CN102747153A - 谷子糯质基因共分离的分子标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种谷子糯质基因共分离的分子标记及其检测方法，用于谷子糯质资源的利用及糯质新品种的选育，所述分子标记为InDel分子标记，扩增引物为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R引物组合。

Description

谷子糯质基因共分离的分子标记及其检测方法

技术领域

本发明提供了谷子Ⅳ型糯质基因的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用于谷子的Ⅳ型糯质基因型的分子鉴定。

背景技术

谷子，脱壳后称小米，小米主要物质为淀粉，含量在75%左右，一般品种直链淀粉含量在12.8%以上 ，糯性品种直链淀粉含量在1.24% -7%之间。糯小米粒小，色淡黄或深黄，质地较硬，糯小米淀粉分子量比普通小米小20多倍，食用消化率比普通小米高20%以上，它还具有较高的粘滞性和良好的适口性，制成品有甜香味。加温处理的糯小米淀粉具有较高的膨胀力和透明性，这些优良特征赋予糯小米宝贵的价值和广泛的用途。

小米是一种营养丰富的食品，在国外糯小米也被评为“营养之王”而列为“保健食品”。经常食用小米对维持蛋白质、氨基酸的代谢平衡都有重要的作用。糯小米的功效主要有1.因其富含维生素B1、B12等，具有防止消化不良及口角生疮的功效；2.具有防止泛胃、呕吐的功效；3.还具有滋阴养血的功能，可以使产妇虚寒的体质得到调养，帮助她们恢复体力；4.糯小米具有减轻皱纹、色斑、色素沉着的功效。为此，糯小米有无限的加工开发潜力，对拉动我国特色谷子产业发展具有重要的作用。

十里香系优质糯性谷子资源，但其它农艺性状很差。豫谷1号系获国家发明奖的优良品种，梗性品质。由豫谷1号×（1066A不育材料×十里香）F4复合杂交选育而成的冀创1号（本课题组选育），是高产、优质糯性品种，其直链淀粉含量(占样品干重) 仅1.22%，在国内谷子糯质品种中含量处于最低水平，表明其为高糯质品种。目前已经制成糯小米酒、糯小米醋、糯小米乳、粘糕等具有糯质特色的小米加工成品。 

冀创1号的选育过程历经15年，而分子标记辅助育种技术通过对目标基因快速而精确的选择，可以为育种提供了非常有效的工具。如果再以目标基因间的差异作为标记，可有效地避免分子标记与目标基因连锁互换的问题，同时可以在苗期进行选择，用PCR技术对DNA的质量要求不高，而且实用性很强，从而大大缩短了育种周期，也提高了选择效率。为此，本研究开发了可以对糯质性状进行基因型鉴定的共显性分子标记，为建立谷子糯质基因鉴定的技术体系奠定了基础，可以大大提高谷子糯质育种进程，促进谷子产业化发展。

发明内容

本发明的目的是：提供一种糯质谷子鉴别的分子标记方法，利用本研究开发的基于PCR的实用经济型标记，可以有效地从谷子中鉴定出含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子，用于谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育，所述标记为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R。

本发明涉及一种鉴别谷子糯质基因的分子标记方法，其特征在于：

用二对特异扩增谷子糯质基因的共显性InDel分子标记引物，分别命名为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R：

waxy-TSI2/int1上游引物：5’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3’

waxy-TSI2/int1下游引物：5’ GGATTTGACTGCATGAAAATG 3’

waxy-int1-1F/4R上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’

waxy-int1-1F/4R下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’

扩增谷子的DNA，若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段，并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段，则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。

本发明所提供的可鉴别糯质谷子的InDel标记，是通过以下方法获得的：

1）从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F₁。收获正反交F₁后再自交，构建糯质基因的F₂分离群体，F₂所结F₃种子经过碘液染色，梗质单株与糯质单株的分离比例符合3︰1，说明十里香的糯性由隐形单基因控制。

2）谷子的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶（GBSS1），决定谷子胚乳和花粉中的直链淀粉合成。普通谷子（WxWx）籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。糯谷子（wxwx）籽粒中含有少量或不含直链淀粉，几乎全部由支链淀粉组成。因为不同转座子插入GBSS1基因序列的不同位点，Waxy基因突变成各种不同的等位基因，减弱或消除了GBSS1基因的表达，对其编码蛋白颗粒凝结型淀粉合成酶的酶活影响界于5%至95%之间，从而形成糯质（waxy）或低淀粉含量（low-amylose）性状。根据文献（Mol Gen Genomics，2005，274：131–140）已经报道的区分糯质类型的4对引物序列，我们合成该4对引物，序列如下：

ex1/ex2引物核酸碱基序列：

上游引物：5’ TGCAAGCCAGTGACGGATCGACGACGACAC3’

下游引物：5’ATGCCGGTGACCAGCGTGGAGGGCTAGCTA3’

ex2int2/ex4r引物核酸碱基序列：

上游引物：5’CATGGCCGTAAGTCCCATCGATCGATCATC3’

下游引物：5’TAGCAGTGGAAGAACCTCACCCTCTCGTAC3’

M5/R7引物核酸碱基序列：

上游引物：5’GGACGTCAGCGAGTGGGACC3’

下游引物：5’ACGAGTCCACCGGTGGACGC3’

M7/R10引物核酸碱基序列：

上游引物：5’CACCAGCCGCTTCGAGCCCT3’

下游引物：5’GCCGGCGTGCCGACCACCTT3’

如图1所示，其中，只有ex1/ex2引物组合对谷子父本糯质十里香与母本梗质豫谷1号的基因组DNA扩增产物不同（其它3组引物扩增产物均相同），前者扩增片段在5 kb左右，后者扩增片段是828 bp。通过对父本PCR产物部分测序证实，扩增片段序列与gi|62318482|dbj|AB210215.1| Setaria italica GBSS1 gene, transposable element TSI-2 in intron 1完全匹配，说明十里香属于Ⅳ型糯质基因，是由TSI-2转座子插入到GBSS1基因的内元1形成的，TSI-2转座子大小是5251 bp。利用转座子TSI-2序列和GBSS1内元1序列，设计一对InDel标记引物waxy-TSI2/int1，可以鉴别出Ⅳ型糯质纯合隐性和杂合显性基因型；利用TSI-2插入位点所在的内元1序列，又设计了一对InDel标记引物waxy-int1-1F/4R，可以鉴别梗质纯合和杂合基因型，即二对引物同时使用能够排除Ⅳ型糯质基因型中杂合基因型的干扰。二对InDel标记引物序列如下，

waxy-TSI2/int1标记的引物核酸碱基序列是：

上游引物：5’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3’

下游引物：5’ GGATTTGACTGCATGAAAATG 3’

waxy-int1-1F/4R标记的引物核酸碱基序列是：

上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’

下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’

waxy-TSI2/int1 标记引物能够在十里香中扩增出984 bp条带，母本中没有扩增条带；waxy-int1-1F/4R标记引物能够在母本豫谷1号中扩增出540 bp条带，父本中没有扩增条带。如果使用该二组InDel标记引物检测谷子DNA，waxy-TSI2/int1引物能扩增出984 bp条带，waxy-int1-1F/4R引物不能扩增出条带，说明该谷子是含有纯合Ⅳ型糯质基因的糯性材料，详见表1。此外，二对标记扩增结果一有一无，增加了结果的可靠性和准确性。

表1：共显性InDel标记的基因型与表现型列表

注：“+”表示标记引物能扩增出条带；“-”表示标记引物不能扩增出条带。

3）利用CTAB方法提取十里香与豫谷1号的400份F₂群体各单株的基因组DNA，利用二组InDel标记引物进行PCR，扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析，我们发现该标记与糯质性状共分离，能对糯质隐性基因型、梗质纯合和杂合显性基因型进行准确鉴别。标记基因型为WxWx，F₃种子胚乳中淀粉遇碘全部变深蓝色；标记基因型为Wxwx，籽粒淀粉遇碘变蓝或棕红色，比例为3︰1；标记基因型为wxwx，籽粒淀粉遇碘全部变棕红色，与十里香表现完全一致。标记基因型WxWx：Wxwx：wxwx符合1:2:1的分离比例。

4）利用该标记对收集的100份谷子材料进行了分析，只有2份材料利用waxy-TSI2/int1标记引物能够扩出984 bp的扩增片段，而利用waxy-int1-1F/4R标记引物没有扩增产物，并且这2份材料的种子胚乳经碘液检测全部变为棕红色，说明这2份材料属于糯质材料，并且是由Ⅳ型糯质基因控制。可见，该标记组合可以准确鉴别Ⅳ型糯质基因。

扩增Ⅳ型糯质和梗质杂合基因型谷子DNA，标记waxy-TSI2/int1能够扩出984 bp的扩增片段，扩增梗质（包括纯合和杂合基因型）谷子DNA，标记waxy-int1-1F/4R能够扩出540 bp的扩增片段。由于该标记是基于Ⅳ型糯质基因而设计的共显性分子标记，可以进行基因型鉴定，即可以对糯质纯合基因型和梗质杂合基因型进行鉴别。

本研究所提供的鉴别Ⅳ型糯质谷子的分子标记方法，具有如下优点：

通过本发明分子标记在国际上首次获得了对谷子Ⅳ型糯质基因型鉴别的共显性分子标记。

本发明的分子标记可以从谷子中鉴别出Ⅳ型糯质谷子，准确可靠，鉴定方便。该标记检测快速经济而有效，不受环境影响。利用该标记可以对谷子资源中Ⅳ型糯质材料进行准确地鉴定和区分。

附图说明

图1 ：4个不同引物组合（ex1和ex2，ex2int2和ex4r，M5和R7，M7和R10）在父母本中扩增GBSS1基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果；（M为DL2000 marker，P1为父本十里香，P2为母本豫谷1号）

图2： 标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R对“十里香/豫谷1号”F₂群体扩增琼脂糖凝胶电泳结果；（M为DL2000 marker，P1为父本十里香，P2为母本豫谷1号，1－14为F₂群体的部分单株，上板是waxy-TSI2/int1检测结果，下板是waxy-int1-1F/4R检测结果）

图3： 标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R对31份谷子材料扩增琼脂糖凝胶电泳结果。1-2道共2份糯质材料带型一致，含有Ⅳ型糯质基因；3-16道共14份梗质材料带型一致；17-27道共11份糯质材料带型一致，28-29道共2份糯质材料带型一致，均不含Ⅳ型糯质基因；30-31道共2份不纯材料带型一致，均是杂合子基因型；（M为DL2000 marker，1－2和17-29为糯质谷子，3-16为梗质谷子，30-31为不纯谷子，上板是waxy-TSI2/int1检测结果，下板是waxy-int1-1F/4R检测结果）

具体实施方法（注意：附图显示的内容似乎与实施例所做的内容不完全一致，尽量让两者保持一致。另外，在实施例1已经确定分子标记和表现型的关联性后，需要对所述方法进行验证，目前的验证方法这么些也可以样本数量较多时，可以通过采用表格的形式列出分子标记的检测结果和相应的表现型的总数目，以便于更直观地建立分子标记和表现型的关联性。）

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、一种鉴别含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子的分子标记的获得

1、供试材料

利用谷子优质糯性资源十里香与梗质品种豫谷1号，以及其杂种F₁、F₂群体。

2、糯质性状鉴定

每份材料随机取成熟籽粒15粒，分别置于小研钵中用杵子捣碎，加碘-碘化钾溶液（2 g KI置于1 mL水中，溶解后加入1 g I₂，震荡至完全溶解，补足蒸馏水至300 mL，棕色玻璃瓶中保存，用时将其稀释10倍）30 mL，杵子混匀样品和溶液，观察胚乳中淀粉颜色的变化。

3、糯质遗传分析群体

2006年利用谷子糯质资源十里香，与梗质品种豫谷1号配制正反交杂交种F₁，2007年种植F₁并收获F₂种子，2008年种植正交F₁来源的F₂群体400株，并在5叶期之前取叶片以提取基因组DNA，并收获F₃种子。利用I₂-KI溶液对种子胚乳中淀粉进行颜色反应，碘遇直链淀粉变深蓝色，否则变棕红色。正反交F₁后代F₂种子胚乳遇碘出现深蓝色和棕红色表型分离，F₃种子胚乳颜色出现深蓝色和棕红色的分离，包括3种情况：15个籽粒胚乳全部变蓝，全部变棕红色，或者部分蓝色部分棕红色，蓝色明显多于棕红色。F₃种子的胚乳性质由F₂基因型决定，出现深蓝色胚乳的单株数与棕红色胚乳单株数的比例符合3:1，说明糯质对梗质是由单基因控制的隐性性状。

表2：F₂分离群体梗糯表型统计

4、DNA提取

参照Gill等人提供的CTAB法提取谷子叶片基因组DNA，并做适当修改，具体步骤如下：

（1）将1-1.5 g谷子叶片在预冷研钵中用液氮研磨成粉末。

（2）将粉末转移到1.5 mL离心管中，加入CTAB提取缓冲液650mL（事先在65℃水浴），摇动使粉末均匀分散于提取液中。

（3）65℃水浴40 min，其间颠倒混匀样品3-4次。

（4）冷却至室温后，加入等体积的氯仿︰异戊醇（24:1），轻轻混匀， 4℃ 12 000 rpm离心15 min。

（5）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿︰异戊醇（24:1），轻轻混匀，4℃ 12 000 rpm离心15 min。

（6）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积（650mL）-20℃预冷的异丙醇，摇匀，-20℃自由沉淀30 min。

（7）4℃ 12000 rpm离心15 min。

（8）弃上清，75%乙醇清洗沉淀1-2次。

（9）弃75%乙醇， DNA沉淀风干后，溶解于200mL TE（1/10），4℃保存备用。

用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量。

5、引物设计及PCR反应

Makoto Kawase等（Mol Gen Genomics，2005，274：131–140）认为糯质基因waxy是由于转座子插入到基因GBSS1后，造成基因低表达或不表达从而减弱或丧失功能引起的。根据插入的转座子类型及插入位点的不同，糯质基因可以分为7种类型。根据文献提供的区分糯质类型的4对引物序列，我们合成该4对引物，序列如下：

ex1/ex2引物核酸碱基序列：

上游引物：5’ TGCAAGCCAGTGACGGATCGACGACGACAC3’

下游引物：5’ATGCCGGTGACCAGCGTGGAGGGCTAGCTA3’

ex2int2/ex4r引物核酸碱基序列：

上游引物：5’CATGGCCGTAAGTCCCATCGATCGATCATC3’

下游引物：5’TAGCAGTGGAAGAACCTCACCCTCTCGTAC3’

M5/R7引物核酸碱基序列：

上游引物：5’GGACGTCAGCGAGTGGGACC3’

下游引物：5’ACGAGTCCACCGGTGGACGC3’

M7/R10引物核酸碱基序列：

上游引物：5’CACCAGCCGCTTCGAGCCCT3’

下游引物：5’GCCGGCGTGCCGACCACCTT3’

其中，只有ex1/ex2引物组合对谷子父本糯质十里香与母本梗质豫谷1号的基因组DNA扩增产物不同（其它3组引物扩增产物均相同），前者扩增片段在5 kb左右，后者扩增片段是828 bp。通过对父本PCR产物部分测序证实，扩增片段序列与gi|62318482|dbj|AB210215.1| Setaria italica GBSS1 gene, transposable element TSI-2 in intron 1完全匹配，说明十里香属于Ⅳ型糯质基因，是由TSI-2转座子插入到GBSS1基因的内元1形成的，TSI-2转座子大小是5251 bp。利用转座子TSI-2序列和GBSS1内元1序列，设计一对InDel标记引物waxy-TSI2/int1，可以鉴别出Ⅳ型糯质纯合隐性和杂合显性基因型；利用TSI-2插入位点所在的内元1序列，又设计了一对InDel标记引物waxy-int1-1F/4R，可以鉴别梗质纯合和杂合基因型，即二对引物同时使用能够排除Ⅳ型糯质基因型中杂合基因型的干扰。二对InDel标记引物序列如下，

waxy-TSI2/int1标记的引物核酸碱基序列是：

上游引物：5’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3’

下游引物：5’ GGATTTGACTGCATGAAAATG 3’

waxy-int1-1F/4R标记的引物核酸碱基序列是：

上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’

下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’

引物合成由上海生工公司完成。将合成的引物用双蒸水稀释为10 μM，-20℃保存备用。

以提取的基因组DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。PCR反应体系（20 μL）为：100 ng 基因组DNA模板、400 μM dNTPs、1×PCR buffer、各0.5 μM上下游引物，1.5 U Taq DNA聚合酶，补纯水至20 μL。引物1的PCR扩增程序为：95℃，4 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 1 min，35个循环；72℃，延伸10 min；10℃，冷却10 min，结束反应。引物1的PCR扩增程序为：95℃，4 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 35 sec，35个循环；72℃，延伸10 min；10℃，冷却10 min，结束反应。PCR反应在ABI VERITI热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂（0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液）后用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照后保存。

利用二对标记引物对“十里香/豫谷1号”F₂群体单株进行PCR分析（图2），我们发现标记基因型与表现型完全一致，即标记纯合显性基因型，其表现型均为籽粒淀粉遇碘全部变深蓝色；标记杂合基因型，其表现型为籽粒淀粉遇碘大部分变深蓝色少部分变棕红色；而标记糯质隐形基因型，其表现型是淀粉遇碘全部变棕红色，与十里香完全一致。

表3：F₂分离群体梗糯标记基因型与表型统计

 该标记与糯质基因共分离，并能对Ⅳ型糯质性状的纯合和杂合基因型鉴别。

实施例2：利用标记对谷子糯质材料的标记基因型分析

从谷子种质资源中我们收集了100份记录为糯质的谷子资源，原产地包括河北、河南、北京市、天津市、晋东南地区、湖北、甘肃、山西等地区，由本课题组保存。

每种材料各取5粒种子进行碘液染色，如果蓝色与棕红色都出现，则再随机选择5粒进行染色观察。其中，59份材料的种子胚乳遇碘全部变成深蓝色，说明这些材料均是梗质；28份材料的种子胚乳遇碘全部变成棕红色，说明这28份材料是糯质材料；13份谷子材料，种子胚乳遇碘变蓝或棕红色，说明材料不纯。

我们利用二对InDel标记对100份谷子材料进行了waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R标记分析。二对标记PCR产物琼脂糖凝胶部分电泳结果见图3。其中，28份碘液染色为棕红色的糯质材料中，只有2份标记基因型同父本十里香，说明它们是含有Ⅳ型糯质基因的糯质材料；59份碘液染色为深蓝色的梗质材料的标记基因型全部同母本豫谷1号；13份不纯材料的标记基因型也同其表现型一致。

本发明成功地将waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R标记应用于辅助选择育种，加快利用糯质资源培育含有Ⅳ型糯质基因的糯质品种的进程。

> waxy-TSI2/int1

GAAGTGGAGGATACTGATGGGTATACCAAGTTTTCCAATGCACAAGCAAAGCAAAATTATTGTGGCTTGCATGGCAATTCACAATTTTATCCGAGAGAATAGTGTTGCCGATAGGGAATTTGATTTGTACGATTGTGATGAAAATGGTGTCCCAATGCCCGGAACTTCAAACCGCGGAGGAGGTGAGACAAGTACCCAAGTAGAAGAAGAAGATAGCAACATGAATGCATTTCGAGATGAAATAGCTCATGCCTTGTACAATAGGTCTAGATAAATTGATTTCAATGTTGTAATGATAATGTATTTGTAGTTTAATTTTGGAGTTGTTGGACATTGTAATAGACATAAAATTCCCTTCTTATGCACTGGTGTATGACTGAAAGAGAAAGAGAAGAAGAGAGTGAAAGAGAAAGAGAAGAAGAGAGTGGAGAAGAAACAAGAAGAAAGGCATAGCGCTTTGCATGCATGCAGTGCAAGGAGGAGAACGGAGGGCACGGCACAGCACCGCACCGCTATGCACGCATGCATGCAAGCAGCGCCAGCGAGTGGAGCCAGCGCAGCACGCATGCATAGCAAGGGGCGCCAGCGAGTGGAGCCAGCGCAGCATGCATGCATGCAAGGGGCGCCAGCGAGTGGGGCCAGCGCATGCATGCGCGCGGGCGGGAGGGGCAGCGCGCGCGGGCGGGAGGACAAAAGCAGGGGTATGGTAGTCATTTTCACTATTAGGTGCTAAATTTTAGCCTCCCATCCAAACACCCATGGGTGCTAAATTTTAGCCTCTTTTTTTGAGTGGGCTAAACTTTAGCTCAAGGCTAAATTTTAGCCCCTACTCCCAAACAGGCCAAGTTAGGTTAATTTTGTTTCATGGAAACTGTTTAGTACAACTCATGTTCCTCATTTCGATGCATGCAACCACACACTACTGGAAATATAAAATCTTCAGTTCGTACTCACAAGTCAGAAGCACCCCCGGATAATCCGAAT

 

>waxy-int1-1F/4R

CCGTTTCGGTCGGTAGGAAGTGCAGGTGCATGCCTCTAGTTTACATCAAGTTTTTTTTTTTTCCTTTTTCGATCCAGTTCGTTTGCCTGTTTCGTATTCTGTCTGAAATCTGAGTCCATGCCGATGTATAGGAAGTGGATGCCTTTAGTTTAGATCAAGGTTTCTAGATCCAGTTTGTTCGTGTGCTTCGTGTTCTGTCTGAATCTAGCTAGGCCTCTGTTGGAGTGGATTAAGTTAGGTTAATTTTGTTTCATGGAAACTGTTTAGTACAACTCATGTTCCTCATTTCGATGCATGCAACCACACACTACTGGAAATATAAAATCTTCAGTTCGTACTCACAAGTCAGAAGCACCCCCGGATAATCCGAATCTGACCTCCAGTGGTAACTGTAGCACAAGTCCACACTTAGATCCGTCCGGAGGGATAATAAATCTGTAATTACTTTTTGACTTGTTGTAAATATATTTGTCATTTTCATGCAGTCAAATCCAAATTTAAATCACCTGAATCACCCATGGTTCAAACATCGAACCCACT

Claims (1)

1.鉴别谷子糯质基因的分子标记方法，其特征在于：

用二对特异扩增谷子糯质基因的共显性InDel分子标记引物，分别命名为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R：

waxy-TSI2/int1上游引物：5’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3’

waxy-TSI2/int1下游引物：5’ GGATTTGACTGCATGAAAATG 3’

waxy-int1-1F/4R上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’

waxy-int1-1F/4R下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’

扩增谷子的DNA，若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段，并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段，则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。

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