目的是为了保证探针活性的最佳性。具体步骤如下（使用试剂盒的第一步“生成蛋白芯片”与此相同）：

1）芯片循环系统的清洗

在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗。在微流体杂交室中装入一张旧芯片（非第一步中生成的芯片），用1mL 预热到95℃的洗涤液（1%SDS（即，1%质量比的十二烷基硫酸钠），以蒸馏水作为溶剂）装入样品管并接入循环系统， 40℃下高转速循环清洗30分钟；再用3mL去离子水常温冲洗。接着换用1mL 预热到95℃的去离子水，40℃下高转速循环清洗系统10分钟；然后用3mL常温去离子水冲洗。

备注说明：将旧芯片装入微流体杂交室的目的是接通整个微流体系，这样才能使洗涤液在系统内流动对其进行洗涤。在清洗结束后，将旧芯片取出，将试剂盒中有相应探针合成的芯片置于杂交室内，而后进行下面的步骤2）。

2）芯片表面的封闭

将第一步中生成的（即试剂盒中的成分①---①号材料）芯片置入微流体杂交室中，取100μL 6×SSPE缓冲液接入循环体系，循环润洗芯片表面，赶尽芯片中气泡。取100μL封闭缓冲液（6×SSPE，25%甲酰胺，1%BSA，pH 6.8）移入样品管，流速100μL/分钟，30℃循环流经芯片30分钟。

封闭缓冲液的制备方法：

④准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8。

⑤取75mL上述①所得的调节pH后的6×SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合。

⑥准备 BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中。

④ 制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合。

⑤常规灭菌。

3）探针在芯片表面的固定

将第二步制备的6种抗体-寡核苷酸复合物探针（即试剂盒中的成分②---②号材料）以各50nM的浓度混合稀释在100μL的封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30℃下以流速20μL/分钟循环孵育2h。反应初始时交替改变几次液体流向，确保将芯片表面的气泡赶除，以免在芯片中造成盲点。将控制液体流向的开关打至“AUTO”档，循环系统中的液体每隔2分钟自动转变流向，使样品能够充盈整个芯片表面并流经每个反应室。在此过程中，交联抗体探针通过DNA互补链配对与DNA芯片上的探针结合，分别固定到芯片的相应位置。探针固定反应完成后，将1mL洗涤缓冲液（1：1的体积比混合封闭缓冲液和水，0.2%SDS）移入样品管中，30℃下20μL/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去。

上述洗涤缓冲液的制备方法为：将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入1mg的SDS均匀混合；常规灭菌。

4）完成以上步骤后，合成的蛋白质芯片的表面探针分布为：

A1-A6：检Cry1Ac蛋白

B1-B6: 检Cry1c蛋白

C1-C6: 检Cry1Ab蛋白

D1-D6: 检Cry1F蛋白

E1-E6: 检SBTI蛋白

F1-F6: 检NPTⅡ蛋白。

实施例2、一种转基因微流体蛋白质芯片检测试剂盒，其用来合成转基因微流体蛋白质芯片和进行转基因检测；该检测试剂盒包括以下成分：

①、含6种探针的微流体DNA芯片；按照实施例1的第一步制备而得。

②、6种抗体-核酸复合物探针；按照实施例1的第二步制备而得。

③、6种检测抗体：

包括：生物素标记抗Cry1Ac兔多抗；生物素标记抗Cry1c兔单抗；抗Cry1Ab鼠抗；抗Cry1F鼠抗；抗SBTI鼠抗；抗NPTⅡ鼠抗。

其中兔抗例如可购自宜康（杭州）生物技术有限公司；鼠抗例如可购自华安（杭州）生物技术有限公司。

⑦、封闭缓冲液（同实施例1）；

⑧、洗涤缓冲液（同实施例1）；

⑨、反应缓冲液：

反应缓冲液为：每475μL的PBS缓冲液（PH=7.4）中加入25μL的20%（质量浓度）BSA溶液；常规灭菌。

实施例3、如实施例2所述的转基因微流体蛋白质芯片检测试剂盒使用方法，依次进行如下步骤：

1）、即时生成微流体蛋白质芯片（同实施例1的第三步）；

2）、在生成的蛋白质芯片上进行样品检测，具体步骤如下：

将转基因检测样品经蛋白提取和纯化后得到样品检测液。将50μL样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μL/min，在4℃条件下过夜（16小时）孵育。反应结束后，用PBST缓冲液在30℃下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品。

PBST缓冲液的制备方法为：称取8g NaCl，0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g KHPO₄，用800mL蒸馏水溶解，加入2mL Tween-20,调节pH至7.2，加入蒸馏水定容至1L，常规灭菌。

备注说明：蛋白提取和纯化为公知技术，例如可按照已经公开发表于《浙江大学学报（农业与生命科学版）》2001年02期的《从转基因水稻中提取Bt毒蛋白的方法与效率》。

3）、检测固定抗原：

涉及6种检测抗体（试剂盒中成分③）

涉及2种显色物质的混合物包括：①Cy3标记链霉亲和素（KPL公司）；②Cy3标记的羊抗鼠抗体（Proteintech Group公司）。

准备检测溶液：取500 μL反应缓冲液，将6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质均以1000倍稀释至反应缓冲液中。

即，检测溶液的制备方法为：

在500 μL的反应缓冲液中加入生物素标记抗Cry1Ac兔多抗、生物素标记抗Cry1c兔单抗、抗Cry1Ab鼠抗、抗Cry1F鼠抗、抗SBTI鼠抗和抗NPTⅡ鼠抗；再加入Cy3标记链霉亲和素和Cy3标记的羊抗鼠抗体。

备注说明：检测溶液中各抗体的加入体积量是由抗体效价决定的，具体如下：

Cry1Ac、Cry1c：0.1μL （稀释5000倍）

Cry1F、Cry1Ab、SBTI、NPTⅡ：将原液稀释10倍后取0.1μL （稀释50000倍）；

注：不同批次生成的抗体效价可能有些不同，应测量效价后适当调整。

Cy3标记链霉亲和素（总100μL）：取0.1μL

Cy3标记羊抗鼠抗体（总100μL）：取0.1μL。

4）、将上述检测溶液接入循环系统，室温（25℃）下反应2小时，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，从而洗去多余的检测抗体和显色物质。

5）扫描：取出芯片，用芯片扫描仪Genepix^TM4000B对芯片结果进行提取，扫描参数选择PMT500，焦距190。观察芯片A、B、C、D、E、F各位点上的信号。

当在某个位点上出现信号时，说明样品检测液中含有该位点所对应的转基因蛋白成分；

反之，说明样品检测液中不含有该位点所对应的的转基因蛋白成分。

实验1、按照实施例3的方法利用蛋白芯片检测Cry1Ac水稻叶片中的转基因物质，依次进行以下步骤：

1.取5g转基因水稻叶片（事先确定含有Cry1Ac基因）和非转基因水稻叶片分别置于不同离心管中，进行蛋白提取和纯化的处理，例如主要为：加入1mL PBS缓冲液（PH=7.4），用枪头轻压叶片约2min，至浸出液呈绿色；离心5min后分离澄清液，置于4℃30min；得样品检测液；

备注说明：2种样品检测液是分别进行以下步骤2~7的操作。

2.使用试剂盒生成高通量转基因微流体蛋白质芯片；

3.将50μL样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μL/min，在4℃条件下过夜孵育。反应结束后用PBST缓冲液在30℃下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品。

4.准备检测溶液：取500 μL反应缓冲液，将试剂盒中6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质：Cy3标记链霉亲和素（KPL公司）、 Cy3标记的羊抗鼠抗体（ProteintechGroup公司）均以1000倍稀释至反应缓冲液中。

Cry1Ac、Cry1c：0.1μL （稀释5000倍）

Cry1F、Cry1Ab、SBTI、NPTⅡ: 将原液稀释10倍后取0.1μL （稀释50000倍）

Cy3标记链霉亲和素（总100μL）：取0.1μL

Cy3标记的羊抗鼠抗体（总100μL）：取0.1μL

5.将检测溶液接入循环系统，室温（25℃）下反应2小时，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，洗去多余的检测抗体和显色物质。

6.扫描：取出芯片，用芯片扫描仪Genepix^TM4000B对芯片结果进行阅读。选择PMT500，焦距190。

7.检测结果：图1显示Cry1Ac转基因叶片和非转基因叶片的检测结果，结果表明，转基因样品在A号位点上获得明显信号（A1:5587，A2:5153，A3:4508，A4:5186，A5:6558 ，A6:6098；平均值：5515；标准偏差：733），即检出Cry1Ac蛋白成分；芯片上的6组重复一致性良好。非转基因检测结果上无信号。

实验2、按照实施例3的方法利用蛋白芯片检测模拟样品中的多种转基因物质：

1.用PBS缓冲液配制含Cry1Ac、Cry1c、Cry1F、Cry1Ab、NPTⅡ、SBTI6种转基因蛋白的混合溶液，每种蛋白的浓度为1ng/mL，模拟含多种转基因物质的样品；作为样品检测液；

2.使用试剂盒生成高通量转基因微流体蛋白质芯片；

4.准备检测溶液：取500 μL反应缓冲液，将试剂盒中6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质Cy3标记链霉亲和素（KPL公司）、Cy3标记的羊抗鼠抗体（Proteintech Group公司）均以1000倍稀释至反应缓冲液中。

Cry1Ac、Cry1c：0.1μL （稀释5000倍）

Cy3标记链霉亲和素（总100μL）：取0.1μL

Cy3标记羊抗鼠抗体（总100μL）：取0.1μL

5.将检测溶液接入循环系统，室温（25℃）下反应2小时，室温下用PBST对芯片洗涤20min，洗去多余的检测抗体和显色物质。

7．检测结果：图2为模拟样品的检测结果。结果显示芯片的A-F位点均出现信号（如表3所示），证明各种转基因物质均被检出；芯片上的重复信号一致性良好。不同种转基因蛋白获得的检测信号的强度差别与抗体的效价有关。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是：包括基于μParaflo^TM微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1Ac)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1c)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1F)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1Ab)、大豆胰蛋白酶(SBTI)和新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因(NPTⅡ)这6种转基因蛋白的同时检测；

所述六种核酸序列为：

A：3′CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T5′

B：3′CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA5′

C：3′TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A5′

D：3′TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG5′

E：3′AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C5′

F：3′TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T5′；

所述6种抗体-寡核苷酸复合物探针中的核酸序列和相应的检测抗体为：

a：5′GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A3′，抗Cry1Ac兔单抗；

b：5′GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT3′，抗Cry1c兔多抗；

c：5′ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T3′，抗Cry1Ab兔单抗；

d：5′ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC3′，抗Cry1F兔多抗；

e：5′TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G3′，抗SBTI兔多抗；

f：5′AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A3′，抗NPTⅡ兔单抗。

2.根据权利要求1所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是：

所述抗体-寡核苷酸复合物探针，其合成方法是按照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联。

3.根据权利要求2所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是：所述按照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联所得的复合物具备以下特征：1)核酸的3’端与抗体上赖氨酸的自由氨基端相连；2)平均每个抗体上连有2-4条寡核苷酸；3)抗体具有良好的活性。

4.一种转基因检测试剂盒，其特征是包括以下成分：

①、含6种探针的μParaflo^TM微流体DNA芯片；

②、6种抗体-寡核苷酸复合物探针；

③、6种检测抗体；

④、封闭缓冲液；

⑤、洗涤缓冲液；

⑥、反应缓冲液；

所述成分①②④⑤用来即时生成如权利要求1、2或3所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片；

所述成分③的6种检测抗体为：生物素标记抗Cry1Ac兔多抗、生物素标记抗Cry1c兔单抗、抗Cry1Ab鼠抗、抗Cry1F鼠抗、抗SBTI鼠抗和抗NPTⅡ鼠抗；

封闭缓冲液的制备方法为：

①准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8；

③准备BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中；

④制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合；

⑤常规灭菌；

反应缓冲液的制备方法为：每475μL的PH＝7.4的PBS缓冲液中加入25μL的质量浓度为20％的BSA溶液；常规灭菌。

5.如权利要求4所述转基因检测试剂盒的使用方法，其特征是包括如下步骤：

1)、即时生成微流体蛋白质芯片；

包括以下步骤：

Ⅰ、芯片循环系统的清洗；

Ⅱ、芯片表面的封闭：

Ⅲ、探针在芯片表面的固定：

将作为成分②的6种抗体- 寡核苷酸复合物探针以各50nM浓度混合稀释在封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30℃下以流速20μL/分钟循环孵育2h；探针固定反应完成后，将洗涤缓冲液移入样品管中，30℃下以20μL/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去；

2)、在生成的蛋白质芯片上进行样品检测，具体步骤如下：

将转基因检测样品经蛋白提取和纯化后得到样品检测液；将50μL样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μL/min，在4℃条件下过夜孵育；反应结束后，用PBST缓冲液在30℃下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品；

3)、检测固定抗原：

涉及6种检测抗体；

准备检测溶液：取500μL反应缓冲液，将6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质均以1000倍稀释至反应缓冲液中；

4)、将上述检测溶液接入循环系统，室温下反应2小时，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，从而洗去多余的检测抗体和显色物质；

5)扫描：取出芯片，用芯片扫描仪Genepix^TM4000B对芯片结果进行提取，扫描参数选择PMT500，焦距190；观察芯片各位点上的信号。