CN102724866B

CN102724866B - 组成型合成植物启动子以及使用方法

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Publication number: CN102724866B
Application number: CN201080060642.0A
Authority: CN
Inventors: J·D·希普斯金德
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2010-01-05
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2030-12-13
Also published as: EP2521439A4; CN102724866A; WO2011084370A1; CA2785845A1; US20120324600A1; EP2521439A1; AR081312A1

Abstract

在植物中（in planta）对转基因表达的控制取决于影响mRNA转录本的转录和翻译两者的基因元件。本发明描述了来自四种不同植物病毒的DNA元件的组合，这些元件在转基因植物中作为mRNA转录本的转录激活子和翻译增强子起作用。

Description

组成型合成植物启动子以及使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体地植物生物技术的领域。

背景技术

在农业生物技术中，可以根据人们的需要对植物进行修饰。实现这一点的一种方式是通过使用现代基因工程技术。例如，通过将感兴趣的基因引入到一种植物中，可以对该植物进行特异性修饰用来表达一种令人希望的表型性状。为此，最通常地用包含一个启动子区、一个编码区以及一个终止区的异源基因来转化这些植物。当对异源基因进行基因工程化用于在植物中进行表达时，启动子的选择通常是一个关键因素。虽然组成地表达某些基因可能是令人希望的（即在任何时候遍及该植物并且在大多数组织和器官中），其他基因仅应答于特定刺激是更令人希望表达的或限于特定细胞或组织中。

已经显示的是与其他启动子相比较某些启动子能够以更高的速率指导RNA合成。这些称为“强启动子”。已经显示某些其他启动子仅在特定类型的细胞或组织中以更高的水平指导RNA合成，并且通常称为“组织特异性启动子”或“组织优先型启动子（tissue-preferredpromoters）”，如果这些启动子优先地在某些组织中指导RNA合成（RNA合成可以在其他组织中以降低的水平发生）。因为引入到植物中的一个嵌合基因（或多个基因）的表达模式是使用启动子来控制的，在分离出能够控制一个嵌合基因（或多个基因）在特定组织类型中以某些水平或在特定的植物发育阶段表达的新型启动子方面存在持续的兴趣。

某些启动子能够横跨植物的所有组织以相对类似的水平指导RNA合成。这些称为“组成型启动子”或“组织依赖型”启动子。根据它们指导RNA合成的效力，可以将组成型启动子分成强、中等和弱类型。因为在许多情况下必需在植物的不同组织中同时表达一种嵌合基因（或多个基因）用以得到该基因（或多个基因）的希望的功能，组成型启动子在这方面是尤其有用的。虽然许多组成型启动子已经从植物和植物病毒中被发现并且被表征，在分离出能够控制一种嵌合基因（或多种基因）以不同水平表达和在同一转基因植物中的多基因表达（用于基因堆叠（gene stacking））的更加新型的组成型启动子（合成的或天然的）方面仍然存在持续的兴趣。

最常用的启动子是胭脂碱合酶（NOS）启动子（Ebert et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5745-5749(1987)）；章鱼碱合酶（OCS）启动子；花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒（CaMV）19S启动子（Lawton et al.Plant Mol.Biol.9:315-324(1987)）；来自核酮糖二磷酸羟化酶（rubisco）小亚基的光诱导型启动子（Pellegrineschi et al.Biochem.Soc.Trans.23(2):247-250(1995)）；Adh启动子（Walker et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624-66280(1987)）。蔗糖合酶启动子（Yang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:414-44148(1990)）；R基因复合体启动子（Chandler et al.Plant Cell 1:1175-1183(1989)）；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。

同源依赖性基因沉默（HDGS）和同源依赖性雄性不育（HDMS）是植物基因工程策略中关注的问题，且被认为是由同源转基因和启动子序列的多重拷贝引起的。转基因沉默可以在转录和转录后水平上发生（Venter,M(2007).Trends Plant Sci.12(3):1360-1385；Meyer,P andSaedler,H.(1996)Homology dependent gene silencing in plants.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47,23-48；Kooter,J.M.et al.(1999)Listening to the silent genes:transgene silencing,gene regulation,andpathogen control.Trends Plant Sci.4,340-345）。重复使用具有相同核心序列以及同源插入区的顺式作用元件（在一个功能结构域中）可能引起转录因子耗尽，因此降低了内源基因表达（Bhullar,S.et al.(2003)Strategies for development of functionally equivalent promoters withminimum sequence homology for transgene expression in plant:cis-elements in a novel DNA context versus domain swapping.PlantPhysiol.132,988-998）。因此，在用于能够表达不诱导HDGS或HDMS的异源序列的合成植物启动子的工业中存在当前的需要。在此披露的合成启动子的一部分能够在不诱导HDGS和HDMS的情况下起作用。另外地，在本行业中对于使用HDGS或HDMS作为在大田中选择杂合植物的手段存在需要。在此披露的合成启动子的一部分能够诱导HDGS和HDMS。

发明内容

本发明一方面是在植物细胞中起作用的一种合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的一种增强子或来自烟草花叶病毒的一种增强子，并且其中当该5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，或者当该5’末端是来自烟草花叶病毒的增强子时，该3’末端是来自玄参花叶病毒的增强子。在另一方面，该合成植物启动子具有一种任选的Kozak序列，该序列延伸超出该合成植物启动子的3’末端。在该合成植物启动子的另一方面，该来自玄参花叶病毒的增强子包含SEQ IDNO：1并且该来自烟草花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：2。在本发明的又另一方面中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：3。在又另一个方面，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：4。在本发明的另外又另一方面中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：5。在另一方面，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：6。在又另一方面中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：7。在另外又另一方面中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：8。在又另一方面中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：9。

本发明的另一方面是构建在植物中起作用的合成植物启动子的一种方法，包括以下步骤：（a）获得来自玄参花叶病毒的一种增强子和来自烟草花叶病毒的一种增强子，以及任选地选自下组的一种或多种核苷酸序列，其组成为：增强子、启动子、外显子、内含子、和其他调节序列；（b）可操作地连接该来自玄参花叶病毒的增强子、该一种或多种任选的核苷酸序列、以及该来自烟草花叶病毒的增强子，因此产生在植物中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子或来自烟草花叶病毒的增强子，并且其中当所述5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，或者当所述5’末端是来自烟草花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自玄参花叶病毒的增强子，并且其中该一种或多种任选的核苷酸序列定位在这些增强子之间。本发明的又另一方面，该来自玄参花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：1并且该来自烟草花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：2。在又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：3。在本发明的另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：4。在又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：5。在又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQID NO：6。在又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：7。在另外又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：8。在又另一方面中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：9。

本发明的又另一方面是在植物、植物细胞、或植物组织中表达异源基因的一种方法，包括（a）根据上面的方法构建一种表达盒，其中该表达盒在植物、植物细胞、或植物组织中起作用；以及（b）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中该异源基因被表达。在另一方面，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的核苷酸序列。在又另一方面，对除草剂耐受性性状进行编码的该核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的核苷酸序列。在又另一方面，该合成植物启动子被操纵用来优化表达。在又另一方面，该合成植物启动子被操纵用来降低表达。在另一方面，该合成植物启动子被操纵用来增加表达。在又另一方面，该植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分是一种单子叶植物。在又另一方面，该植物、植物细胞或植物组织，或者其一部分是玉米。在另外又另一方面，该植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分是一种双子叶植物。在又另一方面，该植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分是大豆。

本发明的另一方面是选择雄性不育植物的一种方法，包括：（a）构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，并且其中当该5’末端是SEQ ID NO：1时，该合成植物启动子的3’末端包含SEQ ID NO：2，或者当该5’末端是SEQ ID NO：2时，该合成植物启动子的3’末端是SEQ ID NO：1，并且其中该合成植物启动子在植物细胞中起作用；（b）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中该异源基因被过表达，并且其中这样的过表达诱导雄性不育；以及（c）选择雄性不育植物。在另一方面，该合成植物启动子是选自下组，其组成为：SEQ ID NO：4和6。在又另一方面，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的核苷酸序列。在又另一方面，对除草剂耐受性性状进行编码的核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的核苷酸序列。

本发明的又另一方面是选择杂合植物的一种方法，包括：（a）构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，并且其中当该5’末端是SEQ ID NO：1时，该合成植物启动子的3’末端包含SEQ ID NO：2，或者当该5’末端是SEQ ID NO：2时，该合成植物启动子的3’末端是SEQ ID NO：1，并且其中该合成植物启动子在植物细胞中起作用；（b）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中在纯合植物中该异源基因被过表达，并且其中这样的过表达诱导基因沉默；以及（c）选择杂合植物。在另一方面，该合成植物启动子是选自下组，其组成为：SEQ ID NO：4和6。在又另一方面，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的一种核苷酸序列。在另外又另一方面，对除草剂耐受性性状进行编码的该核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的核苷酸序列。

参考下面的说明和所附的权利要求可以更好地理解本发明的这些和其他的特征、方面和优势。

序列表中序列的简要说明

SEQ ID NO：1是玄参花叶病毒增强子eFMV-03的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是烟草花叶病毒增强子eTMV-02的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是合成植物启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是野生型夜香树病毒启动子（cestrum viruspromoter）的核苷酸序列。

定义

术语“开放阅读框”和“ORF”是指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指在编码序列中三个邻接核苷酸单元（“密码子”），它们分别限定蛋白合成（mRNA翻译）的起始和链终止。

术语“核酸”是指高分子量的多核苷酸，它可以是单链或双链的，由包含糖、磷酸盐和作为嘌呤亦或嘧啶的碱基的单体（核苷酸）所组成。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸（DNA）是遗传物质，而核糖核酸（RNA）涉及将DNA中包含的信息转移到蛋白质中。“基因组”是在生物体的每个细胞中包含的遗传物质的整体。术语“核苷酸序列”是指可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，任选地包含能够结合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另有说明，本发明的特定核酸序列也暗含地包括其保守修饰的变异体（例如简并密码子取代），和互补序列以及明确指示的序列。具体地，可以通过产生其中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个所选的（或全部）密码子的第三位置的序列来实现简并密码子取代（Batzer,et al.Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka,et al.J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);and Rossolini,et al.Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。术语核酸与基因、cDNA以及由基因编码的mRNA可互换地使用。

“可操作地连接”是指在一个单个核酸片段上核酸序列的结合，从而使得一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能够影响一个编码序列或功能性RNA的表达时，使该启动子与该编码序列或功能性RNA可操作地连接（即该编码序列或功能性RNA是在该启动子的转录控制之下）。在正义或反义方向上的编码序列可以可操作地连接到调节序列上。

“启动子”是指通过提供对于正确转录所要求的RNA聚合酶和其他因子的识别来控制编码序列表达的核苷酸序列。“启动子调节序列”由近端的和更远端的上游元件组成。启动子调节序列影响转录、RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译。这些调节序列包括增强子、非翻译前导序列、内含子、以及多腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。术语“启动子”的含义包括“启动子调节序列”。

“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并可以是启动子的固有元件或被插入用来增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。一级序列可以存在于双链DNA分子的任一条链上，并且甚至当置于离开启动子的上游亦或下游时也能够起作用。“转录增强子”起作用因为它增加了从DNA分子翻译的信使RNA（mRNA）转录本的数量。“翻译增强子”起作用因为它增加了从该mRNA分子翻译的蛋白的数量。

“基因”是指表达mRNA、功能性RNA、或特异性蛋白的核酸片段，包括调节序列。术语“天然基因”是指在自然中发现的基因。术语“嵌合基因”是指其任何基因，该基因包括1）DNA序列，包括未在自然中一起发现的调节序列和编码序列，或2）对非天然邻接的蛋白部分进行编码的序列，或3）非天然邻接的启动子部分。因此，嵌合基因可以包含从不同来源得到的调节序列和编码序列，或包含从相同来源得到的但以与自然发现不同的方式安排的调节序列和编码序列。“转基因”是指通过转化引入到基因组中并且稳定地维持的基因。转基因可以包括例如与有待转化的特定植物的基因异源或者同源的基因。另外，转基因可以包含插入生物体中的天然基因。转基因可以是嵌合基因。术语“内源基因”是指在生物体的基因组中在其天然位置中的天然基因。“外来”基因是指正常地在宿主生物体中未发现的，但通过基因转移引入到该生物体中的基因。

如在此使用的“表达盒”是指能够指导特定核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的DNA序列，包括可操作地连接到可操作地连接到终止信号上的感兴趣的核苷酸序列上的启动子。它还典型地包括核苷酸序列正确翻译所要求的序列。编码区通常对感兴趣的蛋白进行编码，但也可以对感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或未翻译的RNA。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，是指它的组分中至少一项相对于它的其他组分中的至少一项是异源的。

“内含子”是指DNA的插入部分，它几乎仅出现在真核基因内，但是在基因产物中它不被翻译成氨基酸顺序。通过称为剪接的过程从未成熟的mRNA中去除内含子（该过程留下外显子不受影响）从而形成一种mRNA。为了本发明的目的，术语“内含子”的定义包括对从靶基因得到的内含子的核苷酸序列进行修饰，其条件是该修饰的内含子不显著地减少其关联的5’调节序列的活性。

“外显子”是指携带针对蛋白或它的一部分的编码码序列的DNA的部分。通过插入的非编码序列（内含子）将外显子分开。为了本发明的目的，术语“外显子”的定义包括对从靶基因得到的外显子的核苷酸序列进行修饰，其条件是该修饰的外显子不显著地减少其关联的5’调节序列的活性。

基因的表达或过表达涉及基因的转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“反义抑制”是指生产能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录本。“过表达”是指在转基因生物体中生产超出在正常或非转化生物体中生产水平的基因产物。“共抑制”是指生产能够抑制相同或基本类似的外来或外源基因的表达或转录本积累的正义RNA转录本。该共抑制的机制可以是在DNA水平（如DNA甲基化）、在转录水平、或在转录后水平。

术语“组成型启动子”是指在所有或较多发育阶段在植物的所有或大多数组织中有活性的启动子。与分类为组成型的其他启动子一样，表达绝对水平的一些改变可以存在于不同组织或阶段中。

在此，术语“组成型启动子”或“组织依赖性的”可互换地使用。

当与核酸相联系使用时，术语“分离的”是指被鉴定并且与至少一种污染物核酸分开的核酸序列，在其天然来源中它通常与该污染物核酸相关联。分离的核酸以与它在自然界中发现所处的不同形式或设置存在。相反地，未分离的核酸，例如以这种状态发现的DNA和RNA，它们以自然形式存在。分离的核酸可以在转基因植物中并且仍然被认为是“分离的”。

在此术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”/“分离的核酸片段”可互换地使用。这些术语包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，该聚合物任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。处于DNA聚合物形式的多核苷酸可以包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、或其混合物的一种或多种区段。通过以下一个单字母指示来提及核苷酸（通常以它们的5’单磷酸盐形式发现）：“A”为腺苷酸或者脱氧腺苷酸（分别用于RNA或DNA），“C ”为胞苷酸或者脱氧胞苷酸，“G”为鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”为尿苷酸，“T”为脱氧胸苷酸，“R”为嘌呤类（A或G)，“Y”为嘧啶类（C或T)，“K”为G或T，“H”为A或C或T，“I”为肌苷，并且“N”为任何核苷酸。

“异源核酸片段”是指不与本发明的合成植物启动子序列一起天然出现的序列。当该核苷酸序列是与该启动子序列异源时，对于该植物宿主而言它可以是同源的、或天然的、或异源的、或外来的。

如在此使用的术语“基本上类似”是指这些核酸片段，其中在一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响该核酸片段调节基因表达或产生某一表型的能力。该术语也指本发明核酸片段的修饰，例如相对于初始未修饰片段不显著地改变所获得的核酸片段的功能特性的一个或多个核苷酸的缺失或插入。因此应当理解的是（如本领域普通技术人员所应当理解的）本发明包括多于这些具体示例的序列。

“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列并包括多聚腺苷化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多聚腺苷化信号通常特征为将多聚腺苷酸束（polyadenylicacid tracts）添加到mRNA前体的3’末端上。Ingelbrecht et al.Plant Cell1:671-680(1989)举例说明了不同3’非编码序列的用途。

“转化”是指将一种核酸片段转移到宿主生物的基因组中，导致基因稳定地遗传。含有这些转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。

“瞬时表达”是指常见报告基因例如β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）、荧光蛋白基因GFP、ZS-YELLOW1 N1、AM-CYAN1、DS-RED在其中通过转化方法暂时地引入转基因的宿主生物的选定的某些细胞类型中的临时表达。

在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，并在Sambrook,J.et al.In Molecular Cloning:A Laboratory Manual;2nded.;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.1989(下文“Sambrook et al.1989”)或Ausubel,F.M.Brent,R.Kingston,R.E.Moore,D.D.Seidman,J.G.Smith,J.A.and Struhl,K.Eds.;In Current Protocols in Molecular Biology;John Wiley and Sons:New York,1990(下文“Ausubel et al.1990”)中更全面地说明。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于合成大量特异性DNA片段的一种技术，由一系列重复循环组成（Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,Conn.）。典型地，将双链DNA加热变性，在低温下使与目标片段的3’边缘互补的两个引物退火，并且然后在中间温度下延伸。这三个连续步骤的一组构成一个循环。

具体实施方式

在此披露的合成植物启动子核苷酸序列和方法在调节任何异源核酸序列在宿主植物中表达方面是有用的，从而改变植物的表型。

表型的多种改变是令人感兴趣的包括但不限于改变植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御体系等。这些结果可以通过提供在植物中异源产物的表达或内源产物增加的表达来实现。可替代地，这些结果可以通过提供在植物中一种或多种内源产物，特别地酶或辅因子的降低表达来实现。这些改变导致转化植物表型的改变。

感兴趣的基因反映了涉及作物开发那些的商业市场以及兴趣。感兴趣的作物和市场改变，以及当发展中国家对国际市场开放时，也将出现新的作物和技术。此外，随着我们对农学特征和性状（如产量和杂种优势）的理解增加，因此选择用于转化的基因也将改变。转基因（也称为异源基因）的种类包括例如，但不限于，对重要的农学性状、昆虫耐受性、疾病耐受性、除草剂耐受性、不育性、颗粒或种子特征进行编码的基因，以及商业产品。通常地，感兴趣的基因包括涉及油、淀粉、碳水化合物或营养物代谢的那些以及影响种子大小、植物发育、植物生长调节、以及产量提高的那些。植物发育和生长调节也涉及植物不同部分（例如花、种子、根、叶和枝）的发育和生长调节。

其他商业上令人希望的性状是提供冷、热、盐、以及干旱耐受性的基因和蛋白。

疾病和/或昆虫耐受性基因可以编码针对具有较大产量阻碍作用害虫的耐受性，像例如炭疽病、大豆花叶病毒，大豆胞囊线虫、根结线虫、褐色叶斑病（brown leaf spot）、霜霉病、紫斑病（purple seed stain）、种子腐败（seed decay）、以及通常由真菌腐霉菌（Pythium sp.）、疫霉菌（Phytophthora sp.)、丝核菌（Rhizoctonia sp.）、间座壳菌（Diaporthesp.）引起的幼苗病，由细菌丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonassyringae pv.Glycinea）所引起的细菌性枯萎病。提供昆虫耐受性的基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（U.S.Pat.Nos.5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser et al(1986)Gene48:109)；外源凝集素类（lectins）（Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24:825）；植物性杀虫蛋白类（vegetative insecticidal proteins）（VIP3C,U.S.Pat.No.7,378,493）等。

除草剂耐受性性状可以包括对作用是抑制乙酰乳酸合酶（ALS）作用的除草剂（尤其是磺酰脲型除草剂）的耐受性进行编码的基因（例如含有导致这样耐受性的突变的乙酰乳酸合酶ALS基因，具体地是S4和/或HRA突变）。ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆（chlorosulfuron）的耐受性。草甘膦乙酰转移酶（GAT）是来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的一种N-乙酰转移酶，通过基因改组对它进行优化用于对广谱除草剂（草甘膦）进行乙酰化，这形成了在转基因植物中草甘膦耐受性新机制的基础（Castle et al.(2004)Science304,1151-1154）。其他除草剂耐受性性状，包括但不限于，EPSPS（U.S.Pat.No.6,248,076）、Bar（U.S.Pat.No.6,025,545）、和HPPD（U.S.Pat.No.7,312,379）对于本领域普通技术人员而言显然是可以使用的。

本发明包括用至少一种有利的转基因来转化受体细胞。可以使用截然不同的转基因编码载体亦或结合了两个或多个基因编码序列的一个单个载体在一个单个转化事件中提供两种或多种转基因。根据需要可以使用任何说明的任何两种或多种转基因，例如提供除草剂、昆虫、疾病（病毒、细菌、真菌和线虫）或干旱耐受性，油的数量和质量的那些，或增加产量或营养品质的那些。

可以对本发明的合成植物启动子序列进行修饰用来提供该异源核苷酸序列一定范围的组成型表达水平。因此，可以利用少于整个合成植物启动子区域，并且保持驱动该编码序列表达的能力。然而，应当认识到可以通过缺失这些合成植物启动子序列的部分来降低该mRNA的表达水平。因此，如本说明书举例说明的，与SEQ ID NO：3具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性的SEQ IDNO：3片段仍然可以起作用。

本发明包含的还有本发明合成植物启动子的功能等效物，即在严格条件下杂交到SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：9中的任何一个上的核苷酸序列。严格杂交是在65°C，优选地60°C，并最优选55°C的温度下在包含0.1%SDS的两倍浓度（2X）的柠檬酸盐缓冲盐水（SSC）中完成的，紧接着在相同温度下但是用具有降低的SSC浓度的缓冲液冲洗载体（support）。这类降低浓度的缓冲液典型地是包含0.1%SDS的十分之一浓度的SSC（0.1X SSC），优选包含0.1%SSC的0.2X SSC，并且最优选包含0.1%SDS的一半浓度的SSC（0.5XSSC）。

实施例

实施例1.将病毒增强子元件与植物组分结合用来产生合成植物启动子

为了在稳定转化的大豆中表达合成燕麦（Avena sativa）4-羟苯丙酮酸二氧酶（cAvHPPD），通过PCR或直接DNA合成来产生病毒转录和翻译的增强子以及最小启动子，并且通过标准DNA限制性消化（restriction digestion）和连接反应来结合。将包含限定组分eFMV（SEQID NO：1）、eTMV（SEQ ID NO：2）、花椰菜花叶病毒35S增强子区（e35S）以及最小启动子（pr35SCMP：夜香树黄曲叶病毒（CestrumYellow Leaf Curl virus）TATA盒基序；无CAAT 35S近端启动子序列）的合成植物启动子结合用来产生SEQ ID NO：3。随后，通过用DNA限制酶XhoI消化来对SEQ ID NO：3进行修饰用来去除限定组分e35S、pr35SCMP（包括该TATA盒基序），紧接着通过标准连接反应用来产生SEQ ID NO：4。通过将从拟南芥泛素启动子获得的第一个内含子（iUBQ3）（以一个Bgl II（5-初始末端（prime end））和BamHI（3-初始末端）DNA片段形式）连接到BamHI位点上再次对SEQ ID NO：3进行修饰，用来产生SEQ ID NO：5。最后，通过将拟南芥组成型启动子（prAC26）的一个1092个碱基对的DNA片段（以一个Bgl II（5-初始末端）和BamHI（3-初始末端）的形式）连接到BamHI位点上来对SEQ ID NO：3进行修饰，用来产生SEQ ID NO：6。随后将包括包含SEQ ID：3、SEQ ID：4、SEQ ID：5或SEQ ID：6的单个合成植物启动子、cAvHPPD编码区和NOS终止子（tNOS）的完成的基因盒连接到包含用于大豆转化实验适当的选择性标记的二元载体上。表1指示在上面所述合成植物启动子的子元件的安排。本领域普通技术人员可以容易地识别可以适合使用的其他子元件。

表1.在用于大豆的合成植物启动子中子元件的5’至3’安排。

使用根癌土壤杆菌将包括合成植物启动子表达盒的质粒转化到大豆中。对T0事件（event）进行培养并且通过使用硝草酮（mesotrione）喷雾针对cAvHPPD表达进行选择。通过测定针对接合性对存活T0植物的叶子样品进行测试。通过ELISA对存活T0植物的cAvHPPD的表达进行定量（Engvall E,Perlman P(1971)."Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Quantitative assay ofimmunoglobulin G".Immunochemistry 8(9):871–874)。

实施例2.转基因大豆事件的表征

针对分离分析、燕麦HPPD蛋白表达以及对硝草酮除草剂喷雾的耐受性对含有SEQ ID：3、SEQ ID：4、SEQ ID：5、SEQ ID：6或SEQID：7的第一代转基因大豆事件（T1）进行表征。对来自五个独立事件的第一三叶的绿叶组织进行取样用来确定单个幼苗的分离率（纯合的、杂合的或无效的）（如通过接合性测定来确定的）以及燕麦HPPD蛋白表达（通过ELISA）。在V2阶段，用抑制HPPD的除草剂硝草酮喷洒幼苗并且在应用后大约10天对耐受性等级进行确定。来自含有SEQ ID NO：3的转基因大豆事件分析的结果显示与杂合的（HET）同胞物相比较，对纯合子（HOM）的初期损伤显著。这些数据与ELISA数据（显示对于每个独立事件，与HET同胞物相比较，在HOM幼苗中燕麦HPPD蛋白表达的水平较低（<20ng/mg总蛋白））一致（表2）。总之，这些结果表明转基因沉默，由此在HOM同胞物中转基因的过表达激活了小RNA介导的甲基化作用，这导致该转基因非常低的表达（Martienssen RA,Colot V(2001).DNA Methylation and EpigeneticInheritance in Plants and Filamentous Fungi.Science293(5532):1070-1074）。含有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的T1代大豆事件的分析显示燕麦HPPD蛋白更一致的表达（与在HOM同胞物中所预期的一样）（对应地，表3、表4）。这些数据揭示SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5调节燕麦HPPD表达至这样的程度从而减轻转基因沉默的结果，并且提高了对HPPD抑制剂除草剂硝草酮的耐受性。然而，作为举例在SEQ ID NO：6和7中的修饰未减轻在HOM植物中的转基因沉默（表5和6）。

表2.SEQ ID NO：3

表3.SEQ ID NO：4

表4.SEQ ID NO：5

表5.SEQ ID NO：6

表6.SEQ ID NO：7

实施例3.转基因玉米事件的表征

执行用于构建用于玉米中的合成植物启动子的类似策略。除了在下面表7中说明的启动子之外，SEQ ID NO：3还成功地用于促进玉米中异源序列的表达。

表7.用于玉米的合成植物启动子中子元件的5’至3’安排。

¹对于SEQ ID NO：8和9而言，Kozak序列定位在eTMV子元件的3’末端和该异源基因起始密码子之间。

通过基因技术（Gene Art）将SEQ ID NO：8合成为SanDI/BamHI片段，然后直接地连接到含有EPSPS基因（cZmEPSPSct-01）的克隆载体中，从而给予草甘膦耐受性（Terada,et al.(1995)A type I elementcomposed of the hexamer(ACGTCA)and octamer(CGCGGATC)motifs plays a role(s)in meristematic expression of a wheat histone H3gene in transgenic rice plants.Plant Molecular Biology 27:17–26）。通过将xZmH3Cis DNA元件连接到prCMP启动子上（成为一个NheI片段）从而使这些元件是5’至TATA-BOX的，来产生SEQ ID NO：9（Brignon,et al.(1993)Nuclease sensitivity and functional analysis of amaize histone H3 gene promoter.Plant Molecular Biology 22:1007–1015）。

这些数据表明SEQ ID NO：8和9是与未修饰的夜香树病毒启动子（SEQ ID NO：10）同样有效地促进可操作地连接的异源序列的表达。就损伤百分比而言，对于草甘膦植物毒性参见表9。在V4阶段和V8阶段用适当数量的草甘膦（即4x）对植物进行喷雾。在V4阶段的草甘膦喷雾之后7和14天，以及在V8阶段的草甘膦喷雾之后7和14天对损伤百分比进行测量。

表9.草甘膦植物毒性（损伤百分比）

从这些结果可以清楚的是以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的形式体现的合成植物启动子平均而言至少与未修饰的夜香树病毒启动子同样好地起作用。另外，SEQ ID NO：8和9没有显示HDGS和HDMS的证据。如果存在沉默，这些植物将不会与未修饰的prCMP一样对草甘膦具有耐受性。其次，玉米组蛋白H3和H4基因分别组织到40-50和50-60个拷贝的多基因家族中。可以通过使用重复启动子（repetitivepromoter）或顺式作用元件来诱导HDGS。然而，因为玉米已经具有40-50个拷贝的内源组蛋白启动子顺式作用元件，用小麦亦或玉米H3元件来诱导HDGS的可能性不大（Chaubet et al.(1987)Histone genes inhigher plants:organization and expression.Developmental Genetics 8:461–473）。

鉴于在此提供的结果，本发明的一个实施方案是在植物细胞中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的一种增强子或来自烟草花叶病毒的一种增强子，并且其中当该5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，或者当该5’末端是来自烟草花叶病毒的增强子时，该3’末端是来自玄参花叶病毒的增强子。在另一个实施方案中，该合成植物启动子具有一种任选的Kozak序列，该序列延伸超过该合成启动子的3’末端。在本发明的另一个实施方案中，该来自玄参花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：1并且该来自烟草花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：2。在本发明的又另一个实施方案中，该合成植物启动子包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、或9中的任一个。

本发明的一个实施方案是构建在植物中起作用的合成植物启动子的一种方法，包括以下步骤：（a）获得来自玄参花叶病毒的一种增强子和来自烟草花叶病毒的一种增强子，以及任选地选自下组的一种或多种核苷酸序列，其组成为：增强子、启动子、外显子、内含子、和其他调节序列；以及（b）可操作地连接该来自玄参花叶病毒的增强子、该一种或多种任选的核苷酸序列、以及该来自烟草花叶病毒的增强子，因此产生了在植物中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子或来自烟草花叶病毒的增强子，并且其中当所述5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，或者当所述5’末端是来自烟草花叶病毒的增强子时，该启动子的3’末端是来自玄参花叶病毒的增强子，并且其中该一种或多种任选的核苷酸序列定位在这些增强子之间。本发明的另一个实施方案提供了上面的方法，其中该来自玄参花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：1并且该来自烟草花叶病毒的增强子包含SEQ ID NO：2。在又另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ IDNO：3。在又另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：4。在另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：5。在又另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：6。在又另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：7。在另外又另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：8。在另一个实施方案中，步骤（b）的产物包含SEQ ID NO：9。

本发明的一个实施方案是在植物、植物细胞、或植物组织中表达外源基因的一种方法，包括：（a）根据构建在植物中起作用的合成植物启动子的方法来构建合成植物启动子，包括以下步骤：（i）获得来自玄参花叶病毒的一种增强子和来自烟草花叶病毒的一种增强子，以及任选地一种或多种选自下组的核苷酸序列，其组成为：增强子、启动子、外显子、内含子、和其他调节序列；以及（ii）可操作地连接该来自玄参花叶病毒的增强子、该一种或多种任选的核苷酸序列、以及该来自烟草花叶病毒的增强子，因此产生了在植物中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子或来自烟草花叶病毒的增强子，并且其中当所述5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子时，该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，或者当所述5’末端是来自烟草花叶病毒的增强子时，该启动子的3’末端是来自玄参花叶病毒的增强子，并且其中该一种或多种任选的核苷酸序列定位在这些增强子之间；（b）可操作地将该合成植物启动子连接到该异源基因上，由此产生一种表达盒，其中该表达盒在植物、植物细胞、或植物组织中起作用；以及（c）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中该异源基因被表达。在另一个实施方案中，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的一种核苷酸序列。在又另一个实施方案中，对除草剂耐受性性状进行编码的该核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的核苷酸序列。在又另一个实施方案中，该合成植物启动子被操纵用来优化表达。在另一个实施方案中，该合成植物启动子被操纵用来降低表达。在另外又另一个实施方案中，该合成植物启动子被操纵用来增加表达。在又另一个实施方案中，该植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分是一种单子叶植物。在另一个实施方案中，该植物、植物细胞或植物组织，或者其一部分是玉米。在又另一个实施方案中，该植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分是一种双子叶植物。在又另一实施方案中，该植物、植物细胞或植物组织，或者其一部分是大豆。

本发明的一个实施方案是选择雄性不育植物的一种方法，包括：（a）构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，并且其中当该5’末端是SEQ ID NO：1时，该合成植物启动子的3’末端包含SEQ ID NO：2，或者当该5’末端是SEQ ID NO：2时，该合成植物启动子的3’末端是SEQ ID NO：1，并且其中该合成植物启动子在植物细胞中起作用；（b）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中该异源基因被过表达，并且其中这样的过表达导致了雄性不育；以及（c）选择雄性不育植物。在另一个实施方案中，该合成植物启动子是选自下组，其组成为：SEQ ID NO：4和6。在又另一个实施方案中，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的一种核苷酸序列。在又另一个实施方案中，对除草剂耐受性性状进行编码的该核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的一种核苷酸序列。

本发明的一个实施方案是选择杂合植物的一种方法，包括：（a）构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，并且其中当该5’末端是SEQ ID NO：1时，该合成植物启动子的3’末端包含SEQ ID NO：2，或者当该5’末端是SEQ ID NO：2时，该合成植物启动子的3’末端是SEQ ID NO：1，并且其中该合成植物启动子在植物细胞中起作用；（b）产生包含该表达盒的植物、植物细胞、或植物组织，或者其一部分，其中在纯合植物中该异源基因被过表达，并且其中这样的过表达诱导基因沉默；以及（c）选择杂合植物。在另一个实施方案中，该合成植物启动子是选自下组，其组成为：SEQ ID NO：4和6。在又另一个实施方案中，该异源基因包含对除草剂耐受性性状进行编码的一种核苷酸序列。在又另一个实施方案中，对除草剂耐受性性状进行编码的该核苷酸序列包含对HPPD耐受性进行编码的一种核苷酸序列。

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Claims

1.一种在植物细胞中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子并且该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，其中该来自玄参花叶病毒的增强子由SEQ ID NO：1组成并且该来自从烟草花叶病毒的增强子由SEQID NO：2组成，并且其中该合成植物启动子任选地包含定位在这些增强子之间的一种或多种从由下列组成的组中选择的核苷酸序列：增强子类，外显子类，内含子类，以及除了增强子类、启动子类、外显子类和内含子类之外的其他调节序列类。

2.如权利要求1所述的合成植物启动子，其中该合成植物启动子由SEQ ID NO：3组成。

3.如权利要求1所述的合成植物启动子，其中该合成植物启动子由SEQ ID NO：4组成。

4.如权利要求1所述的合成植物启动子，其中该合成植物启动子由SEQ ID NO：5组成。

5.一种构建在植物中起作用的合成植物启动子的方法，该方法包括以下步骤：

a)获得来自玄参花叶病毒的一种增强子和来自烟草花叶病毒的一种增强子，以及任选地一种或多种从由下列组成的组中选择的核苷酸序列：增强子类，外显子类，内含子类，以及除了增强子类、启动子类、外显子类和内含子类之外的其他调节序列类；

b)可操作地连接该来自玄参花叶病毒的增强子、该一种或多种任选的核苷酸序列、以及该来自烟草花叶病毒的增强子，因此产生在植物中起作用的合成植物启动子，其中该合成植物启动子的5’末端是来自玄参花叶病毒的增强子并且该合成植物启动子的3’末端是来自烟草花叶病毒的增强子，其中该来自玄参花叶病毒的增强子由SEQ ID NO：1组成并且该来自从烟草花叶病毒的增强子由SEQ ID NO：2组成，并且其中该一种或多种任选的核苷酸序列定位在这些增强子之间。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(b)的产物由SEQ ID NO：3组成。

7.如权利要求5所述的方法，其中步骤(b)的产物由SEQ ID NO：4组成。

8.如权利要求5所述的方法，其中步骤(b)的产物由SEQ ID NO：5组成。

9.一种在植物、植物细胞或植物组织中表达异源基因的方法，包括：

a)根据权利要求5所述的方法构建一种合成植物启动子；

b)可操作地将该合成植物启动子连接到该异源基因上，由此产生一种表达盒，其中该表达盒在植物、植物细胞或植物组织中起作用；以及

c)产生包含该表达盒的植物、植物细胞或植物组织或者其一部分，其中该异源基因被表达。

10.如权利要求9所述的方法，其中该异源基因包含编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的方法，其中该编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列包含编码HPPD耐受性的核苷酸序列。

12.如权利要求9所述的方法，其中该合成植物启动子被操纵用来优化表达。

13.如权利要求9所述的方法，其中该合成植物启动子被操纵用来降低表达。

14.如权利要求9所述的方法，其中该合成植物启动子被操纵用来增加表达。

15.如权利要求9所述的方法，其中该植物、植物细胞或植物组织或者其一部分是单子叶植物。

16.如权利要求15所述的方法，其中该植物、植物细胞或植物组织或者其一部分是玉米。

17.如权利要求9所述的方法，其中该植物、植物细胞或植物组织或者其一部分是双子叶植物。

18.如权利要求17所述的方法，其中该植物、植物细胞或植物组织或者其一部分是大豆。

19.一种选择雄性不育植物的方法，包括：

a)构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端由SEQ ID NO：1组成并且该合成植物启动子的3’末端由SEQ ID NO：2组成，其中该合成植物启动子在植物细胞中起作用，并且其中该合成植物启动子任选地包含定位在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的一种或多种从由下列组成的组中选择的核苷酸序列：增强子类，外显子类，内含子类，以及除了增强子类、启动子类、外显子类和内含子类之外的其他调节序列类；

b)产生包含该表达盒的植物、植物细胞或植物组织或者其一部分，其中该异源基因被过表达，并且其中这样的过表达导致雄性不育；以及

c)选择雄性不育植物。

20.如权利要求19所述的方法，其中该合成植物启动子是SEQ IDNO：4。

21.如权利要求19所述的方法，其中该异源基因包含编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列。

22.如权利要求21所述的方法，其中该编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列包含编码HPPD耐受性的核苷酸序列。

23.一种选择杂合植物的方法，包括：

a)构建包含可操作地连接到异源基因上的合成植物启动子的一种表达盒，其中该合成植物启动子的5’末端由SEQ ID NO：1组成并且该合成植物启动子的3’末端由SEQ ID NO：2组成，其中该合成植物启动子在植物细胞中具有功能，并且其中该合成植物启动子任选地包含定位在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的一种或多种从由下列组成的组中选择的核苷酸序列：增强子类，外显子类，内含子类，以及除了增强子类、启动子类、外显子类和内含子类之外的其他调节序列类；

b)产生包含该表达盒的植物、植物细胞或植物组织或者其一部分，其中该异源基因在纯合植物中被过表达，并且其中这样的过表达诱导了基因沉默；以及

c)选择杂合植物。

24.如权利要求23所述的方法，其中该合成植物启动子是SEQ IDNO：4。

25.如权利要求23所述的方法，其中该异源基因包含编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列。

26.如权利要求25所述的方法，其中该编码除草剂耐受性性状的核苷酸序列包含编码HPPD耐受性的核苷酸序列。