CN101063139A

CN101063139A - 一种种子特异性高效启动子及其应用

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Publication number: CN101063139A
Application number: CN 200710099169
Authority: CN
Inventors: 于静娟; 梁翰文; 朱登云; 薛静; 赵倩; 敖光明
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2027-05-15
Also published as: CN101063139B

Abstract

本发明涉及一种从谷子中分离到的种子特异性启动子，该启动子是利用Tail－PCR(染色体步移法)从谷子基因组DNA中克隆得到，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，本发明还包括具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主。本发明还涉及该启动子的应用，具体地说是利用该启动子序列来改造植物种子，其方法是将所述启动子下游衔接异源或同源基因，并构建植物表达载体，转化宿主植物，该启动子序列能够驱动其下游基因在其种子中高效特异表达目的蛋白，实现植物遗传改良，或者作为研究植物生物反应器的有效工具。

Description

一种种子特异性高效启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种从谷子中分离到的种子特异性高效启动子序列及其应用。从谷子基因组DNA中克隆得到的上述种子特异性启动子，并与不同的同源、异源基因连接构建植物表达载体，转化宿主植物，使转基因植株种子高效特异表达其下游基因的方法和应用。

背景技术

在转基因植物研究与开发的过程中发现，外源基因的表达量偏低，往往是造成无法得到理想的转基因植物和有效的研究基因作用机理的重要因素。由于影响表达量的关键是基因上游的启动子，因此，选择合适的植物启动子是增强外源基因表达首先要考虑的问题。根据启动子的转录模式可将其分为三类：组成型启动子，组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。现在植物基因工程中已经依据不同用途，开始广泛运用上述三类启动子。例如，组成型启动子中CaMV 35S启动子和CsVMV启动子通常应用于双子叶植物，其中CsVMV启动子在转基因葡萄中驱动外源基因转录能力与使用两个CaMV 35S启动子相当[Li Z J，et al.Expression of bifunctional GFP fusion marker underthe control of three constitutive promoter and enhanced derivatives intransgenic grape.Plant Sci，2001，160：877]。单子叶植物中常使用来自玉米的Ubiqutin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会持续表达。但是，由于组成型启动子驱动基因的表达程度不同，应用中逐渐暴露出一些问题：外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，最终导致死亡。如利用组成型启动子表达病毒衣壳蛋白，就可能会引起病毒衣壳转移，从而导致植物病毒新株系的产生[Robinson DJ.Environmental riskassessment of release of transgenic plants containing virus derived inserts.Transgene Res.1996，5：359.]。除此，重复使用同一启动子驱动两个或两个以上的外源基因，可能引起基因沉默或共抑制现象。

因而，利用特异性启动子使基因在受体植物的特定部位和特定时间或特定条件下得以表达，而且可以表现出发育调节的特性，能够有效避免组成型启动子持续高效表达所造成的浪费和不利影响。组织或器官特异性启动子，诱导型启动子即属于特异性启动子，这类启动子除具有一般的启动子结构外，同时还存在几种控制组织特异性表达的元件，通常还有增强子和沉默子的一般特性，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定，因此具有广泛的应用价值。随着植物基因工程发展，组织或器官特异性启动子的研究和应用成为热点之一。所谓组织或器官特异性启动子包括：种子特异性启动子[Beachy RN，et al.(1985)Accumulation and assembly ofsoybeanβ-conglycinin in seeds of transformed petunia plants.The EMBOJournal，4(12)：3047-3053]、胚乳特异性启动子[V.Colot，et al.(1987)Localization of sequence in wheat endosperm protein gene which confertissue-specific expression in tobacco.The EMBO Journal，6(12)：3559-3564]、根特异性启动子[Yamamoto YT，et al.(1991)Characterization of cis-acting sequences regulating root-specific geneexpression in tobacco.Plant Cell，3，371-382]、韧皮部特异性启动子[Bostwick DE，et al.(1994)Organization and characterization of cucurbitaphloem lectin genes.Plant Molecular Biology，26，887-897]等等。所谓诱导型启动子包括：损伤诱导型[Farmer EE，et al.(1992)Octadecanidprecursors of jasmonic acid activate synthesis of wound-inducibleproteinase inhinbitors.Plant Cell，4，129-134]、化学诱导[Williams S，et al.(1992)Chemicals regulation of Bacillus thuringiensis δ-endotoxinexpression intransgenic plants.Biol/Technol，10，540-543.]、光诱导[Sonnewald U，et al.(1992)Expression of mutant patatin protein intransgenic tobacco plant：Role of glycans and intracellar location.PlantCell，2，345-355.]、热激诱导[Schoffl F，et al.(1989)The function of plantheat shock promoter elements in the regulated expression of chimaericgene in transgenic tobacco.Mol Gen Genet，217(2-3)，246-253.]等等。

其中，种子特异性启动子，由于它只有在植物种子成熟过程中，大量表达其下游基因，而且所表达的外源蛋白大都集中在种子中，这样使其外源蛋白容易储藏，容易运输而备受关注。因此，种子特异性表达启动子的克隆和应用逐渐成为应用的焦点。

自从1985年Beachy等人开始研究大豆伴球蛋白基因时发现，β-伴球蛋白α-亚基基因启动子具有很强的时空调控功能，并在转基因植物中只有在种子成熟后期大量表达下游基因，而转基因植株的其他部位很少表达。随之而来的是许多作物中的种子特异性启动子相继克隆出来，主要包括：与淀粉合成有关的种子特异启动子，如SBE1启动子是淀粉分枝酶基因的启动子，可控制外源基因在水稻种子盾片中特异表达[Qu L Q，et al.Evaluation of tissue specificity and expressionstrength of rice seed component gene promoters in transgenic rice.Plant[J].Biotechnology Journal，2004，2(2)：113-125.]等等；与蛋白质合成有关的种子特异启动子，如与种子中贮藏蛋白质有关的，棉花α-球蛋白(globulin)B基因启动子[Sunilkumar G，et al.Cotton α-globulinpromoter：isolation and functional characterization in transgenic cotton，Arabidopsis，and tobacco[J].Transgenic Re2search，2002，11(4)：347-359.]、水稻谷蛋白1(glutelin-1)基因启动子和玉米素醇溶谷蛋白(Zeatin)启动子[Russell D A，et al.Tissue-specific expression intransgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice[J].Transgenic Research，1997，6(2)：157-168.]、葡萄中2S清蛋白(albumin)启动子[Zhijian T.et al Isolation by improved thermal asymmerricinterlaced PCR characterization of seed-specific 2S albumin gene and itspromoter from grape，Genome，2005，48：312-330.]、野生大豆中未知种子蛋白USP(unknown seed protein)启动子[Baumlein H，et al.A novelseed protein gene from Vicia faba is developmentally regulated intransgenic tobacco and Arabidopsis plants[J].Molecular and GeneralGenetics，1991，225(3)：459-467.]和油菜napinB蛋白启动子[Zhang YJ，et al.Identification of seed-specific promoter nap300 and itscomparison with 7S promoter[J].Progress in Natural Science，2002，12(10)：737-741.]等；与脂肪合成有关的种子特异启动子，Rossak等将FAE1启动子和gus基因连接导入拟南芥后，结果发现，gus基因在转基因拟南芥开花后4～5天的鱼雷型胚开始转录，在开花后9～11天达到转录高峰[Rossak M，et al.Expression of the FAE1 gene and FAE1promoter activity in developing seeds of Arabidopsis thaliana[J].PlantMolecular Biology，2001，46(6)：717-725.]。

上述种子特异性启动子大多数表现为种子特异性表达活性，即只有在受体植物种子或胚乳中特异性表达，而其他组织中几乎不表达或表达量很少。

至今，各类作物种子特异性启动子的研究与应用都已经取得了较大的进展；但是，直接从谷子中克隆或分离得到的种子特异性启动子在国内外还未见报道，在国内也未见公开使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种种子特异表达启动子，所述启动子来自于谷子基因组DNA，其能够在植物种子中特异表达；本发明的另一目的在于提供该启动子在改造植物种子中的应用，其能够驱动同、异源基因在种子中高效特异表达中。

本发明利用Tail-PCR从谷子基因组DNA中克隆得到的核苷酸序列，称之为pF128，长度为1053bp，为双链核酸类型，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。通过三大数据库的检索，未发现有相同或相似性较高的序列。生物信息学分析pF128序列，发现其具备真核启动子的基本元件和种子特异表达的相关顺式元件。

本发明构建了含有pF128驱动外源基因的植物表达载体。在一个优选的实施方式中，其表达盒是由pF128启动子和GUS(β-葡糖醛酸酶基因)报告基因及来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII)，所述的表达载体优选的是重组质粒pBIpF128。

本发明将上述含有所述pF128启动子序列的重组表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，获得外源基因在种子中高效驱动表达的基因工程化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞。

在一个优选的实施方式中，将含有所述pF128启动子序列驱动的表达载体转化拟南芥，获得了GUS基因在种子中高效驱动表达的转基因植物。

本发明所述的植物宿主细胞或宿主组织是植物种子细胞或植物种子本身，或它们的后代，蛋白质等组成成分或种子特性已经改变的植物种子细胞或植物种子本身。

本发明所述的植物组织中表达种子特异性启动子的方法，包括下述步骤：

(1)将含有本发明启动子的植物表达载体导入植物细胞；

(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

本发明中所述启动子的核苷酸序列还包括取代、缺失或插入一个或几个核苷酸所形成的具有相同功能的核苷酸序列。还可以是所述核苷酸序列与其他启动子融合序列。

本发明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其他活性物质功能，包括RNA或DNA序列，该序列与种子特异性启动子正常情况不相结合。此核酸序列包括不同于启动子植物种类的异源核酸序列，以及从相同于启动子植物种类得到的同源核酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种载体，如pBI121等。

本发明中所述的转化技术是指已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织及后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整株植株(包括种子)。

术语“核酸序列”指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷酸单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分被修饰或取代的序列。

术语“种子特异性启动子”是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的植物种子中优先表达。

本发明的谷子种子特异高效表达启动子，是国内首次克隆得到的谷子种子特异性启动子，将所述的启动子序列连接异源或同源基因后，转化到植物中可使异源或同源基因在植物种子中高效特异表达，避免了目的基因在其他部位持续表达所带的不利影响。本发明提供了一种利用所述核苷酸序列驱动目的基因在植物种子中高效特异表达的新方法，在植物的遗传改良和植物生物反应器研究方面具有重大的应用前景。

附图说明

图1：Tail-PCR克隆pF128片段电泳图，图中1为λ/HindIII+EcoRI标记物；2.为阴性对照3、4、5、6、7、8、9、10.分别是引物组合SP4+AD2，SP4+AD3，SP3+AD2，SP3+AD3，SP2+AD2，SP2+AD3，SP1+AD2和SP1+AD3克隆结果；

图2：pF128片段分离电泳图，图中1为λ/HindIII+EcoRI标记物；2为PCR分离pF128序列；

图3：由pF128驱动的植物表达载体构建过程；

图4：GUS组织化学分析，A：根；B：茎；C：叶；D：花；E：结实后10天的种子；F：结实后15天的种子；G：结实后20天的种子；H：基本成熟的种子；I：转化19Z启动子[梁华等，玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达，生物工程学报，1996，12(3)：295-300.]的转基因拟南芥种子；J：野生型拟南芥种子。

图5.1：转pBIpF128基因拟南芥不同组织GUS荧光定量分析，其中，128-R，转基因拟南芥的根；128-L，转基因拟南芥的叶；128-F，转基因拟南芥的花；128-10：结实后10天的种子；128-15：结实后15天的种子；128-20：结实后20天的种子；128-SM：基本成熟的种子。

图5.2：转化pBI121和pBIpF128转基因拟南芥GUS荧光定量比较分析，其中，1、结实后10天的种子；2、结实后15天的种子；3、结实后20天的种子；4、基本成熟的种子。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1.谷子种子特异性启动子序列pF128的克隆

谷子3661种子(中国农业科学院品种资源所)表面消毒后，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，24-28℃培养3-5天，使其长出幼嫩叶片后，收集2g鲜嫩幼苗，用CTAB改进方法提取总DNA，取2-3μlDNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测器纯度和浓度。

依据已知F128 cDNA序列[Xue J.et al，Cloning andCharacterization of seed-specific Expression f128 Gene in Setariaitalica.Journal of Agricultural Biotechnology，2004，12(5)：505-508.]，设计合成3个套式引物SP1-SP3，再根据Liu Yao-Guang等人的Tail-PCR方法，合成4条简并引物AD1-AD4，引物序列如下：

Sp1：5’-AATTAGGTCTTTGAGGCCATCG-3’

Sp2：5’-CCTTTTTTACCAGACCGCAGC-3’

Sp3：5’-GACACAATCGCCTCAATAGCCT-3’

AD1：5’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’

AD2：5’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’

AD3：5’-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3’

AD4：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’

用以上引物进行Tail-PCR反应，反应条件根据Liu Yao-Guang等人的Tail-PCR方法，并略做改进，Tail-PCR反应成分如下：

反应成分	第一步反应混合物用量	第二步反应混合物用量	第三步反应混合物用量
反应成分	第一步反应混合物用量	第二步反应混合物用量	第三步反应混合物用量	10X PCR buffer10mmol/L dNTPs10mmol/LAD1mmol/L SPddH₂OTaq(2.5u/μl)Template	2.5μl0.5μl4.0μl3.0μl13.5μl0.5μl1.0μl(0.5μg/μl)	2.5μl0.5μl4.0μl3.0μl13.5μl0.5μl1.0μl(以稀释100倍的第一步反应产物为模板)	2.5μl0.5μl3.0μl1.5μl15.0μl0.5μl1.0μl(以稀释50倍的第二步反应产物为模板)

以特异引物SP3分别与4个简并引物AD1，AD2，AD3和AD4配对进行PCR扩增，所得产物稀释100倍后取1μl作为模板，以特异引物SP2和相应的简并引物开始进行第二次PCR扩增；依理进行第三次PCR。Tail-PCR反应步骤如下：

反应次序	序号	反应条件	循环次数
反应次序	序号	反应条件	循环次数	第一步反应	123456	95℃ 2min， 97℃ 1min95℃ 15sec，65℃ 15sec，72℃ 30sec95℃ 15sec，25℃ 3min，ramping to 72℃Over 3min， 72℃ 2min95℃ 15sec，44℃ 15sec，72℃ 30sec95℃ 10sec，65℃ 15sec，72℃ 2min95℃ 10sec，65℃ 15sec，72℃ 2min95℃ 10sec，44℃ 15sec，72℃ 2min72℃ 10min	1513121
第二步反应	78	95℃ 10sec，61℃ 15sec，72℃ 2min95℃ 10sec，61℃ 15sec，72℃ 2min95℃ 10sec，48℃ 15sec，72℃ 2min72℃ 10min	151	第一步反应	123456		1513121
第二步反应	78		151	第三步反应	910	95℃ 10sec，65℃ 15sec，72℃ 1.5min95℃ 10sec，65℃ 15sec，72℃ 2min95℃ 10sec，48℃ 15sec，72℃ 2min72℃ 10min	151

PCR反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小和特异性，选取正确目的片段pS3A2，用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司原天为时代生物公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pMD18-T(Takara公司产品)中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，etal.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，p19-21]提取质粒，经限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆(电泳结果如图1所示)，命名重组质粒为pMDpS3A2。

实施例2.谷子种子特异性启动子序列pF128的分离

设计并合成如下两条引物，为以后分离和构建的需要，在两个引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII位点和限制性内切酶XbaI位点：

引物1：5’TGCTCTAGACCTCTCTTGGATGCTAACACA 3’

XbaI

引物2：5’CCAAGCTTTGTGGAGAAGCAGAGAGAAG 3’

HindIII

以质粒DNA pMDpS3A2为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

反应组分	加入量
反应组分	加入量	缓冲液(10X)(含20mmol/LMgCl₂)dNTP(10mmol/L)引物1(10μmol/L)引物2(10μmol/L)Taq(2.5u/μl)H2O模板质粒(0.2μg/μl)	2.5μl0.5μl0.5μl0.5μl0.5μl19.5μl0.5μl
总体积	25.0μl		2.5μl0.5μl0.5μl0.5μl0.5μl19.5μl0.5μl

扩增条件：95℃ 10min；95℃ 1min、58.5℃ 1min、72℃ 1min，共30个循环；72℃ 10min。电泳检测结果表明(附图2所示)，扩增得到1053bp的DNA片段。用DNA胶回收试剂盒(天根科技生化有限公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pMD18-T(Takara公司产品)中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取质粒，经限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆，命名重组质粒为pMDpF128。

实施例3.植物表达载体pBIpF128的构建

构建流程如图3所示，用碱裂解法提取pMDpF128质粒，经过HindIII和XbaI双酶切，得到pF128启动子片段，与经过同样酶切的植物表达载体pBI121的大片段相连，然后将连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒pBIpF128，经限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定，确证pBIpF128含有pF128启动子片段。

实施例4.pF128启动子序列/GUS报告基因表达载体转化拟南芥

利用冻融发将重组的植物表达载体pBIpF128转入根癌农杆菌GV3101，转化方法参照Hofen等[Hofen R，Willmitzer L，(1988)Storage of competent cells for Agrobacterium transformation.NucleicAcids Research，16，9877]。

拟南芥的转化参照Clough等[Clough SJ，Bent AF.(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.The Plant Journal，16(6)，735-743]的Floral dip方法进行。转化受体为拟南芥(Arabidopsis thaliana.)。将过夜培养的农杆菌GV3101[Van Larebeke N，Engler G，Holsters M，Van den ElsackerS，Zaenen I，Schilperoort RA，and Schell J(1974)Large plasmid inAgrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability.Nature(London)，252，169-170](含有pBIpF128)菌液，按照1∶100比例转接至YEB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值0.6-0.8；收集菌体后，用渗入缓冲液悬浮菌体，稀释到OD₆₀₀值0.6左右，把将要开花的花蕾浸泡在含有农杆菌细胞的渗入液里2分钟，22--26℃暗培养24小时。然后，将转化的植株开花结果后，收集种子。

实施例5.转基因拟南芥的筛选和检测

将收集到的种子，分别利用2.5％次氯酸钠溶液和70％乙醇进行表面消毒，种植在含有终浓度100μg/ml卡那霉素的MS培养基上进行筛选。在卡那霉素抗性培养基上能够正常生长的拟南芥幼苗移栽到花盆中，待其开花结果，收集种子。共筛选到58株能够在卡那霉素抗性培养基上正常生长的拟南芥幼苗，移栽花盆后成活54株，每个植株取一片叶，用SDS改进法提取植物总DNA，用分离pF128启动子所用的引物1、2进行PCR扩增，结果表明，54株拟南芥中，有48株表现为阳性，扩增出1053bp的pF128片段，并测序正确，而剩余部分未能扩增出此片段。

实施例6.转基因拟南芥GUS活性组织化学染色分析和荧光定量分析

GUS基因活性的组织化学染色分析方法依据Bradford等人[Bradford H M.A rapid and sensitive method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J].Anal Biochem.，1976，72：248-254.]。将收集转基因拟南芥的不同组织材料与含底物X-Gluc(X-Gluc染液组成：1.0mg/μlX-Gluc；50mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0；10mmol/L EDTA，pH 8.0；0.05mmol/L铁氰化钾；0.05mmol/L亚铁氰化钾；甲醇，终浓度20％；0.1％ Triton X-100.)的染色反应液于37℃保温过夜，进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用95％乙醇脱色后观察。结果发现，与对照株相比，转基因拟南芥的根、茎、叶、花均未有蓝色出现，仅有转基因拟南芥的不同时期的未成熟种子有蓝色出现，如图4。

GUS基因活性的荧光定量分析，根据Jefferson等人[Jefferson RA.(1987)Assaying chimeric genes in plants：The GUS gene fusionsystem.Plant Molecular Biology Repoerter，5(4)，387-405]，取转基因植物材料(根、叶、花、种子)300-500mg，放入1.5ml的离心管中，液氮条件下，研磨材料为粉末后，加入600μl提取缓冲液，冰上充分振荡混匀，离心12600rpm，4℃，15min，吸取上清，即为GUS酶粗提取液。吸取40μl GUS酶粗提取液与360μl GUS反应缓冲液(提取缓冲液中加入1mM的MUG)，充分混匀，37℃下进行反应，于反应开始后不同时期取样100μl，加入盛有900μl反应终止液(0.2mol/L NaCO₃)的离心管中终止反应，用荧光分光光度计在激发365nm、发射455nm、狭缝5nm条件下测定各样品的荧光值。结果发现，与对照株相比，转基因拟南芥的根、叶、花并未发现较高的GUS酶活性，而在不同时期的转基因植株的未成熟种子中却有较高的GUS酶活性，且随着种子逐渐成熟，GUS酶活性逐渐增高，如图5-1；而且和含有组成型启动子35S和玉米19KD醇溶蛋白基因启动子的转基因拟南芥的同时期未成熟种子相比，含有pF128启动子的转基因拟南芥的未成熟种子中表现出了较高的GUS酶活性，如图5-2。

由此可知，本发明所述的谷子种子特异性启动子确实具有种子特异性表达活性。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种种子特异性高效启动子及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1053

<212>DNA

<213>谷子(Setaria italica)

<400>1

tgtggagaag cagagagaag taacaatttg gtgggatcaa gtaaaaaaca ttgagaaatt 60

actatgatgc tcttttaatt atgtataaat ttatttttta agcaaaataa gaaaagaaag 120

taccagtacc actggtactt taaaaccatg gtaacaaagc tcctgttcct ggtggttcgc 180

tcccttaatg ctcgtacgtg tgccgaatat tgatggatca agacgaataa gattgacatt 240

tcgttcctac cttatgcact atgtccatcc ttcttgtata atgttcattt gcccgcgacg 300

agagatgtat ttagtctata ctactgttgt ctcggtatct cttggataag tttgtttgca 360

ttgcatgtat ctcgaatata ttaaccacct ctgttgctga tgtgatctat gttaacctct 420

attcctagct ttattatgtt ttgttttaaa aaatattgtt ttgcaaatat ttgaaaaaat 480

atctccaata aatgacaact aaataaatgc ttatgatagg tatactttca taatttttta 540

tagattttat gatattatat ccagtaagtg ctaataagac tgatggaaat tgtatccata 600

gaggccatcc gttgtcataa atgtgtagca ccaatcttga tacatgtcaa tatagtcagt 660

accaatttca aaataattat gcataataaa tttagatgtt tgtgaatata gaagtactat 720

tgctcacacg tgtgtatcta ctagtgttga ttgtgccact tgtctgtgta atggtatcat 780

gttttacacc tgtataacat gcaacactaa atttgacatg tgtctaacat gcaacactga 840

tatcaacact tgtccatata gcctgtcccc acatcaatcc ttaccatcaa ttctgtatcc 900

aatggctaac atacacaatc gcaaaatagg agcggacctt ccctcatgct tctatataaa 960

ccgggtacca ttctcagaaa actcacatca aaaccaacat agttcttgtg ttagcatcca 1020

agagaggcca aactacttgt agatctaata gcc 1053

Claims

1、一种种子特异性启动子，其特征在于，所述启动子具有SEQID No.1所示的核苷酸序列或该序列经过取代、缺失或插入一个或几个核苷酸所形成的具有相同功能的核苷酸序列。

2、含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3、含有权利要求2所述表达载体的植物宿主细胞或植物宿主组织。

4、按照权利要求3所述的植物宿主细胞或宿主组织，其特征在于所述植物宿主细胞是植物种子细胞所述植物宿主组织是植物种子本身。

5、一种制备转基因植物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

1)将权利要求2所述的表达载体导入植物细胞，

2)使步骤1)所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

6、权利要求1所述的启动子在制备转基因植物中的应用。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的植物为拟南芥。

8、权利要求1所述的启动子在生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品中的应用。

9、权利要求1所述的启动子在改造植物种子特性中的应用。