CN102732535B

CN102732535B - 组蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的应用

Info

Publication number: CN102732535B
Application number: CN 201110094089
Authority: CN
Inventors: 周道绣; 李甜甜
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: CN102732535A

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆得到一种能够提高白叶枯抗病能力的水稻组蛋白去甲基化酶OsSJ5基因在水稻抗病遗传改良中的应用。本发明利用农杆菌介导的转基因方法得到超表达OsJ5的转基因水稻，转基因植株在分孽期开始逐渐出现假病斑，在孕穗期接种白叶枯病发现转基因植株比对照野生型要抗病许多。检测转基因植株的组蛋白修饰情况发现，转基因植株的组蛋白H3K36三甲基化和H3K9三甲基化水平要明显低于野生型。表明本发明的组蛋白去甲基化酶基因OsJ5可以调控水稻组蛋白甲基化修饰并且提高水稻对白叶枯病的抗性。

Description

组蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的应用

技术领域

本发明属于水稻基因工程技术领域。与转基因水稻领域相关。具体涉及一个水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJ5的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与提高水稻抗性有关。

背景技术

真核基因的表达受细胞核内、外多层次的调节，呈现多级调控：包括遗传调控(genetic regulation)和表观遗传调控(epigenetic regulation)。表观遗传是指不直接受DNA序列控制的基因发生表达或功能的变化并可以遗传的现象，其实质在于染色质结构的动态变化对基因表达的影响，由于它不涉及基因序列的改变，不符合孟德尔遗传的遗传方式，是一种全新的遗传机制。常见的表观遗传现象包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、遗传印记、X染色体失活、RNA调控、转座元件等(Levenson JM and Sweatt JD.Epigenetic mechanisms in memory formation.Nat Rev Neurosci，2005，6：108-118)。

细胞对外界环境做出的每一个反应，都要调节某些基因的表达，这几乎都会涉及到染色质活性的变化，染色质活性的变化往往就是通过修饰组蛋白实现的。组蛋白氨基末端的修饰包括磷酸化、泛素化、甲基化/去甲基化、乙酰化/去乙酰化等，这些修饰产生的各种标记的组合就形成了所谓调节染色质结构和基因组表达的“组蛋白密码”(Jenuwein T and Allis CD.Translating the histone code.Science，2001，293：1074-1080)。其中组蛋白的甲基化修饰对植物的生长发育起着重要的作用。组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase，HDM)是近几年发现的一类组蛋白修饰酶(Klose et al.，JmjC-domain-containingproteins and histone demethylation.Nat Rev Genet.2006，7：715-727)可以去除被甲基化修饰的组蛋白尾部的甲基，与组蛋白甲基转移酶(HMT)的功能相反。含有Jumonji C(JmjC)结构域的基因是在人类中新发现的具有组蛋白去甲基化酶功能的一类基因，并且具有位点特异性(Klose et al.，Regulation ofhistone methylation by demethylimination and demethylation.Nature reviews.2007，8：307-318.)。随着研究的深入，越来越多的这类蛋白的成员被发现，功能也越来越丰富。植物中，对jumonji家族功能报道最早的是在2004年发表的调控拟南芥开花的EARLY FLOWERING 6(ELF6)和RELATIVE OF EARLYFLOWERING 6(REF6)(Noh et al.，Divergent Roles of a Pair of Homologous Jumonji/Zinc-Finger-ClassTranscription Factor Proteins in the Regulation of Arabidopsis Flowering Time.The Plant Cell.2004，16：2601-2613.)。水稻的一个基因JMJ706证实具有去除H3K9二甲基化和三甲基化的活性，其突变体呈现花形态的变异以及种子胚乳的异常，实验证明它可能通过调控花发育相关的基因MADS47和DH1的组蛋白修饰水平并促使其表达造成花发育的异常(Sun and Zhou.Rice jmjC domain-containing geneJMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organ development.PNAS.2008，36：13679-13684)。水稻基因组中有20个jumonji基因，除JMJ706外其它基因的功能都未知，这样我们就更有有理由相信，此类基因在水稻的表观遗传调控和生长发育中占据着重要的地位，相关发面的研究也具有一定的科研和应用价值。

发明内容

本发明的目的是克隆并鉴定一种新的水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJ5及其编码蛋白。通过转化水稻本身，培育一种能够提高水稻抗性的转基因水稻。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJ5，其核苷酸序列如SEQ NO：1中第123-3983所示。本发明的组蛋白去甲化酶基因OsJ5的编码基因(SEQ ID NO：1)来源于水稻，由4145个碱基组成，推测的蛋白质编码序列有3861个碱基，是序列1自5’端第123位碱基到3983位碱基组成。将该基因的完整编码序列(Coding sequence)构建到超表达载体PU1301(见图1)，获得转化载体pU1301-OsJ5后直接转入水稻，转基因植株在分孽期开始逐渐出现假病斑，在孕穗期接种白叶枯病发现转基因植株比对照野生型要抗病许多(见图3)。检测转基因植株的组蛋白修饰情况发现，转基因植株的组蛋白H3K36三甲基化和H3K93三甲基化水平要明显低于野生型(见图6)。表明本发明的组蛋白去甲基化酶基因OsJ5可以调控水稻组蛋白甲基化修饰并且提高水稻对白叶枯病的抗性。

具体操作步骤如下：

(1)从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)得到OsJ5基因(登录号AK068952)的核苷酸序列，根据该序列设计引物对，扩增特异的片段区域(其核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示，其中123-3983bp是编码区)，所述引物对的DNA序列如下：

OXJ5-F(正向引物)：5’---GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC---3’

OXJ5-R(反向引物)：5’---GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT------3’

(2)将(1)中扩增片段连接到pU1301(见图1)，获得转化载体PU1301-OsJ5。

(3)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y et.al.，Efficient transformation ofrice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ.1994，6：271-282)将所述的载体导入水稻受体中花11(来自中国农业科学院作物科学研究所)，获得转化植株；

(4)借助Northern Blot方法分析鉴定阳性转基因植株，并初步观察统计转基因植株表型；

(5)利用RT-PCR方法分析水稻内源OsJ5基因表达模式；

(6)利用realtime-PCR分析转基因植株中相关基因的表达；

(7)借助Western Blot分析转基因植株组蛋白修饰情况；

(8)转基因植株接种白叶枯菌株PX099，并进行抗性统计。

本发明优点如下：

本发明组蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的功能在国内外未见报道，对组蛋白去甲基化酶功能的研究和表观调控对水稻抗性的研究起着重要的意义。目前在水稻中还未有去组蛋白H3K36三甲基化酶基因的报道，本发明OsJ5可以去除组蛋白H3K36三甲基化的功能对组蛋白修饰酶基因分子功能的补充有重要的生物学意义。超表达OsJ5转基因植株可以提高水稻对白叶枯病的抗性，这对水稻抗白叶枯病的研究有重要的指导意义，可以在分子水平上揭示抗病机理。并可以为进一步的应用于农作物品种改良打下良好的基础，对保障中国粮食安全具有重要意义。

附图说明

序列表SEQ ID NO 1：是本发明克隆的水稻组蛋白去甲基化酶的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。序列全长为4145bp，其中123-3983bp区域是编码区。

图1：是本发明构建的超量表达载体PU1301示意图。

图2：是OsJ5基因在T1代超表达转基因植株中的表达量检测。中花11为阴性对照，图中：1-1，2-5，3-9，4-2为转基因阳性植株，2-2为转基因阴性植株；

图3：是OsJ5基因超表达转基因植株叶片的形态表型及转基因植株接种白叶枯菌株PXO99 15天后的表型。图3A为超表达转基因植株在自然条件下孕穗期时叶片的表型图；图3B为超表达转基因植株在孕穗期接种白叶枯菌株PXO99 15天后的叶片表型。中花11为阴性对照，图中：1-1，2-5，3-9，4-2为有表型植株的叶片，2-2为转基因无表型阴性植株的叶片。

图4：OsJ5基因的表达模式。图中是OsJ5基因在水稻愈伤、芽、根、茎、幼穗、剑叶、幼叶中的表达模式，actin为内参。

图5：OsJ5基因超表达转基因植株叶片中hAT和HSR201的表达情况。图5A为超表达转基因植株中hAT的相对表达水平；图5B为超表达转基因植株中HSR201的相对表达水平。中花11为对照材料，图中：1-1，2-5，4-2为OsJ5基因超表达转基因的T1代材料，actin为内参；

图6：OsJ5基因超表达转基因植株的组蛋白修饰。Western Blot实验用的一抗分别为H3抗体，三甲基化H3K9抗体，三甲基化H3K36抗体；所检测的蛋白分别为中花11和OsJ5基因超表达转基因T1代材料2-5的组蛋白。

图7：转基因植株接种白叶枯菌株PXO99病情统计。孕穗期采用剪叶法接种白叶枯病菌PXO99(菲律宾菌系生理小种)，每株接种5片完全伸展的叶子，接种后15天调查病斑长度，依据病斑面积(病斑长度/病叶长度)衡量病情。中花11为对照，1-22为OsJ5超表达转基因T1代材料，正体字标注的为分离出的转基因阳性植株，下划线标注的为转基因阴性植株；

具体实施方式

实施例1 OsJ5基因片段克隆

对本发明所需要的基因(登录号AK068952，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/32978976)，主要通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)进行扩增得到OsJ5特异的一段序列，具体步骤是：先抽提来自孕穗期植株叶片的RNA，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAseI2u，10x DNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；然后根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的OsJ5基因的全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mMMg²⁺1.5μl，OXJ5-F和OXJ5-R引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③60℃30秒，④72℃4分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。最后将扩增产物连接到T/A克隆载体pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上用T7和SP6引物测序验证。用来克隆OsJ5的全长片段的引物为：

OXJ5-F(正向引物)：5’---GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC---3’

OXJ5-R(反向引物)：5’---GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT---3’

最终得到的OsJ5基因的全长cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1中第123-3983位所示。

实施例2超表达载体PU1301-OsJ5的构建

具体步骤如下：

1)将带有OsJ5片段(如序列表SEQ ID NO：1中第123-3983位所示)的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒PU1301(见图1)连接，pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37：517-527)基础上改造的，是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠赠。内切酶KpnI和BamHI和连接所使用的T4连接酶均购自宝生物工程大连有限公司，用法及用量按照该公司提供的产品说明书；

2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)LA抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述的方法抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切和PCR检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达质粒载体将其命名为PU1301-OsJ5；

4)把步骤3)的超表达载体PU1301-OsJ5通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数按照本实施例步骤2)的方法进行)导入农杆菌EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。将转化后的菌株命名为T-OsJ5；

实施例3双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测：

具体步骤如下：

1)将T-OsJ5向水稻受体品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)进行。所获得的T0代转基因植株命名为OsJ5-n，其中n＝1，2，3…代表转基因的不同家系。

2)取T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用PCR方法对T0代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下：Hn-F 5’-agaagaagatgttggcgacct-3’，Hn-R 5’-gtcctgcgggtaaatagctg-3’(上海生工生物工程技术有限公司合成)。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0.4μl，TAQ酶0.2μl加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

3)为了检测转基因植株中目标基因的表达量，申请人采用Northern-blot的方法对转基因T1代植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；Northern转膜上样量为15-20μg，探针标记采用随机引物标记的方法，所使用的同位素标记物为a-32P-Dctp，膜在杂交管中先预杂交3个小时左右，然后加入同位素标记的探针，继续杂交12个小时；杂交结束后，用2×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)常温下将杂交膜漂洗10分钟，然后用同样的洗膜液在65℃漂洗，每次两分钟，直到信号值合适为止。洗完膜以后将膜置于干净的滤纸晾干，用保鲜膜包好，然后用磷屏(Phosphorimage，FUJI，日本)压片4-6小时最后用FUJIFILMFLA5100扫描读取结果。

在本实施例中，获得转基因植株的方法采用农杆菌介导的遗传转化方法(文献参见：Hiei et al.，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)报道的主要步骤，培养基以及使用的试剂主要参照华中农业大学授权专利(专利号ZL200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用；专利公开日：2008年6月18日；公开号：CN101200725；专利授权日：2010年04月21日)，本发明实施例的步骤与上述文献的不同之处在于：愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)方法。本发明该阶段的操作步骤是：

(1)用无菌水洗涤水稻愈伤组织至看不见农杆菌。

(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟。

(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水。

(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次潮霉素的浓度为400毫克/升，第二次及以后潮霉素的浓度为250毫克/升)。

最终本发明总共获得独立转基因水稻超表达材料T0代10株。

实施例4 T1代性状调查和表达分析：

1)将本发明T0代阳性植株(即OsJ5基因表达量上升的植株)收种子(T1代)种入大田进行表型鉴定。结果发现转基因阳性植株均有不同程度的表型，具体表现为叶片出现不同程度的假病斑(如图3所示)。

2)为了检测转基因植株中相关基因的表达量，我们用定量PCR方法对转基因植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自孕穗期植株的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAseI 2u，10x DNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mMdNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCRbuffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺ 1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃1分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。反转录的产物进行定量PCR，其反应的体系为25μl，其中含有1.5μl反转录产物、0.25M的左右引物(如下所列的hAT-F和hAT-R；HSR201-F和HSR201-R；Actin-F和Actin-R)和12.5μl的SYBR Green混合物(Applied Biosystems)。反应在7500real-time定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行，反应程序按照Applied Biosystems提供的操作手册进行，水稻actin基因(登录号AK060893.1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/32970911)作为反应中的内参。所有引物均在58℃退火，反应40个循环，每个样设置三个重复，以actin表达量进行平衡化处理。结果表明，本发明克隆的基因OsJ5能激活反转座子hAT(登录号AL606658，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/57834145)表达，也能引起程序性死亡(PCD)相关基因HSR201(登录号AK065433，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/32975451)表达量的增加(如图5所示)。

定量PCR所用的引物的核苷酸序列如下所示：

Realtime hAT-F：5’-AATGGTTGGCAAGGATCGC-3’，

Realtime hAT-R：5’-TCCTCGCGTAATTGCTGCAA-3’；

Realtime HSR201-F：5’-TTGTGGCGTGAAAAACCGTA-3’，

Realtime HSR201-R：5’-TTGGCGGACTAACAGTCGGTA-3’；

Realtime Actin-F 5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’，

Realtime Actin-R 5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’；

实施例5检测水稻内源基因OsJ5的表达模式

以水稻品种“中花11”为材料，分别于愈伤、芽、根、茎、幼穗、剑叶和幼叶取样。按实施例4中的方法提取总RNA后进行反转录，反转录的产物进行半定量PCR检测基因在植物各部位的表达水平。结果显示，OsJ5基因为组成型表达，但在幼穗和叶片中表达量较高(结果如图4所示)。

实施例6 OsJ5基因的蛋白功能检测

为了确定OsJ5蛋白在组蛋白修饰上的作用，申请人通过提取OsJ5转基因和野生型的组蛋白，利用组蛋白修饰类的商业化抗体(见后所述)做Western Blot实验(方法参照Huang et al.，Down-regulationof a Silent Information Regulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and celldeath in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)。具体操作为：分别取播种后40天左右的野生型和转基因的叶片4-5片，液氮研磨后放入3倍体积的组蛋白抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；2mMEDTA；0.25M HCl；5mM 2-mercaptoethanol；0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF))中充分混匀，经12000g，4℃离心10分钟后，吸取上清于另一新离心管，按体积加入三氯乙酸至终浓度为25％，17000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用丙酮洗涤三次，晾干后溶解于上样缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH 6.8；2％SDS；25％甘油(glycerol)；0.01％溴酚蓝(Bromophenol Blue)；10％β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)中，经浓度为15％的SDS-PAGE电泳可检测抽提效果，电泳采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN3电泳槽系统，按照其说明书进行操作。

将提取好的组蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统，按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，pH 7.5)对膜封闭两小时以上，然后以体积比1∶10000加入不同的抗体(如后所示)室温孵育两小时左右。所用抗体为：购自Abcam公司的抗H3K9三甲基化(货号：ab8898，上海菱碧健生物科技有限公司代理)抗体以及抗H3K36三甲基化(货号：ab9050，上海菱碧健生物科技有限公司代理)抗体和抗H3(货号：ab1791，上海菱碧健生物科技有限公司代理)抗体。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1∶10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司，得博生物科技有限公司(北京)代理)，室温孵育1-2小时，然后用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnalPico(购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。

实验结果显示OsJ5具有组蛋白去甲基化功能，是一个组蛋白去甲基化酶，主要作用于H3K9和H3K36三甲基化位点(如图6所示)。

实施例7 OsJ5转基因植株的抗性鉴定

为了研究OsJ5超表达转基因植株是否具有抗病能力，对转基因T1代植株接种白叶枯病菌PXO99(菲律宾菌系生理小种，来自国际水稻研究所)。接种白叶枯菌的培养和浓度调制参照Lin等(Lin et al.，Identification and mapping of a new gene for bacterial blight resistance in rice based on RFLPmakers.Phytopathology，1996，86：1156-1159)，活化的白叶枯病菌株在马铃薯培养基(组分及制备方法：300g去皮马铃薯切片煮沸，纱布过滤后加入0.5g Ca(NO3)2，2gNaH2PO4，15g蔗糖，5g蛋白胨，20g琼脂粉；加水至1L后调pH值至6.8-7.0)斜面28℃下培养2～3天，无菌水稀释至约9×109个/mL的浓度(比浊法)，孕穗期采用剪叶法(Sun et al.，A gene conferring resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae in rice，encodes an LRR receptor kinase-like protein.Plant J，2004，37：517-5272004)接种白叶枯病菌(菲律宾菌系生理小种，PXO99)，每株接种5片完全伸展的叶子，接种后15天调查病斑长度，依据病斑面积(病斑长度/病叶长度)衡量病情，调查数据进行T测验分析显著性(P＜0.05)。

实验结果显示(见图2和图7)本发明的OsJ5基因超表达转基因植株对白叶枯菌的抗性要比对照中花11(野生型)强，证明本发明克隆的OsJ5基因在提高水稻对白叶枯菌抗性上起了关键作用。

Claims

1.一种水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJ5的基因在调控水稻对白叶枯病菌抗性中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJ5的基因在调控水稻对白叶枯病菌抗性中的应用，其特征在于该基因的编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。