CN102725299A

CN102725299A - 光致发光纳米粒子及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102725299A
Application number: CN2011800065212A
Authority: CN
Inventors: 王远; 邵光胜; 韩荣成; 杨文�; 马严; 薛富民
Original assignee: Peking University
Current assignee: Beijing Nano Material Technology Co ltd
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2031-01-19
Also published as: CN102134253B; CN102725299B; CN102134253A; WO2011088744A1; US20130011864A1; EP2527346A4; EP2527346A1

Abstract

本发明公开了一类发光纳米粒子与其制备方法及应用。此类发光纳米粒子由含羧基高分子化合物基质材料和分散在所述基质材料中的稀土发光染料构成；本发明提供的制备发光纳米粒子方法，包括将稀土配合物发光染料和高分子化合物溶解于能与水混溶的有机溶剂中，将上述溶液加入水中，利用共沉淀-自组装过程形成所述发光纳米粒子。本发明提供的发光纳米粒子具有优异的长波激发发光性能、良好的稳定性以及可用于偶联生物分子的表面羧基。基于此类发光纳米粒子的生物探针,在高灵敏发光免疫分析以及生物成像等方面具有广阔应用前景。

Description

光致发光纳米粒子及其制备方法与应用技术领域

本发明涉及一类光致发光纳米粒子和一类可用于制备此类纳米粒子的稀土配合物发光染料与它们的制备方法及应用，特别是一类基于稀土配合物发光染料的发光纳米粒子及其制备方法与应用。

背景技术

稀土配合物发光探针在生物成像、 DNA 检测、免疫分析等领域中有着重要的应用。其主要优势在于稀土配合物具有较长的发光寿命，较大的 Stokes 位移，锐线发射峰等特点。这些特点使其在生化分析中可以通过时间分辨技术有效滤除背景信号干扰，实现高灵敏度的检测，同时避免了传统的放射性标记方法带来的生物安全问题。

由于稀土离子的 f_f 跃迁受跃迁选择定则的限制，稀土离子本身的光吸收能力很弱，要获得较大的光致发光效率，需要对其进行敏化，即通过配体（或电荷转移态）吸光，并使能量转移至稀土离子激发态以实现稀土离子的高效发光。许多稀土配合物能被紫外光激发，获得较好的发光强度。然而，紫外激发光对生物体造成的损伤较大，背景信号较强，同时紫外光穿透深度小，这使紫外激发发光探针的应用受到很多限制。因此，向长波方向扩展稀土配合物的激发窗口，研制具有优良可见光或近红外光激发发光能力的稀土配合物基发光探针成为重要发展方向之一。

具有优良可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物非常有限。近年来，我们设计、合成了铕配合物 Eu (tta) ₃dpbt (dpbt=2- (N，N-二乙基苯胺一 4一基）一 4， 6-二（3， 5-二甲基吡唑一 1一基）一 1， 3， 5-三嗪， tta 为噻吩甲酰三氟丙酮负离子） ( Y. Wang, et al.， Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 5010 ) 。并在此基础上设计、合成了一系列新型稀土配合物，它们均具有优良的可见光和近红外光激发发光性能（Y. Wang, et al. , Adv. Funct. Mater. 2007， 17， 3663；王远，郝锐，马严，具有可见光激发发光性能的铕配合物及其合成方法， ZL 2007 1 0118978. 8 ) 。若将此类稀土配合物作为发光探针应用于生物分析，将使得生物分析具有高灵敏度、高信噪比、穿透深度大、对生物体损伤与干扰小、分析成本低等优点。然而，绝大多数已知的具有可见与近红外光高效激发发光性能的稀土配合物为疏水性分子，且其在水溶液中的稳定性不高，因而难以在水溶液中直接使用这些配合物分子作为生物发光探针。

一个解决此类问题的可行方案是将稀土配合物包埋于聚合物树脂或无机纳米粒子中。西鹏等（西鹏、顾晓华、黄象安、何玉鲜，无机一有机核壳式稀土聚合物材料及其制备方法， CN1966534 ) 采用乳液聚合法以及溶胀包埋法将具有紫外光激发发光性能的疏水稀土配合物包埋于聚合物树脂中，制备了具有紫外光激发发光性能的纳米粒子；陈扬和袁景利等（陈扬，基于发光能量转移原理发光的稀土纳米粒子及制备方法， CN 1304523C; 袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳米稀土微粒及其制备和应用， CN1298807C) 分别采用微乳液法或溶胶凝胶法将亲水性的稀土配合物包埋于二氧化硅为基质的纳米粒子中，制备了具有紫外光激发发光性能的基于稀土配合物的纳米材料。但是以通常的疏水高分子为基质的纳米粒子在水溶液中易发生团聚，且其粒径较大，散射信号强。二氧化硅基质由于难以形成致密包裹层，也常常导致形成的纳米粒子中的发光染料的泄漏。最近袁景利等利用三个含硅氧烷基团的化合物（ APS-BHHCT-Eu³⁺-dpbt， 3- aminopropyl (triethoxyl) si lane, tetraethyl orthosi l icate ) 在反向微乳液中水解共缩合的方法合成了可被可见光激发发光的发光纳米粒子。（Jing Wu , Jingl i Yuan, Yaf eng Guan 等， Journal of Material s Chemi stry, 2009, 19， 1258-1264 ) 。此类纳米粒子表面含有胺基，可用于与生物分子偶联， Eu 发光配合物包裹于氧化硅为主的基质材料中。但是，此类纳米粒子对可见光具有很强的散射能力，其紫外-可见吸收光谱中 Eu配合物的吸收峰很小，且叠加于很强的散射带之上，表明其光致发光强度等性能不太理想。此外由于含有胺基，此类纳米粒子在中性及弱酸性条件下表面荷正电，荷正电的纳米粒子在生物分析中更易导致非特异性吸附。

理想的基于稀土配合物的发光纳米探针应具有以下特征： 1 ) 在水溶液中具有良好的分散性和稳定性； 2 ) 纳米粒子中的稀土配合物或其聚集体具有强的光致发光能力，特别是可见光及近红外光激发发光能力，纳米粒子发光强度大，对激发光和发射光散射能力较弱； 3 ) 纳米粒子表面具有可供偶联生物分子的活性基团，并具有较好的生物相容性和小的非特异吸附能力。

本发明发明人曾采用已见诸报道的稀土配合物基发光纳米粒子合成方法 (例如微乳聚合法、烷氧基硅烷水解包埋法等），对所设计、合成的 Eu (tta) ₃dpbt等具有优异可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物实施纳米包埋以合成新型稀土配合物基发光纳米粒子，但均难以获得令人满意的结果。其主要原因是此类具有优良可见光与近红外激发发光性能的稀土配合物的配体与稀土离子的配位作用较弱，通常的配合物包埋方法容易导致其发生配体解离或发光淬灭，失去原有的光学特性。

发明公开

本发明的目的本发明的目的是提供一类发光纳米粒子及其制备方法与应用。本发明提供的发光纳米粒子，包括基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物。

上述发光纳米粒子，也可只由所述基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物组成。其中，所述基质材料是由主链为碳氢链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子化合物；所述稀土配合物发光染料为在可见光和 /或近红外光和 /或紫外光激发下发射可见光或近红外光的稀土配合物。所述基质材料中，所述疏水基团选自烷基、苯基、酯基和醚基中的至少一种，但不限于上述基团；所述基质材料中，所述疏水基团选自烷基、苯基、酯基和醚基中的至少一种；所述基质材料选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯- 共聚物、丙烯酸 -丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物、苯乙烯- 马来酸酐共聚物、苯乙烯 -马来酸烷基酯-马来酸共聚物、苯乙烯-马来酸异丁基酯-马来酸共聚物、马来酸烷基酯-马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯 -甲基丙烯酸酯-丙烯酸共聚物中的至少一种，优选甲基丙烯酸 -甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物、苯乙烯 -马来酸烷基酯-马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯-马来酸异丁基酯-马来酸共聚物中的至少一种，更优选甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物和苯乙烯- 马来酸异丁基酯-马来酸共聚物中的至少一种；所述稀土配合物选自式 IV结构通式所示化合物、式 V结构通式所示化合物和式 VI 结构通式所示化合物中的至少一种；

所述式 IV、式 V和式 VI结构通式中， La代表铕、镱或钕离子；和均选自碳原子数为 1 至 4 的烷基中的任意一种基团， R₃ R₄ R₅ R₆ R₇和 R₈均选自甲基和 H 中的任意一种基团。式 IV 中的辅助配体为噻吩甲酰三氟丙酮负离子

(简称为 tta) ，式 V 中的辅助配体为 6 6 7 7 8 8 8-七氟 -2 2-二甲基辛烷- 3 5-二酮负离子（简称 fod) ，式 VI 中的辅助配体为萘基甲酰三氟丙酮负离子

(简称 nta)

所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为 1 10 000_: 1，具体可为 1- 2,000:1 1-500:1 1-100:1 1—50:1 1—5:1 1—1.5:1 5-2,000:1 5—500:1 5-100:1 5-50:1，优选 3 1000 1，更优选 3 100 1；所述高分子化合物 (也即基质材料）的数均分子量为 1 500 150 000，具体可为 1 500-100 000 1 900-100 000 5 000-100 000 5 000-65 000 8 000-65 000 8, 000- 10,000 10 000— 100 000 10 000— 65 000 20 000— 80 000，优选 5 000 100,000, 更优选 10 000 70 000；所述高分子化合物中，羧基基团占所述高分子化合物总质量的 0.01%〜40%，具体可为 0.3-30%、 0.8-25%、 0.8-15%、 0.8- 10%、 1-25% 1-15。/。、 1-10% 3-25% 3-15% 3-10% 3-5% 2-3% 2-5% 5- 25%, 优选 0.05-20%; 所述发光纳米粒子的粒径为 3〜200 纳米，具体为 3nm 粒径 <10nm、 5-190nm 10 - 60nm、 12 - 180nm、 12 - 100nm、 12-145nm 22 - 100nm、 30_180nm、 30_100nm、 35_145nm、 35_100nm、 40_180nm、 40_145nm、 40_100nm、 45-180nm, 优选 8-120 nm。

本发明提供的制备上述发光纳米粒子的方法，包括如下步骤：

1) 将所述稀土配合物和所述基质材料溶于能与水混溶的有机溶剂中，得到所述稀土配合物和所述基质材料的有机溶液；

2) 将所述步骤 1) 得到的有机溶液与水混匀；

3) 除去所述步骤 2) 所得混合物中的有机溶剂，离心分离后，将沉淀重新分散于水或缓冲溶液中，得到分散于水或缓冲溶液中的所述发光纳米粒子的溶胶。

该方法的步骤 1) 中，所述稀土配合物的浓度为 1x10— ⁴〜10 g/L，优选 0.01〜3g/L; 所述基质材料的浓度为 1x10— ⁴〜100 g/L，优选 0.01〜10g/L; 所述能与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种；

所述步骤 2) 中，所述水与所述步骤 1) 得到的有机溶液的体积比为 0.2〜 1000，优选 0.5〜100；具体可为 0.2-800、 0.2-200、 0.2-100、 0.5-200、 0.6- 200、 0.6-100、 0.6-50、 1-200、 1-100、 1-50 3-200、 3-100、 3-5、 3-4、 4- 200、 4-100、 4-5；

步骤 3) 中，所述除去所述步骤 2) 所得混合物中的有机溶剂的步骤中，温度为 4〜100°C，优选 4〜80°C; 所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、 Tris-HCl 缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。

上述制备发光纳米粒子的方法为共沉淀包裹法，即将稀土配合物、高分子化合物溶解于能与水混溶的有机溶剂，将其加入水中，形成包有稀土配合物发光染料的所述基质材料的纳米粒子。通过调变稀土配合物、高分子化合物的比例以及有机溶剂可以很方便地对发光纳米粒子中稀土配合物含量、颗粒尺寸等参数进行调控。而发光纳米粒子表面羧基的含量可以通过改变高分子化合物组成控制。

本发明还提供了一种胶体溶液，该溶液是将前述本发明提供的发光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中而形成的。

该胶体溶液中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、 Tris-HCl 缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。

本发明提供的上述发光纳米粒子及由上述发光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中形成的胶体溶液在制备纳米发光生物探针或生物成像发光标记物中的应用，也属于本发明的保护范围。

研制以可见光和近红外光激发高效发光稀土配合物发光染料（例如，式 IV、 V、 VI 所示的稀土配合物发光染料）为基础的，能在水溶液中稳定分散且表面含有易与生物分子键合的羧基的发光纳米粒子必须解决制备过程中所述稀土配合物易被破坏而失去其发光特性的问题。导致这一问题的主要原因是可见光和近红外光激发高效发光稀土配合物发光染料（例如，式 IV、 V、 VI所示的稀土配合物发光染料）的稀土离子与配体的配位作用较弱，许多含有胺基，羧基或硅羟基等基团的化合物（如乙酸，正丁胺，硅酸钠等）易与其反应，使配合物失去长波敏化发光的性能。本发明人发现接于含有疏水侧基的高分子化合物之碳氢链上的羧基与式 IV、 V、 VI等具有优异可见光和近红外光激发发光性能的稀土配合物作用很弱，将其混合溶液加入水中即可生成具有优异可见光和近红外双光子激发发光性能和分散稳定性优良的发光纳米粒子（王远等， Chem. Eur. J. 2010, 16， 8647-8651)。导致这一出乎意料的现象的原因是由于所述高分子化合物之疏水侧基和碳氢主链造成了较强的位阻效应，使接于此类高分子化合物上的羧基在实验条件下难以与上述稀土配合物作用使之分解而失去其光学特性。将所述高分子化合物与所述稀土配合物溶于能与水混溶的有机溶剂形成溶液，在搅拌下将此溶液加入水中时，不溶于水的高分子化合物和稀土配合物发生自组装，聚合物的强疏水部分和疏水稀土配合物倾向于远离水，而聚合物中部分羧基则倾向暴露于表面并电离为羧酸根，使纳米粒子表面荷负电。由于粒子尺寸较小且表面荷负电，因此本发明提供的发光纳米粒子在水和许多缓冲溶液中均具有很高的分散稳定性。由于所述稀土配合物分散于聚合物的强疏水部分构成的介质中，因此本发明提供的发光纳米粒子具有优异的长波光激发发光性能和耐光稳定性。

上述原理使得本发明纳米粒子的基质材料高分子化合物具有较宽的选择范围，对高分子化合物碳氢链上的疏水侧基进行简单的代换，并不超出本发明的保护范围。

本发明还提供了一类作为制备发光纳米粒子的原料的、具有优异光致发光性能的新型稀土配合物及其制备方法。

(式 I )

本发明提供的作为制备发光纳米粒子的原料的稀土配合物的结构通式如式 I 所示，所述式 I结构通式中，和均选自碳原子数为 1至 4的烷基中的任意一种基团，优选均为乙基。本发明提供的制备上述铕离子配合物的方法，包括如下步骤：将式 I I 结构通式所示化合离子配合物。

(式 I I ) (式 I I I ) 所述式 I I结构通式中，！^和均选自碳原子数为 1至 4的烷基中的任意一种基团。

该方法中，所述式 I I 结构通式所示化合物与式 I I I 结构通式所示化合物的摩尔比为 1 : 1；所述反应中，温度为 -10〜100°C，优选 20-30 °C ; 所述反应是在有机溶剂中进行的，所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、氯仿和二氯甲烷中的至少一种。

附图说明

图 1 为实施例 1 制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于 E_U (tta) ₃dpbt 的发光纳米粒子的粒径分布图（动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为 52〜66 nm, 平均粒径 58 nm)。

图 2为实施例 1制备的发光纳米粒子的透射电镜照片。

图 3为实施例 1制备的发光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。

图 4为实施例 1制备的发光纳米粒子的激发光谱（发射波长 λ_∞=614 nm) 。图 5为实施例 1制备的发光纳米粒子的发射光谱（激发波长 λ_εχ=412 nm) 。图 6为实施例 1制备的发光纳米粒子的光稳定性（激发波长 λ_εχ=412 nm, 发射波长 λ_∞=614 nm) 。

图 7 为实施例 2 制备的以苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物为基质材料，基于

E_U (tta) ₃dpbt配合物的发光纳米粒子的粒径分布图（动态光散射法测定，纳米粒子尺寸范围 85〜115 nm, 平均粒径 100 nm)。

图 8为实施例 2制备的发光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。

图 9 为实施例 2 制备的发光纳米粒子的发光激发光谱（发射波长 λ_∞=614 nm)

图 10为实施例 3制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于 E_U (nta) ₃bpt的发光纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。

图 11 为实施例 3 制备的发光纳米粒子的激发光谱（发射波长 λ_∞=620 nm) _c 图 12 为实施例 3 制备的发光纳米粒子的发射光谱（激发波长 λ_εχ=425 nm) _c 图 13 为实施例 3制备的发光纳米粒子的粒径分布（动态光散射法测定，纳米粒子粒径分布范围为 20〜26 nm，平均粒径 22 nm)。

图 14 为实施例 5 制备的发光纳米粒子的激发光谱（发射波长 λ_∞=614 nm) 。图 15 为实施例 11 制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于 Nd (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子的发射光谱（激发波长 λ_εχ=412 nm) 。

图 16 为实施例 12制备的以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于 Yb (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子的发射光谱（激发波长 λ_εχ=412 nm) 。

图 17 为实施例 13 制备的以丙烯酸 -丙烯酸甲酯共聚物为基质材料，基于 Eu (tta) ₃_3H₂0的发光纳米粒子的激发光谱（发射波长 λ_∞= 614 nm) 。

图 18为实施例 16中发光强度随检测物中人 IgG浓度变化图，发光生物探针为发光纳米粒子标记的羊抗人 IgG。

图 19为实施例 16中发光强度随检测物中人 IgG浓度变化图，发光生物探针为商购 FITC标记的羊抗人 IgG。

图 20为实施例 17中对宫颈癌细胞 Hela的发光成像图， A为明场成像图， B 为发光成像图（激发波长 λ_εχ = 405 nm) 。

图 21为实施例 18制备的 Eu (nta) ₃bpt甲苯溶液的紫外-可见吸收光谱。

图 22 为实施例 18 制备的 E_U (nta) ₃bpt 甲苯溶液的激发光谱（发射波长 λ ,=620 nm) 。

图 23 为实施例 18 制备的 E_U (nta) ₃bpt 甲苯溶液的发射光谱（激发波长 λ_6Χ=412 nm) 。

实施发明的最佳方式

为了更具体地说明本发明，现给出若干实施例，但本发明所涉及的内容并不仅仅局限于这些实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，实施例中所用试剂均可商购获得。

实施例 1、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Eu (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子的制备

取甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量为 50， 000，羧基基团质量分数： 1. 0 %) 和 Eu (tta) ₃dpbt (结构如式 VI I 所示）溶解于丙酮中，制成丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为 1 g/L， Eu (tta) ₃dpbt浓度为 0. 1 g /L 的丙酮溶液。在搅拌下，将 20 mL上述溶液滴加入 80 mL水中，继续搅拌 10 min, 得到混合物。将该混合物于 30 °C下蒸发除去丙酮，离心分离，离心转速为 25000 rpm ( 50000G ) ，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得所述表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶。

如图 1所示，动态光散射测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 58 nm, 粒径分布范围 52〜66 nm。发光纳米粒子透射电子显微镜照片如图 2 所示，此类发光纳米粒子呈球形，电镜照片中纳米粒子粒径分布和动态光散射测试结果相吻合。

图 3 为所制备的发光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，发光纳米粒子在可见区的吸收峰位于 412 nm, 发光纳米粒子对可见光的散射强度较弱。发光光谱测试结果表明，所制备的发光纳米粒子具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于 412 nm，尾部延展到 470 nm。发光纳米粒子的激发光谱 (λ_∞=614 nm)如图 4 所示，其发射光谱（λ_∞=412 nm)如图 5 所示。以 4- dicyanome thy lene-2-me thy 1-6-p-dime thy 1 amino styrl-4H-pyran (简禾尔 DCM) 的正丙醇溶液为参考物（荧光量子产率 Φ = 0. 57)，在波长为 410 nm激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 30 (本发明所有实例在计算量子产率时均未扣除吸收处的散射强度）。在波长为 830 nm 的近红外激光激发下，上述发光纳米粒子可发出明亮的红光，以染料 Rhodamine B为参考物测得其双光子激发作用截面为 40 GM ( 1 GM = 10— ⁵° cm⁴ s photo—¹ molecule—¹ ) 。上述结果表明包埋于所制备发光纳米粒子中的稀土配合物 E_U (tta) ₃dpbt 结构完整，保持了其优异的发光特性。所制备的发光纳米粒子在水溶液或磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 中具有优良的分散稳定性，放置 3个月没有观察到沉淀。如图 6所示，所制备的发光纳米粒子具有优异的光稳定性，经 412 nm光照射 1 小时后，其发光强度减弱程度小于 10 % 。 Zeta电位测试结果表明，分散于水中的所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 18 mV。

该实施例中，式 VI I 所示 Eu (tta) ₃dpbt化合物是按照 Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43， 5010-5013中所述方法制备的。

实施例 2、以苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物为基质的基于 E_U (tta) ₃dpbt 的发光纳米粒子的制备

按照与实施例 1 相同的方法，将实施例 1 中共聚物换为苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物（数均分子量为 100, 000，苯乙烯基团质量分数： 40 %，羧基基团质量分数： 25 %) ，使该共聚物的浓度为 10 g/L，离心转速改为 4000rpm，制备得到以苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物为基质的基于 E_U (tta) ₃dpbt 的发光纳米粒子。如图 7 所示，动态光散射测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 100 nm, 粒径分布范围为 85〜115 nm。图 8为所制备的发光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，发光纳米粒子在可见区吸收峰位于 415 nm, 纳米粒子对可见光的散射较弱。发光纳米粒子的激发光谱（λ_∞=614 nm) 如图 9 所示，激发峰位于 415 nm, 可见区激发窗口延展至 470 nm 以上，发光发射峰形与图 5 相似。在波长为 410 nm激发光照射下，以 DCM的正丙醇溶液为参比物，测得所制备的发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 31。 Zeta 电位测试结果表明，所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 28 mV。

实施例 3、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质的基于 E_U (nta) ₃bpt 的发光纳米粒子的制备

将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量： 5， 000，羧基基团质量分数： 10 %) 以及 Eu (nta) ₃bpt (结构如式 VI I I 所示，其制备方法见实施例 18 ) 溶解于甲醇中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为 0. 02 g/L， Eu (tta) ₃bpt浓度为 2x 10— ³ g/L的甲醇溶液。在搅拌条件下，将 25 mL上述溶液滴加入 75 mL水中，继续搅拌 10 min, 得到混合物。将该混合物于 4°C真空旋转蒸发除去甲醇，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶。

图 10为所制备的发光纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，发光纳米粒子在可见区吸收峰位于 425 nm, 纳米粒子对可见光的散射强度较弱。发光光谱测试结果表明，所制备的发光纳米粒子具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于 425 nm，尾部延展到 470 nm。发光纳米粒子的激发光谱 (λ_Μ=614 nm)如图 11所示，其发射光谱 (λ_∞=425 nm)如图 12所示。如图 13所示，动态光散射测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 22 nm, 粒径分布范围 20 ηπ！〜 26 nm。在波长为 410 nm激发光照射下，以 DCM的丙醇溶液为参考物测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 30。 Zeta 电位测试结果表明，所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 21 mV，经 415 nm光照射 0. 5小时后，其发光强度减弱 10%。

实施例 4、以苯乙烯 -马来酸共聚物为基质材料的基于 E_U (tta) ₃dpbt 的发光纳米粒子的制备

取苯乙烯-马来酸共聚物（数均分子量为 65， 000，羧基基团质量分数： 20 %) 和 E_U (tta) ₃dpbt 溶解于丙酮中，制成苯乙烯-马来酸共聚物浓度为 10 g/L， Eu (tta) ₃dpbt 浓度为 l g/L 的丙酮溶液。用撞击流混合法将 60 mL 上述溶液与 40 mL水混合，得到混合物。将该混合物于 50 °C下旋转蒸发除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得所述表面含羧基的发光纳米粒子的水溶胶。

透射电子显微镜测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 7 nm, 粒径分布范围 3〜10 nm。发光纳米粒子的激发光谱（λ_∞=614 nm)如图 14 所示，所制备的发光纳米粒子的可见区激发峰位于 408 nm，尾部延展到 460 nm, 纳米粒子的发射光谱发射峰形同图 5 所示。以 DCM 的正丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm 激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 15。所制备的发光纳米粒子在水溶液或磷酸盐缓冲溶液 (PBS)中具有优良的分散稳定性。 Zeta 电位测试结果表明，分散于水中的所制备发光纳米粒子的 zeta 电位为负 30 mV。

实施例 5、以苯乙烯-马来酸异丁基酯 -马来酸共聚物为基质材料的基于 Eu (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子的制备将苯乙烯 -马来酸异丁基酯-马来酸共聚物（数均分子量为 10， 000，羧基基团质量分数： 18 %) 和 Eu(tta)₃dpbt溶解于 50ml丙酮，向上述溶液中加入 5ml 水，制成苯乙烯 -马来酸异丁基酯-马来酸共聚物浓度为 10 g/L， Eu(tta)₃dpbt 浓度为 l g/L的混合物。于 10°C下旋转蒸发除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于纯水中，制得所述表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶。

透射电子显微镜测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 125 nm，粒径分布范围 100〜140 nm。发光纳米粒子的激发光谱（λ_∞=614 nm)峰形同图 14所示，纳米粒子的发射光谱发射峰形同图 5所示。以 DCM的正丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm 激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0.13。 Zeta电位测试结果表明，分散于水中的所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 26 mV。

实施例 6、以苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物为基质的基于 Eu(fod)₃dpbt 的发光纳米粒子的制备

按照与实施例 1 完全相同的方法，仅将共聚物和配合物替换为苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物（数均分子量为 50，000，羧基基团质量百分数为 2 %) 和 Eu(fod)₃dpbt (结构如式 IX所示）溶于丙酮中，配制成苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物浓度为 25g/L， Eu(fod)₃dpbt浓度为 0.5 g /L，得到以苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物为基质的基于 Eu(fod)₃dpbt的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 145 nm。在波长为 410 nm激发光照射下，以 DCM的丙醇溶液为参考物，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0.25。 Zeta电位测试结果表明，该发光纳米粒子的 zeta 电位为负 15 mV。

该实施例中，式 IX所示 Eu(fod)₃dpbt化合物是按照下述方法制备得到的：取 Eu(fod)₃化合物 0.05 mmol 溶解在 30 mL 的四氢呋喃中制得溶液 D，取 dpbt配体化合物 0.05 mmol溶解于 30 mL四氢呋喃中制得溶液 E，将溶液 D逐滴加入溶液 E 中。 25°C搅拌 1 h，减压蒸干溶剂，得结构如式 IX的橙黄色固体 72.7 mg。其中，配体混合物 dpbt 按照 Angew. Chem. Int. Ed. 2004， 43， 5010-5013中所述方法制备得到。

质谱（MALDI-TOF MS) 分析测得分子离子峰 M/Z =1454；元素分析（质量百分含量）： C， 43.66 % ( 43.78 %) ； H, 4.38 % ( 4.02 %) ； N, 7.43 % (7.71 %) ，括号中为理论值；核磁共振谱表征证明产物为式 IX所示配合物。

实施例 7、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物的混合物为基质的基于 E_U(nta)₃bpt的发光纳米粒子的制备

取 0.1 g 甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量为 50， 000，羧基的质量百分数为 3%) ， 0.05 g 苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物（数均分子量为 20,000, 羧基质量百分数为 5%) ， 0.1 g Eu (nta)₃bpt (结构如式 VIII 所示）溶于 10 ml丙酮，在搅拌和超声作用下将上述溶液加入 90 ml水中，按实施例 1 中所述步骤进行制备，得到以上述两种共聚物之混合物为基质的基于 Eu (nta)₃bpt的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 75 nm。发光光谱测试表明，其发光激发光谱和发射光谱分别与图 11和图 12相似，以 DCM 的丙醇溶液为参比，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0.30。发光纳米粒子经 415 讓光照射 1小时后，其发光强度减弱 10 % 。

实施例 8、以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Eu(fod)₃dpbt的发光纳米粒子的制备

将甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量为 3， 000，羧基基团质量百分数为 15 %) 和 Eu(fod)₃dpbt (结构如式 IX所示）溶解于乙腈中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物浓度为 1.0x10— ³ g/L， Eu(fod)₃dpbt 浓度为 2.0x10— ⁴ g /L 的乙腈溶液。在超声条件下，将 1 mL上述溶液滴加入 100 mL水中，继续超声 10 min, 得到混合物。将该混合物于 80°C处理除去乙腈，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶，其中发光纳米粒子即为以甲基丙烯酸 -甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Eu(fod)₃dpbt的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 12 nm。以 DCM 的丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm 激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0.27。 Zeta 电位测试结果表明，所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 20 mV。

、、、

、- "( i ? \. (式 IX) 实施例 9: 以苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于 E_U(nta)₃bpt 的发光纳米粒子的制备

将苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物（数均分子量为 50， 000，羧基基团质量百分数为 0.5 %) 和实施例 3制备的 Eu(nta)₃bpt (结构如式 VIII所示）溶解于四氢呋喃中，配制成苯乙烯-甲基丙烯酸嵌段共聚物浓度为 50 g/L， Eu(nta)₃bpt 浓度为 lg /L的四氢呋喃溶液。在超声条件下，将 10 mL上述溶液滴加入 50 mL 水中，继续超声 10 min, 得到混合物。将该混合物于 15°C旋转蒸发除去四氢呋喃，离心分离，将所得沉淀重新分散于 Tris-HCl (pH=8) 缓冲溶液中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶，其中发光纳米粒子即为以苯乙烯 -甲基丙烯酸嵌段共聚物为基质材料的基于 E_U(nta)₃bpt的发光纳米粒子。动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 180 nm。发光光谱表面，发光激发光谱和发射光谱峰形分别与图 11和图 12光谱峰形相似，以 DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 30。

实施例 10 : 以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Eu (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子的制备

甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量： 10， 000，羧基基团质量分数： 5 %) 以及 E_U (tta) ₃dpbt 溶解于二甲基甲酰胺中，配制成甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物浓度为 0. 2 g/L， Eu (tta) ₃dpbt浓度为 0. 02 g /L的二甲基甲酰胺溶液。在磁力搅拌条件下，将 10 mL上述溶液滴加入 10 mL水中，继续搅拌 15 min, 得到混合物。于 100 °C加热回流 40 分钟，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶，其中，发光纳米粒子即为以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 E_U (tta) ₃dpbt 的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 40 nm。发光光谱测试结果表明，其可见区的激发峰位于 412 nm, 以 DCM 的丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm 激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0. 31。

实施例 11 : 以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Nd (tta) ₃dpbt的发光

将实施例 10中的 (tta) ₃dpbt浓度为 1 x 10— ⁴ g /L，其他制备步骤与实施例 10 完全相同，得到以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Nd (tta) ₃dpbt的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 45 nm。其发光发射光谱如图 15所示，主发射峰位于近红外区，波长为 1064 nm, Zeta 电位测试结果表明，所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 24 mV。

该实施例中，化合物 Nd (tta) ₃dpbt (结构式如式 X所示）是按照下述方法制备得到的：

在搅拌条件下，将 1. 0 mmol 的 Nd (Ν0₃) ₃·6Η₂0 溶于 15 ml 乙醇，得到 •6H₂0的乙醇溶液，将该溶液逐滴加入到 15 ml 含 3. 0 mmol噻吩甲酰三氟丙酮的乙醇溶液中，室温搅拌，同时加入适量氨水，调节 pH至 7.0。在 80-85°C 下加热反应 3 h，冷却至室温。旋干乙醇，得到淡蓝色固体，用水反复洗涤此固体后，加入 10 ml苯，使固体溶解，用无水氯化钙干燥。滤除氯化钙，旋转蒸干溶剂，得到蓝色油状物，加入 10 ml石油醚，加热溶解，滤除不溶物后，旋干石油醚，真空干燥得到蓝色粉末状产物 Nd(tta)₃_2H₂0 。

取 Nd(tta)₃_2H₂0化合物 0.05 mmol溶解在 30 mL的四氢呋喃中制得溶液 B，取 dpbt配体化合物 0.05 mmol溶解于 30 mL四氢呋喃中制得溶液 C，将溶液 B 逐滴加入溶液 C 中。 25°C搅拌 1 h，减压蒸干溶剂，得橙黄色固体 Nd (tta)₃dpbt₀ 其中，所述 dpbt配体化合物是按照 Angew. Chem. Int. Ed. 2004， 43， 5010-5013中所述方法制备而得。

质谱（ESI-MS) 表征测得 [M+ Na]⁺ = 1247.3；元素分析（质量百分含量）： C, 46.18 % (46.11 %) ； H, 3.62 % (3.29 %) ； N, 8.99 % (9.15 %) ，括号中为理论值；核磁共振谱表征证明产物为 Nd (tta)₃dpbt配合物。

实施例 12: 以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Yb(tta)₃dpbt的发光纳米粒子的制备

将实施例 10中的 Eu(tta)₃dpbt换成 Yb(tta)₃dpbt，其他操作步骤同实施例 10，得到以甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 Yb(tta)₃dpbt 的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 35 nm。其可见区的激发峰位于 412 nm，发光发射光谱如图 16 所示，主发射峰位于近红外区，发射波长分别为 977 nm和 1024 nm。 Zeta 电位测试结果表明，所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 18 mV。

该实施例中，配合物 Yb(tta)₃dpbt 是按照实施例 11 中所述步骤，将 Ν(1(Ν0₃)₃·6Η₂0换为 ΥΜΝ0₃)₃·6Η₂0合成得到的，其结构如式 XI所示。

质谱（ESI-MS)表征测得 [Μ+ Na]⁺ = 1276.1; 元素分析（质量百分含量）：

C, 44.31 % (45.05 %) ； H, 3.38 % (3.22 %) ； N, 9.47 % (8.94 %) ，括号中为理论值；核磁共证上述方法所得产物为 Yb(tta)₃dpbt。

(式 XI)

实施例 13: 以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 E_U(tta 3H₂0 的发光纳米粒子的制备丙烯酸 -丙烯酸甲酯共聚物（数均分子量： 15， 000，羧基基团质量百分数为 5 %) 以及 Eu(tta)₃'3H₂0 (购于 ACR0S 公司）溶解于丙酮中，配制成丙烯酸-丙烯酸酯共聚物浓度为 5 g/L， Eu(tta)₃-3H₂0浓度为 5 g /L 的丙酮溶液。在磁力搅拌条件下，用微量注射器将 500微升上述溶液注射加入 100 mL水中，继续搅拌 10 min。将该溶胶于 40°C处理除去丙酮，离心分离，将所得沉淀重新分散于去离子水中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶，其中，所述发光纳米粒子即为以丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物为基质材料的基于 E_U(tta 3H₂0的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 30 nm。发光光谱测试结果表明，此溶胶中发光纳米粒子激发峰值位于 377 nm, 发射峰值位于 614 nm, 荧光量子产率为 0.35。图 17为该实验制备发光纳米粒子的激发光谱，此类发光纳米粒子具有良好的紫外光激发发光性能。

实施例 14: 以马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的共聚物为基质材料的基于 Eu(tta)₃bpt的发光纳米粒子的制备

将马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物（数均分子量： 8， 000，羧基基团质量分数： 0.5 %) 和 E_U(tta)₃bpt 溶解于乙腈中，配制成马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的共聚物浓度为 5 g/L， Eu(tta)₃bpt浓度为 0.01 g/L 的乙腈溶液。在超声条件下，用注射器将 1 mL 上述溶液注射加入 100 mL 水中，继续超声 10 min。于 80°C旋转蒸发除去乙腈，离心分离，将所得沉淀重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，制得表面含羧基的发光纳米粒子的溶胶，其中，所述发光纳米粒子即为以马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物为基质材料的基于 E_U(tta)₃bpt 的发光纳米粒子。

动态光散射测试结果表明，制备所得发光纳米粒子的平均粒径为 80 nm。发光光谱测试结果表明，上述制备的纳米粒子具有优良的可见光激发发光性能，其可见区的激发峰位于 425 nm。以 DCM的丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm激发光照射下，测得此发光纳米粒子的荧光量子产率为 0.24。

实施例 15、以苯乙烯-马来酸酐共聚物为基质材料的基于 Yb(tta)₃dpbt的发光纳米粒子的制备

将实施例 4 中苯乙烯-马来酸共聚物换为苯乙烯-马来酸酐共聚物（数均分子量为 1900，羧基基团质量分数： 12 %) ，把配合物 Eu(tta)₃dpbt 换为 Yb(tta)₃dpbt, 其它条件同实施例 4。

透射电子显微镜测试结果表明，所制备的发光纳米粒子的平均粒径为 26 nm, 粒径分布范围 16〜40 nm。发光纳米粒子的激发光谱（λ_∞=614 nm)峰形同图 14所示，纳米粒子的发射光谱发射峰形同图 16所示。 Zeta 电位测试结果表明，分散于水中的所制备发光纳米粒子的 zeta电位为负 22 mV。

实施例 16: 纳米发光生物探针（发光纳米粒子标记山羊抗人 IgG) 的合成及其效果验证以实施例 2所制备的发光纳米粒子为标记粒子标记山羊抗人 IgG，以固相夹层发光免疫分析法定量检测人 IgG。具体方法如下所述：

取实施例 2 所制备的发光纳米粒子溶胶 10 ml , 离心洗涤后分散于 10 ml PBS ( 10 mM) 中，加入 0. 2 ml浓度为 10 mg/ml 的山羊抗人 IgG溶液， 0. 2 ml 浓度为 100 mg/ml 的 N- (3-dimethylaminopropyl) -N' - ethylcarbodi imide ( EDO 溶液， 0. 1 ml 浓度为 100 mg/ml 的 N-hydroxysuccinimide ( NHS ) 溶液， 25°C 摇床温育 4. 0 h。离心洗涤三次，除去过量的山羊抗人 IgG、 EDC 和 NHS后将产物分散于含 1 mg/ml 牛血清蛋白（BSA)的 10 mM PBS中，即制得检测人 IgG的发光探针抗 IgG@LNP，放置于 4°C下保存待用。

将山羊抗人 IgG分散于 50 mM的 pH = 9. 16的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，使其浓度为 5 g/mL。将此溶液加入酶标板中，每孔加入量为 100 μΐ, 酶标板在 4°C保温过夜。倒出山羊抗人 IgG溶液后，用 10 mM PBS-Tween-20缓冲溶液（pH = 7. 4，含 0. 5% Tween-20 ) 清洗酶标板 3 次。之后，将 BSA ( 1. 0%) 的 10 mM PBS-Tween-20 缓冲溶液加入上述酶标板孔中，每孔加入量为 100 μΐ, 将此酶标板放在恒温混匀仪中于 25 °C保温 1. 0 h。倒出 BSA溶液，用 10mM PBS-Tween- 20 缓冲溶液清洗酶标板 3 次，在不同的孔中分别加入不同浓度的人 IgG标准溶液，并于 37 °C温育 1. 0 h.。倒出人 IgG溶液，用 10 mM PBS-Tween-20缓冲溶液清洗酶标板 3次。在样品孔中加入制备的发光探针抗 IgG@LNP，同时在对比孔中加入商购的 FITC标记的山羊抗人 IgG，并于 37 °C温育 1. 0 h。最后将过量的溶液倒出，并用 10 mM PBS-Tween-20缓冲溶液清洗酶标板 5次。

采用多功能酶标仪测量上述酶标板各孔发光强度，样品孔激发波长为 410 nm, 检测波长为 614 nm，实验结果如图 18 所示，对比孔激发波长为 485 nm，检测波长为 525 nm, 实验结果如图 19所示。实验结果表明，所合成纳米发光探针抗 IgG@LNP对人 IgG的发光免疫分析检测限为 10 ng/mL，而商购的 FITC标记的山羊抗人 IgG发光探针对人 IgG的发光免疫分析检测限为 500 ng/mL。

实施例 17: 纳米发光生物探针在宫颈癌细胞成像中的应用

在实施例 3所制备的发光纳米粒子表面偶联叶酸，使用所形成的生物探针与宫颈癌细胞 Hela作用，在发光显微镜下做 Hela细胞的发光成像。具体方法如下所述：

取实施例 3 所制备发光纳米粒子溶胶 10 ml , 离心分离，将沉淀分散于 10 ml PBS 缓冲液（10 mM) 中，向其中加入 0. 2 ml 浓度为 100 mg/ml 的 EDC溶液， 0. 1 ml 浓度为 100 mg/ml 的 NHS溶液， 25°C活化反应 1. 0 h，将反应物离心分离，沉淀用 10 ml PBS ( 10 mM) 溶液洗涤，重新分散于 10 ml PBS ( 10 mM) 中，加入 0. 1 ml浓度为 10 mg/ml的叶酸溶液，反应 4. 0 h。将产物离心，沉淀用 10 ml PBS ( 10 mM ) 溶液洗涤，除去过量的叶酸后将产物分散于含 1 mg/ml BSA 的 10 mM PBS 溶液中，即制得表面经叶酸修饰的纳米发光探针 FAiLNP, 于 4°C下保存待用。取对数生长期的 Hela细胞，用 0. 25%的胰蛋白酶消化后，以 3>< 10⁴个 /cm²的密度接种于共聚焦培养皿中。加入 0. 5 ml德氏改良基础培养基（DMEM培养基），在含有 5 % C0₂的培养箱中于 37°C培养 24 h，取出后用 10 mM PBS冲洗除去培养基，将发光探针 FA@LNP用 DMEM培养基稀释 10倍加入培养皿，常温温育 2 h。用 10 mM PBS冲洗三次，除去培养基和过量的发光纳米粒子，使用发光显微镜进行 Hela细胞成像（如图 20 ) ，明场成像图（图 20A) 表明细胞状态良好，探针分子未造成细胞死亡，说明发光探针 FA@LNP毒性较低。发光成像图如图 20B所示，激发波长为 405 nm。图 20B表明，发光探针 FA@LNP特异性修饰于 Hela细胞表面，并且 FA@LNP未发生明显聚集。

实施例 18、制备式¥111所述511 ^ 化合物

在氩气保护下， 100 mmol 二乙基苯胺与 50 mmol 三聚氯嗪在 80_90°C搅拌 8-9 h。将反应所得溶液冷却至室温，加入苯 30 ml , 过滤除去不溶物，再将所得溶液减压蒸除溶剂，用石油醚做洗脱液，通过硅胶柱分离，得到产物 2- (N，N- 二乙基苯胺 -4-基） -4， 6-二氯

(式 VI I I )

在氩气保护下，将新切的金属钾 1. 25 mmol 加入到无水四氢呋喃中；加入 1. 75 mmol 吡唑，加热回流 3h 产生吡唑负离子；将反应混合物置于冰浴中，向其中加入 2- 二乙基苯胺 -4-基） -4， 6-二氯 -1， 3， 5-三嗪 0. 5 mmol , 室温搅拌 lh，然后在 80-85°C的油浴中回流反应 8-9 h。反应液冷却后减压蒸除溶剂，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液做洗脱液，通过硅胶柱分离，所得粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合液重结晶，得到黄色针状晶体产物 2- ( /^二乙基苯胺一 4 一基）一4，6-二（吡唑一1一基）一1，3，5-三嗪（简称 bpt) 72 mg。

取 3mmol 4， 4， 4-三氟 -1- (2-萘酚） -1， 3-丁二酮（nta) 溶于 15ml 无水乙醇中，在搅拌下加入 3ml含 1 mmol氢氧化钠的水溶液，然后加入 5 ml含 1 mmol 六水合氯化铕的水溶液，再向反应液中加入约 100 ml 水，所得反应液加热到 60 ！搅拌反应 4 小时。将反应液冷却至室温，过滤，所得固体常温下真空抽空后溶于 50 ml 无水乙醇，热过滤，滤液中加入 100 ml水，所得沉淀冷冻，过滤所得固体真空干燥，再用适量的正己烷洗涤固体，收集固体于 50°C下真空干燥，得到 0. 85 g产品 Eu (nta) ₃ 0。

分别取 53. 7 mg上述配合物和 20 mg bpt溶于 10 ml 四氢呋喃中，将前者慢慢滴加入后者中，常温反应 2 小时，反应液减压旋干，加入少量无水乙醚后再加入适量的正己烷，待析出沉淀，收集固体，于 70°C下真空干燥，得到 58 mg 产品 Eu (nta)₃dpbt。

质谱（EI MS)表征测得分子离子峰 M/Z = 1182 ( M-naphen ) ⁺；元素分析 (质量百分含量）结果： C， 55.83 % (56.01 %) ； H, 3.53 % (3.39 %) ； N, 8.56 % (8.57 %) ，括号中为理论值；核磁共振谱证明产物是式 VIII 所示的化合物。图 21为所制备的 E_U(nta)₃bpt化合物甲苯溶液的紫外-可见吸收光谱，由图中可以看到，可见区吸收峰位于 412 nm, 相对 Eu(tta)₃dpbt化合物的吸收峰红移达 10 nm。 Eu (nta)₃bpt化合物甲苯溶液的激发光谱（λ_∞=620 nm)如图 22所示， E_U(nta)₃bpt具有优异的可见光激发发光性能，其可见区激发峰位于 412 nm, 尾部延展到 460 nm。其发射光谱（λ_∞=410 nm)如图 23所示， Eu (nta) ₃bpt化合物中 Eu离子的 ⁵D。→ ⁷F₂跃迁发射峰与 Eu(tta)₃dpbt化合物的不同，说明由于配体的改变， Eu 离子的配位环境发生了较大变化。以 DCM 的正丙醇溶液为参考物，在波长为 410 nm激发光照射下，测得 Eu(nta)₃bpt 化合物在 20 °C的荧光量子产率为 0.52，相对于 Eu(tta)₃dpbt化合物提高了 30%。

工业应用

本发明提供的发光纳米粒子，具有如下优点：

1、具有优异的发光性能。本发明的发光纳米粒子具有基于稀土配合物的发射峰窄、 Stocks 位移大、发光寿命长的优点。本发明发光纳米粒子在水溶液和缓冲溶液中对激发光和发射光散射能力弱，发光亮度高。当使用具有可见和近红外光激发发光性能的稀土配合物为发光染料时，在可见光和近红外光激发下具有很高的荧光量子产率，例如本发明实施例 1 至 3 中制备的基于 Eu(tta)₃dpbt、 Eu(fod)₃dpbt或者 Eu(nta)₃bpt的发光纳米粒子在可见光激发下的荧光量子产率高于 0.3 (计算时未扣除吸收处的散射强度），由于所制备纳米粒子可含有较高含量的发光稀土配合物，因此其具有很高的可见光激发发光亮度。本发明的一些稀土配合物基发光纳米粒子较溶解于有机溶剂中的同种稀土配合物具有更好的长波可见光激发发光性能，例如，与溶于甲苯中的 E_U(tta)₃dpbt 相比，本发明的基于 E_U(tta)₃dpbt 的发光纳米粒子的可见光区激发峰及激发窗口红边发生显著红移，其长波激发发光亮度（Φχε) 更高。本发明的一些发光纳米粒子同时具有优异的双光子激发发光性能，例如上述基于 Eu(tta)₃dpbt, Eu(fod)₃dpbt 或者 Eu(nta)₃bpt 的发光纳米粒子在近红外激光激发下，可发出明亮的红光，粒子中稀土配合物双光子激发作用截面达到 30 GM 以上（1 GM = 10— ⁵° cm⁴ s photo—¹ molecule—¹)。

2、稳定性好。在本发明提供的发光纳米粒子中，由于所用高分子化合物具有两亲性，稀土配合物发光染料分散于高分子基质材料的疏水环境中，避免了水分子以及水溶液中的其他成分与其作用。本发明提供的发光纳米粒子表面含有羧基，使其在水溶液及一些缓冲溶液中具有很好的分散稳定性，分散于水中的纳米粒子表面带负电，有利于减少生物分析中的非特异性吸附。本发明的发光纳米粒子同时具有很好的耐光、热稳定性。例如，实施例 1、 7 制备的发光纳米粒子在激发光 1小时照射的条件下，其发光强度下降幅度小于 10%。

3、本发明提供的制备方法简便、可控性强，解决了具有优良可见光和近红外光激发发光性能性能稀土配合物的纳米包埋问题，使其优异的发光性能在纳米粒子中得以基本保持或进一步提高。

发光纳米粒子表面的羧基可用于生物分子的键合以制备性能优异的纳米发光探针。本发明提供的发光纳米粒子的优异光致发光性能使其非常适用于合成灵敏度高、穿透深度大、对生物样品损伤小的纳米发光生物探针。各种抗原、抗体、酶、 DNA、 RNA, 如免疫球蛋白 IgG，甲胎蛋白 AFP等，均可采用本发明所提供的发光纳米粒子进行标记。标记后获得的纳米发光生物探针可以用于生物分析，例如高灵敏发光免疫分析，生物发光成像以及生物芯片等。

本发明提供的 E_U(nta)₃bpt等稀土配合物具有以下优点：此类配合物不仅具有高荧光量子产率（0.52，参比物为 DCM的正丙醇溶液， 20°C) ，而且其激发光谱激发峰位于 412 nm 处，尾部延展到 460 nm (浓度为 1.0X10— ⁵ M) ，而已报道的 Eu(tta)₃dpbt， Eu (nta) ₃dpbt等配合物 (0. S. Wolfbeis, et al. , Anal. Chem. 2006， 78， 5094-5101; Y. Wang, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2004， 43， 5010-5013) 的激发光谱激发峰位于 403 nm, 尾部延展至约 440 nm (浓度为 1.0X10 M) 。由此可见，本发明提供的 Eu(nta)₃bpt 等配合物具有更为突出的长波敏化铕离子发光性质。它们在生物传感、生化分析等方面具有重要应用价值。

Claims

权利要求

1、一种发光纳米粒子，包括基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物；

其中，所述基质材料是由主链为碳氢链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子化合物；所述稀土配合物发光染料为在可见光和 /或近红外光和 /或紫外光激发下发射可见光或近红外光的稀土配合物。
2、根据权利要求 1 所述的发光纳米粒子，其特征在于：所述发光纳米粒子由所述基质材料和分散在所述基质材料中的稀土配合物组成。
3、根据权利要求 1 或 2所述的发光纳米粒子，其特征在于：所述基质材料中，所述疏水基团选自烷基、苯基、酯基和醚基中的至少一种；所述基质材料选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸 -丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物、苯乙烯 -马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸烷基酯-马来酸共聚物、苯乙烯-马来酸异丁基酯-马来酸共聚物、马来酸烷基酯- 马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯 -甲基丙烯酸酯- 丙烯酸共聚物中的至少一种，优选甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物、苯乙烯 -马来酸烷基酯-马来酸共聚物、马来酸单丁酯与甲基乙烯基醚的聚合物和苯乙烯 -马来酸异丁基酯-马来酸共聚物中的至少一种，更优选甲基丙烯酸 -甲基丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯 -甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-马来酸共聚物和苯乙烯 -马来酸异丁基酯-马来酸共聚物中的至少一种；

所述稀土配合物选自式 IV结构通式所示化合物、式 V结构通式所示化合物和式 VI结构通式所示化合物中的至少一种；

所述式 IV、式 V和式 VI结构通式中， La代表铕、镱或钕离子；和均选自碳原子数为 1 至 4 的烷基中的任意一种基团， R₃、 R₄、 R₅、 R₆、 R₇和 R₈均选自甲基和 H中的任意一种基团。

4、根据权利要求 1-3 任一所述的发光纳米粒子，其特征在于：所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为 1〜10，000 _: 1，优选 3〜1000_: 1，更优选 3〜 100： 1；所述高分子化合物的数均分子量为 1， 500〜150， 000，优选 5，000〜 100, 000, 更优选 10，000〜70，000；所述高分子化合物中，羧基基团占所述高分子化合物总质量的 0. 01%〜40 %；所述发光纳米粒子的粒径为 3〜200 纳米，优选 8-120 nm。
5、一种制备权利要求 1-4任一所述发光纳米粒子的方法，包括如下步骤:

1 ) 将所述稀土配合物和所述基质材料溶于能与水混溶的有机溶剂中，得到所述稀土配合物和所述基质材料的有机溶液；

2 ) 将所述步骤 1 ) 得到的有机溶液与水混匀；

3 ) 除去所述步骤 2 ) 所得混合物中的有机溶剂，离心分离后，将沉淀重新分散于水或缓冲溶液中，得到分散于水或缓冲溶液中的权利要求 1-4中任一所述的发光纳米粒子的溶胶。

6、根据权利要求 5 所述的方法，其特征在于：所述步骤 1 ) 中，所述稀土配合物的浓度为 1 x 10— ⁴〜10 g/L，优选 0. 01〜3 g/L_; 所述基质材料的浓度为 1 x 10— ⁴〜100 g/L，优选 0. 01〜10 g/L; 所述能与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种；

所述步骤 2 ) 中，所述水的体积与所述步骤 1 ) 得到的有机溶液的体积比为 0. 2〜1000，优选 0. 5〜100；

所述步骤 3 ) 中，所述除去所述步骤 2 ) 所得混合物中的有机溶剂的步骤中，温度为 4〜100°C，优选 4〜80°C ; 所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、 Tris-HCl 缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
7、权利要求 1-4 任一所述发光纳米粒子在制备纳米发光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。
8、权利要求 1-4 任一所述发光纳米粒子分散于水或缓冲溶液中形成的胶体溶液。
9、根据权利要求 8 所述的胶体溶液，其特征在于：所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、 Tris-HCl缓冲溶液和碳酸盐缓冲溶液中的至少一种。
10、权利要求 8或 9任一所述胶体溶液在制备纳米发光生物探针或生物成像发光标记物中的应用。
11、式 I结构通式所示铕离子配合物，

所述式 I结构通式中，！^和均选自碳原子数为 1至 4的烷基中的任意一种

(式 I)
12、根据权利要求 11 所述的配合物，其特征在于：所述式 I 结构通式中，！^和均为乙基。
13、一种制备权利要求 11或 12所述铕离子配合物的方法，包括如下步骤：将式 Π 结构通式所示化合物与式 III 结构通式所示化合物反应，得到权利要求 11或 12所述铕离子配合物，

、Ν'·

/、Ν 、入 hT

(式 II) (式 III) 所述式 II结构通式中，！^和均选自碳原子数为 1至 4的烷基中的任意一种基团。
14、根据权利要求 13所述的方法，其特征在于：所述式 II结构通式所示化合物与式 ΠΙ 结构通式所示化合物的摩尔比为 1: 1；所述反应中，温度为 _10〜 100°C，优选 20-30°C; 所述反应是在有机溶剂中进行的，所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙醚、苯、甲苯、二甲苯、氯仿和二氯甲烷中的至少一种。