CN102753579A

CN102753579A - 抗钙粘着蛋白抗体

Info

Publication number: CN102753579A
Application number: CN2010800281876A
Authority: CN
Inventors: 油谷浩幸; 张黎临; 石井敬介; 甲田克志; 阪本爱弥; 胜见惠子; 大西浩史; 粥川容子
Original assignee: Perseus Proteomics Inc; University of Tokyo NUC
Current assignee: Perseus Proteomics Inc; University of Tokyo NUC
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-10-24
Also published as: CA2760642A1; US8455249B2; US9017683B2; AU2010242338B2; JP5723270B2; AU2010242338A1; US20130243771A1; US20130245232A1; EP2426149A4; KR20120051603A; JPWO2010126137A1; US20120136140A1; WO2010126137A1; EP2426149A1

Abstract

本发明的目的是提供具有高抗体依赖性细胞毒性的抗钙粘着蛋白抗体。根据本发明，提供识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上的抗钙粘着蛋白抗体。

Description

抗钙粘着蛋白抗体

技术领域

本发明涉及识别钙粘着蛋白的特定结构域，且具有高抗体依赖性细胞毒性的抗钙粘着蛋白抗体。

背景技术

癌症是占据死亡原因的前位的重要疾病，但其治疗需求尚未得到满足。近年来，为了解决现有的化学疗法对正常细胞也造成损害的问题，积极研究利用分子靶标药的癌症治疗，该分子靶标药是将癌细胞中特异性表达的特定分子作为靶标来设计药物而进行治疗。

能成为对于癌症的分子治疗药的靶标的分子可以列举钙粘着蛋白。钙粘着蛋白是作为钙依赖性地参与同种亲和性的细胞粘着的分子而发现的膜蛋白质(Yoshida and Takeichi, Cell 28：217-224, 1982)。具有由相互同源性高的约110个氨基酸残基组成的钙粘着蛋白重复序列(ECs)的蛋白质被称为钙粘着蛋白超家族，其中存在120种以上的蛋白质，它们对多细胞结构的维持发挥了重要的作用。

报告了钙粘着蛋白在癌细胞中表达升高的例子，研究了对于与正常组织相比癌组织中的钙粘着蛋白的表达高的癌细胞，将使抗癌剂与识别钙粘着蛋白的抗体结合的药物、或具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC：Antibody-dependent cellular cytotoxicity)的抗体用于癌症的治疗(WO2002/097395号公报、WO2007/102525号公报)。

属于钙粘着蛋白超家族的蛋白质根据其结构特征可以大体分类为：1)经典钙粘着蛋白、2)桥粒钙粘着蛋白、3)原钙粘着蛋白、4)其他。作为钙粘着蛋白超家族的主要成员的经典钙粘着蛋白的相互同源性高(图1)。即，是形成二聚体的单次跨膜蛋白质，具有在细胞外区域中的EC1-EC5的5个钙粘着蛋白结构域及细胞内结构域。经由经典钙粘着蛋白的细胞粘着具有在同种细胞间粘着的特征，其通过细胞相互识别根据细胞种类而特异性地表达状态不同的同种钙粘着蛋白分子来进行。通过E-钙粘着蛋白识别E-钙粘着蛋白并与其结合，P-钙粘着蛋白识别P-钙粘着蛋白并与其结合的机制，同种细胞相互粘着(图2)。

钙粘着蛋白相互的同种/异种的识别取决于位于细胞外结构域的N端的钙粘着蛋白结构域1(EC1)(Nose A.等人, Cell 61：147-155, 1990)。Klingel等人揭示，当人P-钙粘着蛋白的氨基酸序列的第1位～第213位(序列编号2)替换人E-钙粘着蛋白的对应的区域时，其不与E-钙粘着蛋白结合，而与P-钙粘着蛋白结合(Klingel H.等人, J of Cell Science 113：2829-36, 2000)。这样可以认为，以E-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白为代表的经典钙粘着蛋白通过相同的机制相互结合。

近年来，作为分子靶标药的许多癌症治疗用抗体药物实际已上市并且正在提高治疗效果。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是作为已上市的抗癌剂的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)等的主要抗肿瘤机制，ADCC活性的增强关系到治疗效果的提高、副作用的降低等。因此，正在进行探索ADCC活性更高的抗体的研究、及增强ADCC活性的技术的开发。例如正在开发：去除与抗体的Fc部分结合的糖链的末端的岩藻糖的技术(WO00/61739号公报)、通过置换Fc部分的氨基酸来提高与效应细胞的亲和性并增强ADCC活性的技术(WO2008/121160号公报)。

如上所述，使用具有ADCC活性的抗体作为癌症的治疗药的概念是公知的。但是，虽然存在关于结构域结构和包含P-钙粘着蛋白的经典钙粘着蛋白的功能的关联的报告，但并未暗示ADCC活性的强度与经典钙粘着蛋白的结构的关联。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2002/097395号公报

专利文献2：WO2007/102525号公报

专利文献3：WO00/61739号公报

专利文献4：WO2008/121160号公报

非专利文献

非专利文献1：Yoshida and Takeichi, Cell 28：217-224, 1982

非专利文献2：Nose A.等人, Cell 61：147-155, 1990

非专利文献3：Klingel H.等人, J of Cell Science 113：2829-36, 2000。

发明内容

本发明将提供具有高抗体依赖性细胞毒性的抗钙粘着蛋白抗体作为应解决的课题。

本发明者为了解决上述课题而进行深入研究，对P-钙粘着蛋白抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性进行测定后发现，其具有根据ADCC活性的强弱而分为2群的倾向。因此，根据各抗体识别的区域而进行分类后，判明ADCC活性强的抗体以高概率识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一种。

规定抗体的ADCC活性的要素可以列举：抗体的Fc部分对效应细胞的Fc受体的亲和性、抗体对抗原的亲和性、抗体识别的表位。为了发挥ADCC活性，必须使抗体与抗原结合，并使效应细胞的Fc受体与抗体的Fc部位结合，但是推定，由于抗体结合的CDH3的区域的差异，效应细胞与抗体的Fc部位的结合存在空间限制，并产生ADCC活性的差异。本发明是根据这些发现而完成的。

即，根据本发明，提供了以下发明。

(1) 抗钙粘着蛋白抗体，其识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上。

(2) 根据(1)所述的抗体，其中钙粘着蛋白为P-钙粘着蛋白。

(3) 根据(1)或(2)所述的抗体，其是从将可溶型P-钙粘着蛋白作为免疫原而给予的免疫动物取得的抗体产生细胞所产生的抗体。

(4) 根据(1)至(3)中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。

(5) 杂交瘤，其产生根据(4)所述的抗体。

(6) 细胞毒剂，其包含根据(1)至(4)中任一项所述的抗体。

(7) 根据(6)所述的细胞毒剂，其给予癌细胞。

另外，本说明书中的EC1的上游区域表示E-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白的EC1的上游侧24个氨基酸残基的区域、以及其他的钙粘着蛋白的对应区域。

本发明的抗钙粘着蛋白抗体的特征是：识别钙粘着蛋白的EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且具有高抗体依赖性细胞毒性。能够发挥高细胞毒性的抗体用作用于制备修饰抗体、变异抗体的材料。另外，通过将本发明的抗钙粘着蛋白抗体给予表达钙粘着蛋白的癌症，可以发挥以抗体依赖性细胞毒性为机制的抗癌作用。即，本发明的抗钙粘着蛋白抗体用作抗癌剂。

附图说明

图1示出除了E-钙粘着蛋白(CDH1)、N-钙粘着蛋白(CDH2)、P-钙粘着蛋白(CDH3)的信号及前肽序列的成熟蛋白质的序列。

图2示出属于经典钙粘着蛋白家族的分子的粘着机制。

图3示出使人CDH3强制表达细胞系和市售抗人CDH3抗体反应的流式细胞术的结果。A：CDH3强制表达CHO细胞、B：CHO细胞。a：抗CDH3抗体0.01μg/ml、b：抗CDH3抗体0.1μg/ml、c：抗CDH3抗体1μg/ml。

图4示出3例取得抗体和各细胞系的典型的流式细胞术结果。A：CDH3强制表达CHO细胞、B：CHO细胞、C：源自肺癌的细胞系NCI-H358。a：抗CDH3抗体0.01μg/ml、b：抗CDH3抗体0.1μg/ml、c：抗CDH3抗体1μg/ml。

图5示出各抗体的ADCC活性。

图6示出CDH3部分长度蛋白质片段1～5与CDH3细胞外区域的对应。

图7示出CDH3部分长度蛋白质的表达结果。A：片段1、B：片段2、C：片段3、D：片段4、E：片段5。

图8示出CDH3部分长度蛋白质与各抗体通过蛋白质印迹法的反应。A：片段1、B：片段2、C：片段3、D：片段4、E：片段5。

图9示出使用肽阵列的PPMX13的表位解析的结果。X轴的数值表示肽阵列的编号。A：PPMX13、B：无初次抗体。

图10示出各种肿瘤组织的CDH3的mRNA的表达结果。A：正常组织、B：各种癌组织、C：胰腺癌分化度。

图11示出各种肿瘤组织中的CDH3的表达结果。

图12示出在移植源自人肺癌的细胞系NCI-H351得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。

图13示出在移植源自人胰腺癌的细胞系PK-45P得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。

图14示出在移植源自人皮肤癌的细胞系A431得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。

具体实施方式

以下，更详细地对本发明进行说明。

本发明的抗体是特征为识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上的抗钙粘着蛋白抗体；是特征为识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为0.1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为25%以上(例如强于PPMX5的活性)的抗钙粘着蛋白抗体；或者是识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且ADCC的最大活性为35%以上(例如强于PPMX6的活性)的抗钙粘着蛋白抗体。此处，ADCC的最大活性是指提高抗体浓度而ADCC活性的上升达到稳定时的ADCC活性。

本说明书中，P-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白及N-钙粘着蛋白的EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域1(EC1)、钙粘着蛋白结构域2(EC2)、钙粘着蛋白结构域3(EC3)、钙粘着蛋白结构域4(EC4)、钙粘着蛋白结构域5(EC5)分别表示以下区域。另外，其他钙粘着蛋白的对应的区域可以通过对由Genbank等得到的公知的钙粘着蛋白蛋白质的序列进行比较而确定。序列的比较可以使用公知的程序例如ClustalW2(Thompson JD等人, Nucleic Acids Research 22 (22)： 3673-3680、1994)或者ClustalX2(Thompson JD等人, Nucleic Acids Research 25 (24)： 4876-4882, 1997)等来进行。

?P-钙粘着蛋白(CDH3)

EC1的上游区域：序列编号2的氨基酸序列的第108位～第131位

钙粘着蛋白结构域1(EC1)：序列编号2的氨基酸序列的第132位～第236位

钙粘着蛋白结构域2(EC2)：序列编号2的氨基酸序列的第237位～第348位

钙粘着蛋白结构域3(EC3)：序列编号2的氨基酸序列的第349位～第461位

钙粘着蛋白结构域4(EC4)：序列编号2的氨基酸序列的第462位～第550位

钙粘着蛋白结构域5(EC5)：序列编号2的氨基酸序列的第551位～第654位。

?E-钙粘着蛋白(CDH1)

EC1的上游区域：序列编号4的氨基酸序列的第155位～第178位

钙粘着蛋白结构域1(EC1)：序列编号4的氨基酸序列的第179位～第283位

钙粘着蛋白结构域2(EC2)：序列编号4的氨基酸序列的第284位～第395位

钙粘着蛋白结构域3(EC3)：序列编号4的氨基酸序列的第396位～第507位

钙粘着蛋白结构域4(EC4)：序列编号4的氨基酸序列的第508位～第597位

钙粘着蛋白结构域5(EC5)：序列编号4的氨基酸序列的第598位～第704位。

?N-钙粘着蛋白(CDH2)

EC1的上游区域：序列编号6的氨基酸序列的第160位～第183位

钙粘着蛋白结构域1(EC1)：序列编号6的氨基酸序列的第184位～第288位

钙粘着蛋白结构域2(EC2)：序列编号6的氨基酸序列的第289位～第402位

钙粘着蛋白结构域3(EC3)：序列编号6的氨基酸序列的第403位～第518位

钙粘着蛋白结构域4(EC4)：序列编号6的氨基酸序列的第519位～第607位

钙粘着蛋白结构域5(EC5)：序列编号6的氨基酸序列的第608位～第719位。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)可以使用公知的方法测定。本说明书的ADCC活性的数值是指在与实施例4中的测定相同的条件下测定时的抗体依赖性细胞毒性。具体地，如下所述。

(1) 效应细胞的制备

从C3H/HeJ Jcl小鼠(8周龄、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄细胞，将该细胞在含有10%FBS的RPMI1640培养基中制备成2×10⁶个/mL，在50ng/mL人IL-2(PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF(PEPROTECH公司)存在下培养6天。在测定当天回收细胞，使用含有10%FBS的HAM培养基清洗后，制成效应细胞溶液。

(2) 靶标细胞的制备

使用全长CDH3表达CHO细胞(EXZ1501)作为靶标细胞。将细胞从板上剥离后，将其悬浮于含有10%FBS的HAM培养基中使其达到1×10⁷个/mL，添加⁵¹Cr以达到终浓度150uCi，在5%二氧化碳培养箱中在37℃培养1.5小时。将该细胞用培养基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培养基，种植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其达到1×10⁴个/孔，制成靶标细胞。

(3) ADCC活性的测定

在靶标细胞中以50μL/孔分开注入分别制备成0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL浓度的抗体溶液后，在室温下温育15分钟，接着，分开注入100μL效应细胞(1×10⁵细胞/孔)，在二氧化碳培养箱中培养4小时。回收培养上清液，利用闪烁计数器测定100μL培养上清液中的放射活性。细胞毒性可以根据下式求出。

细胞毒性(%)＝(A－C)/(B－C)×100

A：各抗体添加孔的放射活性值(cpm)

B：在靶标细胞中添加100μL的2%NP40溶液、50μL含有10%FBS的RPMI培养基的孔的放射活性值(cpm)

C：在靶标细胞中添加包含效应细胞的150μL含有10%FBS的培养基的孔的放射活性值(cpm)。

本发明的抗体识别的钙粘着蛋白的种类期望的是经典钙粘着蛋白。其例子可以列举E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白，但并不限定于这些。

用以制备本发明的抗体的抗原可以使用钙粘着蛋白或其部分肽。一个例子是可以使用可溶型CDH3蛋白质等，但并不限定于此。

本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。本发明的抗体(多克隆抗体及单克隆抗体)可以通过各种方法中的任意一种来制造。这样的抗体的制造法在本领域中为众所周知[例如参照Sambrook, J等人, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。

(a) 多克隆抗体的制备

为了制备多克隆抗体，将钙粘着蛋白或作为其部分肽的EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域优选地作为抗原，并将该抗原给予哺乳动物例如大鼠、小鼠、兔等。每只动物的抗原给予量在不使用佐剂时为0.1mg～100mg，在使用佐剂时为1μg～100μg。佐剂可以列举：弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内等来进行。另外，免疫的间隔并无特别限定，以数天至数周间隔、优选2周～5周间隔，进行1次～10次、优选2次～5次免疫。然后，从最后的免疫日起6天～60天后，利用酶免疫测定法(ELISA(酶联免疫吸附测定)或EIA(酶免疫测定))、放射性免疫测定法(RIA；放射免疫测定)等测定抗体效价，在显示最大的抗体效价的当天采血，获得抗血清。在需要从抗血清纯化抗体时，可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法或将这些方法加以组合而纯化。

(b) 单克隆抗体的制备

为了制备单克隆抗体，首先，将钙粘着蛋白或作为其部分肽的EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域优选地作为抗原，并给予哺乳动物例如大鼠、小鼠、兔等。每只动物的抗原的给予量在不使用佐剂时为0.1mg～100mg，在使用佐剂时为1μg～100μg。佐剂可列举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内来进行。另外，免疫的间隔并无特别限定，以数天至数周间隔、优选2周～5周间隔，进行1次～10次、优选2次～5次免疫。然后，从最后的免疫日起1天～60天后、优选1天～14天后采集抗体产生细胞。抗体产生细胞可列举：脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选脾脏细胞或局部淋巴结细胞。

为了获得细胞融合杂交瘤，进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞可以使用小鼠等动物的一般可得的确立细胞株。所使用的细胞系优选具有药物选择性，并且具有在未融合的状态下无法在HAT选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中生存、而仅可在与抗体产生细胞融合的状态下生存的性质的细胞系。骨髓瘤细胞例如可以列举P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-1等小鼠骨髓瘤细胞系。

接着，使上述骨髓瘤细胞和抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合是在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用培养基中，将1×10⁶个/ml～1×10⁷个/ml的抗体产生细胞和2×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml的骨髓瘤细胞混合(抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞比优选为5：1)，在细胞融合促进剂存在下进行融合反应。细胞融合促进剂可以使用平均分子量为1000道尔顿～6000道尔顿的聚乙二醇等。另外，也可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合。

从细胞融合处理后的细胞挑选目标杂交瘤。挑选的方法是：使用例如含有胎牛血清的RPMI-1640培养基等将细胞悬浮液适当稀释后，在微量滴定板上以3×10⁵个/孔左右在各孔中添加选择培养基，以后适当地更换选择培养基进行培养。其结果是在使用选择培养基培养开始后，可以获得从14天前后繁殖的细胞作为杂交瘤。

接着，在增殖的杂交瘤的培养上清液中，筛选是否存在目标抗体。杂交瘤的筛选根据通常的方法进行即可，并无特别限定。例如，可以采集繁殖为杂交瘤的孔中所含的培养上清液的一部分，利用酶免疫测定法、放射性免疫测定法等，筛选产生与钙粘着蛋白的EC1的上游区域、EC4或者EC5结构域结合的抗体的杂交瘤。融合细胞的克隆可以利用限度稀释法等来进行，最后确立作为单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。

从所确立的杂交瘤采集单克隆抗体的方法可以采用通常的细胞培养法或腹水采集法等。在细胞培养法中，将杂交瘤在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中，在通常的培养条件(例如37℃、5%的CO₂浓度)下培养7天～14天，并从其培养上清液取得抗体。

在使用腹水采集法的情况下，在提供骨髓瘤细胞的哺乳动物和同种系动物的腹腔内给予约1×10⁷个杂交瘤，并使杂交瘤大量地增殖。接着，在1周～2周后采集腹水。在上述抗体的采集方法中需要抗体纯化时，可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法，或将这些方法加以组合来纯化。

本发明的抗体的种类并无特别限制，可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊抗体、骆驼抗体、鸡抗体等，或为了降低针对人的异种抗原性等而人为改变的基因重组型抗体例如嵌合抗体、人化抗体等的任意一种。基因重组型抗体可以使用已知的方法来制造。嵌合抗体是包含人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体，该抗体可以通过将编码小鼠抗体的可变区的DNA和编码人抗体的恒定区的DNA连接，并将该DNA整合入表达载体并导入宿主中而产生抗体来获得。人化抗体是将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植至人抗体的互补性决定区所得的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，利用PCR法，由制备成末端部具有重叠的部分的多个寡核苷酸，合成设计为连接小鼠抗体的CDR和人抗体的骨架区(framework region；FR)的DNA序列。将所得的DNA和编码人抗体的恒定区的DNA连接，接着整合入表达载体，将表达载体导入宿主而产生抗体(EP239400号公报、国际公开WO96/02576号公报等)。

另外，人抗体的取得方法也为已知。例如也可以使人淋巴细胞在体外通过所期望的抗原或者表达所期望的抗原的细胞致敏，使致敏淋巴细胞和人骨髓瘤细胞例如U266融合，获得对抗原具有结合活性的所期望的人抗体(参照日本特公平1-59878)。另外，可以通过利用所期望的抗原对具有人抗体基因的全部组分的转基因动物进行免疫，取得所期望的人抗体(参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。而且，使用人抗体文库，通过淘选而取得人抗体的技术也为已知。例如，可以将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。如果解析所选择的噬菌体的基因，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以由该序列制备适当的表达载体而取得人抗体。这些方法已经为众所周知，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。

另外，这些抗体只要不丧失作为识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上，识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为0.1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为25%以上(例如强于PPMX5的活性)的抗体，或者识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且ADCC的最大活性为35%以上(例如强于PPMX6的活性)的抗体的特性，则可以为一价抗体、二价抗体、多价抗体中的任一种抗体，也可以为抗体片段(fragment)等低分子化抗体或抗体的修饰物等。另外还可以为在抗体片段或低分子化抗体例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、ScFv(单链Fv)、双抗体等中融合Fc部分而赋予ADCC活性的抗体。为了获得这样的抗体，构建编码这些抗体的基因、将所构建的基因导入表达载体后在适当的宿主细胞中表达即可。

抗体的修饰物也可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。另外，也可以在抗体中结合放射性同位素、化学治疗剂等，特别地，放射性标记抗体是有用的。这样的抗体修饰物可以通过对所得的抗体实施化学修饰而获得。另外，抗体的修饰方法也为本领域技术人员所公知。

本发明的抗体由于表现出高抗体依赖性细胞毒性，所以可以作为细胞毒剂使用。本发明的细胞毒剂可以通过与例如表达钙粘着蛋白的癌细胞接触而伤害癌细胞。

本发明的细胞毒剂中，除了本发明的抗体外，还可以根据需要适当含有药学上所容许的载体、赋形剂、稀释剂等。本发明的细胞毒剂例如可以制成注射剂。对于本发明的细胞毒剂的给予量，依赖于患者的症状的程度、年龄及体重、给予方法等，作为有效成分的抗体的重量通常在约10ng～约100mg/kg体重的范围。

通过以下的实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明并不受实施例限定。

实施例

实施例1： CDH3表达CHO细胞系的确立

为了获得抗CDH3抗体筛选用细胞系，进行表达全长CDH3的CHO细胞的确立。

(1) CDH3基因表达载体的制备

为了将序列编号1所示的全长人CDH3DNA插入哺乳类表达载体pEF4/myc-HisB(Invitrogen公司)，利用2种限制酶KpnⅠ(Takara Bio公司)及XbaⅠ(Takara Bio公司)将该DNA在37℃处理1小时后，利用T4 DNA连接酶(Promega公司)根据常用方法将该DNA插入利用相同的KpnⅠ及XbaⅠ处理的pEF4/myc-HisB中，获得表达载体pEF4-CDH3-myc-His。

(2) CDH3稳定表达系的取得

根据FuGENE(注册商标)6转染试剂(Roche Diagnostics公司)的方案，在转染前一天在尺寸10cm皿中种植8×10⁵个细胞的CHO细胞并培养一晩后，将8μg的表达载体pEF4-CDH3-myc-His和16μL的FuGENE6试剂在400μL的无血清RPMI1640培养基(SIGMA-ALDRICH公司)中混合并室温放置15分钟后，将其添加至细胞培养液中进行转染。在转染第三天使用选择试剂(Zeocin(注册商标))通过限度稀释法进行克隆。

CDH3全长表达CHO的克隆分选通过使用抗c-Myc单克隆抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)的蛋白质印迹法来进行，其结果是，获得表达量高、且增殖良好的CDH3全长表达CHO细胞系(EXZ1501)。使用市售抗CDH3抗体(R＆D SYSTEMS公司)并利用流式细胞术所测定的该细胞系的结果示于图3中。

实施例2：可溶型CDH3抗原的制备

为了获得制备抗CDH3抗体的免疫原，制备使C末端跨膜区域及其以后区域缺损的可溶型CDH3(sCDH3)蛋白质。

(1) 可溶型CDH3抗原表达载体的制备

将CDH3全长cDNA作为模板，使用设计为使相当于CDH3细胞外区域的部分(相当于序列编号2的1-654、以下为sCDH3cDNA)扩增的正向引物(序列编号7：CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT、(hCDH3FullFW))和反向引物(序列编号8：CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC、(hCDH3SolbRV))进行PCR反应。反应中使用KOD-Plus(东洋纺公司)，在94℃-15秒、55℃-30秒、68℃-90秒、30个循环的反应条件下进行。

然后，通过琼脂糖凝胶电泳切出包含作为目标尺寸的约2.0kbp的条带的凝胶片段，使用QIA(注册商标)快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)，获得目标sCDH3cDNA。

为了将该sCDH3cDNA插入表达用载体pEF4/myc-HisB，使用2种限制酶KpnI及XbaI将该cDNA处理后，使用T4 DNA连接酶根据常用方法将该cDNA插入使用相同的KpnI及XbaI处理的pEF4/myc-HisB中，获得表达载体pEF4-sCDH3-myc-His。

(2) 可溶型CDH3蛋白质的表达

根据FuGENE6转染试剂的方案，在转染前一天在尺寸10cm的皿中种植8×10⁵个CHO细胞并培养一晩后，将8μg的表达载体pEF4-sCDH3-myc-His和16μL的FuGENE6试剂于400μL的无血清RPMI1640培养基中混合，室温放置15分钟后，将其添加于细胞培养液中进行转染。在转染第三天使用选择试剂(Zeocin)通过限度稀释法进行克隆。

可溶型CDH3表达CHO细胞的分选通过使用抗c-Myc单克隆抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)的蛋白质印迹法来进行。选择向培养上清液中的分泌量多且增殖良好的细胞系，结果获得可溶型CDH3表达CHO细胞系(EXZ1702)。对于所选择的可溶型CDH3表达CHO细胞系(EXZ1702)，使用3个培养面积为1,500cm²的滚瓶，在每个滚瓶的333mL无血清培养基CHO-S-SFM-II(Invitrogen公司)中培养72小时，并回收培养上清液。从所得的培养上清液中，通过利用HisTrap(注册商标)HP柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的亲和色谱法和利用Superdex(注册商标)200pg柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的凝胶过滤色谱法，获得可溶型CDH3蛋白质。

实施例3：抗CDH3单克隆抗体的制备

(1) 将可溶型CDH3蛋白质作为免疫原的单克隆抗体的制备

通过将溶解于生理盐水中的50μg的可溶型CDH3蛋白质和Titer-MAX Gold(注册商标)(TiterMax公司)等量混合，并注射至MRL/lpr小鼠(日本SLC株式会社)的腹腔内及皮下而进行初次免疫。第2次及以后的免疫通过将同样制备的相当于25μg蛋白质量的可溶型CDH3蛋白质和Titer-MAX Gold混合并注射至腹腔内及皮下而实施。从最后免疫起3天后从小鼠无菌性地制备脾脏细胞，根据常用方法，通过聚乙二醇法进行与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O-Ag14或P3-X63-Ag8.653的细胞融合。

(2) 抗CDH3抗体产生杂交瘤的分选

抗CDH3抗体的分选利用使用表达全长CDH3的CHO细胞系(EXZ1501)的流式细胞术来进行。

即，通过使用2mM的EDTA-PBS处理表达全长CDH3的CHO细胞系(EXZ1501)而将CHO细胞系从培养板剥离后，将CHO细胞系悬浮于FACS溶液中使其达到1×10⁶个/mL。将该细胞悬浮液种植至96孔板中使其达到50μL/孔，添加杂交瘤培养上清液在4℃下反应60分钟，使用FACS溶液(200μL/孔)清洗2次后，添加AlexaFluor488标记抗小鼠IgG?山羊F(ab')₂(Invitrogen公司)，在4℃下反应30分钟。然后使用FACS溶液清洗2次后，实施流式细胞术，分选对CDH3表达CHO细胞见到强反应的杂交瘤。

将由该杂交瘤获得的抗体与CDH3表达CHO细胞(EXZ1501)、作为亲株的CHO细胞及确认CDH3为高表达的癌细胞NCI-H358的典型的反应结果示于图4中。确认了所分选的所有杂交瘤与CDH3表达CHO细胞(EXZ1501)及NCI-H358反应，而不与CHO细胞反应。

实施例4：抗CDH3抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的测定

ADCC活性的测定是根据使经放射性标记的靶标细胞在效应细胞存在下与抗体作用、测定其游离放射活性的方法。

(1) 效应细胞的制备

从C3H/HeJ Jcl小鼠(8周龄、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄细胞，将该细胞在含有10%FBS的RPMI1640培养基中制备为2×10⁶个/mL，在50ng/mL人IL-2(PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF(PEPROTECH公司)存在下培养6天。在测定当天回收细胞，使用含有10%FBS的HAM培养基清洗后，制成效应细胞溶液。

(2) 靶标细胞的制备

靶标细胞使用全长CDH3表达CHO细胞(EXZ1501)。将细胞从板剥离后，将其悬浮于含有10%FBS的HAM培养基中使其达到1×10⁷个/mL，添加⁵¹Cr以达到终浓度150uCi，在5%二氧化碳培养箱中在37℃培养1.5小时。将该细胞用培养基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培养基，种植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其达到1×10⁴个/孔，制成靶标细胞。

(3) ADCC活性的测定

在靶标细胞中以50μL/孔分开注入分别制备成0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL浓度的抗体溶液后，在室温下温育15分钟，接着，分开注入100μL效应细胞(1×10⁵细胞/孔)，在二氧化碳培养箱中培养4小时。回收培养上清液，利用闪烁计数器测定100μL培养上清液中的放射活性。

此时，根据下式求出细胞毒性。

细胞毒性(%)＝(A－C)/(B－C)×100

A：各抗体添加孔的放射活性值(cpm)

对试验进行3次重复测定，由其平均值算出细胞毒性(%)。

将试验结果示于表1及图5中。在具有ADCC活性的抗体中发现了具有特别强的活性的抗体群。将抗体浓度为1μg/mL时的ADCC活性为30%以上的抗体设为高ADCC活性群，将抗体浓度为1μg/mL时的ADCC活性小于30%的抗体设为低ADCC活性群。

[表1]

R＆D-104805表示市售抗CDH3抗体(R＆D SYSTEMS公司)。

BD-610227表示市售抗CDH3抗体(BD BIOSCIENCE公司)。

阴性Ab1、阴性Ab2表示识别与CDH3无关的抗原的抗体。

＊S：高ADCC活性(抗体浓度为1μg/mL时为30%以上)

W：低ADCC活性(抗体浓度为1μg/mL时小于30%)。

产生抗体PPMX12的杂交瘤PPMX12在2010年1月20日、在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(邮政编码292-0818，日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8)、以保藏编号NITE BP-865在布达佩斯条约下保藏。

实施例5：根据CDH3部分长度表达蛋白质的抗CDH3单克隆抗体的表位分类

所得的抗CDH3抗体的表位分类通过与CDH3部分序列表达物的蛋白质印迹法来进行。对于CDH3部分序列表达物，设计片段1～片段5以使各片段间序列充分重复(图6)。

(1) CDH3部分长度蛋白质的表达载体的制备

将实施例1的全长CDH3cDNA作为模板，使用后述的引物组进行PCR反应。该反应使用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad公司)，在条件为98℃-10秒、60℃-10秒、72℃-30秒、35个循环下进行。利用琼脂糖凝胶电泳切出包含接近目标尺寸的条带的凝胶，使用QIA(注册商标)快速凝胶提取试剂盒，获得目标CDH3cDNA片段。

为了将该CDH3片段插入大肠杆菌表达载体pCold(注册商标)TF(Takara Bio公司)中，将该片段使用2种限制酶KpnI及XbaI处理后，使用T4 DNA连接酶根据常用方法将该片段插入使用相同的KpnI及XbaI处理的pColdTF中，获得用于表达各片段的表达载体。

使用以下引物组进行PCR反应而获得各片段。

片段1(序列编号2的108位-236位)

正向引物：TATGGAGCTCGGTACCGATTGGGTGGTTGCTCCAATATCTG(序列编号：9)

反向引物：AGATTACCTATCTAGACTACTGCATCACAGAAGTACCTGGTAGG(序列编号：10)

片段2(序列编号2的132位-348位)

正向引物：TATGGAGCTCGGTACCAAGTCTAATAAAGATAGAGACACCAAG(序列编号：11)

反向引物：AGATTACCTATCTAGACTACCTCTGCACCTCATGGCCCACTGCATTCTCA(序列编号：12)

片段3(序列编号2的237位-461位)

正向引物：TATGGAGCTCGGTACCGTGACAGCCACGGATGAGGATGATG(序列编号：13)

反向引物：AGATTACCTATCTAGACTAGACACACACAGGCTCCCCAGTG(序列编号：14)

片段4(序列编号2的349位-550位)

正向引物：TATGGAGCTCGGTACCCTGACGGTCACTGATCTGGACG(序列编号：15)

反向引物：AGATTACCTATCTAGACTAGGGCTCAGGGACTGGGCCATGGTCATTG(序列编号：16)

片段5(序列编号2的462位-654位)

正向引物：TATGGAGCTCGGTACCTACACTGCAGAAGACCCTGACAAGG(序列编号：17)

反向引物：AGATTACCTATCTAGACTAACCTCCCTTCCAGGGTCCAGGGCAGGTTTCG(序列编号：18)。

(2) CDH3部分长度蛋白质的表达

使用(1)的CDH3片段的表达载体，根据常用方法转化大肠杆菌Rossetta(注册商标)2(Merck公司)，并在LB培养基中培养。在600nm的吸光值为0.4的阶段冰冷30分钟，将异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)浓度设为0.5mM，在20℃下培养18小时后进行回收。

对于CDH3部分长度蛋白质的表达，在将大肠杆菌培养液电泳后实施使用抗Penta-His抗体(QIAGEN公司)的蛋白质印迹法，通过在预料的位置存在条带而确认。

即，添加相当于上述大肠杆菌培养液量的1/10量的电泳缓冲液，在还原条件下对5%-20%梯度凝胶(Bio-Rad公司)充电而电泳后，将凝胶转印至Immobilon(注册商标)P(Millipore公司)。转印膜在使用TBS-T(0.05%Tween(注册商标)20、TBS)轻柔地洗涤后，在加入了40%BSA的TBS中振荡1小时后，添加在加入了10%Block-Ace(注册商标)(雪印乳业公司)的TBS-T中稀释的各抗CDH3抗体并振荡1小时。将膜使用TBS-T洗涤后，使用在加入了10%Block-Ace的TBS-T中稀释的HRP-抗小鼠IgG抗体(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)振荡1小时后，使用TBS-T进行洗涤。显色是根据厂商的说明书，使用ECL(注册商标)-Plus(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)，利用X线胶片RX-u(富士胶片公司)进行检测。将所得的结果示于图7中。

(3) 使用CDH3部分序列表达物的抗体表位分类

将表达上述各CDH3部分长度蛋白质的大肠杆菌溶解物在还原条件下对5%-20%梯度凝胶(Bio-Rad公司)充电而电泳后，使用印迹装置(Bio-Rad公司)转印至Immobilon P(Millipore公司)。将转印膜使用TBS-T(0.05%Tween20、TBS)轻柔地洗涤后，在加入了40%BSA的TBS中振荡1小时后，以等间隔切割成狭条，添加在加入了10%Block-Ace的TBS-T中稀释的各抗CDH3抗体并振荡1小时。将膜使用TBS-T洗涤后，使用在加入了10%Block-Ace的TBS-T中稀释的HRP-抗小鼠IgG抗体(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)振荡1小时后，使用TBS-T进行洗涤。显色是根据厂商的说明书，使用ECL-Plus(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)，利用X线胶片RX-u(富士胶片公司)进行检测。将所得的结果示于图8中。

根据与各CDH3部分长度蛋白质的反应性，确定各抗体识别的区域(表2)。

以下示出与序列编号2所示的CDH3序列上的各抗体识别的区域的对应关系。

EC1的上游区域：108位-131位

EC1：132位-236位

EC2：237位-348位

EC3：349位-461位

EC4：462位-550位

EC5：551位-654位。

[表2]

R＆D-104805表示市售抗CDH3抗体(R＆D SYSTEMS公司)。

BD-610227表示市售抗CDH3抗体(BD BIOSCIENCE公司)。

阴性Ab1、阴性Ab 2表示识别与CDH3无关的抗原的抗体。

＊S：高ADCC活性(抗体浓度为1μg/mL时为30%以上)

W：低ADCC活性(抗体浓度为1μg/mL时小于30%)。

实施例6：使用肽阵列的抗CDH3单克隆抗体表位确定

在前述的根据CDH3部分长度表达蛋白质的表位确定中，将认为相当于其边界区域的抗体PPMX13作为对象，使用肽阵列(JPT Peptide Technologies公司制造的Replitope)更详细地进行表位确定。

具体而言，将相当于CDH3的细胞外区域的区域(相当于序列编号2的108位-563位)从N端起每13个残基、每2个氨基酸残基滑动合成的肽(108位-120位、110位-122位???551位-563位)在玻璃载片上固相化，制备使用SuperBlock(PIERCE公司)封闭的肽，并与作为初次抗体的表位检索对象的抗体反应。使用TBS-T清洗3次后，使用经DyLight649萤光标记的抗小鼠抗体(PIERCE公司)进行检测。将未使表位检索对象的抗体反应的抗体作为阴性对照进行测定。将测定结果示于图9中。在相当于序列编号2所示的CDH3的氨基酸序列446位-472位、490位-504位的区域观察到强信号，推测其为该抗体的表位。

结合实施例5及实施例6中所确定的抗体的识别区域的结果研究与ADCC活性的关联时，显示ADCC高活性抗体集中在EC1的上游区域、EC4及EC5的区域。

实施例7：正常组织及癌组织中的CDH3mRNA的表达

利用从正常人组织及各种癌组织通过激光捕获显微切割法(Laser Capture Microdissection)回收的样品，使用ISOGEN(Nippon Gene公司)根据常规方法制备总RNA。使用GeneChipU-133B(Affimetrix公司)，根据Expression Analysis Technical Manual(Affimetrix公司)，对各10ng RNA解析基因表达。将全基因的表达得分的平均值设定为100，并探索癌细胞中表达亢进的基因时，CDH3在肺癌、大肠癌、胰腺癌中表达高(图10B)。另外，对分化度不同的胰腺癌组织中的CDH3mRNA的表达进行研究时，发现与分化度无关地表达高的组织(图10C)。

实施例8：利用免疫组织化学染色的癌组织中的CDH3蛋白质的表达

为了确认癌症临床样本中的CDH3蛋白质的表达，在癌症样本组织阵列中进行免疫染色。

癌细胞组织阵列使用上海芯超生物科技有限公司(Shanghai Outdo Biotech Co.,Ltd.)制造的胰癌(腺癌)、肺癌(腺癌)、肺癌(扁平上皮癌)及大肠癌(腺癌)。

对各组织阵列载片进行脱石蜡处理，在10mMTris 1mM EDTA(pH9.0)中进行95℃40分钟活化。利用ENVISION＋Kit(Dako公司)附带的封闭试剂进行内源性过氧化物酶的钝化后，使载片与抗CDH3抗体610227(BD BIOSCIENCE公司)、及作为阴性对照的抗HBs抗体Hyb-3423在5μg/mL的浓度下在4℃下反应一晩。冲洗抗体溶液后，使载片与ENVISION＋Kit附带的聚合物二次抗体试剂在室温下反应30分钟。利用ENVISION＋Kit附带的显色试剂进行显色，利用苏木精伊红溶液进行核染色。

图11中示出结果。癌细胞被抗CDH3抗体染色，而正常细胞未被染色。

实施例9：异种移植物模型中的抗肿瘤效果

在移植了源自人肺癌的细胞系NCI-H358、源自人皮肤癌的细胞系A431、及源自人胰腺癌的细胞系PK-45P的异种移植物中，确认了抗CDH3抗体的抗肿瘤效果。

使用含有10%FBS的RPMI1640培养基培养NCI-H358及PK-45P，使用含有10%FBS的DMEM培养基培养A431，将它们移植至SCID小鼠(雌性、7周龄、日本CLEA)的右腹侧部皮下使其达到5×10⁶个/小鼠。

将NCI-H358移植小鼠分成6群(n＝8)，对各群从尾静脉给予PPMX12产生抗体0.01mg/kg、0.06mg/kg、0.3mg/kg、1.5mg/kg、作为对照抗体的RCB1205产生抗体(抗百日咳毒素小鼠IgG抗体)7.5mg/kg。给予在平均肿瘤尺寸达到90mm³时开始，一周2次(每3天或者4天1次)，进行8次。

将PK-45P移植小鼠分成2群(n＝8)，对各群从尾静脉给予PPMX12产生抗体7.5mg/kg、作为对照抗体的RCB1205产生抗体(抗百日咳毒素小鼠IgG抗体)7.5mg/kg。给予在平均肿瘤尺寸达到120mm³时开始，一周2次(每3天或者4天1次)，进行7次。

将A431移植小鼠分成2群(n＝8)，对各群从尾静脉给予PPMX12产生抗体7.5mg/kg、作为对照抗体的RCB1205产生抗体(抗百日咳毒素小鼠IgG抗体)7.5mg/kg。给予在平均肿瘤尺寸达到110mm³时开始，一周2次(每3天或者4天1次)，进行6次。

在给予日测定肿瘤尺寸及体重。最后给予后再观察1周，并测定体重、肿瘤尺寸、肿瘤重量。将各结果示于图12～图14中。PPMX12产生抗体在所有试验中显示出抗肿瘤活性。另外确认，在使用NCI-H358移植小鼠的试验中，抗肿瘤效果依赖于给予量而增强。

序列表

<110> Perseus Proteomics Inc.

<120> 抗钙粘着蛋白抗体

<130> 101028A

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2490

<212> DNA

<213> 人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2490)

<400> 1

atg ggg ctc cct cgt gga cct ctc gcg tct ctc ctc ctt ctc cag gtt 48

Met Gly Leu Pro Arg Gly Pro Leu Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Val

1 5 10 15

tgc tgg ctg cag tgc gcg gcc tcc gag ccg tgc cgg gcg gtc ttc agg 96

Cys Trp Leu Gln Cys Ala Ala Ser Glu Pro Cys Arg Ala Val Phe Arg

20 25 30

gag gct gaa gtg acc ttg gag gcg gga ggc gcg gag cag gag ccc ggc 144

Glu Ala Glu Val Thr Leu Glu Ala Gly Gly Ala Glu Gln Glu Pro Gly

35 40 45

cag gcg ctg ggg aaa gta ttc atg ggc tgc cct ggg caa gag cca gct 192

Gln Ala Leu Gly Lys Val Phe Met Gly Cys Pro Gly Gln Glu Pro Ala

50 55 60

ctg ttt agc act gat aat gat gac ttc act gtg cgg aat ggc gag aca 240

Leu Phe Ser Thr Asp Asn Asp Asp Phe Thr Val Arg Asn Gly Glu Thr

65 70 75 80

gtc cag gaa aga agg tca ctg aag gaa agg aat cca ttg aag atc ttc 288

Val Gln Glu Arg Arg Ser Leu Lys Glu Arg Asn Pro Leu Lys Ile Phe

85 90 95

cca tcc aaa cgt atc tta cga aga cac aag aga gat tgg gtg gtt gct 336

Pro Ser Lys Arg Ile Leu Arg Arg His Lys Arg Asp Trp Val Val Ala

100 105 110

cca ata tct gtc cct gaa aat ggc aag ggt ccc ttc ccc cag aga ctg 384

Pro Ile Ser Val Pro Glu Asn Gly Lys Gly Pro Phe Pro Gln Arg Leu

115 120 125

aat cag ctc aag tct aat aaa gat aga gac acc aag att ttc tac agc 432

Asn Gln Leu Lys Ser Asn Lys Asp Arg Asp Thr Lys Ile Phe Tyr Ser

130 135 140

atc acg ggg ccg ggg gca gac agc ccc cct gag ggt gtc ttc gct gta 480

Ile Thr Gly Pro Gly Ala Asp Ser Pro Pro Glu Gly Val Phe Ala Val

145 150 155 160

gag aag gag aca ggc tgg ttg ttg ttg aat aag cca ctg gac cgg gag 528

Glu Lys Glu Thr Gly Trp Leu Leu Leu Asn Lys Pro Leu Asp Arg Glu

165 170 175

gag att gcc aag tat gag ctc ttt ggc cac gct gtg tca gag aat ggt 576

Glu Ile Ala Lys Tyr Glu Leu Phe Gly His Ala Val Ser Glu Asn Gly

180 185 190

gcc tca gtg gag gac ccc atg aac atc tcc atc atc gtg acc gac cag 624

Ala Ser Val Glu Asp Pro Met Asn Ile Ser Ile Ile Val Thr Asp Gln

195 200 205

aat gac cac aag ccc aag ttt acc cag gac acc ttc cga ggg agt gtc 672

Asn Asp His Lys Pro Lys Phe Thr Gln Asp Thr Phe Arg Gly Ser Val

210 215 220

tta gag gga gtc cta cca ggt act tct gtg atg cag gtg aca gcc acg 720

Leu Glu Gly Val Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Gln Val Thr Ala Thr

225 230 235 240

gat gag gat gat gcc atc tac acc tac aat ggg gtg gtt gct tac tcc 768

Asp Glu Asp Asp Ala Ile Tyr Thr Tyr Asn Gly Val Val Ala Tyr Ser

245 250 255

atc cat agc caa gaa cca aag gac cca cac gac ctc atg ttc acc att 816

Ile His Ser Gln Glu Pro Lys Asp Pro His Asp Leu Met Phe Thr Ile

260 265 270

cac cgg agc aca ggc acc atc agc gtc atc tcc agt ggc ctg gac cgg 864

His Arg Ser Thr Gly Thr Ile Ser Val Ile Ser Ser Gly Leu Asp Arg

275 280 285

gaa aaa gtc cct gag tac aca ctg acc atc cag gcc aca gac atg gat 912

Glu Lys Val Pro Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Ala Thr Asp Met Asp

290 295 300

ggg gac ggc tcc acc acc acg gca gtg gca gta gtg gag atc ctt gat 960

Gly Asp Gly Ser Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Val Glu Ile Leu Asp

305 310 315 320

gcc aat gac aat gct ccc atg ttt gac ccc cag aag tac gag gcc cat 1008

Ala Asn Asp Asn Ala Pro Met Phe Asp Pro Gln Lys Tyr Glu Ala His

325 330 335

gtg cct gag aat gca gtg ggc cat gag gtg cag agg ctg acg gtc act 1056

Val Pro Glu Asn Ala Val Gly His Glu Val Gln Arg Leu Thr Val Thr

340 345 350

gat ctg gac gcc ccc aac tca cca gcg tgg cgt gcc acc tac ctt atc 1104

Asp Leu Asp Ala Pro Asn Ser Pro Ala Trp Arg Ala Thr Tyr Leu Ile

355 360 365

atg ggc ggt gac gac ggg gac cat ttt acc atc acc acc cac cct gag 1152

Met Gly Gly Asp Asp Gly Asp His Phe Thr Ile Thr Thr His Pro Glu

370 375 380

agc aac cag ggc atc ctg aca acc agg aag ggt ttg gat ttt gag gcc 1200

Ser Asn Gln Gly Ile Leu Thr Thr Arg Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala

385 390 395 400

aaa aac cag cac acc ctg tac gtt gaa gtg acc aac gag gcc cct ttt 1248

Lys Asn Gln His Thr Leu Tyr Val Glu Val Thr Asn Glu Ala Pro Phe

405 410 415

gtg ctg aag ctc cca acc tcc aca gcc acc ata gtg gtc cac gtg gag 1296

Val Leu Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile Val Val His Val Glu

420 425 430

gat gtg aat gag gca cct gtg ttt gtc cca ccc tcc aaa gtc gtt gag 1344

Asp Val Asn Glu Ala Pro Val Phe Val Pro Pro Ser Lys Val Val Glu

435 440 445

gtc cag gag ggc atc ccc act ggg gag cct gtg tgt gtc tac act gca 1392

Val Gln Glu Gly Ile Pro Thr Gly Glu Pro Val Cys Val Tyr Thr Ala

450 455 460

gaa gac cct gac aag gag aat caa aag atc agc tac cgc atc ctg aga 1440

Glu Asp Pro Asp Lys Glu Asn Gln Lys Ile Ser Tyr Arg Ile Leu Arg

465 470 475 480

gac cca gca ggg tgg cta gcc atg gac cca gac agt ggg cag gtc aca 1488

Asp Pro Ala Gly Trp Leu Ala Met Asp Pro Asp Ser Gly Gln Val Thr

485 490 495

gct gtg ggc acc ctc gac cgt gag gat gag cag ttt gtg agg aac aac 1536

Ala Val Gly Thr Leu Asp Arg Glu Asp Glu Gln Phe Val Arg Asn Asn

500 505 510

atc tat gaa gtc atg gtc ttg gcc atg gac aat gga agc cct ccc acc 1584

Ile Tyr Glu Val Met Val Leu Ala Met Asp Asn Gly Ser Pro Pro Thr

515 520 525

act ggc acg gga acc ctt ctg cta aca ctg att gat gtc aat gac cat 1632

Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Thr Leu Ile Asp Val Asn Asp His

530 535 540

ggc cca gtc cct gag ccc cgt cag atc acc atc tgc aac caa agc cct 1680

Gly Pro Val Pro Glu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Cys Asn Gln Ser Pro

545 550 555 560

gtg cgc cag gtg ctg aac atc acg gac aag gac ctg tct ccc cac acc 1728

Val Arg Gln Val Leu Asn Ile Thr Asp Lys Asp Leu Ser Pro His Thr

565 570 575

tcc cct ttc cag gcc cag ctc aca gat gac tca gac atc tac tgg acg 1776

Ser Pro Phe Gln Ala Gln Leu Thr Asp Asp Ser Asp Ile Tyr Trp Thr

580 585 590

gca gag gtc aac gag gaa ggt gac aca gtg gtc ttg tcc ctg aag aag 1824

Ala Glu Val Asn Glu Glu Gly Asp Thr Val Val Leu Ser Leu Lys Lys

595 600 605

ttc ctg aag cag gat aca tat gac gtg cac ctt tct ctg tct gac cat 1872

Phe Leu Lys Gln Asp Thr Tyr Asp Val His Leu Ser Leu Ser Asp His

610 615 620

ggc aac aaa gag cag ctg acg gtg atc agg gcc act gtg tgc gac tgc 1920

Gly Asn Lys Glu Gln Leu Thr Val Ile Arg Ala Thr Val Cys Asp Cys

625 630 635 640

cat ggc cat gtc gaa acc tgc cct gga ccc tgg aag gga ggt ttc atc 1968

His Gly His Val Glu Thr Cys Pro Gly Pro Trp Lys Gly Gly Phe Ile

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ctc cct gtg ctg ggg gct gtc ctg gct ctg ctg ttc ctc ctg ctg gtg 2016

Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Leu Leu Leu Val

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ctg ctt ttg ttg gtg aga aag aag cgg aag atc aag gag ccc ctc cta 2064

Leu Leu Leu Leu Val Arg Lys Lys Arg Lys Ile Lys Glu Pro Leu Leu

675 680 685

ctc cca gaa gat gac acc cgt gac aac gtc ttc tac tat ggc gaa gag 2112

Leu Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val Phe Tyr Tyr Gly Glu Glu

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Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Tyr Asp Ile Thr Gln Leu His Arg

705 710 715 720

ggt ctg gag gcc agg ccg gag gtg gtt ctc cgc aat gac gtg gca cca 2208

Gly Leu Glu Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Arg Asn Asp Val Ala Pro

725 730 735

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Thr Ile Ile Pro Thr Pro Met Tyr Arg Pro Arg Pro Ala Asn Pro Asp

740 745 750

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Glu Ile Gly Asn Phe Ile Ile Glu Asn Leu Lys Ala Ala Asn Thr Asp

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Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Thr Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly

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Ser Gly Ser Asp Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ser Ala Ser

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gac caa gac caa gat tac gat tat ctg aac gag tgg ggc agc cgc ttc 2448

Asp Gln Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu Trp Gly Ser Arg Phe

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aag aag ctg gca gac atg tac ggt ggc ggg gag gac gac tag 2490

Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu Asp Asp

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Cys Trp Leu Gln Cys Ala Ala Ser Glu Pro Cys Arg Ala Val Phe Arg

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Glu Ala Glu Val Thr Leu Glu Ala Gly Gly Ala Glu Gln Glu Pro Gly

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Gln Ala Leu Gly Lys Val Phe Met Gly Cys Pro Gly Gln Glu Pro Ala

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Leu Phe Ser Thr Asp Asn Asp Asp Phe Thr Val Arg Asn Gly Glu Thr

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Val Gln Glu Arg Arg Ser Leu Lys Glu Arg Asn Pro Leu Lys Ile Phe

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Pro Ser Lys Arg Ile Leu Arg Arg His Lys Arg Asp Trp Val Val Ala

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Pro Ile Ser Val Pro Glu Asn Gly Lys Gly Pro Phe Pro Gln Arg Leu

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Asn Gln Leu Lys Ser Asn Lys Asp Arg Asp Thr Lys Ile Phe Tyr Ser

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210 215 220

Leu Glu Gly Val Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Gln Val Thr Ala Thr

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Asp Glu Asp Asp Ala Ile Tyr Thr Tyr Asn Gly Val Val Ala Tyr Ser

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Glu Lys Val Pro Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Ala Thr Asp Met Asp

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Gly Asp Gly Ser Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Val Glu Ile Leu Asp

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Ala Asn Asp Asn Ala Pro Met Phe Asp Pro Gln Lys Tyr Glu Ala His

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Val Pro Glu Asn Ala Val Gly His Glu Val Gln Arg Leu Thr Val Thr

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Asp Leu Asp Ala Pro Asn Ser Pro Ala Trp Arg Ala Thr Tyr Leu Ile

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Val Leu Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile Val Val His Val Glu

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Val Arg Gln Val Leu Asn Ile Thr Asp Lys Asp Leu Ser Pro His Thr

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Ala Glu Val Asn Glu Glu Gly Asp Thr Val Val Leu Ser Leu Lys Lys

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Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Leu Leu Leu Val

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Leu Leu Leu Leu Val Arg Lys Lys Arg Lys Ile Lys Glu Pro Leu Leu

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Leu Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val Phe Tyr Tyr Gly Glu Glu

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Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Tyr Asp Ile Thr Gln Leu His Arg

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Gly Leu Glu Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Arg Asn Asp Val Ala Pro

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Glu Ile Gly Asn Phe Ile Ile Glu Asn Leu Lys Ala Ala Asn Thr Asp

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Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Thr Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly

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Ser Gly Ser Asp Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ser Ala Ser

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Asp Gln Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu Trp Gly Ser Arg Phe

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Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu

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acaaacaaaa aaactcatgg agcgatttta ttatcttggg ggatgagacc atgagattgg 3660

aaaatgtaca ttacttctag ttttagactt tagtttgttt tttttttttt cactaaaatc 3720

ttaaaactta ctcagctggt tgcaaataaa gggagttttc atatcaccaa tttgtagcaa 3780

aattgaattt tttcataaac tagaatgtta gacacatttt ggtcttaatc catgtacact 3840

tttttatttc tgtatttttc cacttcactg taaaaatagt atgtgtacat aatgttttat 3900

tggcatagtc tatggagaag tgcagaaact tcagaacatg tgtatgtatt atttggacta 3960

tggattcagg ttttttgcat gtttatatct ttcgttatgg ataaagtatt tacaaaacag 4020

tgacatttga ttcaattgtt gagctgtagt tagaatactc aatttttaat ttttttaatt 4080

tttttatttt ttattttctt tttggtttgg ggagggagaa aagttcttag cacaaatgtt 4140

ttacataatt tgtaccaaaa aaaaaaaaaa aggaaaggaa agaaaggggt ggcctgacac 4200

tggtggcact actaagtgtg tgttttttta aaaaaaaaat ggaaaaaaaa aagcttttaa 4260

actggagaga cttctgacaa cagctttgcc tctgtattgt gtaccagaat ataaatgata 4320

cacctctgac cccagcgttc tgaataaaat gctaattttg gatctggaaa aaaaaaaaaa 4380

<210> 6

<211> 906

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Met Cys Arg Ile Ala Gly Ala Leu Arg Thr Leu Leu Pro Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Gln Ala Ser Val Glu Ala Ser Gly Glu Ile Ala Leu Cys

20 25 30

Lys Thr Gly Phe Pro Glu Asp Val Tyr Ser Ala Val Leu Ser Lys Asp

35 40 45

Val His Glu Gly Gln Pro Leu Leu Asn Val Lys Phe Ser Asn Cys Asn

50 55 60

Gly Lys Arg Lys Val Gln Tyr Glu Ser Ser Glu Pro Ala Asp Phe Lys

65 70 75 80

Val Asp Glu Asp Gly Met Val Tyr Ala Val Arg Ser Phe Pro Leu Ser

85 90 95

Ser Glu His Ala Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Gln Asp Lys Glu Thr Gln

100 105 110

Glu Lys Trp Gln Val Ala Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Thr Leu Thr

115 120 125

Glu Glu Ser Val Lys Glu Ser Ala Glu Val Glu Glu Ile Val Phe Pro

130 135 140

Arg Gln Phe Ser Lys His Ser Gly His Leu Gln Arg Gln Lys Arg Asp

145 150 155 160

Trp Val Ile Pro Pro Ile Asn Leu Pro Glu Asn Ser Arg Gly Pro Phe

165 170 175

Pro Gln Glu Leu Val Arg Ile Arg Ser Asp Arg Asp Lys Asn Leu Ser

180 185 190

Leu Arg Tyr Ser Val Thr Gly Pro Gly Ala Asp Gln Pro Pro Thr Gly

195 200 205

Ile Phe Ile Ile Asn Pro Ile Ser Gly Gln Leu Ser Val Thr Lys Pro

210 215 220

Leu Asp Arg Glu Gln Ile Ala Arg Phe His Leu Arg Ala His Ala Val

225 230 235 240

Asp Ile Asn Gly Asn Gln Val Glu Asn Pro Ile Asp Ile Val Ile Asn

245 250 255

Val Ile Asp Met Asn Asp Asn Arg Pro Glu Phe Leu His Gln Val Trp

260 265 270

Asn Gly Thr Val Pro Glu Gly Ser Lys Pro Gly Thr Tyr Val Met Thr

275 280 285

Val Thr Ala Ile Asp Ala Asp Asp Pro Asn Ala Leu Asn Gly Met Leu

290 295 300

Arg Tyr Arg Ile Val Ser Gln Ala Pro Ser Thr Pro Ser Pro Asn Met

305 310 315 320

Phe Thr Ile Asn Asn Glu Thr Gly Asp Ile Ile Thr Val Ala Ala Gly

325 330 335

Leu Asp Arg Glu Lys Val Gln Gln Tyr Thr Leu Ile Ile Gln Ala Thr

340 345 350

Asp Met Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Gly Leu Ser Asn Thr Ala Thr Ala

355 360 365

Val Ile Thr Val Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Thr Ala

370 375 380

Met Thr Phe Tyr Gly Glu Val Pro Glu Asn Arg Val Asp Ile Ile Val

385 390 395 400

Ala Asn Leu Thr Val Thr Asp Lys Asp Gln Pro His Thr Pro Ala Trp

405 410 415

Asn Ala Val Tyr Arg Ile Ser Gly Gly Asp Pro Thr Gly Arg Phe Ala

420 425 430

Ile Gln Thr Asp Pro Asn Ser Asn Asp Gly Leu Val Thr Val Val Lys

435 440 445

Pro Ile Asp Phe Glu Thr Asn Arg Met Phe Val Leu Thr Val Ala Ala

450 455 460

Glu Asn Gln Val Pro Leu Ala Lys Gly Ile Gln His Pro Pro Gln Ser

465 470 475 480

Thr Ala Thr Val Ser Val Thr Val Ile Asp Val Asn Glu Asn Pro Tyr

485 490 495

Phe Ala Pro Asn Pro Lys Ile Ile Arg Gln Glu Glu Gly Leu His Ala

500 505 510

Gly Thr Met Leu Thr Thr Phe Thr Ala Gln Asp Pro Asp Arg Tyr Met

515 520 525

Gln Gln Asn Ile Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Asp Pro Ala Asn Trp Leu

530 535 540

Lys Ile Asp Pro Val Asn Gly Gln Ile Thr Thr Ile Ala Val Leu Asp

545 550 555 560

Arg Glu Ser Pro Asn Val Lys Asn Asn Ile Tyr Asn Ala Thr Phe Leu

565 570 575

Ala Ser Asp Asn Gly Ile Pro Pro Met Ser Gly Thr Gly Thr Leu Gln

580 585 590

Ile Tyr Leu Leu Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Gln Val Leu Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Glu Thr Cys Glu Thr Pro Asp Pro Asn Ser Ile Asn Ile Thr

610 615 620

Ala Leu Asp Tyr Asp Ile Asp Pro Asn Ala Gly Pro Phe Ala Phe Asp

625 630 635 640

Leu Pro Leu Ser Pro Val Thr Ile Lys Arg Asn Trp Thr Ile Thr Arg

645 650 655

Leu Asn Gly Asp Phe Ala Gln Leu Asn Leu Lys Ile Lys Phe Leu Glu

660 665 670

Ala Gly Ile Tyr Glu Val Pro Ile Ile Ile Thr Asp Ser Gly Asn Pro

675 680 685

Pro Lys Ser Asn Ile Ser Ile Leu Arg Val Lys Val Cys Gln Cys Asp

690 695 700

Ser Asn Gly Asp Cys Thr Asp Val Asp Arg Ile Val Gly Ala Gly Leu

705 710 715 720

Gly Thr Gly Ala Ile Ile Ala Ile Leu Leu Cys Ile Ile Ile Leu Leu

725 730 735

Ile Leu Val Leu Met Phe Val Val Trp Met Lys Arg Arg Asp Lys Glu

740 745 750

Arg Gln Ala Lys Gln Leu Leu Ile Asp Pro Glu Asp Asp Val Arg Asp

755 760 765

Asn Ile Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp

770 775 780

Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Gln Pro Asp Thr Val Glu Pro Asp Ala

785 790 795 800

Ile Lys Pro Val Gly Ile Arg Arg Met Asp Glu Arg Pro Ile His Ala

805 810 815

Glu Pro Gln Tyr Pro Val Arg Ser Ala Ala Pro His Pro Gly Asp Ile

820 825 830

Gly Asp Phe Ile Asn Glu Gly Leu Lys Ala Ala Asp Asn Asp Pro Thr

835 840 845

Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly

850 855 860

Ser Thr Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ser Ser Gly Gly

865 870 875 880

Glu Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys

885 890 895

Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Asp Asp

900 905

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 7

cgcggtacca tggggctccc tcgt 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 8

ccgtctagat aacctccctt ccagggtcc 29

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 9

tatggagctc ggtaccgatt gggtggttgc tccaatatct g 41

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 10

agattaccta tctagactac tgcatcacag aagtacctgg tagg 44

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 11

tatggagctc ggtaccaagt ctaataaaga tagagacacc aag 43

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 12

agattaccta tctagactac ctctgcacct catggcccac tgcattctca 50

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 13

tatggagctc ggtaccgtga cagccacgga tgaggatgat g 41

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成DNA

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agattaccta tctagactag acacacacag gctccccagt g 41

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 15

tatggagctc ggtaccctga cggtcactga tctggacg 38

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 16

agattaccta tctagactag ggctcaggga ctgggccatg gtcattg 47

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

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tatggagctc ggtacctaca ctgcagaaga ccctgacaag g 41

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 18

agattaccta tctagactaa cctcccttcc agggtccagg gcaggtttcg 50

Claims

1. 抗钙粘着蛋白抗体，其识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4（EC4）或者钙粘着蛋白结构域5（EC5）中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上。

2. 根据权利要求1所述的抗体，其中钙粘着蛋白为P-钙粘着蛋白。

3. 根据权利要求1或2所述的抗体，其为从将可溶型P-钙粘着蛋白作为免疫原而给予的免疫动物取得的抗体产生细胞所产生的抗体。

4. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。

5. 杂交瘤，其产生根据权利要求4所述的抗体。

6. 细胞毒剂，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的抗体。

7. 根据权利要求6所述的细胞毒剂，其给予癌细胞。