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CN102711772A - Artemin拮抗剂的抗肿瘤用途 - Google Patents

Artemin拮抗剂的抗肿瘤用途 Download PDF

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CN102711772A
CN102711772A CN2010800571328A CN201080057132A CN102711772A CN 102711772 A CN102711772 A CN 102711772A CN 2010800571328 A CN2010800571328 A CN 2010800571328A CN 201080057132 A CN201080057132 A CN 201080057132A CN 102711772 A CN102711772 A CN 102711772A
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cancer
antibody
antagonist
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P·E·罗比埃
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Auckland Uniservices Ltd
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Abstract

本发明涉及使用artemin功能的一种或多种拮抗剂(诸如抗-artemin多核苷酸或抗-artemin抗体和抗体片段)预防和治疗乳腺癌的方法和这些拮抗剂的用途。具体地，本发明涉及通过artemin功能性的拮抗而实现的治疗抗性乳腺癌细胞对抗癌治疗的重新敏化。

Description

ARTEMIN拮抗剂的抗肿瘤用途
技术领域
本发明涉及使用artemin功能的一种或多种拮抗剂(诸如抗-artemin抗体和抗体片段)预防和治疗乳腺癌的方法和这些拮抗剂的用途。具体地，本发明涉及通过artemin功能性的拮抗而实现的治疗抗性乳腺癌细胞对抗癌治疗的重新敏化。
背景技术
肿瘤细胞对抗癌治疗(诸如使用化学治疗剂的治疗)的抗性，是乳腺癌的临床处置中的一个重要的且严重的问题。在大约90％的原发性乳腺癌和大约50％的转移灶的治疗开始时，全身性抗癌剂通常是有活性的。但是，在可变的时期以后，发生进展，使得对治疗的抗性不仅是常见的，而且是意外的。因而，抗性的反转是乳腺癌治疗策略的一个重要目标。
持续需要改善乳腺癌治疗的新方案，包括恢复或增强化学治疗剂和其它癌症疗法的抗癌活性的新方案。
本发明的一个目的是，找到实现上述改善的乳腺癌治疗或至少给公众提供有用的选择的某种方法。
发明内容
因此，在第一个方面，本发明提供了一种完全地或部分地反转负荷乳腺癌的患者对癌症治疗剂的抗性的方法，所述方法包括抑制所述患者中的artemin(ARTN)功能性的步骤。
在一个实施方案中，所述负荷乳腺癌的患者具有原位乳腺癌。在另一个实施方案中，所述负荷乳腺癌的患者具有侵袭性乳腺癌。
在不同的实施方案中，提供artemin的功能完全地或部分地诱导或介导所述抗性。
在一个实施方案中，通过给所述患者施用artemin功能的拮抗剂来抑制artemin功能性。
在不同的实施方案中，artemin功能的拮抗剂可以是反义多核苷酸、RNAi多核苷酸或能够抑制artemin功能性的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体(mAb)。
在不同的实施方案中，已经诱导或介导了对它的抗性的癌症治疗剂是化学治疗剂。
在不同的实施方案中，例如当所述患者具有一个或多个乳房肿瘤时，所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂是雌激素受体拮抗剂。
在不同的实施方案中，所述雌激素受体拮抗剂是他莫昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、阿佐昔芬、雷洛昔芬或氟维司群。
在不同的实施方案中，例如当所述患者具有一个或多个乳房肿瘤时，所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂是芳香酶抑制剂。
在不同的实施方案中，所述芳香酶抑制剂是福美坦、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑或依西美坦。
在不同的实施方案中，所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂是紫杉醇或多柔比星。
在不同的实施方案中，所述癌症治疗剂是辐射治疗，包括外线束放射疗法、立体定位放射疗法、3D适形放射疗法、调节强度的放射疗法、粒子疗法或放射性同位素疗法。
在不同的实施方案中，所述患者具有这样的肿瘤：BCL2是所述肿瘤的抗性标志物。
在另一个方面，本发明提供了一种重新敏化负荷乳腺癌的患者的一个或多个肿瘤的方法，所述肿瘤据预测是或变成对癌症治疗剂治疗抗性的，所述方法包括抑制所述患者的artemin功能性的步骤。
在一个实施方案中，所述肿瘤对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂治疗具有抗性，这是由于在肿瘤内或在患者体内存在升高水平的artemin，包括在来自患者的样品(诸如组织样品、肿瘤活组织检查物或血液或血浆样品)内存在升高水平的artemin。
在一个实施方案中，所述肿瘤对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂具有抗性，这是由于在肿瘤内的高水平的BCL2。
在一个实施方案中，所述肿瘤对化学治疗剂治疗是抗性的。
在一个实施方案中，建立或预测出针对它的抗性的化学治疗剂是雌激素受体拮抗剂。
在不同的实施方案中，所述雌激素受体拮抗剂是他莫昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、阿佐昔芬、雷洛昔芬或氟维司群。
在一个实施方案中，建立或预测出针对它的抗性的化学治疗剂是芳香酶抑制剂。
在不同的实施方案中，所述芳香酶抑制剂是福美坦、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑或依西美坦。
在一个实施方案中，建立或预测出针对它的抗性的化学治疗剂是紫杉醇或多柔比星。
本发明另外提供了一种治疗负荷乳腺癌的患者的方法，所述患者的肿瘤对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂具有抗性，所述方法包括下述步骤：
(a)抑制所述患者的artemin功能性；以及
(b)以有效地诱导抗肿瘤效应的量来施用癌症治疗剂。
在一个实施方案中，步骤(a)会使肿瘤对治疗重新敏化或反转抗性。
在不同的实施方案中，所述施用的癌症治疗剂与所述肿瘤对它具有抗性或者据预测将会或变成对它具有抗性的癌症治疗剂相同。
在不同的实施方案中，所述施用的癌症治疗剂与所述肿瘤对它具有抗性或者据预测将会或变成对它具有抗性的癌症治疗剂不同。
在不同的实施方案中，通过施用artemin功能的拮抗剂来抑制artemin功能性。
本发明另外提供了一种治疗负荷乳腺癌的患者的方法，所述患者已经用在所述患者中有效地诱导抗肿瘤效应的量的癌症治疗剂预先治疗，以抑制artemin功能性。
在一个实施方案中，所述预先治疗的患者对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂具有抗性。
在另一个方面，本发明提供了一种重新敏化一个或多个对治疗抗性的乳腺癌细胞的方法，所述方法包括：将有效量的artemin功能的拮抗剂施用给所述一个或多个癌细胞。
在一个实施方案中，所述乳腺癌细胞构成在受试者中存在的肿瘤。
在一个实施方案中，所述乳腺癌细胞是乳癌细胞。
在一个实施方案中，所述乳腺癌细胞构成癌，诸如乳癌，包括在受试者中存在的一种或多种癌。
在一个实施方案中，所述癌细胞对一种或多种治疗剂治疗(包括一种或多种化学治疗剂)是抗性的。在一个实施方案中，所述癌细胞是顽固性癌细胞。
在一个实施方案中，所述方法另外包括：给所述癌细胞施用一种或多种治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是癌细胞已经形成针对它的抗性的治疗剂。
在施用artemin功能的拮抗剂之前、同时或之后，可以施用一种或多种治疗剂。因此，artemin功能的拮抗剂和一种或多种化学治疗剂的施用可以是同时的、顺序的或分开的。
在另一个方面，本发明提供了一种抑制一个或多个乳腺癌细胞的方法，其中所述一个或多个乳腺癌细胞是治疗抗性的，所述方法包括：给所述一个或多个癌细胞施用artemin功能的拮抗剂和治疗剂。
在一个实施方案中，所述抑制是生长的抑制，包括锚着非依赖性的生长的抑制。
在另一个实施方案中，所述抑制是细胞存活的抑制。
在一个实施方案中，所述抑制是增殖的抑制。
在一个实施方案中，所述抑制是有丝分裂的抑制。
在一个实施方案中，所述抑制是细胞周期进展的抑制。在不同的实施方案中，通过减量调节一个或多个细胞周期进展必需基因，包括细胞周期进展必需基因DDND1、CDK2、CDC24A、BRCA1、CHEK2和RB1中的一个或多个，或通过增量调节一个或多个细胞周期进展抑制基因，抑制细胞周期进展。
在一个实施方案中，所述抑制是转移的抑制。在不同的实施方案中，通过减量调节一个或多个促转移基因，包括MMP1、MMP9、PLAUR、SERPINB5、SERPINE1、Vimentin和TGFB1中的一个或多个，或通过增量调节一个或多个抗-转移基因，抑制转移。
在一个实施方案中，所述抑制是细胞能动性的抑制。
在一个实施方案中，所述抑制是细胞凋亡的诱导。在不同的实施方案中，通过减量调节一个或多个抗细胞凋亡基因，包括抗细胞凋亡基因BCL-2、BCL2L1和TERT中的一个或多个，或通过增量调节一个或多个促细胞凋亡基因，包括促细胞凋亡基因BAD、BAX和CASP7中的一个或多个，诱导细胞凋亡。
在一个实施方案中，所述施用是同时的、顺序的或分开的。
在另一个方面，本发明提供了一种反转受试者对抗癌治疗的抗性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用artemin功能的拮抗剂，所述受试者具有治疗抗性的乳腺癌。
在一个实施方案中，所述抗癌治疗是化学治疗剂。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的乳腺癌的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用artemin功能的拮抗剂和治疗剂，其中所述乳腺癌包含一个或多个对治疗抗性的细胞。
在一个实施方案中，所述癌症包含一个或多个对治疗剂治疗抗性的细胞。
在一个实施方案中，所述治疗剂是这样的治疗剂：在受试者中存在的一个或多个癌细胞对它是抗性的。在一个实施方案中，所述治疗剂是这样的治疗剂：在受试者中存在的一个或多个癌细胞已经变成对它是抗性的。在一个实施方案中，所述治疗剂是这样的治疗剂：在暴露于所述治疗剂以后，在受试者中存在的一个或多个癌细胞已经变成对它是抗性的。
在一个实施方案中，所述受试者以前已经被施用治疗剂，或所述一个或多个癌细胞以前已经被暴露于治疗剂。
在不同的实施方案中，治疗包括在受试者中治愈、抑制、改善、延迟或预防癌症或癌症症状的发作，或预防癌症或癌症症状的重现或复发。
在另一个方面，本发明提供了artemin功能的拮抗剂，其用于重新敏化一个或多个乳腺癌细胞。
在一个实施方案中，针对这样的治疗重现敏化一个或多个癌细胞：所述癌细胞已经形成对它的抗性，或者据预测所述癌细胞将会或变成对它具有抗性。
在另一个方面，本发明提供了artemin功能的拮抗剂在制备药剂中的用途，所述药剂用于重新敏化一个或多个乳腺癌细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种用于反转乳腺癌细胞对癌症治疗的抗性的组合物，所述组合物包括artemin功能的拮抗剂。
本发明另外提供了一种组合物，其包含artemin功能的拮抗剂和一种或多种乳腺癌治疗剂。
本发明另外包括测定或监测受试者的一个或多个乳腺癌细胞对治疗剂的抗性的方法，所述方法包括：使包含来自受试者的一个或多个乳腺癌细胞的样品接触artemin功能的拮抗剂和治疗剂，并测量一个或多个癌细胞的抑制。
在一个实施方案中，所述方法另外包括：在没有artemin功能的拮抗剂存在下，使包含来自受试者的一个或多个癌细胞的样品接触所述治疗剂，并测量所述一个或多个癌细胞的抑制。
在一个实施方案中，所述测定或监测抗性是测定或监测抗性的获得。
本发明另外提供了一种诱导乳癌细胞对抗雌激素剂的敏感性的方法，所述方法包括抑制所述细胞中的artemin功能性的步骤。
在一个实施方案中，所述乳癌细胞存在于患者中。
在一个实施方案中，通过给所述细胞或所述患者施用artemin功能的拮抗剂来抑制artemin功能性。
在一个实施方案中，所述抗雌激素剂是癌细胞对它具有抗性的试剂。
本发明另外提供了一种测定BCL2介导的抗性在表现出这种抗性的癌细胞中的存在或程度的方法，所述方法包括：给抗性的癌细胞施用artemin功能的拮抗剂和癌症治疗剂，并测量癌细胞存活、癌细胞能动性、癌细胞增殖、癌细胞有丝分裂、细胞周期进展、癌细胞转移或癌细胞细胞凋亡中的一项或多项。
本发明的另一个特征是，区分一个或多个癌细胞中的BCL2介导的癌症治疗抗性和雌激素非依赖性的/非BCL2介导的癌症治疗抗性的方法，所述方法包括：施用有效量的artemin功能的拮抗剂和所述癌细胞对它具有抗性的癌症治疗剂，并测量癌细胞存活、癌细胞能动性、癌细胞增殖、癌细胞有丝分裂、细胞周期进展、癌细胞转移或癌细胞细胞凋亡中的一项或多项。
本发明也将artemin功能的拮抗剂或本发明的组合物表征为试剂盒的一部分，所述试剂盒用于根据公开的方法诊断或治疗癌症，包括抗性的癌症。所述试剂盒包括至少一种artemin功能的拮抗剂和任选的使用说明书，例如，在诊断或治疗癌症或诊断或治疗抗性的癌症中。
在一个实施方案中，所述试剂盒另外包括至少一种治疗剂，诸如癌症治疗剂。
下面的实施方案可能涉及本文所述的发明的任意方面。
在一个实施方案中，所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阳性的，或包含一个或多个ER阳性的细胞。在一个实施方案中，给ER阳性的细胞施用artemin功能的拮抗剂会减少锚着非依赖性的生长，包括E2刺激的锚着非依赖性的生长。
在另一个实施方案中，所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性的，或包含一个或多个ER阴性的细胞。
在不同的实施方案中，artemin功能的拮抗剂是抗-artemin抗体，诸如抗-artemin多克隆抗体或抗-artemin单克隆抗体、嵌合的抗-artemin抗体、CDR-移植的抗-artemin抗体、人源化的抗-artemin抗体、抗-arteminFab、抗-artemin Fab′、抗-artemin F(ab′)2、抗-artemin Fv、抗-artemin二硫键连接的Fv、抗-artemin scFv、抗-artemin单结构域抗体、抗-artemin双体、抗-artemin多特异性的抗体、抗-artemin双特异性的抗体和抗-artemin双特异性的抗体。
在另一个实施方案中，artemin功能的拮抗剂是反义多核苷酸、siRNA多核苷酸、iRNA或短发夹RNA(shRNA)多核苷酸。
在另一个实施方案中，artemin功能的拮抗剂包含artemin是其配体的受体的胞外结构域，包括artemin是其高亲和力配体的受体的胞外结构域。在一个实施例中，artemin功能的拮抗剂是GFRα3受体的胞外结构域或其功能变体或片段。
在不同的实施方案中，所述化学治疗剂选自：他莫昔芬、氟维司群、紫杉醇或多柔比星。在其它实施方案中，所述化学治疗剂选自：托瑞米芬、艾多昔芬、阿佐昔芬、雷洛昔芬、福美坦、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑和依西美坦。
在不同的实施方案中，所述化学治疗剂选自：有丝分裂抑制剂，诸如长春花生物碱类，包括长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、鬼臼毒素，紫杉烷类，包括多西他赛、larotaxel、ortataxel、紫杉醇和tesetaxel，和埃博霉素，诸如ixabepilone；拓扑异构酶I型抑制剂，诸如托泊替康、伊立替康、喜树碱、卢比替康和贝洛替康，拓扑异构酶II型抑制剂，包括安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷，蒽环类抗生素，诸如阿柔比星、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星，和蒽二酮，诸如米托蒽醌和pixantrone；抗代谢物，包括二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞，胸苷酸合酶抑制剂，诸如雷替曲塞和培美曲塞，腺苷脱氨酶抑制剂，包括喷司他丁，卤代的或核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如克拉屈滨、氯法拉滨和氟达拉滨，硫代嘌呤，包括硫鸟嘌呤和巯嘌呤，胸苷酸合酶抑制剂，包括氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟和氮尿苷，DNA聚合酶抑制剂，诸如阿糖胞苷，核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如吉西他滨，次甲基化剂，包括阿扎胞苷和地西他滨，和核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如羟基脲；细胞周期非特异性的抗肿瘤剂，包括烷基化剂诸如氮芥，包括氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺、苯丁酸氮芥、美法仑、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀，亚硝基脲，包括卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀和链佐星，烷基磺酸盐类，包括白消安、甘露舒凡和曲奥舒凡，氮丙啶类，包括卡波醌、塞替派、三亚胺醌和曲他胺，类烷基化剂，包括铂剂诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、沙铂，肼类，诸如丙卡巴肼，三氮烯类，诸如达卡巴嗪、替莫唑胺、六甲蜜胺和二溴甘露醇，和链霉素类，诸如放线菌素、博来霉素、道诺霉素、丝裂霉素和普卡霉素；光敏化剂，包括氨基酮戊酸、氨基酮戊酸甲酯、乙法昔罗，和卟啉衍生物类，诸如卟吩姆钠、他拉泊芬、替莫泊芬和维替泊芬；酶抑制剂，包括法呢基转移酶抑制剂诸如tipifarnib，细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂，诸如alvocidib和seliciclib，蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米，磷酸二酯酶抑制剂，诸如阿那格雷，IMP脱氢酶抑制剂，诸如噻唑呋林，脂氧合酶抑制剂，诸如马索罗酚，和PARP抑制剂，诸如olaparib；受体拮抗剂，诸如内皮缩血管肽受体拮抗剂包括阿曲生坦，类视色素X受体拮抗剂，诸如贝沙罗汀和睾内酪；和其它化学治疗剂，包括安吖啶、曲贝替定、类视色素诸如阿利维A酸和维A酸、三氧化二砷、天冬酰胺清除剂(depleter)诸如门冬酰胺酶或培门冬酶、塞来考昔、秋水仙胺、elesclomol、依沙芦星、依托格鲁和氯尼达明。
对本文公开的数字范围(例如，1-10)的提及，也意图包括对在该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及在该范围内的任意有理数范围(例如，2-8、1.5-5.5和3.1-4.7)的提及，因此，在本文中明确公开的所有范围的所有子范围都在本文中明确地公开。这些仅是特别指出的实例，认为在本申请中以类似的方式明确阐述了在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合。
在本说明书中，在已经提及专利说明书、其它外部文件或其它信息来源的情况下，这通常是为了提供讨论本发明的特征的背景的目的。除非另外特别说明，对这样的外部文件的提及不应解释为承认：在任何管辖权内，这样的文件或这样的信息来源是现有技术，或形成本领域的普通一般知识的一部分。
广义上也可说，本发明由在本申请说明书中提及的或指出的部分、要素和特征组成，单独地或总体地，或者由两种或更多种所述部分、要素或特征的任何或全部组合组成，并且在本文中提及具有本发明相关领域已知的等效物的具体整体的情况下，此种已知等效物视作并入本文中，如同单独阐述。
下文描述本发明的其它方面和实施方案。
附图说明
参考附图，从下面的描述中显而易见本发明的这些及其它方面(应当在其所有方面考虑)，所述描述仅以示例的方式给出，在附图中：
图1.表明，通过拮抗artemin，使已经获得他莫昔芬抗性的乳腺癌细胞对化学疗法重新敏化，如在本文中在实施例1中所述。(A)用DMSO(媒介物)、10nM E2或1μM他莫昔芬处理7天时段的TAMS和TAMR细胞。(B)用DMSO(媒介物)或1μM他莫昔芬处理72小时的TAMS和TAMR细胞。上图：通过半定量RT-PCR测得的ARTN mRNA水平。下图：通过SDS-PAGE鉴定出的可溶性的全细胞提取物，并针对artemin进行探测。(C)用1μM他莫昔芬(单独地，或与400μg/ml抗-artemin IgY组合地)治疗10天的TAMS和TAMR细胞在软琼脂中的集落形成。
图2.ARTN的去除会恢复紫杉醇抗性的乳癌细胞的紫杉醇敏感性，如在本文中在实施例2中所述。(A)分别是BT549野生型和BT549紫杉醇抗性的细胞在单层和基质胶培养物中的细胞和3D形态学。(B)在BT549野生型和BT549紫杉醇抗性的细胞中的ARTN表达(有或没有紫杉醇)的蛋白印迹，和证实在BT549野生型和紫杉醇抗性的细胞中的、siRNA介导的ARTN去除的蛋白印迹。(C)在单层培养物中的细胞生存试验，其对比了BT549野生型和紫杉醇抗性的细胞(±siARTN)。(D)BT549野生型和紫杉醇抗性的细胞(±siARTN)在软琼脂中的集落形成。(E)BT549野生型和紫杉醇抗性的细胞(±siARTN)在3D基质胶中的生长。＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001。
图3.ARTN的去除会恢复IR抗性的乳癌细胞的电离辐射(IR)敏感性，如在本文中在实施例3中所述。(A)分别是BT549野生型和BT549IR抗性的细胞的ARTN表达(有或没有IR)的蛋白印迹，和证实在BT549和MDA-MB-231野生型和IR抗性的细胞中的、siRNA介导的ARTN去除的蛋白印迹。(B)在单层培养物中的细胞生存试验，其对比了BT549(左图)和MDA-MB-231(右图)野生型和IR抗性的细胞(±siARTN)。(C)BT549(左图)和MDA-MB-231(右图)野生型和IR抗性的细胞(±siARTN)在软琼脂中的集落形成。(D)BT549(左图)和MDA-MB-231(右图)野生型和IR抗性的细胞(±siARTN)在3D基质胶中的生长。＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001。
具体实施方式
下面是本发明的描述，包括其优选实施方案，以通用术语给出。在“实施例”部分下给出的公开内容进一步阐明了本发明，所述“实施例”部分提供了支持本发明及其具体实施例的实验数据。
定义
术语“抗体”应以尽可能最宽泛的含义进行理解，并旨在包括完整的单克隆抗体和多克隆抗体。也旨在涵盖修饰了抗体，只要它们展示出想要的生物活性。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性地结合(发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些包括、但不限于：多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fc、Fab、Fab’、和Fab2片段以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE、IgD和IgY中的任何类别，它们彼此的差别是在分子中存在的重链的性质。这些也包括亚类，诸如IgG1、IgG2及其它。轻链可以是κ链或λ链。在全长抗体中，每个重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。所述VH和VL区可以进一步细分成高变区(称作互补性决定区(CDR))，所述高变区中散布有更保守的区域(称作框架区(FR))。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，它们从氨基端至羧基端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在本文中对抗体的提及包括对所有类、亚类以及类型的提及。也包括嵌合抗体，例如对一种以上来源(例如，小鼠或人序列)特异性的单克隆抗体或其修饰。还包括骆驼类抗体(camelid antibody)或纳米抗体(nanobody)。应该理解，对“抗体”或任何类似术语的每次提及，在本文中包括完整抗体及其任何修饰。具体地，预见到本领域已知的这样的突变体、变体或衍生物抗体形式。在下面讨论了它们的非限制性实施方案。已经证实，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。这样的抗体实施方案也可以是双特异性的、二特异性的或多特异性的形式；具体地，结合2种或更多种不同的抗原。结合片段(其被包括在本文使用的术语“抗体”和更具体的术语抗体的“抗原结合部分”内)的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即含有通过在铰链区处的二硫键相连的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗体的单条臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546，Winter等人，PCT公开WO 90/05144A1，通过引用并入本文中)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，使用重组方法，通过合成的连接物可以连接它们，所述连接物使它们能够制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。在术语抗体的“抗原结合部分”内，也意图包括这样的单链抗体。其它形式的单链抗体(诸如双体)也被包括在术语“抗体”和具体的术语“抗原结合部分”内。双体是二价的、双特异性的抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但是用连接物相连，所述连接物因为太短而不允许在相同多肽链上的2个结构域之间配对。所述结构域因而被迫与另一条链的互补结构域配对，产生2个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
术语“反义”应被广义地解释。旨在表示能够结合artemin的转录物的任何核酸(优选RNA，但包括单链DNA)。它包括能与DNA或RNA(优选mRNA)特异性地杂交的寡核苷酸及其衍生物(及其盐，在存在成盐基团的情况下)。此种寡核苷酸或寡核苷酸衍生物可以包括这样的核苷酸单元或其核苷酸类似物/衍生物：其数量和同一性足够以允许此种杂交。在大多数情况下，反义寡核苷酸及其衍生物与DNA的互补序列、前-mRNA或成熟的mRNA特异性地结合(杂交)，如由Watson-Crick碱基配对所限定。
本文使用的“改变的”多核苷酸包括：具有不同核苷酸的缺失、插入或置换而产生编码相同或功能等效序列的多核苷酸的那些。多肽和抗体也可为“改变的”，并且含有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默改变并产生功能等效序列。根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，可以进行有意的氨基酸置换，只要保留序列的至少一种生物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫学活性。例如，带负电荷的氨基酸可以包括门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的、具有不带电荷的极性头部基团的氨基酸可以包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。通过例如与同系物、直系同源物或旁系同源物的序列对比(如在本文中的附图中所示)，可以获得产生置换和/或缺失或添加的指南。
术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”表示，参与抗原相互作用的免疫球蛋白分子的部分或其片段或修饰。抗原结合位点通常由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重和轻链的V区内的三条高度趋异序列(divergent stretch)(称作“高变区”)插入在更保守的侧翼序列(flanking stretch)(称作“框架区”)之间。因此，术语“框架区”或“FR”指在免疫球蛋白的高变区之间以及邻近高变区的天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间上彼此相对排列以形成抗原结合表面。该抗原结合表面通常与结合的抗原的三维表面互补，重和轻链各自的三个高变区称作“互补性决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域的分配，是按照已接受的定义(参见，例如，Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest，N ationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991；和Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917，1987，Chothia等人Nature 342：878-883，1989)。
本文使用的“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、蛋白或抗体的序列，及其任何片段，以及任何天然存在的、重组的、合成的或半合成的分子。本发明的序列包括至少5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸，优选至少5至10个、5至15个、10至15个、或12至15个氨基酸。优选地，该序列保留原始氨基酸序列的生物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫学活性。应该理解，“氨基酸序列”和类似术语并不限于与全长分子相关的完整的原始序列，也包括其任何修饰。
当提及artemin使用时，术语“拮抗剂”、“拮抗”等意在表示，抵消(counter)、减少或消除artemin的一种或多种生物活性。尽管可能希望完全抑制活性，这不是必需的。“拮抗”可以发生在表达和生产水平(例如，转录或翻译水平)，或通过靶向功能而发生。例如，本文使用的拮抗预见到例如RNA水平的降低(例如，减少的转录、增加的周转和/或降低的稳定性)、在活性所需的翻译后修饰的多肽水平的降低(例如，减少的翻译、增加的周转和/或降低的稳定性)或活性的降低。应当理解，可以间接地或直接地实现拮抗。
因此，“artemin功能的拮抗剂”、“artemin的拮抗剂”或“artemin功能性的拮抗剂”是这样的药剂：其能够抵消、减少或消除artemin的一种或多种生物活性，诸如在所述药剂接触的细胞中。本领域技术人员会认识到，为了在本发明的方法中是有效的，artemin功能的拮抗剂不需要直接地介导它对artemin的作用，而是可以间接地拮抗artemin的生物活性。在一个实施例中，通过降低或消除artemin水平，例如，通过减少artemin mRNA的转录或翻译，artemin功能的拮抗剂可以发挥作用。在另一个实施例中，artemin功能的拮抗剂可以减少或阻断artemin与配体或结合配偶体(诸如受体，诸如GFRα3)的结合。在另一个实施例中，artemin功能的拮抗剂可以减少或阻断artemin-结合的受体与信号转导分子(artemin-结合的受体否则会与其结合，诸如artemin-结合的GFRα3与RET的结合)的结合或相互作用。在某些实施方案中，artemin功能的拮抗剂也可以减少或阻断在相关途径中的下游或上游试剂的活性或表达水平。在具体的方面，本发明的artemin功能的拮抗剂可用于使一个或多个癌细胞对抗癌治疗重新敏化，所述抗癌治疗是诸如本文所述的用于抑制细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性(特别是癌细胞)的那些。具体地，所述药剂可以用于下述的一项或多项：减少细胞增殖(例如，通过减少细胞分裂)、增加细胞死亡(例如，通过增加细胞凋亡或坏死)或减少细胞侵入和/或转移(例如，通过减少降低细胞支架活性、细胞活动)。
本文使用的“artemin”表示GDNF家族配体artemin，且可以包括类似的序列和/或活性，包括、但不限于前-原-artemin的同种型或同种型前体，诸如人artemin前体的同种型，包括人artemin同种型1前体(Entrez蛋白IDs：NP_003967和NP_476432，SEQ ID NO：1)、人artemin同种型2前体(Entrez蛋白ID：NP_476501，SEQ ID NO：2)和人artemin同种型3前体(Entrez蛋白IDs：NP_476431和NP_001129687，SEQ ID NO：3)，原-artemin的同种型和成熟的artemin的同种型，诸如成熟的人artemin的同种型(SEQ ID NO：4-6)。因此，artemin多核苷酸包括能够编码artemin(包括人artemin)的多核苷酸，且其实例是，但不限于：人artemin转录物变体1(GenBank登记号：NM_003976)、人artemin转录物变体2(GenBank登记号：NM_057091)、人artemin转录物变体3(GenBank登记号：NM_057160)、人artemin转录物变体4(GenBank登记号：NM_057090)、人artemin转录物变体5(GenBank登记号：NM_001136215)和编码人artemin的基因(GeneID：9048)。为了在本发明中使用，人序列是优选的，但也可以使用其它同系物和直系同源物。应该理解，在本文中对这些因素(例如，artemin及其同种型)的每次提及，将包括全长序列及其任何片段或修饰(包括变体)。artemin还一家被称作neublastin和enovin。
术语“癌症”和“癌性的”表示哺乳动物中通常特征在于异常的或失控的细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的生理状况。癌症以及癌症病理学可以与下述因素相关：例如，转移、对邻近细胞的正常功能的干扰、在异常水平的细胞因子或其它分泌产物的释放、炎性或免疫应答的抑制或恶化、瘤形成、癌前病变(premalignancy)、恶性肿瘤、周围或远距离的组织或器官(例如淋巴结等)的侵袭。具体地包括：乳腺癌和癌变前征状，其可以包括上皮肿瘤、非上皮肿瘤，癌(例如原位癌)，以及侵袭性乳腺癌。
术语“编码区”或“开放读码框”(ORF)表示基因组DNA序列或cDNA序列的有义链，其在适当调节序列的控制下能够生成转录产物和/或多肽。通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在，鉴别编码序列。当插入遗传构建体中时，当与启动子和终止子序列可操作地相连时，“编码序列”能够被表达。
在本说明书中使用的术语“包含”是指“至少部分地由……组成”。当解释本说明书中的包括术语“包含”的每句语句时，也可能存在以该术语开始的那个或那些以为的特征。有关的术语诸如“包含”和“包括”以相同的方式进行解释。
本文提及核酸使用的术语“互补的”或“互补性”是指，多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对实现的天然结合。对于序列A-G-T，互补序列是T-C-A，反向互补是A-C-T，反向序列是T-G-A。两个单链分子之间的互补性可能是部分的，其中只有一些核酸结合，或者当在单链分子之间存在完全互补性时，其可以是全部的。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这对于扩增反应以及iRNA和PNA的设计和应用尤其重要，所述扩增反应取决于核酸链之间的结合。
本文使用的术语“衍生物”表示多核苷酸的化学修饰或与其互补的多核苷酸。此种修饰包括，例如，烷基、酰基或氨基对氢的替换。在优选的方面，多核苷酸衍生物编码这样的多肽：其保留天然分子的生物学或免疫学功能。衍生多肽或抗体是这样的：其通过糖基化、聚乙二醇化或任何类似方法而被修饰，所述修饰保留它的来源序列的一种或多种生物功能(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫学功能。对于抗体，术语“衍生物”包括，例如，杂交和重组抗体。抗体的“杂交”和“重组”形式包括，例如，人化抗体、双体、三体和单链抗体。
术语“结构域”表示蛋白或蛋白复合物的单元，其包括多肽亚序列、完整多肽序列或多个多肽序列，其中所述单元具有确定的功能。所述功能应当理解为广义地定义，且可以是抗原结合活性、配体结合活性、催化活性等，或可以对蛋白的结构具有稳定作用。
本文使用的术语“表位”包括：能够特异性地结合免疫球蛋白或相关分子(例如scFv或T细胞受体)的任何多肽或肽决定簇。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸和/或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位包括两种主要类型，即，顺序表位(SE)和构象表位(CE)，在所述顺序表位中，抗体结合由肽键连接的氨基酸残基的连续序列，在所述构象表位中，抗体结合非连续的残基，所述残基通过多肽链的折叠凑到一起。构象表位在本文中也称作天然表位。通过分析抗原-抗体复合物的晶体结构可知，为了被抗体识别，所述残基必须通常可用于相互作用，并且因此存在于抗原表面附近。使用可商业得到的算法来预测SE和CE。
当解离常数≤1μM、优选≤100nM、最优选≤10nM时，称抗体特异性地结合抗原。在某些方面，抗体可以与本文所述的配体特异性地结合或反应。对于抗体，“特异性地结合”或“与……特异性地免疫反应”意指，抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应，且不与其它多肽反应(即结合)，或者以远远更低的亲和力(例如Kd＞10-6)与其它多肽结合。
术语“表达”包括从基因或基因的一部分生产多核苷酸和多肽，尤其是生产RNA(例如mRNA)，并且包括由RNA或基因或基因的一部分所编码的多肽的生产，以及与表达相关的可检测物质的出现。在术语“表达”的范围内包括：例如，由多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用等形成复合物。另一实例是结合配体(例如杂交探针或抗体)与基因或其它多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白片段的结合，以及所述结合配体的可视化。因此，在下面的生物分子的术语“表达”内包括在微阵列上、在杂交印迹(诸如RNA印迹)上、或在免疫印迹(诸如蛋白印迹)上、或在珠阵列上、或通过PCR分析测得的斑点强度的增加。
术语“表达构建体”表示这样的遗传构建体：其包括将插入的多核苷酸分子转录、并任选地将转录物翻译成多肽所必需的元件。表达构建体通常在5’至3’方向包括：启动子(其在所述构建体将要导入的宿主细胞中有功能)、要表达的多核苷酸和终止子(其在所述构建体将要导入的宿主细胞中有功能)。
在本文中预见到的表达构建体可以插入可复制的载体中用于克隆或用于表达，或可以整合进宿主基因组中。
在本文中提供的多核苷酸序列的“片段”是长度优选为至少15个核苷酸的连续核苷酸的子序列。本发明的片段包含本发明多核苷酸的优选至少20个核苷酸、更优选至少30个核苷酸、更优选至少40个核苷酸、更优选至少50个核苷酸、最优选至少60个连续核苷酸。多核苷酸序列的片段可以用于反义、基因沉默、三螺旋或核酶技术中，或用作引物、探针，包括在微阵列中，或用于基于多核苷酸的选择方法中。
与启动子多核苷酸序列有关的术语“片段”意图包括这样的序列：其包含能够调节所述片段可操作地连接的多核苷酸序列的表达的启动子多核苷酸序列的顺式元件和区域。
优选地，本发明的多核苷酸序列的片段包含本发明多核苷酸的至少20个、更优选至少30个、更优选至少40个、更优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个、更优选至少300个、更优选至少400个、更优选至少500个、更优选至少600个、更优选至少700个、更优选至少800个、更优选至少900个、最优选至少1000个连续核苷酸。
本文使用的术语“功能变体”和“功能片段”(例如关于artemin，或关于artemin功能的多肽拮抗剂)表示不同于特别鉴定的序列的多肽序列，其中删除、置换或添加了一个或多个氨基酸残基，或包含特别鉴定的序列的片段的序列。功能变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。功能变体可以来自相同物种或来自其它物种，且可以包括同系物、旁系同源物和直系同源物。多肽的功能变体或功能片段具有特别鉴定的天然多肽的一种或多种生物活性，诸如引起由所述天然多肽引起的一种或多种生物学效应的能力。例如，artemin的功能片段可以结合或激动由artemin结合或激动的一种或多种受体。
功能变体或功能片段可以具有比天然多肽更大的或更小的活性。在一个实施例中，功能变体或功能片段所具有的特别鉴定的天然多肽的一种或多种生物活性可以以比所述天然多肽更大或更小的程度存在于所述功能变体或功能片段中。在另一个实施例中，功能变体或功能片段所具有的特别鉴定的天然多肽的每种生物活性以比所述天然多肽更大或更小的程度存在于所述功能变体或功能片段中。在其它实施例中，可能希望提供这样的功能变体或功能片段：其中天然多肽的一种或多种生物活性得到维持或以比天然多肽更大的程度存在，但是天然多肽的一种或多种其它生物活性不存在或以比天然多肽更小的程度存在。这样的功能片段的实例包括本文所述的抗-artemin抗体片段。
用于测定由本文所述多肽引起的一种或多种生物学效应的方法和试验是本领域众所周知的，在本文中描述了实例，并且这样的方法和试验可以用于鉴别或证实一种或多种功能变体或功能片段，例如，artemin或artemin功能的多肽拮抗剂的功能变体或功能片段。例如，artemin的增加细胞中的一种或多种致癌特性(诸如在本文实施例中描述的那些)的能力的试验，可以用于鉴定artemin的一种或多种功能变体或功能片段。类似地，artemin功能的拮抗剂(诸如artemin功能的多肽拮抗剂，包括抗-artemin抗体)的能力的试验，可以用于鉴定artemin功能的拮抗剂的一种或多种功能变体。
功能片段的实例包括这样的多肽片段：其包含负责生物活性(例如，受体结合、抗原结合等)的氨基酸序列。
术语“引物”表示这样的短多核苷酸：其通常具有游离的3’OH基团，其与模板杂交，并用于引发与模板互补的多核苷酸的聚合。这样的引物的长度是优选至少5个、更优选至少6个、更优选至少7个、更优选至少8个、更优选至少9个、更优选至少10个、更优选至少11个、更优选至少12个、更优选至少13个、更优选至少14个、更优选至少15个、更优选至少16个、更优选至少17个、更优选至少18个、更优选至少19个、更优选至少20个核苷酸。
术语“探针”表示这样的短多核苷酸：其用于在基于杂交的试验中检测与所述探针互补的多核苷酸序列。所述探针可以由本文定义的多核苷酸的“片段”组成。这样的探针的长度是优选至少5个、更优选至少10个、更优选至少20个、更优选至少30个、更优选至少40个、更优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个、更优选至少300个、更优选至少400个、最优选至少500个核苷酸。
本文使用的术语“同源性”表示与共同祖先的关系，并因此表示相似性、同一性或互补性的程度。可为部分同源性(即一定的％同一性)或完全同源性(即100％同一性)。使用功能术语“基本上同源的”表示，至少部分地抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。使用在低严谨性条件下的杂交试验(例如，DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)，可以检验完全互补序列与靶序列的杂交的抑制。在低严谨性条件下，基本上同源的序列或杂交探针会与完全同源序列竞争结合靶序列，并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说，低严谨性条件允许非特异性结合；低严谨性条件要求两个序列彼此的相互结合是特异性的(即选择性的)相互作用。
本文使用的术语“杂交”表示，核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。
本文使用的“插入”或“添加”表示这样的氨基酸或核苷酸序列的变化：与天然存在的分子相比，其分别导致加入一个或多个氨基酸残基或核苷酸。
“抑制”意在表示减少或消除，并预见到部分地和完全地减少或消除。生物活性的“抑制”(例如由基因产物介导的抑制)可以发生在表达和生产水平(例如，转录或翻译水平)，或通过例如靶向功能而发生。因此，当提及artemin功能性使用时，术语“抑制”是指artemin的或由artemin介导的一种或多种功能的减少或消除。
术语“修饰的”或“修饰”表示，改变的序列和序列片段、变体以及衍生物，如在本文中所述。该术语包括多肽、多核苷酸、抗体和在本文中描述的类似试剂。
本文使用的术语“单克隆抗体”、“mAb”或“单克隆抗体组合物”表示一群抗体分子，其含有包括独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物的抗体分子的分子种类。具体地，单克隆抗体的互补性决定区(CDR)是独特的。mAb包括能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点，该反应特征在于与该表位的独特结合亲和力。
本文使用的术语“核酸序列”或“核苷酸序列”表示，多核苷酸、寡核苷酸的序列或其片段，以及天然的、重组的、合成的或半合成起源的DNA或RNA，其可为单链或双链，并且可以表示有义链或反义链，或者编码区或非编码区。本发明的序列优选地包括至少15、21、27、33、36、39、45、51、57或66个核苷酸，优选至少15-36、15-66、36-66或45-66个核苷酸、或者至少100个核苷酸、或者至少1000个核苷酸。应该理解，在本文中对“核酸序列”或“核苷酸序列”的每次提及将包括原始的全长序列及其任何补体或修饰。还应该理解，对于具有特定SEQ ID NO.的“多核苷酸”(或“寡核苷酸”或“探针”或“引物”等)的任何提及将包括DNA和相应的RNA序列。
术语“寡核苷酸”表示多核苷酸，典型地为探针或引物，包括、但不限于：单链DNA、单链或双链RNA、RNA：DNA杂交体以及双链DNA。经常通过化学方法，例如使用可商业得到的自动化寡核苷酸合成仪，或者通过多种其它方法(包括体外表达系统、重组技术以及在细胞和生物体中表达)，合成寡核苷酸，诸如单链DNA探针寡核苷酸。
术语“患者”或“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括、但不限于：禽类和哺乳动物，尤其是小鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛和马。
本文使用的“肽核酸”或“PNA”表示，包括通过肽骨架连接的碱基的反义分子或反基因试剂。
本文使用的短语“药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂”旨在包括这样的物质：其可用于制备药物组合物，并且可与根据本发明的试剂共同施用，同时允许所述试剂执行它的预期功能。这些通常是安全的、无毒的，并且不是在生物学上或在其它方面不期望的。药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂的实例包括溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳剂等。稀释剂、载体和/或赋形剂可含有小量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。
术语“多核苷酸”(例如，“artemin”，其可以用于讨论多核苷酸)当以单数或复数使用时，通常表示任何核酸序列，例如，任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。这包括、但不限于：单链和双链DNA、包括单链和双链区的DNA、单链和双链RNA，和包括单链和双链区的RNA、包括DNA和RNA(其可为单链，或者更典型地为双链，或者包括单链和双链区)的杂交分子。也包括：含有RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。具体包括mRNA、cDNA以及基因组DNA，及其任何片段。该术语包括：含有一个或多个修饰的碱基(例如氚化碱基)或不常见碱基(例如肌苷)的DNA和RNA。本发明的多核苷酸可以包括编码序列或非编码序列，或者有义序列或反义序列，或者iRNA如siRNA。应该理解，在本文中对于“多核苷酸”或相似术语的每次提及将包括全长序列及其任何补体或修饰。
本文使用的术语“多肽”表示寡肽、肽或蛋白或其片段，以及天然存在的、重组的、合成的或半合成的分子。当在本文中列举这些术语来表示天然存在的蛋白分子的氨基酸序列时，该术语无意所述将氨基酸序列限制为全长分子的完整的、原始序列。应该理解，在本文中对于“多肽”或相似术语的每次提及将包括全长序列及其任何修饰。
术语“重新敏化”及其语法等效描述表示，对刺激的应答的形成或存在(在对所述刺激的应答以前不存在或不明显的情况下)，或者对刺激的更大应答的形成或存在(在更小的应答以前存在或明显的情况下)。例如，当提及细胞对试剂的应答(例如，对与试剂的接触或暴露的应答)使用时，细胞对试剂的重新敏化是指，在细胞中形成对所述试剂的应答(当以前没有应答或更小应答存在时)。用于测定例如细胞对试剂的重新敏化的方法，是本领域众所周知的，在本文中提供了这样的方法的实例。通常，重新敏化是通过统计上显著的量——也就是说，当重新敏化时对刺激的应答显著大于在没有重新敏化时对刺激的应答。另外，在本文的实施例中提供了统计上显著的重新敏化的实例和评估统计显著性的方法。
本文使用的术语“严谨条件”或“严谨性”表示，由核酸、盐和温度限定的杂交条件。这些条件是本领域众所周知的，并且可被改变，以便鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。参见，例如，Sambrook，J.等人(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，和Ausubel，F.M.等人(1989)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY。包括低或高严谨性的众多等效条件取决于诸如下述的因素：序列(例如DNA、RNA、碱基组合物)的长度和性质、靶标(例如DNA、RNA、碱基组合物)的性质、环境(例如在溶液中或固定化在固体底物上)、盐和其它组分(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)的浓度以及反应温度(例如在低于探针解链温度约5℃到低于该解链温度约20℃至25℃的范围内)。可改变一种或多种因素，以产生与上面列举的条件不同但等效的低或高严谨性条件。
本文使用的术语“基本上纯化的”或“分离的”表示这样的核酸或氨基酸序列：它们从其细胞的、重组的或合成的环境取出，并且不含有至少60％、优选75％、最优选至少90％或至少99％的在它们的环境中与它们相伴的其它组分。“分离的”多核苷酸和多肽已经从在天然状态中与其相伴的至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出。因此，应该理解，分离的多核苷酸和多肽处于与在自然界中发现它们的形式或场合不同的形式。还应该理解，“分离的”并不一定反映该序列已经被纯化的确切程度(例如具体百分数)。
“治疗”以及相似术语表示这样的方法和组合物：其用于预防、治愈、或改善医学病症(例如医学疾病、病症或征状)，或者减轻此种病症的至少一种征状。具体地，这包括这样的方法和组合物：其用于预防或延缓医学病症发作；用于治愈、纠正、降低、减缓或改善病症的身体效应或发展效应；用于预防病症或病症征状的再现或复发；或用于预防、终止、降低、或改善病症造成的疼痛或苦楚。术语“治疗”以其最广义来理解。该术语并不一定暗示，治疗受试者直到完全康复。因此，本文使用的“治疗”广义地包括抑制、降低、或预防细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性；改善细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的征状或严重性；或者预防或以其它方式降低形成细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的风险，例如癌症，特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或其它癌症。
本文使用的术语“变体”表示不同于特别鉴定的序列的多核苷酸或多肽序列，其中删除、置换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可以来自相同物种或来自其它物种，且可以包括同系物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，多核苷酸和多肽的变体具有与野生型多核苷酸或多肽的生物活性相同或类似的生物活性。当提及多核苷酸和多肽时，术语“变体”包括本文定义的多核苷酸和多肽的所有形式。
多核苷酸和多肽变体
本文使用的术语“多核苷酸”是指，单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其具有任意长度、但是优选至少15个核苷酸，且包括(作为非限制性实例)：基因的编码序列和不编码序列、有义和反义序列补体、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离的和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。许多核酸类似物是本领域众所周知的，且也被预见到。
多核苷酸变体
变体多核苷酸序列优选地表现出与指定的多核苷酸序列的至少50％、更优选至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在指定的多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、至少100个核苷酸位置或整个长度的比较窗上，发现同一性。
可以如下方式测定多核苷酸序列同一性。在bl2seq(Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)中，使用BLASTN(来自BLAST程序套件，2.2.10版[2004年10月])，将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较，所述bl2seq可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。除应关闭对低复杂性部分的过滤以外，利用bl2seq的预设参数。
可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的同一性：
bl2seq-i nucleotideseq 1-j nucleotideseq2-F F-p blastn
参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。bl2seq程序在“Identities＝”行中将序列同一性报告为相同核苷酸的数量及百分比。
使用总体序列比对程序(例如Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)，也可以在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多核苷酸序列同一性。Needleman-Wunsch总体比对算法的一个完整实现，参见EMBOSS套件(Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A.EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite，Trends in Genetics June 2000，第16卷，第6期，第276-277页)中的needle程序。该EMBOSS套件可从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/得到。EuropeanBioinformatics Institute 服务器也在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线提供执行两个序列之间的EMBOSS-needle总体比对的工具。
或者，可使用GAP程序，其计算两个序列在无处罚末端空隙的情况下的最佳总体比对。GAP描述在以下论文中：Huang，X.(1994)On GlobalSequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235。
本发明的多核苷酸变体也涵盖这样的变体：所述变体展现与可能保留那些序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能恰当地预期随机发生。使用从来从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套件(2.2.10版[2004年10月])可公开获得的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。
可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的相似性：
bl2seq-i nucleotideseq 1-j nucleotideseq2-F F-p tblastx
参数-FF关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。此数据库的尺寸是由bl2seq程序中的默认值设定。对于远小于1的小E值而言，E值大致为这样的随机匹配的机率。
当与任一个特别鉴定的序列相比较时，变体多核苷酸序列优选地表现出小于1x10-10、更优选地小于1x10-20、小于1x10-30、小于1x10-40、小于1x10-50、小于1x10-60、小于1x10-70、小于1x10-80、小于1x10-90、小于1x10-100、小于1x10-110、小于1x10-120或小于1x10-123的E值。
或者，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与指定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。
术语“在严谨条件下杂交”及其语法等效描述是指，多核苷酸分子在限定的温度及盐浓度条件下与靶多核苷酸分子(诸如固定于DNA或RNA印迹(诸如DNA印迹或RNA印迹)上的靶多核苷酸分子)杂交的能力。通过最初在更低严谨性条件下杂交，随后将严谨性增加至希望的严谨性，可以测定在严谨杂交条件下杂交的能力。
关于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严谨杂交条件为，比天然双链体的解链温度(Tm)低不超过25至30℃(例如10℃)(一般参见，Sambrook等人编，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Press；Ausubel等人，1987，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing)。大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可通过下式来计算：Tm＝81.5+0.41％(G+C)-log(Na+).(Sambrook等人，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS84：1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件是这样的杂交条件，诸如在6×SSC、0.2％SDS的溶液中预洗涤；在65℃，在6×SSC、0.2％SDS中杂交过夜；随后在1×SSC、0.1％SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤，并在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤。
关于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件是，比Tm低5至10℃。平均而言，长度小于100碱基对的多核苷酸分子的Tm降低大约(500/寡核苷酸长度)℃。
关于称为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen等人，Science.1991年12月6日；254(5037)：1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，且可使用Giesen等人，Nucleic Acids Res.1998年11月1日；26(21)：5004-6中所述的公式来计算。长度小于100个碱基的DNA-PNA杂交物的示例性的严谨杂交条件为，比Tm低5至10℃。
本发明的变体多核苷酸也涵盖这样的多核苷酸：其不同于本发明的序列，但因遗传密码的简并性而编码具有与由本发明的多核苷酸所编码的多肽相似的活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列变化是“沉默变异”。除ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)以外，同一氨基酸的其它密码子可通过本领域认可的技术发生改变，例如，以优化在特定宿主有机体中的密码子表达。
引起编码的多肽序列中的一个或若干个氨基酸的保守置换但不显著改变其生物活性的多核苷酸序列变化，也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等人，1990，Science247，1306)。在有些实施方案中，导致非保守氨基酸置换的多核苷酸序列改变会合乎需要地产生在本文中预见到的功能变体，这样的序列改变也被包括在本发明中。
使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自BLAST程序套件(2.2.10版[2004年10月])的bl2seq程序，通过先前所述的tblastx算法，可以测定由于编码的多肽序列中的沉默变异及保守置换而产生的变体多核苷酸。
多肽变体
就多肽而言，术语“变体”涵盖天然存在的、重组地和合成地生产的多肽。变体多肽序列优选地与本发明的序列表现出至少50％、更优选至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在本发明的多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、至少100个氨基酸位置或整个长度的比较窗上，发现同一性。
多肽序列同一性可以如下方式测定。在bl2seq中使用BLASTP(来自BLAST程序套件，2.2.10版[2004年10月])将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较，bl2seq可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。除应关闭对低复杂性区域的过滤以外，利用bl2seq的默认参数。
使用总体序列比对程序，也可在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多肽序列同一性。如上文所论述的EMBOSS-needle(可获自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/)及GAP(Huang.X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applicationsin the Biosciences 10，227-235)，也是适用于计算多肽序列同一性的总体序列比对程序。
本发明的多肽变体也涵盖这样的多肽变体：其展现与可能保留序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能恰当预期随机发生。使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自BLAST程序套件(2.2.10版[2004年10月])的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。可使用以下unix命令行参数检验多肽序列的相似性：
bl2seq-i peptideseq 1-j peptideseq2-F F-p blastp
当与任一个特别鉴定的序列相比较时，变体多肽序列优选地表现出小于1x10-10、更优选地小于1x10-20、小于1x10-30、小于1x10-40、小于1x10-50、小于1x10-60、小于1x10-70、小于1x10-80、小于1x10-90、小于1x10-100、小于1x10-110、小于1x10-120或小于1x10-123的E值。
参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每一个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。对于远小于1的小E值而言，E值大致为该随机匹配的机率。
所述多肽序列的一个或若干个氨基酸的保守置换(不显著改变其生物活性)也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等人，1990，Science 247，1306)。同样地，在本发明中包括从一个或多个氨基酸的置换(包括非保守置换)产生的功能变体。
本发明的多肽变体也包括这样的变体：其由编码多肽的核酸生成，但是与野生型多肽的差别在于，它被不同地处理，使得它具有改变的氨基酸序列。例如，通过选择性剪接初级RNA转录物模式为生产野生型多肽的模式，可以生成变体。
本发明也包括保持至少一种生物活性(例如对于细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的作用)或者免疫原性/免疫学功能的变体。优选的变体是与公开的序列具有至少80％、更优选至少90％序列同一性的变体。最优选的变体是与在本文中公开的序列具有至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的变体。通过按照下面描述来比对待比较的两个序列，确定同一性百分数：测定比对部分的相同残基数，将该数除以发明(检索)序列中的残基总数，并且将结果乘以100。有用的比对程序是AlignX(Vector NTI)。
术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其用于将遗传构建体转运至宿主细胞中。所述载体可能能够在至少一个额外宿主系统(诸如大肠杆菌)中复制。
除非另有说明，否则本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、和生物化学的常规技术，它们属于本领域的技能。在例如下述文献中充分地解释了这样的技术：Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Sambrook等人，1989；以及，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Sambrook等人，2000；Oligonucleotide Synthesis，MY Gait，编，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney，编，1987；Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell，编，Blackwell Science Inc.，1987；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells，JAM.Miller & MAP.Calos，编，1987；CurrentProtocols in Molecular Biology，FEM.Ausubel等人，编，1987；和PCR：ThePolymerase Chain Reaction，Mullis等人，编，1994。
乳腺癌
乳腺癌(也称作乳癌)是在女性中最常见的癌症。乳腺癌通常起源于乳房的导管(例如，原位导管癌)和小叶(例如，原位小叶癌)。该疾病的进展和侵袭会快速的出现，该癌症通常扩散至腋窝(腋下)淋巴结。这之后可能发生转移——广泛分布至身体的其它区域，经常到达骨、肺和肝。
最常见的乳腺癌类型是侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)。IDC通常起源于导管，然后穿透导管壁，以在乳房的脂肪组织中继续生长。可能跟随着通过淋巴系统和血流的转移。
另一种常见的侵袭性乳腺癌是侵袭性小叶癌(ILC)，它起始于生产乳汁的小叶，且象IDC一样，可以转移至身体的其它部分。
存在许多不太常见的乳腺癌类型，包括炎症性乳腺癌、三重阴性乳腺癌、混合瘤乳腺癌、髓样癌、化生性癌、粘液癌、乳头的佩吉特病、小管癌、乳头状癌、腺样囊性癌(囊性腺样癌)、叶状瘤和乳房的血管肉瘤。
与乳腺癌有关的主要危险因素包括：家族史、年龄、性别、雌激素水平、饮食、吸烟和肥胖。
本发明提供了适用于治疗和诊断乳腺癌的方法和组合物，所述乳腺癌对一种或多种治疗是抗性的。乳腺癌的治疗可以包括：外科手术、辐射治疗、激素治疗或化学疗法。
用于治疗乳腺癌的化学治疗剂可以分成3类：蒽环类抗生素(它们会改变DNA结构)，紫杉烷类(它们会阻止癌细胞分裂)和烷基化剂(它们会造成DNA的烷基化)。蒽环类抗生素的实例包括：表柔比星(Ellence
Figure BDA00001770713200311
)和多柔比星(阿霉素
Figure BDA00001770713200312
)。紫杉烷类包括：紫杉醇(泰素
Figure BDA00001770713200313
)和多西他赛(泰索帝
Figure BDA00001770713200314
)，而烷基化剂包括环磷酰胺(Cytoxin
Figure BDA00001770713200315
)。其它常用于治疗乳腺癌的化学治疗剂包括：甲氨蝶呤(
Figure BDA00001770713200316
Figure BDA00001770713200317
Figure BDA00001770713200318
)、氟尿嘧啶(氟尿嘧啶
Figure BDA00001770713200319
5-Fu、Adrucil
Figure BDA000017707132003110
)、长春瑞滨(诺维本
Figure BDA000017707132003111
)、吉西他滨(健择)和卡培他滨(希罗达
Figure BDA000017707132003113
)。
乳腺癌的激素治疗可以分类为：选择性的雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、生物应答修饰剂和其它激素治疗。这些在下面予以简单讨论。
SERMS在癌细胞起雌激素受体拮抗剂的作用。实例包括：他莫昔芬、雷洛昔芬(易维特)和阿佐昔芬。芳香酶抑制剂如下起作用：结合酶芳香酶，从而抑制该酶对雌激素的生产。这会造成癌细胞饥饿，从而阻止细胞生长和分裂。实例包括：依西美坦(阿诺新
Figure BDA000017707132003115
)，来曲唑(Femera
Figure BDA000017707132003116
)，阿那曲唑(瑞宁得
Figure BDA000017707132003117
)和甲地孕酮(梅格施
Figure BDA000017707132003118
)。生物应答修饰剂如下起作用：结合在癌细胞中表达的某些蛋白，从而阻止肿瘤的进一步生长。一个实例是曲妥单抗(赫赛汀
Figure BDA000017707132003119
)，即结合癌细胞中的HER2的单克隆抗体。其它激素治疗包括：醋酸戈舍瑞林(诺雷德
Figure BDA000017707132003120
)(即一种合成的促黄体素释放素，其会阻断乳腺癌细胞中的雌激素的释放)和氟维司群(Faslodex
Figure BDA000017707132003121
)(其会破坏癌细胞中的雌激素受体)。
辐射治疗可以是用于治疗所有阶段的乳腺癌的有效护理标准，但是，通常在外科手术(病灶切除术或乳房切除术)以后推荐它。用于治疗乳腺癌的外科手术很少是可行选择，这是由于该级别的非特异性性质，和癌症很少局限于器官中的一个地点的事实。
已经提出了乳腺癌细胞变成具有治疗抗性的许多不同机理。在根本上，对治疗的抗性部分地由遗传放大造成，其中使用单一药剂的每次治疗都会选择出对治疗越来越有抗性的那些癌细胞。这会有效地减少这样的细胞对其它治疗的应答性。
更具体地，已经鉴别出多个抗性机理，包括：减少的药物蓄积，减少的药物流入，增加的药物流出，改变的细胞内药物运输，增加的药物或毒性中间体的失活，增加的治疗诱发的损伤的修复或增加的对治疗诱发的损伤的耐受性，减少的药物活化，一种或多种药物靶标、辅因子或代谢物水平的改变，细胞毒性的下游效应物、信号传递途径或对药物的细胞凋亡应答的改变，改变的基因表达(包括通过突变、扩大或消除、改变的转录、转录后加工或翻译)，药理学或解剖学药物屏障(所谓的“肿瘤圣所”)的形成，和宿主-药物相互作用，包括：增加的正常组织对药物的灭活，减少的正常组织对药物的活化，和相对增加的正常组织药物敏感性(毒性)。
乳腺癌细胞形成对治疗剂的抗性的具体机理仍然不明。但是，最新的研究提示了不同的细胞凋亡途径或细胞存活途径的作用。
外在的细胞凋亡途径会被肿瘤坏死因子家族的成员和各自的配体活化。内在的线粒体途径通常响应于细胞内应激信号(作为例如DNA损伤的结果)或胞外刺激(诸如辐射、化学治疗药物和病毒感染)而被活化。Bcl-2家族的蛋白(它们调节细胞色素C的释放)在内在细胞凋亡的调节中起重要作用，且Bcl-2的过表达已经涉入癌症化学抗性中。
广泛地报道了p53在细胞对不同应激(诸如癌基因、化学治疗剂、缺氧和异常生长因子信号传递)的防御中的涉入。具体地，p53在细胞周期控制和进展中的涉入，提示它的表达可能是对特定化疗药物的敏感性的重要决定因素。
细胞存活途径是多种多样的，且包含广范围的生理刺激。最近已经报道，磷脂酰肌醇3-激酶/AKT(PI3K/AKT)途径在针对抗肿瘤药物的抗性中起作用。具体地，据报道，肿瘤抑制基因PTEN的表达会通过诱导细胞凋亡来显著增加多柔比星化学敏感性，而PI3K p110-β的击倒(knock-down)会刺激肿瘤生长(通过调节细胞周期蛋白E和Bcl-2)。
已经假定涉及环加氧酶(Cox)和前列腺素的另一种机理，该机理包含活化诸如IAP(细胞凋亡蛋白的抑制剂)等抗细胞凋亡基因的转录。
例如，乳腺癌患者中的他莫昔芬抗性已经被归因于许多不同的机理。这样的机理的实例包括：雌激素受体(ER)中的突变(其影响药物与ER结合并引起应答的能力)、由减少的流入或增加的流出导致的他莫昔芬细胞内可用性减小、增加的他莫昔芬向激动性代谢物的代谢以及HER2在癌细胞中的过表达。
本发明认识到，在多种乳腺癌中，artemin的功能拮抗剂可有效地使癌细胞对治疗重新敏化。
artemin的功能拮抗剂
申请人已经证实，artemin在许多乳腺癌细胞系(包括MCF-7、BT549和MDA-231)中表达。本发明认识到，artemin功能的拮抗剂可用于治疗乳腺癌，其通过使乳腺癌对一种或多种治疗(诸如一种或多种治疗)重新敏化来终止乳腺癌的进展、转移或再现。
本文公开的数据证实，artemin功能的拮抗剂(具体地，抗-artemin抗体和抗-artemin siRNA)会重新敏化治疗抗性的乳腺癌细胞，以有效地抑制ER+和ER-乳癌细胞中的细胞侵袭和锚着非依赖性的生长(癌症生长和转移中的2种重要生物活性)。这样，artemin功能的拮抗剂代表用于乳腺癌治疗和诊断的理想新试剂。抵消、减少或抑制artemin的生物活性的artemin功能拮抗剂(例如抗-artemin抗体)可以用于使乳腺癌细胞对抗癌治疗重新敏化，所述抗癌治疗包括涉及下述方式的那些：抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞存活、抑制癌细胞能动性和/或抑制致癌性。这些功能拮抗剂可以与其它药剂结合地施用，所述其它药剂是例如：化学化合物(例如，小分子和化学治疗剂)、受体激动剂或拮抗剂、其它抗体、iRNA和放射治疗。
抗-artemin抗体
本发明包括这样的方法和组合物：其使用artemin的抗体，例如，结合artemin的至少一部分或修饰的序列的抗体(在本文中也称作“抗-artemin抗体”)。在某些实施方案中，抗-artemin抗体可以用于拮抗由artemin介导的一种或多种功能。例如，抗-artemin抗体可以干扰或减少artemin与受体的结合。在另一个实施例中，抗-artemin抗体可以干扰或减少artemin-结合的受体与信号转导分子(否则在没有抗-artemin抗体的情况下，artemin-结合的受体会与其结合或相互作用)的结合或相互作用。在本发明的某些方面，抗-artemin抗体可以用于抑制artemin。应该理解，为了本发明的目的，抗体的片段或修饰不需要完全像抗体一样起作用。也就是说，该片段或其它修饰不需要能够将免疫系统细胞在体内募集到结合artemin的位点。不需要生产中和抗体。本发明相关领域的普通技术人员将认识到产生抗体片段的方法。本发明的抗体片段可以包括完整抗体之一的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。然而，作为一般实例，通过完整抗体的蛋白水解消化，可以产生片段，或者通过重组核酸技术，可以直接地生产片段。
应该理解，已知基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区相连，而重链也包括约10或更多个氨基酸的“D”区。通常参见，Fundamental Immunology第7章(Paul，W.，ea.，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
基于同种型和表位作图、生化表征，以及通过功能表征(诸如它们的下述能力：阻断artemin与一种或多种受体的结合，或阻断artemin-结合的受体与信号转导分子的结合)，可以表征适用于本发明的抗体。阻断配体结合或活化的试剂，可用于在本文中公开的多种病症的治疗方法中。也预见到这样的抗体：其识别artemin和/或相关配体，但不能阻断受体结合。在不同的实施方案中，这样的抗体可用于检测和纯化这样的配体，以及用于如下文所详述的诊断和监测病症在受试者中的进展的方法中。这样的抗体也可用于分析配体或它的其它修饰序列的翻译后修饰。
抗体的人源化可用于降低在其它动物中产生的抗体免疫原性。使用本领域已知的技术，可以实现人化抗体的生产或抗体的人源化，例如在鼠抗体的人源化的情形下，通过表位定向选择。将啮齿动物单克隆抗体人源化的最常用策略是：CDR移植(Reichmann，L.，M.Clark，H.Waldman，和G.Winter.1998.Reshaping human antibodies for therapy.Nature332L323-327；Jones PT，Dear PH，Foote J，Neuberger MS，Winter G.1986.Replacing the complementarity determining regions in a human antibodywith those from a mouse.Nature 321：522-25)和表面重塑(Pedersen，J.T.，A.H.Henry，S.J.Searle，B.C.Guild，M.Roguska，和A.R.Rees.1994.Comparison of surface accessible residues in human and murineimmunoglobulin Fv domains.Implication for humanization of murineantibodies.J.Mol.Biol.235：959-973)。也可以使用表位定向选择来实现抗体的人源化(Wang等人，J.Immunological Methods 241：171-184，2000)。
Maynard，J.，和Georgiou，G.2000.Antibody engineering.Annu RevBiomed Eng 2：339-376的方法提供了其它实例。
基于合理的设计方案以及反复优化，即由计算机模型化辅助的框架残基的定点突变，可以生产人化抗体。可使用利用噬菌体展示的其它选择性人源化策略。参见，例如，Baca，M.，L.G.Presta，S.J.O’Connor，和J.A.Wells.1997.Antibody humanization using monovalent phage display.J.Biol.Chem.272：10678-10684；Hoogenboom，H.R.，A.P.de Bruine，S.E.Hufton，R.M.Hoet，J.W.Arends，和R.C.Roovers.1998.Antibody phagedisplay technology and its applications.Immunotechnology.4：1-20；Jespers，L.S.，A.Roberts，S.M.Mahler，G.Winter，和H.R.Hoogenboom.1994.Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoiresto a single epitope of an antigen.Biotechnology(NY)12：899-903；Rader，C.和C.F.Barbas，III.1997.Phage display of combinatorial antibodylibraries.Curr.Opin.Biotechnol.8：503-508；Rader，C.，D.A.Cheresh，和C.F.Barbas，III.1998.A phage display approach for rapid antibodyhumanization：designed combinatorial V gene libraries.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：8910-8915；Rosok，M.J.，D.E.Yelton，L.J.Harris，J.Bajorath，K.E.Hellstrom，I.Hellstrom，G.A.Cruz，K.Kristensson，H.Lin，W.D.Huse，和S.M.Glaser.1996.A combinatoriallibrary strategy for therapid humanization of anticarcinoma BR96Fab.J.Biol.Chem.271：22611-22618。
在其它方面，使用用人免疫球蛋白基因座重构的转基因动物品系(例如，XenoMouse品系)，可以生产人抗体。这样的品系使得在动物宿主中产生全人抗体成为可能(Mendez，M.J.，L.L.等人1997.Functionaltransplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates humanantibody response in mice.Nat.Gen.15：146-156)。具体地，XenoMouse动物在它们的基因组中包括含有66个人重链和32个κ轻链免疫球蛋白基因的酵母人工染色体(YAC)，其中所述内源重链和κ基因座通过靶向缺失而在功能上灭活(Mendez等人，同上)。小鼠表达人μ、δ、γ2和κ链和小鼠λ链，其中人κ与小鼠λ的比率为75∶1(Mendez等人，同上)。以前已证实，XenoMouse动物会生产针对蛋白抗原的人抗体(Green，L.L.，等人1994.Antigen-specific human monoclonal antibodies from miceengineered with human Ig heavy and light chain YACs.Nat.Gen.7：13-21；Mendez等人，同上)，并且也可对T非依赖性抗原(如多糖)做出应答。作为一个实例，可以使用两组或更多组遗传上不同的XenoMouse动物来生产抗体，例如：Xm2a-3品系，其由一种含有重链和轻链基因的双YAC重构；以及Xm2a-5品系，其由两种YAC重构，一种具有重链而另一种具有轻链基因(Jakobovits，A.1995.Production of fully human antibodies bytransgenic mice.Curr.Opin.Biotechnol.6：561-566；也参见，Russell ND等人，Production of protective human antipneumococcal antibodies bytransgenic mice with human immunoglobulin loci.Infect Immun.2000Apr；68(4)：1820-6)。
本发明相关领域的技术人员会理解术语“双体”和“三体”。这些是这样的分子：所述分子包括通过短肽连接物与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)，所述短肽连接物因为太短而不能允许同一链上的两个结构域之间配对。这促使与一条或多条其它链的互补结构域配对，并促进与两个或更多个功能抗原结合位点的二聚或三聚分子的形成。生成的抗体分子可为单特异性的或多特异性的(例如，在双体的情形下，为双特异性的)。使用本发明相关领域的标准方法，可以从两种或更多种抗体产生这样的抗体分子(参见，例如，Todorovska等人Design and application ofdiabodies，triabodies，and tetrabodies for cancer targeting.J.Immunol.Methods.2001Feb 1；248(1-2)：47-66；Holliger P，Prospero T，和Winter G，Diabodies：small bivalent and bispecific antibody fragments，Proc NatlAcad Sci USA，90，6444-6448，1993；以及Tomlinson I和Holliger P，Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments，Methods Enzymol，326，461-479，2000)。
可根据本领域的标准方法进行抗体的生产。例如，在生产多克隆抗体的情形下，可使用Bean描述的方法(Eric S.Bean(2001)PolyclonalAntibodies.见：Basic Methods in Antibody Production andCharacterization antibodies.Howard，G，和Bethel D.(编)，CRC Press，5：21-50，2000)。例如，根据Stewart(Sandy J.Stewart(2001)MonoclonalAntibody Production.见：Basic Methods in Antibody Production andCharacterization antibodies.Howard，G.And Bethel D.(编)，CRC Press，6：51-68，2000)或在Monocolonal Antibody Production Techniques andApplications，Lawrence B Schook编，Marcel Dekker Inc.，New York，1987中的方法，可以制备单克隆抗体和对应的杂交瘤。使用本领域的标准技术，可以亚克隆、生长和维持杂交瘤。例如，它们可在诸如DMEM或RPMI-1640等培养基中在体外生长和维持。或者，这可以在所选择的动物中在体内作为腹水瘤进行。
通过标准的重组技术，也可生产用于本发明的抗体(参见，例如，Siegel(2002)Siegel DL，Recombinant monoclonal antibody technology，Transfus Clin Biol，9(1)：15-222002；Welschof，M.，C.Christ，I.Hermes，A.Keller，C.Kleist，和M.Braunagel.2003.Generation and screening of amodular human scFv expression library from multiple donors.MethodsMol.Biol.207：103-121)。发明人认为，重组技术是商业规模上优选的生产抗体的手段。基于抗体的氨基酸序列、遗传密码和其中所理解的简并性，可以容易地鉴定编码抗体的多核苷酸。例如，使用本领域的标准操作，可以从杂交瘤细胞分离出编码抗体的多核苷酸，并随后表征。例如，基于抗体的一部分的氨基酸序列，可以设计多核苷酸探针，并随后用于分离编码抗体的重链和/或轻链的基因。或者，通过标准的化学合成方法，例如使用亚磷酰胺和固相化学，可以产生多核苷酸。可使用标准方法确定本发明的抗体的氨基酸序列；例如可使用Edman降解和HPLC或质谱分析。
应该理解，适用于本发明中的抗-artemin抗体包括：抗体片段，以及在本文中特别地提及的抗体的修饰，象这样也可以适当地修饰编码所述抗体的核酸。例如，重链和轻链恒定结构域的编码序列可被同源人结构域代替。或者，可将CDR移植到同源的人β折叠框架上。以此方式，可通过重组技术产生抗体修饰，例如人化抗体。如本文所述，通过标准重组规程，可以生产适用于本发明的抗体。因此，本发明也预见到：编码抗体、抗体片段或其修饰的多核苷酸，包括所述多核苷酸的构建体，以及包括所述构建体的宿主细胞。根据本发明的多核苷酸可为DNA、RNA或cDNA，例如双链或单链、有义或反义序列，如在本文中所述。
例如，使用本发明相关领域已知的标准规程，可以从培养物上清液、腹水或血清中分离出适用于本发明的抗体。通过一种或多种方法，诸如亲和色谱法、离子交换色谱法、相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、嗜硫凝胶色谱法、色谱聚焦、蛋白A或G琼脂糖柱、羟基磷灰石柱、去污剂提取、电泳、渗透冲击处理、包涵体纯化、硫酸铵沉淀、与液态聚合物一起离心、过滤和透析，也可以进行分离或纯化。使用本领域的多种标准技术，可以从转化的宿主细胞或培养基或转基因生物体中回收本发明的重组抗体。应该理解，使用标准方法，例如使用Edman降解和HPLC或质谱分析(M.W.Hunkapiller，R.M.Hewick，W.J.Dreyer，和L.E.Hood.1983.High-Sequencing with a Gas-Phase Sequenator.Methods Enzymol.91：399)，可以测定本发明抗体的氨基酸序列。
可以使用标准方法来鉴定用于抗体生产的氨基酸序列。例如，通过Abie Pro 3.0：肽抗体设计(超文本传输协议：//www.changbioscience.com/abie/abie.html)，可以预测多肽的抗原区段。更具体地，根据Hopp-Woods scale(Hopp TP，Woods KR.Prediction ofprotein antigenic determinants from amino acid seq uences.Proc Natl AcadSci U S A.1981Jun；78(6)：3824-8.)和/或Kyte和Doolittle scale(Kyte J，Doolittle RF.A simple method for displaying the hydropathic character ofa protein.J Mol Biol.1982May 5；157(1)：105-32.)，可以预测抗原区段。具体的计算机程序包括：MAPAG(Aguilar RC，Retegui LA，Roguin LP IntJ Biomed Comput.1994Nov-Dec；37(3)：225-35)；PEOPLE(Alix AJ.：Vaccine.1999Sep；18(3-4)：311-4)；和HYDRPHIL(E A Mesri等人J ClinMicrobiol.1990June；28(6)：1219-1224)。这样的表位可为构象特异性的，因为它们可以包括非连续残基，并且可构成预测的抗原序列的不同部分，或者预测的抗原序列的一个或多个部分的组合，或者一种或多种全长序列。抗原序列可以包括能形成与在天然多肽中所遇到的类似3-D结构(例如表面残基)的氨基酸或其衍生物的任何组合。
对于artemin，可以使用序列分析来预测用于抗体生产的抗原序列。这些配体的序列信息是可广泛获得的(参见，例如，Rosenblad C，GronborgM，Hansen C，Blom N，Meyer M，Johansen J，Dago L，Kirik D，Patel UA，Lundberg C，Trono D，Bj orklund A，Johansen TE.In vivo protection ofnigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novelGDNF-family member neublastin/artemin.Mol Cell Neurosci.2000Feb；15(2)：199-214.Erratum见：Mol Cell Neurosci 2001Sep；18(3)：332-3)。在示例性的序列分析中，Abie Pro 3.0：肽抗体设计(超文本传输协议：//www.changbioscience.com/abie/abie.html)表明，根据Hopp-Woods scale和Kyte和Doolittle scale(Hopp TP，Woods KR.Prediction of proteinantigenic determinants from amino acid sequences.Proc Natl Acad Sci U SA.1981Jun；78(6)：3824-8；Kyte J，Doolittle RF.A simple method fordisplaying the hydropathic character of a protein.J Mol Biol.1982May5；157(1)：105-32)，它们是两个高度抗原性的区段。
artemin的这些抗原序列包括：PPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARG(残基1-43，相对于140个氨基酸的经加工的最大的成熟蛋白；SEQ ID NO：7)和GALRPPPGSRPVSQP(残基92-106；SEQ ID NO：8)。此外，14个氨基酸的27种抗原肽预测如下：PPPQPSRPAPPPPA(残基1-14；SEQ IDNO：9)；PPQPSRPAPPPPAP  (残基2-15；SEQ ID  NO：10)；PQPSRPAPPPPAPP(残基3-16；SEQ ID NO：11)；QPSRPAPPPPAPPS(残基4-17；SEQ ID NO：12)；PSRPAPPPPAPPSA(残基5-18；SEQ IDNO：13)；SRPAPPPPAPPSAL  (残基6-19；SEQ ID NO：14)；RPAPPPPAPPSALP(残基7-20；SEQ ID NO：15)；PAPPPPAPPSALPR(残基8-21；SEQ ID NO：16)；APPPPAPPSALPRG(残基9-22；SEQ IDNO：17)；PPPPAPPSALPRGG(残基10-23；SEQ ID NO：18)；PPPAPPSALPRGGR(残基11-24；SEQ ID NO：19)；PPAPPSALPRGGRA(残基12-25；SEQ ID NO：20)；APPSALPRGGRAAR(残基14-27；SEQID NO：21)；PPSALPRGGRAARA(残基15-28；SEQ ID NO：22)；PSALPRGGRAARAG(残基16-29；SEQ ID NO：23)；LPRGGRAARAGGPG(残基19-32；SEQ ID NO：24)；PRGGRAARAGGPGS(残基20-33；SEQ ID NO：25)；RGGRAARAGGPGSR(残基21-34；SEQ ID NO：26)；GGRAARAGGPGSRA(残基22-35；SEQ ID NO：27)；GRAARAGGPGSRAR(残基23-36；SEQ ID NO：28)；RAARAGGPGSRARA(残基24-37；SEQ ID NO：29)；ARAGGPGSRARAAG(残基26-39；SEQ ID NO：30)；AGGPGSRARAAGAR(残基28-41；SEQ ID NO：31)；GGPGSRARAAGARG(残基29-43；SEQ ID NO：32)；GALRPPPGSRPVSQ(残基92-105；SEQ ID NO：33)；ALRPPPGSRPVSQP(残基93-106；SEQ ID NO：34)。
除了治疗用途以外，针对artemin的抗体可用于本发明的诊断用途。本领域普通技术人员将容易地理解用于确定抗体使一个或多个癌细胞对治疗重新敏化(例如，预防、减少或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性)的效力的方法，并因而会理解，如何将这样的方法用于诊断用途。然而，作为实例，可使用在本文其它地方描述的方法，包括在实施例部分中提及的一种或多种试验。
artemin的核苷酸功能拮抗剂
本领域技术人员会认可，使用本领域众所周知的核苷酸试剂作为基因表达的抑制剂或基因产物表达或功能的抑制剂，可以容易地实现artemin的功能拮抗剂。
siRNA、shRNA和反义多核苷酸
在基因型与基因的增量调节表达有关的情况下，可以执行使用例如RNAi、siRNA、shRNA或反义方法的治疗，以减少mRNA的丰度，并如此减少所述基因的表达。
“RNAi分子”或“siRNA”表示形成双链RNA的核酸，当所述siRNA在与基因或靶基因相同的细胞中表达时，所述双链RNA具有减少或抑制基因或靶基因的表达的能力。“siRNA”因而表示，通过互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常具有大量的或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA表示这样的核酸：其与靶基因具有大量的或完全的同一性，并形成双链siRNA。siRNA的序列可以与全长靶基因或其亚序列相对应。通常，siRNA的长度是至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度是15-50个核苷酸，双链siRNA的长度是约15-50碱基对，优选约20-30个碱基核苷酸、优选约20-25个核苷酸长度，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度)。
“shRNA”或“短发夹RNA”表示，与紧密的发夹环形成双链RNA的核酸，其具有通过裂解成siRNA而减少或抑制基因或靶基因的表达的能力。
“反义”多核苷酸是这样的多核苷酸：其与靶多核苷酸基本上互补，且具有与靶多核苷酸特异性地杂交的能力。反义多核苷酸可以用于减少靶基因的表达。
除了治疗用途以外，针对artemin的核苷酸拮抗剂(诸如siRNA、shRNA或抗-反义多核苷酸)可用于本发明的诊断用途。本领域普通技术人员将容易地理解用于确定这种拮抗剂使一个或多个癌细胞对治疗重新敏化(例如，预防、减少或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性)的效力的方法，并因而会理解，如何将这样的方法用于诊断用途。然而，作为实例，可使用在本文其它地方描述的方法，包括在实施例部分中提及的一种或多种试验。
artemin多核苷酸
本发明包括artemin多核苷酸用于制备表达载体和宿主细胞的用途，和用于制备artemin功能的拮抗剂性(包括反义多核苷酸和iRNA，包括shRNA和siRNA)的用途。
用于本发明中的artemin多核苷酸包括一个或多个选自下述的序列：(a)包括选自SEQ ID NO：1-34或其修饰的至少一个氨基酸序列的编码序列的序列；(b)选自SEQ ID NO：1-34或其修饰的至少一个氨基酸序列的编码序列的补体、反向序列和反向补体；(c)选自SEQ ID NO：1-34或其修饰的至少一个氨基酸序列的编码序列中含有的开放读码框；(d)选自SEQ ID NO：1-34或其修饰的至少一个氨基酸序列的编码序列的功能结构域；(e)包括选自选自SEQ ID NO：1-34或其修饰的至少一个氨基酸序列的编码序列的至少指定数量的连续核苷酸的序列；和(f)包括选自GenBank登记号：NM_003976、NM_057091、NM_057160、NM_057090、NM_001136215或NM_057090或其补体或修饰序列的序列的至少指定数量的连续核苷酸的序列。在一个具体实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括选自SEQ ID NO：1-34的至少一个氨基酸序列的编码序列。也提供了寡核苷酸探针和引物以及它们的修饰。在本文中将所有这些多核苷酸和寡核苷酸探针和引物总体上称作本发明的多核苷酸。
本领域技术人员会理解，作为遗传密码简并性的结果，可产生大量编码artemin多肽的核苷酸序列，其中一些与任何已知的及天然存在的基因的核苷酸序列具有最小同源性。因此，本发明预见到通过基于可能的密码子选择来选择组合而可以得到的核苷酸序列的每个可能的变化。根据适用于天然存在的氨基酸序列的标准三联体遗传密码做出这些组合，并且认为具体地公开了所有此种变化。
artemin的核苷酸序列或其修饰优选地能够在适当选择的严谨性条件下与天然存在序列的核苷酸序列杂交。然而，产生具有基本上不同的密码子选择的核苷酸序列或其修饰可能是有益的。根据特定密码子被特定原核细胞或真核细胞宿主利用的频率，可以选择密码子，以增加在所述宿主中表达多肽的比率。实质上改变核苷酸序列及其衍生物而不改变编码的氨基酸序列的其它原因包括：与天然存在序列所产生的转录物相比，具有更希望的性质(例如更大的半衰期)的RNA转录物的产生。
本发明也包括完全通过合成化学来生产artemin的多核苷酸或其修饰。生产以后，使用本领域众所周知的试剂，可以将合成的序列插入到许多可用的表达载体和细胞系统中的任一个中。此外，使用合成化学可将突变引入核苷酸序列或其任何衍生物中。本发明也包括能够在如Wahl，G.M.And S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152：399-407)和Kimmel，A.R.(1987；Methods Enzymol.152：507-511)所教导的不同严谨性条件下与要求保护的核苷酸序列(具体地，在选自GenBank登记号：NM_003976、NM_057091、NM_057160、NM_057090、NM_001136215或NM_057090的序列中所示的那些，或其补体或修饰序列)杂交的多核苷酸序列。
本领域众所周知的和通常可用的DNA测序方法，可以用于实践本发明的任何实施方案。所述方法可使用酶，诸如DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE(U.S.Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、热稳定的T7聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，或聚合酶的组合，以及校对外切核酸酶，诸如在ELONGASE Amplification System(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中所见的那些。优选地，该方法用仪器自动完成，所述仪器例如HamiltonMicro Lab 2200(Hamilton、Reno、NV)、Peltier热循环仪(PTC200；MJResearch、Watertown、MA)、ABI催化剂以及373和377DNA测序仪(Perkin Elmer)，或基因组测序仪20TM(Roche Diagnostics)。
利用部分核苷酸序列，并使用本领域已知的多种方法，可以延伸核酸序列，以检测上游序列如启动子和调控元件。例如，一种可使用的方法是“限制位点”PCR，其使用通用引物来回收与已知基因座相邻的未知序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2：318-322)。具体地，首先在连接物序列的引物和对已知区域特异性的引物存在下，扩增基因组DNA。然后使用相同的连接物引物和在第一种特异性引物内的另一个特异性引物，对扩增的序列进行第二轮PCR。用适当的RNA聚合酶转录每轮PCR的产物，并用反转录酶来测序。
使用可商业得到的毛细管电泳系统，可以分析测序或PCR产物的大小或者确认其核苷酸序列。具体地，毛细管测序可使用用于电泳分离的可流动聚合物，由激光活化的四种不同荧光染料(每种用于一种核苷酸)，以及用电荷耦合器件照相机检测发射波长。使用适当的软件(例如GENOTYPER和Sequence NAVIGATOR，Perkin Elmer)，可以将输出/光强度转变成电信号，并且可由计算机控制从上样到计算机分析以及电子数据显示的整个过程。对于可能在特定样品中以有限量存在的小片DNA的测序，尤其优选毛细管电泳。
用于本发明中的组合物
artemin功能的拮抗剂(例如，抗-artemin抗体或抗体片段)可以单独使用，或者以与一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂相组合的组合物的形式使用。artemin功能的拮抗剂或包含artemin功能的拮抗剂的组合物可以与抗癌治疗剂(例如，一个或多个癌细胞具有抗性的抗癌治疗剂)组合地使用。本发明相关领域的技术人员将容易地理解可用于本发明组合物中的多种药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂。应该理解，这样的稀释剂、载体和/或赋形剂的选择，将在一定程度上由所用试剂的性质、想要的组合物剂型以及给药模式决定。作为实例，在施用多核苷酸(例如适合表达抗体或抗体片段的载体)的情形下，合适的载体包括等渗溶液、水、盐水溶液、葡萄糖水溶液等。
除了标准的稀释剂、载体和/或赋形剂以外，本发明的药物组合物可与其它组分一起或以某种方式来配制，从而增强试剂活性或帮助保护试剂的完整性。例如，所述组合物可进一步包括佐剂或这样的组分，所述组分在施用给受试者后会提供针对降解的保护或减少试剂的抗原性。或者，可以修饰试剂，以便允许靶向特定的细胞、组织或肿瘤。
可配制试剂以结合持续释放系统。因为该情形，组合物可以包括成型制品形式的半渗透聚合物基质，例如膜，或微胶囊。持续释放基质包括：聚丙交酯(美国专利号3,773,919；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers：22：547-56)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.：15：267)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.：15：267)、或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
本发明的试剂也可配制成脂质体。使用本发明相关领域已知的技术，可以制备包含所述化合物的脂质体。作为实例，参见：DE 3,218,121、EP52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、日本专利申请83-118008、美国专利号4,485,045和4,544,545和EP 102,324。通常，脂质体为小的(从或约200至800埃)单层形式，其中脂质含量大于约30mol％胆固醇，针对最有效的治疗来调整所选比例。也可将用于本发明中的试剂聚乙二醇化，以增加它们的寿命。
另外，预见到，根据本发明的组合物可与在特定情况下有益于受试者的其它成分一起配制，artemin功能的拮抗剂可以与其它试剂共同施用，所述其它试剂是例如：化学化合物，诸如小分子，以及受体激动剂或拮抗剂，其它抗体，反义多核苷酸和iRNA。另外，在适当的时候，掺入一种或多种抗肿瘤剂可能是有益的。此种试剂的实例包括：烷基化剂，例如，苯丁酸氮芥(例如，LeukeranTM)、环磷酰胺(例如，安道生TM、CycloblastinTM、NeosarTM、CyclophosphamideTM)、异环磷酰胺(例如，和乐生TM、IfexTM、MesnexTM)、塞替派(例如，ThioplexTM、ThiotepaTM)；和抗代谢物/S-相抑制物，例如，甲氨蝶呤钠(例如，FolexTM、AbitrexateTM、EdertrexateTM)、5-氟尿嘧啶(例如，EfudixTM、EfudexTM)、羟基脲(例如，DroxiaTM、Hydroxyurea、HydreaTM)、安吖啶、吉西他滨(例如，健择TM)、达卡巴嗪、硫鸟嘌呤(例如，兰快舒TM)。
还包括抗代谢物/有丝分裂毒物，例如，依托泊苷(EtopophosTM、Etoposide、ToposarTM)、长春碱(例如，VelbeTM、VelbanTM)、长春地辛(vindestine)(例如，EldesineTM)、长春瑞滨(例如，诺维本TM)、紫杉醇(例如，泰素TM)；抗生素型试剂，例如，多柔比星(例如，RubexTM)、博来霉素(例如，BlenoxaneTM)、更生霉素(例如，CosmegenTM)、柔红霉素(例如，CerubidinTM)、丝裂霉素(例如，MutamycinTM)；激素类试剂，例如，氨鲁米特(例如，CytadrenTM)、阿那曲唑(例如，瑞宁得TM)、雌莫司汀(例如，EstracytTM、EmcytTM)、戈舍瑞林(例如，诺雷德TM)、六甲基三聚氰胺(例如，HexametTM)、来曲唑(例如，FemaraTM)、阿那曲唑(例如，瑞宁得TM)和他莫昔芬(例如，EstroxynTM、GenoxTM、NovaldexTM、SoltamoxTM、TamofenTM)。
另外包括任何两种或更多种抗肿瘤剂的组合(例如，阿霉素/5-氟尿嘧啶/环磷酰胺(FAC)；和环磷酰胺/甲氨蝶呤/5-氟尿嘧啶(CMF))。尤其有用的是包括例如至少两种或更多种下述试剂的组合：例如，环磷酰胺(例如，CYTOXAN)、甲氨蝶呤(例如，RHEUMATREX)、5-氟尿嘧啶(例如，ADRUCIL)、多柔比星(例如，阿霉素)和环磷酰胺(例如，CYTOXAN)。可用于转移性疾病的试剂是：例如，卡培他滨(例如，希罗达)、多柔比星(例如，阿霉素)包括它的脂质体制剂、吉西他滨(例如，健择)、紫杉烷类，包括紫杉醇(例如，泰素)和多西他赛(例如，泰索帝)、长春瑞滨(例如，诺维本)和曲妥单抗(例如，赫赛汀)。本发明相关领域的普通技术人员将容易地理解可能有益的其它试剂的实例。根据已接受的药学实践，本发明的试剂也可与除了在本文中所具体提及的那些以外的化合物和试剂一起配制。
应该理解，在施用多核苷酸(例如，artemin功能的核苷酸拮抗剂的表达载体，或抗体或抗体片段的表达载体)的情形下，可将它们包装进病毒递送系统中，所述病毒系统自身可配制成本文所述的组合物。本发明相关领域的技术人员可理解具有本文所述的发明性质的多种适合的病毒载体。然而，作为实例，可以使用反转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)。本发明相关领域的技术人员将容易地理解可用于实施本发明的此种载体的方法。然而，仅作为实例，反转录病毒载体的使用报道于：Miller等人，1993，Meth.Enzymol.217：581-599，和Boesen等人，1994，Biotherapy 6：291-302；腺病毒载体的使用报道于例如：Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503；Rosenfeld等人，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell 68：143-155；Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开WO94/12649；和Wang，等人，1995，Gene Therapy 2：775-783；并且，AAV的使用已经报道于：Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利号5,436,146。
根据要使用的给药模式以及所用的适当的药学赋形剂、稀释剂和/或载体，本发明的组合物可适于常规剂型，例如溶液、可口服施用的液体、可注射的液体、片剂、包衣片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、透皮贴剂、混悬液、乳剂、持续释放制剂、凝胶、气雾剂、脂质体、粉剂和免疫脂质体。所选剂型将反映期望使用的给药模式、待治疗的病症以及所用试剂的性质。特别优选的剂型包括：可口服施用的片剂、凝胶、丸剂、胶囊、半固体、粉剂、缓释制剂、混悬液、酏剂、气雾剂、软膏剂或用于局部给药的溶液、以及可注射的液体。熟练技术人员将容易地认识到适当的剂型和配制方法。通常，通过使特定试剂和成分彼此接触或混合来制备组合物。然后，如果需要，将产物成型为想要的制剂。作为实例，用于配制组合物的某些方法可参见参考文献，诸如Gennaro AR：Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，2000。
根据组合物的类型、单位剂量的大小、载体、稀释剂和/或赋形剂的种类以及本领域普通技术人员公知的其它因素，可以宽泛地改变在组合物中的artemin功能的拮抗剂的量。一般而言，最终的组合物可以包括0.0001重量％(w％)至100w％的artemin功能的拮抗剂，优选0.001w％至10w％，余量为存在的任何其它活性试剂和/或载体、稀释剂和/或赋形剂。例如，本文所述的抗-artemin抗体或抗体片段可以以下述量存在于组合物中：约0.001-99.99重量％、更优选约0.01-20重量％、更优选约1-5重量％。具体地，所述抗体或抗体片段可以以1-100mg/ml(例如，10mg/ml)的浓度存在。这些抗体或抗体片段可以以低压冻干或水溶液的形式提供。其它量也可能是合适的。
一般的载体和具体的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。所述载体可以在单独的无菌容器中或与所述抗体混合地提供。通常，盐水、醇的水溶液、白蛋白-盐水溶液和丙二醇溶液是合适的。但是，也可以使用其它载体。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度对受体是无毒的，且包括：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐，其pH通常为5.0-8.0，最经常为6.0-7.0；盐诸如氯化钠、氯化钾等，用于产生等渗性；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白、亲水聚合物诸如聚山梨酯80、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖类和本领域技术人员已知的其它标准成分(Remington′s Pharmaceutical Science第16版，Osol，A.编1980)。
用于本发明中的artemin功能的拮抗剂也可以与用于体外使用的载体或稀释剂(优选地，用于体内和离体使用的药学上可接受的载体或稀释剂)一起提供为组合物。用于本发明中的artemin功能的拮抗剂可以提供为基本上纯的，不含有不希望的污染物。这意味着，artemin功能的拮抗剂通常是至少约50％w/w(重量/重量)纯的，以及基本上不含有干扰蛋白和污染物。优选地，artemin功能的拮抗剂是至少90、95％或99％w/w纯的。药物组合物通常是无菌的、基本上等渗的，并根据食品和药物管理局或类似机构的良好生产实践来制备。
当用于治疗目的时，artemin功能的拮抗剂(诸如抗-artemin抗体或抗体片段)应当具有适合人施用的纯度。所述组合物可以含有本领域已知的其它成分。具体地，也可以添加其它治疗药物、载体或稀释剂、免疫佐剂等。当上述的组合物用于体内成像或诊断时，它可以包含约0.001-99.9重量％的artemin功能的拮抗剂，更优选约0.01-25重量％的artemin功能的拮抗剂。通常，当所述组合物用于治疗目的时，它可以含有约0.001-99.9重量％的artemin功能的拮抗剂，更优选约0.01-30重量％的artemin功能的拮抗剂。当用于体液(诸如脊髓液)中的细胞的离体靶向时，所述组合物可以包含约0.0001-50重量％、优选约0.01-20重量％的artemin功能的拮抗剂。当应用于癌细胞的体外诊断时，本发明的组合物可以包含约0.001-35重量％的artemin功能的拮抗剂，更优选约0.01-10重量％的artemin功能的拮抗剂。但是，其它量也可能是合适的。
在某些实施方案中，特别在artemin功能的拮抗剂是抗-artemin抗体的情况下，通过施用一定量的放射性标记形式的artemin功能的拮抗剂，可以对患者进行体内成像和/或诊断，所述量会有效地到达癌症部位，并进一步非侵入性地检测标记的artemin功能的拮抗剂在肿瘤细胞处的任何定位。在某些方面，可以以下述量施用artemin功能的拮抗剂：约0.001-5000mg/kg重量/治疗、更优选约0.01-5000μg/kg重量/治疗、更优选约0.1-500μg/kg重量/治疗。但是，也可以使用其它量。可以使用的放射性标记是111In、125I、99mTc和131I及其它。根据使用的放射性标记，使用PET扫描仪，和使用在医学领域广泛使用的NMR成像和/或放射性计数装置，可以检测这些放射性同位素。
对于免疫毒素，通常希望将它制成可以肠胃外地施用的药物组合物。这如下实现：使用含有合适的药物组合物的介质，进行最后的纯化步骤。这样的制剂通常包括：药用缓冲剂，以及赋形剂、稳定剂等。药学上可接受的组合物是无菌的、非免疫原性的且无热原的。它们的制备细节是本领域众所周知的，且在本文中进一步描述。应当理解，应当最低限度地将内毒素污染保持在安全水平，例如，低于0.5ng/mg蛋白。根据本发明的合适的药物组合物通常包含约10至约100mg免疫毒素，所述免疫毒素与可接受的药用稀释剂或赋形剂(诸如无菌水溶液)相混合，得到关于抗体-毒素缀合物的约0.25至约2.5mg/ml的终浓度。
治疗方法
本文提供的研究探究了乳腺癌细胞对化学治疗剂和放射疗法的抗性的反转。不希望受任何理论的约束，申请人预测artemin功能性的拮抗适用于反转对使用多种乳腺癌疗法的治疗的抗性。
在一个实施方案中，本发明涉及通过拮抗artemin功能性、通过反转一个或多个乳腺癌细胞对治疗的抗性来预防、减少或抑制细胞增殖、细胞存活和/或细胞能动性的方法。优选地，所述方法是用于治疗受试者的特征在于异常的细胞增殖、细胞存活和/或细胞能动性的乳腺癌。这些异常的特征可能存在于受试者的一种或多种细胞类型中，且可以包括转移性病症。
在不同的实施方案中，所述乳腺癌治疗包括：靶向上皮肿瘤(例如，来自细胞衬里导管或小叶)或非上皮肿瘤(例如，来自支持间质)诸如血管肉瘤、原发性间质肉瘤和叶状瘤的治疗。在其它示例性的实施方案中，所述乳腺癌治疗包括：靶向癌(例如，原位癌，包括原位小叶癌(LCIS)、原位导管癌)的治疗，以及靶向侵袭性癌症(包括腺癌)的那些治疗，和靶向罕见形式的乳腺癌(包括髓样癌、粘液癌和小管癌、乳头的佩吉特病和转移性乳腺癌)的那些治疗。
本发明相关领域的普通技术人员会理解，考虑到本发明的性质和在本文中报告的结果，本发明可用于多种不同的动物。因此，所述诊断和治疗方法可以应用于任何目标动物。具体地，本发明可应用于哺乳动物，更具体地，人。
本发明相关领域的普通技术人员会理解用于抑制artemin功能性的多种手段和试剂。作为实例，可使用artemin功能的拮抗剂，诸如针对artemin的抗体，或此种抗体的功能修饰。在本文中详细地描述了示例性的拮抗剂。用于本发明的拮抗剂会拮抗artemin的一种或多种生物学效应，并优选地表现出反转一个或多个乳腺癌细胞对治疗的抗性的能力。本领域技术人员会认可，这样的拮抗剂因此可以使治疗能够具有：1)预防、减少或抑制细胞增殖的能力；2)预防、减少或抑制细胞存活的能力；3)预防、减少或抑制细胞能动性的能力；4)预防、减少或抑制artemin和/或相关配体的表达或活性的能力；5)预防、减少、降低或控制乳房肿瘤的转移的能力。
涉及先天性或获得性免疫的多种免疫治疗策略可以用于拮抗artemin功能性，包括活菌疫苗的局部应用；(b)细胞因子的使用；(c)针对artemin的主动免疫接种；(d)使用针对artemin的抗体的被动治疗；和(e)效应细胞(例如T细胞)的过继转移。针对artemin的主动免疫接种可以用于诱导免疫应答，或者可以使用被动免疫接种，其中使用针对artemin的人化单克隆抗体。关于一般指导，参见，例如，Riethmüller G，等人，Monoclonal antibody therapy for resected Dukes’C colorectal cancer：seven-year outcome of a multicenter randomized trial.J Clin Oncol1998；16：1788-1794；Riethmüller G，等人，Randomized trial of monoclonalantibody for adj uvant therapy of resected Dukes’C colorectal carcinoma.German Cancer Aid 17-1A Study Group.Lancet 1994；343：1177-1183；Herlyn DM，等人，Inhibition of growth of colorectal carcinoma in nudemice by monoclonal antibody.Cancer Res 1980；40：717-721。
对于免疫接种，纯抗原在诱导获得性(即，抗原特异性的)免疫应答方面经常是无效的，除非使用某些佐剂来刺激先天性免疫。因此，设计了众多方案，以通过使用化学和/或细菌试剂来在接种位点处刺激先天性免疫。可以为特定MHC单元型设计用于疫苗的合成肽(参见，例如，Toes RE等人Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth throughspecific T-cell tolerance induction.Proc Natl Acad Sci USA1996；93：7855-7860)。可以将抗原肽加载到热激蛋白(或作为重组病毒样颗粒)上，以增加免疫接种的效力。通常，免疫应答的有效诱导需要在提供适当的辅助或二级信号的环境中的抗原呈递。
若干实验设计使用经过病毒特异性肽或肿瘤相关肽脉冲处理的树突细胞，以诱导肿瘤反应性的T细胞和移植的肿瘤细胞的排斥。可以用合成的抗原肽或重组蛋白来加载树突细胞。也可以给树突细胞加载下面的一种或多种：剥离自肿瘤细胞表面的天然肽；源自肿瘤的加载肽的热激蛋白；源自肿瘤的mRNA；或融合的肿瘤细胞(关于综述，参见Shurin MR.Dendritic cells presenting tumor antigen.Cancer Immunol Immunother1996；43：158-164)。这些策略的一个优点是，可以诱导针对(独特的)单个不同肿瘤抗原以及肿瘤相关抗原的有力免疫。
对于artemin的抗原，可以使用牛痘、利斯特菌属或病毒样颗粒来开发重组疫苗。在其它方案中，可以使用遗传疫苗接种，例如通过肌肉内注射编码肿瘤抗原的裸DNA质粒构建体(参见例如，Donnelly JJ，Ulmer JB，Liu MA.DNA vaccines.Life Sci 1997；60：163-172)。也可使用GM-CSF来提高树突细胞在注射位点处的抗原呈递(参见，例如，Syrengelas AD，ChenTT，Levy R.DNA immunization induces protective immunity against B-celllymphoma.Nat Med 1996；2：1038-1041)。在其它方案中，可以使用具有抗-独特型抗体的疫苗接种。
作为其它方案，可以使用被动抗体疗法或肿瘤特异性的T细胞的过继转移。例如，使用针对artemin的抗体的被动免疫接种可以保护对抗肿瘤细胞的攻击，并且当在癌细胞攻击后不久施用时，可以是治疗性的(例如，参见Riethmüller G，等人Monoclonal antibody therapy for resectedDukes’C colorectal cancer：seven-year outcome of a multicenterrandomized trial.J Clin Oncol 1998；16：1788-1794；Riethmüller G，等人Randomized trial of monoclonal antibody for adj uvant therapy of resectedDukes’C colorectal carcinoma.German Cancer Aid 17-1A Study Group.Lancet 1994；343：1177-1183；Herlyn DM，等人Inhibition of growth ofcolorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody.Cancer Res1980；40：717-721)。
作为替代方案，可以使用抗-独特型抗体治疗来诱导癌细胞进入长期休眠状态(参见，例如，Miller RA，Maloney DG，Warnke R，Levy R.Treatmentof B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody.N Engl J Med1982；306：517-522)。此外，针对肿瘤细胞的抗体可以用作细胞因子或细胞毒性试剂(例如放射化学试剂或天然毒素)的载体(参见，例如，Ghetie V，Vitetta E.Immunotoxins in the therapy of cancer：from bench to clinic.Pharmacol Ther 1994；63：209-234；Reisfeld RA，Gillies SD.Recombinantantibody fusion proteins for cancer immunotherapy.Curr Top MicrobiolImmunol 1996；213：27-53)。重组抗体-细胞因子或抗体-毒素融合蛋白可用于在围绕肿瘤细胞的间质中浓缩这些试剂。作为替代方案，可以改造双特异性的单克隆抗体，以结合效应细胞以及癌细胞上的肿瘤抗原。也可以将单克隆抗体人源化，以降低患者对中和抗-鼠抗体的刺激。作为另外的方案，T细胞的过继转移可以与更长久建立的肿瘤负荷一起使用。可以用IL-2在体外繁殖已经从患者分离出的T细胞，然后灌注到也接受了IL-2的患者中(参见，例如，Smith CA，等人A doptive immunotherapy for Epstein-Barrvirus-related lymphoma.Leuk Lymphoma 1996；23：213-220)。
考虑到本文中的发明描述以及已知方法，可以测定试剂的抑制artemin功能性的效力。例如，通过观察试剂的预防、减少或抑制artemin的表达或拮抗artemin的一种或多种功能效果，可以测定它们的效力。作为实例，可研究artemin功能的拮抗剂对下述一种或多种的影响：细胞侵袭、细胞迁移、基因转录水平、以及表达水平或其缺失或对artemin作出应答的基因。此种研究可在体外或在体内进行。应当理解，为了用于本发明的方法和组合物中，能够使一个或多个癌细胞对治疗重新敏化的artemin功能性的拮抗剂是优选的。
本文描述的试验(包括在实施例中描述的那些)可用于测定根据本发明的artemin功能的拮抗剂的适合性。具体地，可以使用RT-PCR和RNA印迹分析来检测在mRNA水平的表达，并且可以使用蛋白印迹法和直接或间接免疫染色来检测在蛋白水平的表达。为了检测活性，可以使用基于细胞的试验来检测细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性。对于转移的抑制，可使用体内试验，例如，描述于，Fidler，I.J.(1973)Nat.New Biol.242，148-149；和Price J.E.The biology of cancer metastasis.Prog.Clin.Biol.Res.，354A：237-255，1990，或Kerbel R.S.What is the optimal rodentmodel for anti-tumor drug testing？Cancer Metastasis Rev.，17：301-304，1998；Killion J.J.，Radinsky R.，Fidler I.J.Orthotopic models arenecessary to predict therapy of transplantable tumours in mice.CancerMetastasis Rev.，17：279-284，1998；和Price J.E.Analyzing the metastaticphenotype.J.Cell.Biochem.，56：16-22，1994。类似地，用于评估细胞凋亡的诱导或抑制的方法是本领域众所周知的，并且促细胞凋亡的和抗细胞凋亡的细胞标志物同样是众所周知的。
施用途径/方案
通过能够将希望的活性(例如，artemin功能性的抑制)递送至受试者体内的靶位的任何方式，可以施用本发明的artemin功能的拮抗剂性或组合物。这样的试剂和组合物因此可以用于反转癌细胞对治疗的抗性，诸如对治疗剂的抗性，并如此可以用于治疗中，以抑制在靶位处的细胞增殖、细胞存活和/或细胞能动性。靶位可为身体内可能具有病症或者易患病症的任何位点，并且可以包括一个或多个细胞、组织或特定肿瘤。例如，给药可以包括肠胃外给药途径、全身给药途径、口服和局部给药。给药可以通过下述方式：注射(皮下、眶内、眼、椎管内、脑池内、局部)、灌注(使用例如，缓释装置或微泵如渗透泵或皮肤贴剂)、植入物、气雾剂、吸入、划痕法、腹膜内的、囊内的、肌内的、瘤内的、鼻内的、口服的、经颊的、透皮的、肺的、直肠的或阴道的递送。应该理解，所选择的给药途径可取决于靶位在受试者体内的位置，以及所用试剂(例如，抗体或抗体片段)或组合物的性质。
在一个具体的实施方案中，可以施用多核苷酸，例如通过使用缺陷型或者减毒的反转录病毒或其它病毒载体的感染(参见例如，美国专利号4,980,286)，或者通过裸DNA的直接注射，或者通过微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，DuPont)的使用；通过用脂质或细胞表面受体或转染试剂的包覆；包囊在脂质体、微粒或微胶囊中；通过与已知进入细胞核的肽相连；或者通过与接受受体介导的胞吞作用的配体的连接而施用(参见，例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可以用于靶向特异性地表达受体的细胞类型)等。此外，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包括病毒融合肽(以分裂核内体)，使得核酸分子避免溶酶体降解。
在另一个实施方案中，通过如下述文献所述靶向特定受体，可以在体内靶向多核苷酸，用于细胞特异性的摄取和表达：例如，1992年4月16日的WO 92/06180(Wu等人)；1992年12月23日的WO 92/22635(Wilson等人)；1992年11月26日的WO 92/20316(Findeis等人)；1993年7月22日的WO 93/14188(Clarke等人)；和1993年10月14日的WO 93/20221(Young)。或者，可以在细胞内导入多核苷酸，并且通过同源重组(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature 342：435-438)，将其整合到宿主细胞DNA中用于表达。为了本发明的目的，可以向其中导入多核苷酸的细胞包括任何想要的、可获得的细胞类型。适当的细胞类型将取决于待治疗的病症的性质。然而，作为实例，可以将多核苷酸导入癌细胞中。
应该理解，根据诸如待治疗的病症的性质、受试者的征状的严重性、待治疗的任何肿瘤的大小、待治疗的靶位、所选择的给药模式、以及受试者的年龄、性别和/或一般健康等变量，施用的试剂或组合物的剂量、给药周期、以及一般给药方案可在受试者之间有所不同。考虑到这样的因素，本发明相关领域的普通技术人员将容易地理解或者能够确定适合的给药方案。应该理解，给药可以包括单独的每日剂量，或者许多不连续的分份剂量的给药也可能是适当的。本发明也预见到组合不同给药模式或途径的给药方案。例如，可以组合瘤内注射和全身给药。
应该理解，本发明方法可以包括其它步骤，例如施用其它试剂或组合物，特别是，一种或多种乳腺癌治疗剂，或者考虑到待治疗的病症可能有益于受试者的其它试剂。例如，可以施用用于治疗增殖性病症的其它试剂(例如上述抗肿瘤试剂)。应该理解，这样的其它试剂和组合物可与本发明的试剂和组合物同时施用，或者按顺序方式施用。例如，可以在施用artemin功能的拮抗剂或包含artemin功能的拮抗剂的组合物之前或之后，施用所述其它试剂或组合物。应该理解，关于试剂或组合物的顺序递送，尽管可能优选在施用一种试剂或组合物后立即顺序地施用另一种，但这并不必须立即发生。在试剂或组合物递送之间，可以有时间延迟。延迟期将取决于诸如下述因素：待治疗的病症以及要递送的组合物或试剂的性质。然而，作为实例，本发明预见到几小时到几天或几个月的时段。
在具体的方面，将artemin功能的拮抗剂配制成用于肠胃外施用(通过静脉内输注或快速浓注、肌肉内地或皮下地)。静脉内输注在在短至15分钟内施用，但是更经常持续30分钟，或持续1、2或甚至3小时。也可以将artemin功能的拮抗剂直接地注射进疾病(例如，肿瘤)的部位，或包囊进运输试剂(诸如脂质体)中。施用的记录将足以减轻要治疗的病症，且可能是0.1-5mg/kg体重，例如1、2、3或4mg/kg，但是可能高达10mg/kg或甚至15或20mg/kg。也可以施用固定的单位剂量，例如，50、100、200、500或1000mg，或所述剂量可以基于患者的表面积，例如，100mg/m2。通常施用1-8剂之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)来治疗癌症，但是可以施用10、20或更多剂。可以每天、每2周、每周、每隔周、每个月或在某种其它间隔施用artemin功能的拮抗剂，这取决于例如试剂的半衰期，持续1周、2周、4周、8周、3-6个月或更久。对于长期施用，重复的疗程也是可能的。设计施用的剂量和间隔的方案，以减轻或至少部分地阻止疾病的征状(生化的、组织学的和/或临床的)，包括它的并发症和在疾病发展过程中的中间病理学表型。
在其它方面，适用于本发明中的药物组合物可以用于预防处于乳腺癌风险中的患者。这样的患者包括：具有乳腺癌的遗传易感性的患者，已经暴露于致癌剂(诸如辐射或毒素)的患者，和先前已经接受乳腺癌治疗并处于复发危险中的患者。预防剂量是足以消除或减少疾病(包括疾病的生化的、组织学的和/或临床的症状，它的并发症和在疾病发展过程中呈现的中间病理学表型)的风险、减轻其严重性或延迟其开始的量。
在示例性的实施方案中，使用artemin功能性的一种或多种拮抗剂治疗乳腺癌，会增加具有乳腺癌(特别当复发或难治时)的患者的无进展存活中位值或总存活时间，并在有些实施方案中，与在没有artemin功能性的拮抗存在下的相同治疗(例如，化学疗法)相比，使这样的存活增加至少30％或40％、但是优选50％、60％-70％或甚至100％或更久。额外地或替换地，使用artemin功能性的一种或多种拮抗剂的治疗(例如，标准的化学疗法)，在某些实施方案中会增加具有癌症(特别当复发或难治时)的患者的完全应答率、部分应答率或客观应答率(完全应答率+部分应答率)，并在有些实施方案中，与在没有artemin功能性的拮抗存在下的相同治疗(例如，化学疗法)相比，使其增加至少30％或40％、但是优选50％、60％-70％或甚至100％。
诊断方法和组合物
如本文所述，本发明的方法和组合物特别适用于抗-乳腺癌治疗，例如，用于预防、减少或抑制细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的治疗，并涉及反转乳腺癌细胞的抗性。在不同的实施方案中，本发明的方法适用于测定或监测一个或多个乳腺癌细胞的抗性，包括诊断患者中的一个或多个乳腺癌细胞的抗性。在一个宽泛的实施方案中，本发明提供了一种抑制artemin功能性的方法，例如通过阻断artemin与一种或多种受体的相互作用，或更宽泛地，阻断artemin或artemin功能性的介质与结合剂的相互作用，所述方法包括：使artemin功能的拮抗剂(诸如抗-artemin抗体、抗体片段或其修饰)接触乳腺癌细胞，并测定所述细胞对治疗的敏感性。该方法可以在体内或在体外进行。本领域的普通技术人员会容易地理解这样的方法：所述方法用于测定artemin功能的拮抗剂的反转乳腺癌细胞对治疗剂的抗性的效力。但是，作为实例，可以使用本文别处所述的方法，包括在“实施例”部分中提及的一种或多种试验。
可以如下获得用于诊断或一般地监测受试者的乳腺癌细胞或乳腺癌的抗性状态的信息：直接对比在有和在没有artemin功能的拮抗剂存在下实验样品中的细胞对治疗剂的敏感性，或对比实验样品中的细胞对治疗剂的敏感性和测得的基础水平或标准的敏感性。
优选地，为了指示抗性，观察在不同条件下的敏感性之间的统计上显著的差异。但是，甚至在没有统计上显著的差异的情况下，得到的结果也可以提供关于乳腺癌细胞、携带乳房肿瘤的受试者或受试者中的乳腺癌的状态的有价值的信息。应当理解，乳腺癌细胞对不同试剂的敏感性可能随细胞类型、取样操作、向其它试剂的暴露等而异。本领域技术人员熟知控制这样的差异的方法。
应当理解，通过将在实验样品中观察到的对试剂的敏感性相对于从一定范围的其它受试者得到的结果的数据库进行对比，可以诊断或一般地测定受试者中的乳腺癌细胞或乳腺癌的抗性状态。代替利用从许多正常受试者得到的标准或基础敏感性水平，可在知晓他们不存在医学病症期间，或在有活跃的医学病症期间，从单个受试者测定基础敏感性水平。这可能特别适用于进行中的和/或间歇的疾病的情形、乳腺癌复发或需要持久监测受试者状态的事件或病症。例如，可在乳腺癌缓解期间测定基础水平，此后在不同的时间进行诊断操作以评估状态。这可提供关于乳腺癌进展的有价值信息，或者帮助评估乳腺癌的治疗是否被证明为成功的。
在一个实施方案中，本发明涉及artemin功能性的抑制在诊断病症的方法中的用途，所述病症的特征在于对一种或多种抗乳腺癌治疗的抗性。这样的病症通常与细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性、尤其是顽固性的细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性有关。优选地，所述方法用于诊断特征为受试者中异常的细胞增殖、细胞存活、细胞能动性和/或致癌性的乳腺癌。该异常的细胞生长和/或增殖可发生于受试者的一种或多种细胞类型中，并且可以包括转移性的或其它的乳腺癌。
根据本发明，artemin功能的拮抗剂(例如特异性地结合artemin的一种或多种抗体)可用于诊断特征在于改变的artemin表达的乳腺癌，或者用于监测待治疗的患者的试验中。具体地，预见到依赖于一种或多种抗-artemin抗体的诊断方法。可以以与上述那些相同的方式，制备用于诊断目的的抗体。诊断试验包括这样的方法，所述复发利用抗体和标记来检测人体液或者细胞或组织提取物中的相应肽或多肽。抗体可经修饰或不经修饰而使用，并且可通过使它们与报告分子共价或非共价连接而进行标记。可使用本领域已知的多种报告分子，在本文中描述它们中的一些。
多种方法(包括ELISA、RIA和FACS)是本领域已知的，并且会提供用于诊断改变的或异常的artemin表达水平的基础。通过在适于复合物形成的条件下，使取自正常哺乳动物受试者(优选人)的体液或细胞提取物与抗体混合，建立表达的正常值或标准值。通过不同的方法，但优选通过光度测量或荧光测量手段，可以量化标准复合物形成的量。将在受试者、对照以及疾病、来自活组织检查组织的样品中表达的量与标准值相比较。标准值与受试者值之间的偏差，会建立用于诊断病症的参数。
所述抗体或抗体片段可用于检测和量化活组织检查组织中的表达，其中所述表达可能与乳腺癌有关，或与对特定治疗(例如使用一种或多种化学治疗剂的治疗)的敏感性有关。诊断试验可用于区别表达的存在与否和改变，以及用于监测治疗干预期间的调节水平。
artemin功能的拮抗剂可以用于诊断与表达的增加或减少有关的乳腺癌，且可以用于本领域众所周知的定性或定量方法中。在一个具体方面，artemin功能的拮抗剂可以用于试验中，所述试验检测不同乳腺癌(特别是上述的那些)的活化、诱导或抗性。这样的试验也可用于评估特定治疗性处理方案在动物研究、临床试验中的的效力，或用于监测单个患者的治疗。
为了提供用于诊断与对乳腺癌治疗(诸如化学治疗剂)的抗性有关的病症的基础，建立表达的正常谱或标准谱。这可如下实现：将取自正常受试者(动物或人)的体液或细胞提取物与artemin功能的拮抗剂和化学治疗剂相混合。通过将获自正常受试者的值与已知对化学治疗剂敏感的乳腺癌细胞系的值相比较，可以量化对化学治疗剂的正常敏感性。可将获自正常样品的标准值与从有乳腺癌征状的患者的样品得到的值相比较。使用标准值和受试者值之间的偏差，确立抗性乳腺癌的存在，也就是说，存在对化学治疗剂的抗性。
一旦诊断出抗性的乳腺癌并且开始治疗方案，可以定期重复试验，以评估患者中的敏感性水平是否开始接近在正常患者中观察到的水平。获自连续检测的结果可用于显示在几天到几月的范围期间的治疗效力。对于抗性的乳腺癌，来自个体的活组织检查组织中的artemin多肽的相对高的量的存在，可以指示抗性发展的倾向，或者可提供在抗性的实际临床征状出现前检测抗性的手段。该类型的更确定的诊断，可允许保健人员更早地使用预防性措施或积极的治疗，从而预防乳腺癌的产生或进一步进展或获得对一种或多种抗乳腺癌治疗的抗性。
本领域技术人员会认识到，在下面具体地讨论抗-artemin抗体作为artemin功能性的示例性拮抗剂的用途的范围内，在这样的用途中可以用适当的其它拮抗剂替换。
也可用于量化artemin的表达的方法包括：放射性标记抗体、对照多肽的结合、以及插入实验结果的标准曲线。通过进行ELISA形式的试验，可以加速多种样品的定量速度，在所述试验中，目标序列以不同的稀释度存在，并且分光光度测量或比色测量反应会提供快速定量。
在其它实施方案中，本文所述的抗体、抗体片段或其修饰可以用在微阵列中的试剂。所述微阵列可以用于同时地监测大量样品中的表达水平，并显示和监测治疗剂的活性。根据本领域已知的方法，可以制备和使用微阵列。所述微阵列基质可以是纸、尼龙或任意其它类型的膜、滤器、芯片、平板诸如微孔滴定板、载玻片或任意其它合适的固体支持物。在一个方面，可以使用类似于点或槽印迹的分格阵列将样品连接至基质的表面上。在另一个方面，手工地或通过使用可获得的设备、材料和仪器(包括多通道移液器或机器人设备)生产阵列，并可以包括约8、24、96、384、1536或6144个样品，或从2至1,000,000的任何其它倍数，这使它可有效地用于可商业得到的仪器。
为了使用微阵列进行样品分析，可以从生物样品提取多肽。生物样品可获自任何体液(例如血液、尿、唾液、痰、胃液等)、培养的细胞、活组织检查或其它组织制品。可以与微阵列一起温育标记的抗体或抗体片段，使得它们结合微阵列的多肽。可以调节温育条件，使得发生特异性的结合。在除去未结合的抗体以后，可以使用扫描仪测定标记的水平和图样。检查经扫描的图像，以确定在微阵列上的多肽序列的相对丰度。检测系统可用于同时测量许多不同序列的结合的存在与否以及量。
在另一个实施方案中，适用于本发明中的抗体可用于基于免疫组织化学的用途。根据标准的免疫组织化学技术，可以从目的组织获取薄切片(例如约4-40μm)，或者可以使用整个组织。通过使用切片机，可以实现切片，并且可以将切片固定到载玻片上。然后可以处理组织，以使细胞膜破裂，例如使用去污剂如Triton X-100。也可以使用其它的暴露步骤，以及阻断步骤，以使非特异性结合最小化。对于直接免疫组织化学，使用目的标记抗体(例如FITC缀合的抗血清)结合组织切片中的抗原。对于间接免疫组织化学，使用未标记的第一抗体结合组织抗原，而使用标记的第二抗体与所述第一抗体反应。
抗-artemin抗体和抗体片段也可用作体内诊断剂，以提供乳腺癌细胞(例如，肿瘤)或各个转移灶(诸如对一种或多种抗乳腺癌治疗抗性的那些)的图像。可以采用不同的诊断方法，诸如磁共振成像(MRI)、X-射线成像、计算机发射型断层摄影术和类似的技术。在这类成像中，所用的抗体部分一般结合乳腺癌标志物，诸如artemin，而成像剂是在成像时可检测的物质，例如顺磁的、放射性的或荧光的分子。许多合适的成像剂是本领域已知的，使它们与抗体连接的方法也是本领域已知的(参见，例如，US 5,021,236和US 4,472,509，二者通过引用并入本文)。某些连接方法涉及金属螯合络合物的应用，使用例如有机螯合剂如DTPA连接于抗体上(美国专利4,472,509)。在偶联剂(例如戊二醛或高碘酸盐)存在下，抗体也可以与酶反应。在有这些偶联剂存在下，或者通过与异硫氰酸酯反应，可以制备带荧光素标志物的缀合物。
在顺磁离子的情况下，示例性的试剂包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，其中钆是特别优选的。在其它背景(例如X-射线成像)下有用的离子包括、但不限于：镧(III)、金(III)、铅(II)，特别是铋(III)。在放射性同位素用于诊断应用的情况下，有用的试剂包括：砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和钇90。经常使用125I，也常常使用锝99m和铟111，这是因为它们的低能量和适合长范围检测。在MRI中特别有用的元素包括核磁性自旋共振同位素157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe，其中钆经常是优选的。
根据本领域众所周知的方法，可以制备用于本发明中的放射性标记的抗体和抗体片段。例如，通过接触碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂(例如次氯酸钠)或者酶氧化剂(例如乳过氧化物酶)，可以碘化抗体。通过配体交换过程，可以用锝99m标记根据本发明的抗体，举例来说，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐、将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加到该柱上，或者通过直接的标记技术，例如通过温育高锝酸盐、还原剂例如SNCl2、缓冲溶液例如邻苯二甲酸钠-钾溶液以及抗体。常用于将放射性同位素(其作为金属离子存在)结合到抗体上的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
在选择放射性核素用于体内诊断时要考虑的一个因素是，核素的半衰期足够长，以致于在靶标达到最大摄取时其仍可以检测，但又足够短，以致于施加到宿主的有害辐射以及背景被最小化。理想的是，用于体内成像的放射性核素缺乏微粒发射，但在140-2000keV的范围内产生大量的光子，这可以通过常规的γ相机容易地检测。标记的抗体的给药可以是局部的或全身的，并且通过静脉内、动脉内、经由脊髓液或者类似的方式完成。给药也可以是皮内或者腔内，取决于待检查的身体部位。在经过足够的时间使标记的抗体或片段与患病组织(在本案中，癌组织)结合后，例如30分钟到48小时，然后通过成像技术检查待研究的受试者部位。MRI、SPECT、平面闪烁成像以及其它新兴的成像技术都可以使用。监测并记录结合的放射性同位素的分布以及它随着时间的增加或减少。通过将该结果与从临床正常个体的研究所获得的数据进行比较，可以确定患病组织的存在和程度。确切的成像方案会必要地发生变化，取决于患者特有的因素，并取决于待检查的身体部位、给药方法、所用标记的类型等。
用于治疗或诊断的试剂盒
本发明的拮抗剂和组合物可以用于试剂盒中，所述试剂盒适用于反转乳腺癌细胞的抗性和治疗如本文所定义的乳腺癌。拮抗剂和组合物也可以用于诊断试剂盒中。试剂盒可以包含在合适的容器中的artemin功能的至少一种拮抗剂。例如，所述试剂盒可以包括抗-artemin抗体或抗体片段或其修饰。所述试剂盒可以另外包括一种或多种辅助试剂，诸如适用于检测artemin功能性的拮抗剂和介质之间(诸如抗-artemin抗体或抗体片段和artemin或其部分之间)的复合物的存在的试剂。这些可以提供在其它的单独的容器中，正如特定用途可能必需的。在采用能够结合第一抗体的第二抗体的情况下，这样的第二抗体可以提供在试剂盒中，例如在单独的小瓶或容器中。如果存在的话，第二抗体通常带有标记，且可以以与本文所述的抗体制剂类似的方式配制。所述试剂盒可以另外包含一种或多种治疗剂，包括一种或多种乳腺癌治疗剂，诸如一种或多种化学治疗剂，包括乳腺癌细胞对其可能获得抗性或已经获得抗性的那些。
对于包含抗-artemin抗体的试剂盒，所述抗体组合物可以单独提供，或与对其它表位特异性的其它抗体组合地提供。所述抗体或抗体片段可以具有或没有标记，且可以与辅助成分(例如，缓冲剂诸如Tris、磷酸盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀生物剂和/或惰性蛋白诸如牛血清白蛋白)一起提供。一般而言，这些辅助物以小于约5重量％(基于活性抗体的量)的量存在，且通常以至少约0.001重量％(基于抗体浓度)的总量存在。所述抗体或抗体片段可以与辅助成分一起提供为低压冻干的混合物，或者所述辅助成分可以单独提供，由用户进行组合。
在一个具体方面，所述试剂盒可以包括artemin功能的拮抗剂作为单独包装的试剂，所述拮抗剂的量足以进行至少一个诊断试验。artemin功能的拮抗剂可以与固相支持物或珠子组合地提供为试剂。所述试剂盒可以用于分离artemin多肽或肽或表达artemin的细胞。在具体的方面，包含抗-artemin的试剂盒可以用于FACS分析。所述试剂盒可以包含本文公开的杂交瘤细胞系，并允许生产抗-artemin抗体。在具体的方面，可以包括所述杂交瘤细胞系的细胞培养基。
在治疗用试剂盒的情况下，可以将artemin功能的拮抗剂配制成适合直接施用给受试者，例如作为药物组合物。或者，所述试剂盒可以包括在一个容器中的一种或多种试剂以及在另一个容器中的药用稀释剂、载体和/或赋形剂；每个容器中的内容物在给药前混合到一起。适于存储和/或施用试剂或组合物的任何容器可用于本发明的试剂盒中。本领域技术人员将理解适合的容器。作为实例，此种容器包括管形瓶和注射器。容器可适当地灭菌和密封。此外，本发明的试剂盒也可以包括该试剂盒的组分的使用及给药的说明书。
参考下面的实施例来进一步阐明本发明。
实施例
在本文中描述的实施例是为了例证本发明的实施方案的目的。其它的实施方案、方法和分析类型是在分子诊断领域的普通技术人员技能的范围内，并且不需在本文中详细描述。认为在本领域范围内的其它实施方案是本发明的一部分。
实施例1
材料和方法
细胞培养
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得乳癌细胞系MCF-7。
对于没有雌激素的细胞培养，在雌激素或抗雌激素治疗之前，在不含酚磺酞的RPMI-1640中培养MCF-7细胞3天，所述RPMI-1640中补充了10％葡聚糖被覆活性炭处理过的胎牛血清(CS-FBS)。
如Shaw等人(2006)所述，建立他莫昔芬抗性的(TAMR)细胞系。简而言之，使亲代MCF-7细胞连续暴露于1μM他莫昔芬(其在不含酚磺酞的RPMI 1640培养基中，该培养基含有10％CS-FBS)6个月，直到所述细胞形成对他莫昔芬的生长抑制作用的抗性。在不含他莫昔芬的相同培养基中培养对他莫昔芬敏感的MCF-7细胞，将其命名为他莫昔芬敏感的(TAMS)细胞。
细胞数目试验
以5×104细胞/孔的密度，将细胞一式三份地接种在6-孔平板上的3ml含有10％或0.2％FBS的完全培养基中。在这些条件下，培养细胞最多10天，每隔天更换培养基，直到收获。为了比较细胞增殖速率，每2天用血球计数器量化每孔中的总细胞数。使用锥虫蓝来评估细胞存活力。
细胞增殖试验
使用MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑溴化物)试验来测量细胞增殖。以5×103细胞/孔的浓度，将细胞接种到96孔平底组织培养微量培养板中，在100μl含有10％FBS的培养基中。在试验当天，将10μl的MTT标记试剂以终浓度0.5mg/ml加入每孔中，并且在培养箱中标记细胞5h。在温育期结束时，除去培养基，并且用100μl溶解溶液(在10％SDS水溶液中的0.01N HCl)使转化的染料溶解。然后密封板，并在37℃过夜放置，以完全溶解紫色甲臜(formazan)晶体。使用Spectra Max 250多板读数器，在570nm的波长测量转化的染料的吸光度，用650nm进行背景扣除。每种处理至少一式三份地进行。
通过基于质粒的siRNA建立artemin耗尽的细胞系
为了检验artemin特异性的siRNA的效率，使用编码靶向artemin转录物的siRNA的pSilencer-ARTN质粒，或阴性对照siRNA质粒pSilencer-CK，以及pEGFP-C1载体(EGFP)或在EGFP编码序列的3’UTR内插入了artemin cDNA的pEGFP-ARTN质粒，进行试验。将质粒瞬时共转染进靶细胞中。转染24h后，用紫外-可见荧光显微镜观察EGFP的表达。
为了建立artemin耗尽细胞系，将pSilencer-ARTN质粒或pSilencer-CK质粒稳定地转染进细胞中。通过向培养基中加入潮霉素，选择细胞克隆。转染的细胞系生成阳性细胞克隆池。通过RT-PCR和蛋白印迹法，测定artemin在稳定克隆中的表达。
对于每个构建体，通过DNA测序验证插入物。
免疫印迹法
用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，并在裂解缓冲液(20mM Tris·HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％
Figure BDA00001770713200641
1％Nonidet P-40，1μg/ml蛋白酶抑制剂混合液(GEHealthcare)和0.1mM PMSF)中在4℃裂解。随后对裂解物进行声处理，并通过在4℃以15,000×g离心15min，使其澄清。向每种样品中加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液(50mM Tris·HCl，pH 6.8；2％SDS；2％β-巯基乙醇，和溴酚蓝)并煮沸该样品5min。使用标准电印迹规程，对样品进行使用12.5％分离胶的不连续SDS-PAGE，并转移到硝酸纤维素膜(HybondTMC-extra)上。用有0.1％吐温20的5％脱脂乳的PBS溶液(PBST)在室温封闭膜1h。然后用在含有1％脱脂乳的PBST中的第一抗体于4℃免疫标记该印迹。
用适当的第二抗体室温温育后，按照生产商(GE Healthcare)所述，通过ECL plusTM化学发光检测免疫标记。剥离印迹，并用抗β-肌动蛋白的单克隆抗体再次进行探针检测(reprobe)，以保证细胞裂解物蛋白的均等加载。通过在50℃在含有62.5mM Tris·HCl(pH 6.7)、2％SDS和0.7％β-巯基乙醇的溶液中温育30min，剥离印迹。然后经若干次在室温的PBST换液，洗涤印迹30min。通过将膜再次暴露于ECL plusTM，确定剥离的效率。此后，按上述重新封闭印迹并免疫标记。
质粒构建体
为了构建artemin表达质粒，将含有来自IMAGE cDNA克隆5453642的人artemin转录物变体4(NM_057090)的编码序列的BamHI和BglII片段亚克隆到pCMV6-XL4中的BglII位点处。生成的质粒命名为pCMV6-XL4-artemin。为了构建稳定转染的artemin表达载体，
为了构建以后使用的artemin表达质粒，将两种寡物5’-atcGCCGCCACCATGGaacttggacttggaggcctctccacgctgtcccactgcccctggc-3’(正向，大写字母为Kozak序列；SEQ ID NO：35)和5’-ctaggccaggggcagtgggacagcgtggagaggcctccaagtccaagttccatggcggcggcgat-3’(反向；SEQ ID NO：36)退火，形成在其5’末端具有Kozak序列、且在其3’末端具有AvrII突出端的人artemin的5’序列。将这些退火的寡物与含有人artemin的剩余编码序列的AvrII/AgeI片段(从pCMV6-XL4-artemin释放出)一起，克隆进pIRESneo3载体中在EcoRV和AgeI位点之间。生成的质粒命名为pIRESneo3-artemin。
将编码113个氨基酸的成熟C-端肽(SEQ ID NO：4)的人artemincDNA片段亚克隆进pQE30载体(Qiagen)中，与N-端His标签编码序列在框架内。得到的构建体pQE30-artemin编码MRGSHHHHHHGS的N-端肽(SEQ ID NO：37)，其后面是包含113个氨基酸的成熟的artemin蛋白。
为了设计靶向artemin的siRNA寡核苷酸，将DNA序列AA(N19选为AACTGGCCTGTACTCACTCAT(SEQ ID NO：38)。该序列对于所有四种artemin转录物变体都是共同的。针对人基因组序列的BLAST检索显示，只有artemin基因会被靶向。根据生产商的说明书，将一对寡核苷酸5′-gatccgctggcctgtactcactcatttcaagagaatgagtgagtacaggccagttttttggaaa-3′(正向；SEQ ID NO：39)和5′-agcttttccaaaaaactggcctgtactcactcattctcttgaaatgagtgagtcaggccagcg-3′(反向；SEQ ID NO：40)克隆进pSilencer 2.1-U6hygro载体(Ambion)中。生成的质粒命名为pSilencer-ARTN。作为阴性对照，使用pSilencer-CK编码与人基因序列没有明显序列相似性的siRNA(Ambion)。
总RNA的制备
根据生产商的说明书，以1ml/10cm2，用Trizol试剂(Invitrogen)从培养的细胞中分离出总RNA。将RNA重新悬浮于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的不含核酸酶的水中。进一步用DNA酶I在37℃处理RNA样品30min。通过加入25mM EDTA并在65℃温育15min，终止反应。然后如下纯化RNA样品：在苯酚/氯仿(pH 5.2，苯酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1)中提取，随后再次用氯仿提取，并进行乙醇沉淀。通过A260/A280吸收值来评估RNA的量化和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的质量。将A260/A280比率大于1.6的RNA样品保存于-80℃，用于进一步分析。
针对artemin的鸡多克隆抗体的生产
Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA)如下制备鸡多克隆抗体。免疫接种：在第0天，用重组人artemin(～0.5mg/鸡)和完全弗氏佐剂免疫鸡，在第9、29和39天再次加强(～0.17mg/鸡)。在免疫接种之前和之后收集鸡蛋。
从蛋黄提取IgY：收集鸡蛋，分离蛋黄，并汇集。在4℃进行纯化。稀释蛋黄，并离心。从澄清的上清液中沉淀出IgY。离心分离沉淀物，并溶解在PBS中。对免疫接种之前和之后的鸡IgY样品过滤除菌，以得到纯度等于或大于90％的～5mg/ml的终浓度，并于4℃保存。
重组人artemin蛋白在细菌中的生产
于37℃在1升含有100μg/ml羧苄西林的LB中，培养用质粒pQE30-artemin转化的大肠杆菌Rosetta-gamiTM B(DE3)pLysS感受态细胞，直到A600达到0.5。然后通过加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.2mM来诱导蛋白表达，并对培养物温育额外的5至6h。收获细胞，并在50ml 20mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA和0.1mg/ml溶菌酶中重新悬浮细胞团。通过声处理破裂细胞，然后于4℃以10,000g离心30分钟以分离包涵体。用2％Triton X-100、20mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA洗涤包涵体2次，然后用20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，以除去去污剂和EDTA。
随后，将包涵体溶解在50ml溶解缓冲液(6M盐酸胍、10mM Tris-HCl和100mM NaH2PO4、pH 8.0)中，并于4℃过夜摇动。于4℃以10,000g离心30分钟后，将上清液与4ml Ni-NTA(Qiagen)50％浆混合，并于4℃摇动1小时。然后将裂解物-树脂混合物装载到空柱中，随后用20ml 25mM咪唑、10mM Tri-HCl、100mM NaH2PO4、500mM NaCl、8M尿素(pH8)洗涤。用1ml含有250mM咪唑、10mM Tris-HCl、100mM NaH2PO4、150mM NaCl、8M尿素(pH 8.0)的洗脱缓冲液洗脱蛋白。收集级分，并通过SDS-PAGE进行分析，通过考马斯蓝染色进行显影。通过Bradford氏试验，估算纯化的蛋白的产量。
试剂
β-雌二醇(E2)和他莫昔芬购自Sigma-Aldrich(UK)。
反转录-PCR
使用一步反转录(RT)-PCR试剂盒(Qiagen)，使用下述引物对，测定artemin转录物的存在：5′-CTTTGCAGACTGGACCCTTACC-3(正向；SEQ ID NO：41)和5′-AGCTCCCATGAGTGAGTACAGG-3′(反向；SEQ ID NO：42)。对于RT-PCR，使用下面的程序。开始，将1μg总RNA稀释为0.1μg/μl，以使样品处理的变动最小。用DNA酶I对该稀释液处理15min，然后通过加入EDTA至5M并加热至70℃持续15min，使DNA酶失活。然后将DNA酶处理的RNA与主混合液(master cocktail)混合至终体积50μl，所述主混合液含有生产商建议的浓度的RT-PCR缓冲液、正向和反向引物、dNTP、RNA酶抑制剂、含反转录酶(Omniscript和Sensiscript)和HotStart耐热性DNA聚合酶的酶混合物。
温度循环方法包括：在50℃反转录反应60min，随后是HotStart DNA聚合酶在95℃的变性和活化15min，以及在95℃20秒、在54-62℃30秒、和在72℃1min的30个PCR扩增循环。在循环结束时，在72℃最终延伸5min。
类似地，使用0.2μg总RNA作为内部对照，使用下述引物对，通过RT-PCR扩增β-肌动蛋白：5′-ATGATATCGCCGCGCTCG-3′(正向；SEQ ID NO：43)和5′-CGCTCGGTGAGGATCTTCA-3′(反向；SEQ IDNO：44)。
在1％琼脂糖凝胶上分级分离10微升每种RT-PCR产物。通过大小、限制性酶消化以及DNA测序，证实RT-PCR产物的身份。
集落形成的软琼脂试验
对于软琼脂集落形成试验，在首先覆盖有一层琼脂(0.5％)的96孔板中培养细胞。在含有10％FBS的培养基中培养细胞。将5×103细胞接种进100μl 0.35％琼脂糖中，并接种到0.5％琼脂糖基底层上。将100μl补充了血清的、含有药物或抗体的培养基加到上面，每3天更换。于37℃在保湿培养箱中温育该板。10天以后，加入
Figure BDA00001770713200681
(1∶10体积试剂，Invitrogen)，并在37℃温育4小时，随后在530nm的激发波长和590nm的发射波长测量荧光。
软琼脂生长试验
为了进行软琼脂集落形成试验，将50μl在含有血清的培养基中的0.5％琼脂糖铺到96孔平底微量培养板的每个孔中，作为基底琼脂层。接下来，将5×103个细胞(在100μl 0.35％琼脂糖于含血清培养基中的混合物中)铺板到基底层上。随后，加入100μl培养基，以防止琼脂糖凝胶干燥。对于抗体处理，将指示浓度的抗体加入到上琼脂层和培养基中，以保证细胞完全暴露于抗体。于37℃在保湿培养箱中温育该板。每3天更换包括抗体的上层培养基。10天后，将20μl  5mg/ml MTT(Sigma Chemical Company，St Louis，MO，USA)加入每孔中，并于37℃温育4小时，随后加入100μl酸化的裂解缓冲液(在10％SDS中的0.01％HCl)。于42℃温育该板，以保证均匀混合。简短摇动该板，然后使用SynergyTM2多模式微量培养板读数器(BioTek instruments，Inc.，Vermont，USA)在595nm(检验波长)和690nm(参考波长)读数。
统计学
所有实验重复3-4次。将所有数字数据表示为来自一式三份地进行的代表性实验的平均值±SEM(平均值标准误差)，并使用Microsoft ExcelXP，通过Student氏t检验评估统计分析。
基质胶TM内的3D培养
对于3D基质胶TM培养，通过胰蛋白酶消化来收获单层培养的细胞，在完全培养基中悬浮，并通过巴斯德移液器分离若干次，成为单细胞悬浮液。这以后，将50μl含有5,000个细胞的完全培养基加入150μl生长因子减少的基质胶TM(Becton Dickinson，Bedford，MA)中，所述基质胶TM用含有20％FBS的完全培养基进行1∶1稀释。轻轻混合它，置于用基质胶预涂覆的Nunc 4-孔载片上，并于37℃温育，直到基质胶固化。然后用完全培养基覆盖细胞，并于37℃在5％CO2下培养最多24天，其间每2天更换培养基。用光学显微术在随机选择的视野中计数类器官形成。
蛋白印迹分析
如以前所述(Liu和Lobie，2007)，使用下述抗体进行蛋白印迹分析：山羊抗-artemin多克隆抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)和小鼠抗-β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma，St Louis，MO)。
结果
artemin功能的拮抗会反转获得性他莫昔芬抗性
为了确定artemin功能的拮抗是否会反转乳癌细胞的他莫昔芬抗性，开发了他莫昔芬抗性的MCF-7细胞系(命名为TAMR)。在汉语10nM E2或1μM他莫昔芬的无雌激素的培养基中测量TAMS和TAMR细胞的生长共7天。TAMS细胞保持对E2的应答和他莫昔芬敏感性。相比而言，TAMR细胞表现出对E2的应答和他莫昔芬敏感性的损失(图1A)。然后对比了TAMS和TAMR细胞中的artemin表达。在没有他莫昔芬存在下，TAMR细胞中的artemin的mRNA和蛋白水平都比TAMS细胞增加。他莫昔芬显著地消除了TAMS细胞中的artemin表达。但是，TAMR细胞响应于他莫昔芬处理而在mRNA和蛋白水平保持升高的artemin表达(图1B)。
为了进一步确定artemin的功能在TAMR细胞中的功能，通过在软琼脂试验中的集落形成，测量了用单独的或与抗-artemin IgY相组合的他莫昔芬处理过的TAMR细胞的锚着非依赖性的生长。图1C证实，他莫昔芬处理不会影响TAMR细胞的集落形成，从而证实了这些细胞的获得性他莫昔芬抗性。单独的抗-artemin IgY使TAMR细胞的基础生长抑制了14％(图1C)。但是，使用抗-artemin抗体和他莫昔芬的联合处理使集落形成减少了28％，产生了与在用单独的他莫昔芬处理过的TAMS细胞中观察到的类似的效应。
讨论
已经提出，驱动信号传递途径的生长因子从根本上促进新形成的或获得性的内分泌抗性的发展(Arpino等人，2008；Massarweh和Schiff，2006)。但是，尚未确定生长因子信号传递途径在抗雌激素抗性中的临床关联性。
本工作首次证实，artemin功能的拮抗剂性可以反转抗雌激素抗性。不希望受任何理论的约束，上述结果提示，artemin功能的拮抗剂性会使细胞对抗-雌激素试剂(诸如他莫昔芬或氟维司群)的抑制作用重新敏化，实现细胞周期停止和药物诱发的细胞凋亡。
在上述的TAMR细胞中，artemin表达大幅增加，且不受他莫昔芬处理的影响。再次不希望受任何理论的约束，artemin表达在抗性时的增加提示，artemin信号传递变得重新活化，且可能促进TAMR细胞的生长。
值得注意的是，抗-artemin抗体处理对artemin的抑制显著地增加了抗雌激素在化学抗性的MCF-7细胞中的生长抑制活性，恢复了他莫昔芬抗性的细胞的他莫昔芬敏感性。因而，用artemin功能的拮抗剂进行处理会增加抗雌激素在乳癌细胞中的效力，恢复抗性的细胞对化学疗法的敏感性。认为artemin的抑制是用于治疗抗性乳癌的新颖的辅助治疗方案。本发明认识到，artemin的治疗靶向可以用于反转抗雌激素抗性，这又可以降低乳癌相关的死亡率。
实施例2
材料和方法
细胞培养
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得乳癌细胞系BT549，并在保湿气氛中在5％CO2下在37℃在补充了10％FBS(FBS，Invitrogen)的RPMI-1640中培养。
在选择压力(40nM紫杉醇)下连续培养紫杉醇抗性的细胞系4天，然后更换为无紫杉醇的培养基培养另外4天。这重复进行4个循环，直到建立抗性。以后，将紫杉醇抗性的细胞转移至无紫杉醇的培养基中5-7天，然后进行实验。
细胞功能试验
如上面在实施例1中所述，进行细胞生存、软琼脂集落形成试验和3D基质胶生长试验。对于细胞生存试验，将3000个细胞接种进100ul培养基(2％FBS)中，每24h测定存活力。
试剂
阿尔玛蓝购自Invitrogen。泰素来自Sigma。基质胶购自BDBiosciences 。
蛋白印迹分析
如上面在实施例1中所述，进行蛋白印迹分析。
结果
artemin功能的拮抗会反转乳癌细胞的获得性紫杉醇抗性
为了测定artemin功能的拮抗是否会反转乳癌细胞的紫杉醇抗性，开发了紫杉醇抗性的BT549细胞系(命名为BT549-PTX Res)。抗性的亚系与亲代系的差别在于，它对紫杉醇的敏感性降低了近2倍。与对照BT549-野生型细胞相比，BT549PTX Res细胞在单层培养物中表现出更散乱的、伸长的和间质的细胞形态学。当在3D基质胶中培养时，对照BT549野生型细胞产生局限性的集落，而BT549-PTX Res细胞表现出比对照细胞更乱的结构，并且大量PTX Res细胞从集落主体扩散开(图2A)。
对PTX Res和对照野生型细胞(±紫杉醇)中的ARTN蛋白表达进行蛋白印迹，以表征这些乳癌细胞中的ARTN表达。与对照野生型细胞(±紫杉醇)相比，在PTX Res细胞中观察到增加的ARTN表达。此外，与没有紫杉醇的野生型细胞相比，紫杉醇的存在也增加了野生型细胞中的ARTN表达(图2B)。因而，ARTN表达在乳癌细胞的紫杉醇抗性中增加。
与紫杉醇敏感的细胞相比，紫杉醇抗性的细胞在单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长中表现出增加。与紫杉醇敏感的细胞相比，紫杉醇抗性的细胞也在单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长中表现出对紫杉醇的更低敏感性(图2C、D、E)。
采用siRNA来分别剥夺BT549PTX Res和野生型细胞中的ARTN。靶向ARTN的siRNA有效地剥夺2个细胞对中的ARTN表达(图2B)，而杂乱的siRNA(siCONT)的转染对ARTN表达没有影响。
ARTN的剥夺会降低BT549野生型细胞的单层增殖、在软琼脂中的集落形成、3D基质胶生长的基础能力。ARTN的剥夺也会消除或在很大程度上废除紫杉醇抗性细胞(BT549PTX Res细胞)在有和没有紫杉醇存在下在单层增殖、在软琼脂中的集落形成、3D基质胶生长中的增强的活性(图2C、D和E)。组合的ARTN剥夺和紫杉醇施用会将单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长的水平进一步降低至在用紫杉醇处理过的紫杉醇敏感细胞中观察到的水平。因而，artermin的功能拮抗(在本案中，通过ARTN的剥夺)会反转对紫杉醇的获得性抗性。
实施例3
材料和方法
细胞培养
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得MDA-MB-231乳癌细胞系。在保湿气氛中在5％CO2下在37℃在补充了10％FBS(FBS，Invitrogen)的RPMI-1640中培养MDA-MB-231和BT549细胞系。
每天将电离辐射(IR)抗性的细胞系暴露于IR(4Gy Co60γ-辐射)，持续4天，然后在没有辐射下培养另外4天。这重复进行6个循环，直到建立抗性。以后，在无辐射条件下培养IR抗性的细胞5-7天，然后进行实验。如上面在实施例1中所述，使用针对ARTN的siRNA。
如上面在实施例2中所述，进行所有试剂、蛋白印迹分析和细胞功能和存活力试验。
结果
artemin功能的拮抗会反转乳癌细胞的电离辐射抗性
为了确定artemin功能的拮抗是否会反转乳癌细胞对电离辐射(IR)的抗性，开发了IR抗性的MDA-MB-231和BT549细胞系(分别命名为MDA-MB-231IR Res和BT549-IR Res)。
IR抗性的亚系与亲代系的差别在于，它们对IR的敏感性降低了近1.8倍。
对两对IR Res和对照野生型细胞(±辐照)中的ARTN蛋白表达进行蛋白印迹，以表征这些乳癌细胞中的ARTN表达。与具有辐照的各个野生型细胞相比，在两对IR Res细胞中观察到增加的ARTN表达(图3A；左图)。因而，ARTN表达在乳癌细胞的IR抗性中增加。
与IR敏感的细胞相比，IR抗性的细胞在单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长中表现出增加。与IR敏感的细胞相比，IR抗性的细胞也在单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长中表现出对IR的更低敏感性(图3B、C、D)。
采用siRNA来分别剥夺BT549和MDA-MB-231IR抗性的和野生型细胞中的ARTN。靶向ARTN的siRNA有效地剥夺每个细胞对中的ARTN表达(图3A；右图)，而杂乱的siRNA(siCONT)的转染对ARTN表达没有影响。
ARTN的剥夺会降低BT549和MDA-MB-231-野生型(IR敏感的)细胞的单层增殖、在软琼脂中的集落形成、3D基质胶生长的基础能力。ARTN的剥夺也会消除或在很大程度上废除IR抗性的细胞在有和没有IR处理下在单层增殖、在软琼脂中的集落形成、3D基质胶生长中的增强的活性(图3B、C、D)。组合的ARTN剥夺和IR处理会将单层增殖、在软琼脂中的集落形成和3D基质胶生长的水平进一步降低至在用IR处理过的IR敏感细胞中观察到的水平。因而，artermin的功能拮抗(在本案中，通过ARTN的剥夺)会反转对IR的获得性抗性。
在本文中已经参考某些优选的实施方案描述了本发明，以便帮助读者无需过多实验而实践本发明。然而，本领域普通技术人员将容易地认识到，可改变或修改许多组分和参数到某一程度，而不悖离本发明的范围。此外，提供名称、标题等以提高读者对本文件的理解，它们不应被理解为限制本发明的范围。
在上面和在下面(如果有的话)引用的所有专利申请、专利和出版物的全部公开内容通过引用整体并入本文中。参考文献
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Claims (42)

1.一种完全地或部分地反转负荷乳腺癌的患者对癌症治疗剂的抗性的方法，所述方法包括抑制所述患者的artemin功能性的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过给所述患者施用artemin功能的拮抗剂来抑制artemin功能性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述artemin功能的拮抗剂是反义多核苷酸、RNAi多核苷酸或能够抑制artemin功能性的抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体(mAb)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述RNAi多核苷酸是siRNA多核苷酸或shRNA多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述siRNA多核苷酸包含SEQ IDNO：38的12个或更多个连续核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中已经诱导或介导了对它的抗性的癌症治疗剂是化学治疗剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂是雌激素受体拮抗剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述雌激素受体拮抗剂是他莫昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、阿佐昔芬、雷洛昔芬或氟维司群。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂是芳香酶抑制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述芳香酶抑制剂是福美坦、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑或依西美坦。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤对它具有抗性的化学治疗剂选自：有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、埃博霉素、拓扑异构酶I型抑制剂、拓扑异构酶II型抑制剂、蒽环类抗生素、蒽二酮、抗代谢物包括二氢叶酸还原酶抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、腺苷脱氨酶抑制剂、卤代的或核糖核苷酸还原酶抑制剂、硫代嘌呤、胸苷酸合酶抑制剂、DNA聚合酶抑制剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、次甲基化剂和核糖核苷酸还原酶抑制剂、细胞周期非特异性的抗肿瘤剂包括烷基化剂、氮芥、亚硝基脲、链佐星、烷基磺酸盐类、氮丙啶、类烷基化剂、铂试剂、肼、三氮烯、链霉素、光敏化剂、卟啉衍生物、酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、IMP脱氢酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、PARP抑制剂、受体拮抗剂、类视色素X受体拮抗剂、安吖啶、曲贝替定、类视色素、三氧化二砷、天冬酰胺清除剂、塞来考昔、秋水仙胺、elesclomol、依沙芦星、依托格鲁和氯尼达明。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤对它具有的抗性的化学治疗剂是辐射治疗。
14.一种使负荷乳腺癌的患者的肿瘤重新敏化的方法，所述肿瘤对用癌症治疗剂进行治疗具有抗性或者据预测将会或变成对用癌症治疗剂进行治疗具有抗性，所述方法包括抑制所述患者的artemin功能性的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中由于在所述肿瘤内或在所述患者体内存在升高水平的artemin，包括在来自所述患者的样品内存在升高水平的artemin，所述肿瘤对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂具有抗性。
16.一种治疗负荷乳腺癌的患者的方法，所述患者的肿瘤对癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对癌症治疗剂具有抗性，所述方法包括下述步骤：
(a)抑制所述患者的artemin功能性；以及
(b)以有效地诱导抗肿瘤效应的量来施用癌症治疗剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)使所述肿瘤对治疗重新敏化或反转所述抗性。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中施用的所述癌症治疗剂与所述肿瘤对它具有抗性或者据预测将会或变成对它具有抗性的癌症治疗剂相同。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中施用的所述癌症治疗剂与所述肿瘤对它具有抗性或者据预测将会或变成对它具有抗性的癌症治疗剂不同。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中通过施用选自下述的artemin功能的拮抗剂来抑制所述患者的artemin功能性：反义多核苷酸、RNAi多核苷酸或能够抑制artemin功能性的抗体。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中在施用所述癌症治疗剂之前，抑制artemin功能性。
22.一种治疗负荷肿瘤的患者的方法，所述患者已经进行预先治疗以抑制artemin功能性，所述方法包括：给所述患者施用在所述患者中有效地诱导抗肿瘤效应的量的癌症治疗剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述预先治疗的患者对所述癌症治疗剂具有抗性或者据预测将会或变成对所述癌症治疗剂具有抗性。
24.一种使一个或多个对治疗具有抗性的乳腺癌细胞重新敏化的方法，所述方法包括：将有效量的artemin功能的拮抗剂施用给所述一个或多个癌细胞。
25.一种抑制一个或多个乳腺癌细胞的方法，其中所述一个或多个癌细胞对治疗具有抗性，所述方法包括：给所述一个或多个癌细胞施用artemin功能的拮抗剂和治疗剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是生长的抑制，包括锚着非依赖性的生长的抑制。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是细胞存活的抑制。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是增殖的抑制。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是有丝分裂的抑制。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是细胞周期进展的抑制。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是转移的抑制。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是细胞能动性的抑制。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述抑制是细胞凋亡的诱导。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述施用是同时的、顺序的或分开的。
35.一种artemin功能的拮抗剂，其用于使一个或多个癌细胞对用癌症治疗剂进行治疗重新敏化。
36.artemin功能的拮抗剂在制备药剂中的用途，所述药剂用于使一个或多个癌细胞对用癌症治疗剂进行治疗重新敏化。
37.一种用于反转癌细胞对用癌症治疗剂进行治疗的抗性的组合物，所述组合物包含artemin功能的拮抗剂。
38.根据权利要求37所述的组合物，其包含artemin功能的拮抗剂和一种或多种癌症治疗剂。
39.一种测定或监测受试者的一个或多个癌细胞对治疗剂的抗性的方法，所述方法包括：使包含来自所述受试者的一个或多个癌细胞的样品接触artemin功能的拮抗剂和所述治疗剂，以及测量所述一个或多个癌细胞的抑制。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法另外包括：在没有artemin功能的拮抗剂存在下，使包含来自所述受试者的一个或多个癌细胞的样品接触所述治疗剂，以及测量所述一个或多个癌细胞的抑制。
41.一种测定BCL2介导的抗性在表现出这种抗性的癌细胞中的存在或程度的方法，所述方法包括：给具有抗性的癌细胞施用artemin功能的拮抗剂和癌症治疗剂，以及测量癌细胞存活、癌细胞能动性、癌细胞增殖、癌细胞有丝分裂、细胞周期进展、癌细胞转移或癌细胞的细胞凋亡中的一项或多项。
42.一种区分一个或多个癌细胞对癌症治疗的BCL2介导的抗性和对所述癌症治疗的非BCL2介导的抗性的方法，所述方法包括：施用有效量的artemin功能的拮抗剂和所述癌细胞对它具有抗性的癌症治疗剂，以及测量癌细胞存活、癌细胞能动性、癌细胞增殖、癌细胞有丝分裂、细胞周期进展、癌细胞转移或癌细胞的细胞凋亡中的一项或多项。
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