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CN102695955A - 检测抗-tnf药物和自身抗体的试验 - Google Patents

检测抗-tnf药物和自身抗体的试验 Download PDF

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CN102695955A CN2010800604425A CN201080060442A CN102695955A CN 102695955 A CN102695955 A CN 102695955A CN 2010800604425 A CN2010800604425 A CN 2010800604425A CN 201080060442 A CN201080060442 A CN 201080060442A CN 102695955 A CN102695955 A CN 102695955A
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Abstract

本发明提供检测和测量样品中抗-TNFα药物治疗和自身抗体的存在或水平的方法。本发明可用于最优化治疗和监测接受抗-TNFα药物治疗患者以检测抗药物的自身抗体(如HACA和/或HAHA)的存在或水平。

Description

检测抗-TNF药物和自身抗体的试验
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年10月26日递交的美国临时申请号61/255,048，2009年11月19日递交的美国临时申请号61/262,877，2010年4月15日递交的美国临时申请号61/324,635，2010年5月17日递交的美国临时申请号61/345,567，2010年6月3日递交的美国临时申请号61/351,269，2010年10月4日递交的美国临时申请号61/389,672和2010年10月15日递交的美国临时专利申请号61/393,581的优先权，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。
发明背景
自身免疫疾病是重要和广泛传播的医学难题。例如，类风湿关节炎(RA)是一种影响到200万以上美国人的自身免疫疾病。RA引起关节慢性炎症且通常为进行性疾病，可能导致关节破坏和功能残疾。类风湿关节炎的病因未知，但该病的病因学涉及遗传倾向、传染因子和环境因素。活跃性RA的症状包括疲劳、缺乏食欲、低烧、肌肉关节疼痛和僵硬。还有在该病突发过程中，由于滑膜炎症，关节经常红肿、疼痛和触痛。此外，由于RA是全身性疾病，炎症可能影响关节以外的机体器官和区域，包括眼睛和口腔的腺体、肺衬膜、心包膜和血管。
处理RA和其他自身免疫疾病的传统疗法包括采用作用快速的“第一线药物”和作用较慢的“第二线药物”。第一线药物能减轻疼痛和炎症。这类第一线药物的示例包括可口服给药或直接注射入组织和关节的阿斯匹林、萘普生、布洛芬、依托度酸和其他非类固醇消炎药(NSAID)，以及皮质激素。第二线药物能促进疾病缓解，防止关节进行性破坏，也称为改良疾病抗类风湿药物或DMARD。第二线药物的示例包括：金、氢化氯奎、柳氮磺吡啶，和免疫抑制剂，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和环孢霉素。然而，这些药物中的许多有有害的副作用。因此，已在寻找对类风湿关节炎和其他自身免疫失调的其他疗法。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由许多细胞类型包括单核细胞和巨噬细胞所产生的一种细胞因子，起初是根据它能诱导某些小鼠肿瘤坏死而鉴定。后来，与恶病质有关的称为恶液质的因子显示与TNF-α相同。TNF-α在病理生理学上涉及到多种其他人类疾病和失调，包括休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病。
由于人TNF-α(hTNF-α)在多种人类失调中起有害作用，已设计了治疗策略来抑制或对抗hTNF-α的活性。具体说，已寻找到能抑制和中和hTNF-α活性的抗体，作为抑制hTNF-α的工具。一些最早的这类抗体是用hTNF-α免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤所分泌的小鼠单克隆抗体(mAb)(参见Moeller等人的美国专利号5,231,024)。虽然这些小鼠抗-hTNF-α抗体常常显示对hTNF-α有高亲和力能中和hTNF-α的活性，但小鼠抗体给予人所产生的相关问题，如血清半衰期短、不能触发人类某些效应器的功能和在人体中引发产生抗小鼠抗体的不良免疫应答(“人抗-小鼠抗体”(HAMA)反应)限制了其体内应用。
近年来，已采用生物学疗法来治疗自身免疫疾失调如类风湿关节炎。例如，四种TNF-α抑制剂：嵌合性抗-TNF-αmAb REMICADETM(英夫利昔单抗)，TNFR-IgFc融合蛋白ENBRELTM(依那西普)，人抗-TNFαmAb HUMIRATM(阿达木单抗)和PEG化(PEGylated)的Fab片段--CIMZIA(赛妥珠单抗)已经FDA批准用于治疗类风湿关节炎。CIMZIA
Figure BPA00001573238200022
也用于治疗中等至严重的克罗恩病(CD)。虽然已证明这些生物治疗剂能成功地治疗类风湿关节炎和其他自身免疫疾病如CD，但不是所有的治疗对象对这种治疗有反应或反应良好。而且，给予TNF-α抑制剂可能会诱导对该药物的免疫应答，导致产生自身抗体，如人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。这类HACA、HAHA或HAMA免疫应答可能与免疫治疗TNF-α抑制剂的超敏反应和药代动力学显著改变和生物扰乱相关，阻碍了用该类药物作进一步治疗。因此，本领域需要检测患者样品中存在抗-TNF-α生物制剂和/或其自身抗体的试验，以监视TNF-α抑制剂的治疗效果和指导治疗决策。本发明满足了这种需求并提供相关的效益。
发明概述
已证明TNF-α涉及炎症疾病，自身免疫疾病，病毒、细菌和寄生虫感染，恶性肿瘤和/或神经变性疾病，它是采用特异性生物学方法治疗疾病，如类风湿关节炎和克罗恩病的有用靶标。TNF-α抑制剂，如抗-TNFα抗体是一类重要的治疗剂。因此，需要检测存在抗-TNFα生物制剂和/或及自身抗体的试验方法。
因此，在一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记TNFα与含有或怀疑含有抗-TNFα药物的样品接触，形成含抗-TNFα药物的标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中标记TNFα和抗-TNFα药物彼此不共价结合)；
(b)标记复合物进行分子大小排阻层析以(如从游离的标记TNFα中)分离标记的复合物；和
(c)检测标记的复合物，从而检测抗-TNFα药物的存在或水平。
在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNFα药物治疗对象的样品中REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)和CIMZIA
Figure BPA00001573238200031
(赛妥珠单抗)的水平。
在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记抗-TNFα药物与含有或怀疑含有抗-TNFα药物自身抗体的样品接触，形成含自身抗体的标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中标记抗-TNFα药物与自身抗体彼此不共价结合)；
(b)标记复合物进行分子大小排阻层析以(如从游离的标记TNFα药物中)分离标记的复合物；和
(c)检测标记的复合物，从而检测自身抗体的存在或水平。
在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNFα药物治疗对象样品中的自身抗体水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。
在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记抗-TNFα药物和标记TNFα与含有或怀疑含有抗-TNFα药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFα药物、标记TNFα与自身抗体之间形成第一标记复合物(即免疫复合物或偶联物)；(其中第一标记复合物的组分彼此不共价结合)和在标记抗-TNFα药物与自身抗体之间形成第二标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中第二标记复合物的组分彼此不共价结合)，其中标记抗-TNFα药物和标记TNFα所含的标记不相同；
(b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析，以分离第一标记复合物与第二标记复合物(例如彼此分离，和与游离的标记TNFα和游离的标记抗-TNFα药物分离)；和
(c)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当第一标记复合物和第二标记复合物都存在时，检测非中和形式自身抗体(即不干扰抗-TNFα药物与TNFα之间结合的自身抗体)的存在或水平；当只存在第二标记复合物时，检测中和形式自身抗体(即干扰抗-TNFα药物与TNFα之间结合的自身抗体)的存在或水平。
在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNFα药物治疗对象样品中的自身抗体水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。
在一个相关实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记抗-TNFα药物与含有或怀疑含有抗-TNFα药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFα药物与自身抗体之间形成第一标记复合物(即免疫复合物或偶联物)(其中标记抗-TNFα药物与自身抗体彼此不共价结合)；
(b)第一标记复合物进行分子大小排阻层析，以(如从游离的标记抗-TNFα药物中)分离第一标记复合物；
(c)检测第一标记复合物，从而检测存在的自身抗体或其水平；
(d)使标记TNFα与第一标记复合物接触，在标记TNFα药物与标记TNFα之间形成第二标记复合物(即免疫复合物或偶联物)(其中标记抗-TNFα药物与标记TNFα彼此不共价结合)，其中标记TNFα药物与标记TNFα所含的标记不相同；
(e)第二标记复合物进行第二分子大小排阻层析，以(如从游离的标记TNFα中)分离第二标记复合物；和
(f)检测第二标记复合物，从而检测中和形式的自身抗体(即干扰抗-TNFα药物与TNF-α之间结合的自身抗体)的存在或水平。
在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNFα药物治疗对象样品中的自身抗体的水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。
在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象提供确定抗-TNFα药物有效量的方法，所述方法包括：
(a)测量对象第一样品中的抗-TNFα药物水平，包括：
(i)使第一样品接触一定量的标记TNFα，形成含标记TNFα与抗-TNFα药物的第一复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而测量抗-TNFα药物的水平；
(b)测量所述对象第二样品中抗-TNFα药物自身抗体的水平，包括：
(i)使第二样品接触一定量的标记抗-TNFα药物，形成含标记抗-TNFα药物与自身抗体的第二复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平；和
(c)从步骤(a)测得的抗-TNFα药物水平减去步骤(b)测得的自身抗体水平，从而测得抗-TNFα药物的有效量。
在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：
(a)按照本发明方法测定抗-TNFα药物的有效量；
(b)比较抗-TNFα药物的有效量与抗-TNFα药物的水平；和
(c)根据步骤(b)的比较，确定抗-TNFα药物的后续剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。
在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括：：
(a)测定所述对象第一样品中的抗-TNFα药物水平；
(b)测定所述对象第二样品中抗-TNFα药物自身抗体的水平；和
(c)根据抗-TNFα药物和自身抗体水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化抗-TNFα药物的治疗和/或减轻其毒性。
在另一个实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFα药物的样品中抗-TNFα药物的存在或水平的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照接触样品，形成标记TNFα与抗-TNFα药物的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记TNFα和标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)用标记TNFα的量除以标记内部对照的量确定第一比率；
(f)用步骤(c)测得的积分除以步骤(d)测得的积分确定第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照确定抗-TNFα药物的存在或水平
在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：根据上面章节步骤(e)的标记TNFα与标记内部对照比率和上面章节步骤(f)的标记TNFα与标记内部对照比率的比较，确定所述对象抗-TNFα药物的后续剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。
在某些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对照与样品接触，形成标记抗-TNFα药物与自身抗体的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记抗-TNFα和标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记抗-TNFα药物峰曲线下面积的积分；
(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)将标记抗-TNFα药物含量除以标记内部对照含量，测得第一比率；和
(f)除以步骤(c)和(d)所得的积分，测得第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照确定自身抗体的存在或水平。
在另一个实施方式中，本发明提供测定样品中抗-TNFα药物的存在或水平，和抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)含一定量的标记TNFα的第一检测底物；
(b)含一定量的标记抗-TNFα的第二检测底物；
(c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照；
(d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNFα药物α和一定量的标记内部对照；
(e)任选的提取对象样品的工具；和
(f)任选的使用该试剂盒的说明书小册。
本领域技术人员通过阅读以下详述和附图说明将会明白本发明的其他目的、特征和优点。
附图简要说明
图1.显示本发明试验的示例实施方式，其中采用分子大小排阻HPLC来检测TNFα-Alexa647与HUMIRATM之间的结合。
图2.显示HUMIRATM与TNFα-Alexa647结合的剂量响应曲线
图3.显示目前检测HACA水平的基于ELISA的方法，称为桥连试验。
图4.本发明检测产生的抗REMICADETM的HACA/HAHA自身抗体试验的示例概要图解说明。
图5.显示结合REMICADETM-Alexa647的抗-人IgG抗体的剂量响应分析。
图6.显示结合REMICADETM-Alexa647的抗-人IgG抗体的第二剂量响应分析。
图7.显示结合REMICADETM-Alexa647的抗-人IgG抗体的剂量响应曲线。
图8.显示正常人血清和HACA阳性血清中形成的REMICADETM-Alexa647免疫复合物。
图9.提供用本发明的桥连试验或迁移改变试验(mobility shift assay)，检测20位患者血清样品HACA的概况。
图10.提供用目前检测HACA血清浓度的方法与本发明新颖HACA试验方法的概况和比较。
图11.显示荧光(F1)标记的IFX与正常(NHS)或HACA-阳性血清孵育的SE-HPLC图。在孵育的混合液中加入递增量的HACA-阳性血清导致IFX-F1峰以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置C1和C2。
图12.显示用迁移改变试验测定的，随着HACA-阳性血清的稀释度增加所产生的结合和游离的IFX-F1的剂量响应曲线。(A)稀释度递增的HACA-阳性血清与37.5ng的IFX-F1一起孵育。SE-HPLC分析发现，稀释度越高(HACA越低)，游离的IFX-F1越多。(B)稀释度递增的HACA-阳性血清与37.5ng的IFX-F1一起孵育。SE-HPLC分析发现稀释度越高(HACA越低)，HACA所结合的IFX-F1越少。
图13.显示TNFα-F1与正常(NHS)或掺入IFX的血清一起孵育的SE-HPLC图。在孵育混合液中加入递增量的IFX的血清导致荧光TNFα峰以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置。
图14.显示用迁移改变试验测定的，随着掺入IFX的血清的稀释度增加所产生的结合和游离的TNFα的剂量响应曲线。将递增浓度的IFX加到孵育混合液中降低了游离的TNFα的百分比同时提高了结合的TNFα的百分比。
图15.显示在不同时间点以迁移改变试验测定的，用IFX治疗的IBD患者血清的相对HACA水平和IFX浓度。
图16.显示患者的处理-在不同时间点检测用IFX治疗的IBD患者血清的HACA水平和IFX浓度。
图17.显示本发明检测(A)非中和抗体或(B)中和抗体，如HACA的存在的试验的示例实施方式。
图18.显示本发明检测中和性自身抗体如HACA的存在的试验的一种替代实施方式。
图19.显示在存在不同含量抗人-IgG时F1-标记的ADL与正常人血清(NHS)一起孵育后的迁移改变图。在孵育混合液中加入递增量的抗-人IgG，导致游离的F1-ADL峰(FA)以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置C1和C2，而内部对照(IC)位置不变。
图20.显示抗-人IgG对游离F1-ADL的迁移的剂量响应曲线。取递增量的抗-人IgG与37.5ng的F1-ADL和内部对照一起孵育。反应混合液中加入的该抗体越多，游离的F 1-ADL与内部对照的比例越低。
图21.显示在存在不同含量ADL时，F1-标记TNF-α与正常人血清(NHS)一起孵育后的迁移改变图。Ex＝494nm；Em＝519nm。在孵育混合液中加入递增量的ADL，导致游离的TNF-F1峰(F1)以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置，而内部对照(IC)峰位置不变。
图22.显示ADL对游离的TNF-α-F1迁移的剂量响应曲线。递增量的ADL与100ng的TNF-α-F1和内部对照一起孵育。反应混合液中加入的抗体ADL越多，游离的TNF-α-F1与内部对照的比例越低。
图23.显示F1标记的Remicade(IFX)与正常(NHS)或HACA阳性患者混合血清孵育后的迁移改变分布。
图24.显示F1标记的HUMIRA(ADL)与正常(NHS)或小鼠抗-人IgG抗体孵育后的迁移改变分布。
图25.显示F1标记的HUMIRA(ADL)与正常(NHS)或HACA阳性患者混合血清孵育后的迁移改变概况。
发明详述
I.引言
本发明部分根据以下发现：采用分子大小排阻层析的同质迁移改变试验特别有利于检测TNFα抑制剂以及针对它们所产生的自身抗体(如HACA、HAHA等)的存在或水平。具体说，本发明提供不需要任何洗涤步骤的“混和与读取”试验。因此，易于彼此区分复杂的与不复杂的蛋白质疗法。此外，采用本发明的试验可最大程度减少游离药物的任何可能的干扰。相反，检测HACA或HAHA水平的经典ELISA要到机体清除TNFα抑制剂后才能进行，这可能要花费多达3个月时间。而且，除了抗-TNFα抗体，本发明一般还可用于各种蛋白质治疗药物。本发明的试验还具有其他优点，因为不需要使抗原吸附到固体表面上从而可消除无关IgG的非特异性结合，可检测亲和力弱的抗体，和显示灵敏度和特异性高于目前可用的检测方法，如酶免疫试验。
检测抗-TNFα生物药物以及其他免疫治疗药物血清浓度的重要性可从以下事实得到证明：FDA要求在临床试验期间进行药代动力学和药物耐受性(如免疫应答)研究。还发现本发明可用于监测接受这些药物治疗的患者以确保他们得到正确的剂量，这种正确剂量使药物不会被机体清除太快，患者不会产生针对该药物的免疫应答。此外，本发明可用于指导由于先前药物失效而在不同的药物之间的切换。
II.定义
本文所用的以下术语具有它们本身的含义，除非另有说明。
本文所用的术语“抗-TNFα药物”或“TNFα抑制剂”旨在包括通过例如抑制TNFα与其细胞表面受体相互作用、抑制TNFα蛋白的产生、抑制TNFα基因的表达、抑制细胞分泌TNFα、抑制TNFα受体的信号传导、或可导致对象TNFα活性降低的任何其他手段能直接或间接抑制TNFα活性的试剂、包括蛋白质、抗体、抗体片段、融合蛋白(如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(如DVDIg)、小分子TNFα拮抗剂和其相似的天然或非天然产生的分子和/或重组和/或工程改造形式。术语“抗-TNFα药物”或“TNFα抑制剂”优选包括能干扰TNFα活性的制剂。TNFα抑制剂的例子包括依那西普(ENBRELTM，安进公司(Amgen))、英夫利昔单抗(REMICADETM，强生公司(Johnson and Johnson))、人抗-TNFα单克隆抗体-阿达木单抗(D2E7/HUMIRATM，雅培公司(AbbottLaboratories))、赛妥珠单抗(CIMZIA
Figure BPA00001573238200101
UCB公司)、CDP 571(克隆泰克(Celltech)公司)和CDP 870(克隆泰克公司)以及能抑制TNFα活性的其他化合物，从而当给予患有或有风险患有TNFα活性受损的失调(如RA)的对象时能治疗该失调。
本文术语“预计对TNFα抑制剂的治疗有反应”意指评估用TNFα抑制剂治疗对象可能有效或可能无效的可能性(如向对象提供可衡量的药效)。具体说，通常是在治疗开始后观察到对象出现治疗有效的指标(如有可衡量药效的指标)时方能评估治疗可能有效或无效。特别优选的TNFα抑制剂是已得到FDA批准用于治疗TNFα介导的人类疾病或失调，如类风湿关节炎或炎性肠病(IBD)的生物制剂，这类制剂包括：阿达木单抗(HUMIRATM)、英夫利昔单抗(REMICADETM)、依那西普(ENBRELTM)和赛妥珠单抗(CIMZIA
Figure BPA00001573238200111
UCB公司)。
术语“分子大小排阻层析”(SEC)意思包括依据分子的大小和/或流体动力学体积分离溶液中的分子的层析方法。可将其应用于大分子或高分子复合物，如蛋白质及其偶联物。通常采用水溶液来转运样品使之通过层析柱，这种技术也称为凝胶过滤层析。
术语“复合物”，“免疫复合物”，“偶联物”和“免疫偶联物”包括但不限于：TNFα结合(如通过非共价键)于抗-TNFα药物，抗-TNFα药物结合(如通过非共价键)于抗-TNFα药物的自身抗体，和抗-TNFα药物结合(如通过非共价键)于TNFα和抗-TNFα药物的自身抗体二者。
本文所用术语“标记的”所修饰的物质包括与经验上可检测的另一种分子或化学物偶联的任何物质、分子、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关物质。适合用作标记来标记物质的化学物包括但不限于：荧光染料，如AlexaFluor染料、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200113
647染料、量子斑点、发光染料、发冷光染料和放射性核素，如125I。
术语“有效量”包括能在需要的对象中达到治疗效果的药物剂量，以及物质的生物可利用量。术语“生物可利用的”包括给药剂量中有治疗活性的组分(分数)。例如，用于治疗病理生理学上涉及TNFα的疾病和失调，包括但不限于：休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主疾病的药物有效量，可以是能防止或减轻一种或多种该疾病相关症状的用量。
短语“曲线下面积”是数学术语，用于描述两维图像中一部分的积分。例如，在作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图中，图中各个峰表示检测到特定分子。这些峰的积分，包括y轴最小值，如两维图像的基线围绕的面积和两维图像本身围绕的面积积分。同样也可用计算公式：曲线下面积＝∫a bf(x)dx来描述峰的积分，f(x)是两维图像的函数，变量“a”和“b”表示x-轴峰积分的界线。
短语“荧光标记的检测”包括检测荧光标记物的工具。该检测工具包括但不限于：分光光度计、荧光光度计、光度计，经常与层析仪合用的检测工具，例如但不限于：分子大小排阻高效液相层析仪，例如但不限于Agilent-1200HPLC系统。
括弧“[]”表示参见该括弧内的物质浓度。
短语“最优化的治疗”包括最优化剂量(如有效用量或水平)和/或特定治疗类型的效果。例如，最优化抗-TNFα药物的剂量，包括增加或减少后续给予对象的抗-TNFα药物的用量。在某些情况下，最优化抗-TNFα药物的类型包括改变给予的抗-TNFα药物，从一种药物换成不同的药物(如不同的抗-TNFα药物)。在某些其他情况下，最优化治疗包括同时给予一种剂量的抗-TNFα药物(如增加、减少的剂量或与原先剂量相同的剂量)联用免疫抑制药物。
术语“同时给药”包括给予一种以上的活性制剂，从而一种活性制剂发挥生理效应的持续时间与第二种活性制剂发挥生理效应的时间相重叠。
术语“对象”、“患者”或“个体”通常指人，但是也指其他动物，例如包括其他灵长动物、啮齿动物、狗、猫、马、羊、猪等。
术语“治疗方案”包括采用能减轻或预防TNFα介导疾病或失调的相关一种或多种症状的治疗方法。该术语包括给予任何化合物、药物、程序和/或治疗方案，用于改善患TNFα介导疾病或失调个体的健康，包括本文所述的任何治疗剂。本领域技术人员懂得，可根据抗-TNFα药物和/或抗-TNFα药物自身抗体的存在和浓度水平，改变疗程或目前疗程的剂量。
术语“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”包括能产生免疫抑制作用的任何物质，例如通过照射或给予这类药物，如抗代谢药、抗淋巴血清、抗生素等可防止或减轻免疫应答反应。合适的免疫抑制药物包括但不限于：硫代嘌呤药物，如硫唑嘌呤(AZA)及其代谢产物；抗代谢药物，如氨甲喋呤(MTX)、西罗莫司(雷怕霉素)、坦西莫司、依维莫司、他克莫司(FK-506)、FK-778；抗-淋巴细胞抗体球蛋白、抗-胸腺细胞抗体球蛋白、抗-CD3抗体、抗CD4抗体和抗体-毒素偶联物、环孢霉素、霉酚酸酯、咪唑立宾一磷酸酯、蒿属香豆素、乙酸格拉默及其代谢产物、药学上可接受的盐、衍生物、前药和组合。
术语“硫代嘌呤药物”包括：硫唑嘌呤(AZA)、6-巯基嘌呤(6-MP)和其有治疗作用的任何代谢产物，包括但不限于：6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、6-甲基巯嘌呤苷、6-硫代肌苷核苷酸(如6-硫代肌苷一磷酸盐、6-硫代肌苷二磷酸盐、6-t硫代肌苷三磷酸盐)、6-硫代鸟嘌呤核苷酸(如6-硫代鸟苷一磷酸盐、6-硫代鸟苷二磷酸盐、6-硫代鸟苷三磷酸盐)、6-硫代黄苷核苷酸(如6-硫代黄苷一磷酸盐、6-硫代黄苷夺磷酸盐、6-硫代黄苷三磷酸盐)、其衍生物、同类物和组合。
术语“样品”包括获自个体的生物学标本。适合本发明所用的样品包括但不限于：全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪水、任何其他体液、组织样品(如活检)和其细胞提取物(如血液红细胞提取物)。在一优选实施方式中，所述样品是血清样品。本领域技术人员懂得，可在分析前稀释样品，如血清样品。在某些情况下，术语“样品”包括但不限于：血液、机体组织、血液的血清、淋巴液、淋巴结组织、脾组织、骨髓，或用这些组织的一种或多种衍生的富含免疫球蛋白的组分。在某些其他情况下，术语“样品”包括血液的血清，或从血液血清或血液衍生的富含免疫球蛋白的组分。在某些情况下，术语“样品”包括体液。
III.实施方式的描述
本发明方法的各步骤不需要以它们提出的特定顺序实施。本领域普通技术人员懂得本发明方法步骤的其他顺序包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记TNFα与含有或怀疑含有抗-TNFα药物的样品接触，与抗-TNFα药物形成标记的复合物；
(b)使标记的复合物通过分子大小排阻层析以分离所述标记复合物；和
(c)检测所述标记复合物，从而检测抗-TNFα药物。在某些情况下，所述方法尤其可用于以下的抗-TNFα抗体：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)和CIMZIA
Figure BPA00001573238200141
(赛妥珠单抗)。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种参与全身炎症的细胞因子，是能激发急性反应的一组细胞因子中的一个成员。在免疫细胞调控中TNFα起着重要作用。TNFα也能诱导细胞凋亡，从而诱导炎症和抑制肿瘤发生及病毒复制。TNFα制剂主要是长212个氨基酸的II型跨膜蛋白，为稳定的同质三聚体。
本文所用的术语“TNFα”意指包括以17kDa分泌蛋白形式和26kDa膜结合形式存在的一种人细胞因子，其生物学活性形式是17kDa分子的非共价结合三聚体。TNFα结构的进一步描述可参见，例如Jones等人(1989)，Nature，338：225-228。术语TNFα的意思包括：人TNFα、重组的人TNFα(rhTNFα)或与人TNFα蛋白至少有约80％相同。人TNFα由35个氨基酸的胞浆结构域、21个氨基酸的跨膜区段和177个氨基酸的胞外结构域(ECD)组成(Pennica，D等(1984)Nature 312：724)。在ECD内，人TNFα与恒河猴的氨基酸序列有97％相同，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠TNFα的氨基酸序列有71％-92％相同。可用标准的重组表达方法制备或购买其商品(R&D系统(R&DSystems)公司，产品分类号210-TA，明尼苏达州明尼阿波利斯)。
在某些实施方式中，“TNFα”是一种“抗原”，是能被抗-TNFα抗体结合的一种分子或该分子的一部分。TNF-α可含有一个或一个以上的表位。在某些情况下，TNFα以高选择性方式与抗TNFα抗体反应。优选的能结合本发明抗-TNFα抗体、片段和区域的抗原包含SEQ ID NO：1中的至少5个氨基酸。在某些情况下，TNFα的长度足够包含TNFα的一个表位，从而能结合抗-TNFα抗体、其片段和区域。
在某些实施方式中，含有结合抗-TNFα抗体、其片段和区域的长度足够的表位的TNFα长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220个氨基酸。在一种些实施方式中，所用的TNFα包含SEQ ID NO：1的77-233残基。
在某些情况下，至少标记TNFα可溶性部分，即SEQ ID NO：1的残基77-233中的一个氨基酸。在某些情况下，采用胺反应活性荧光团衍生物。在大多数情况下，此胺反应活性基团是一种酰化试剂，与胺反应时能形成羧酰胺、磺酰胺或硫脲。事实上所有蛋白质都含有赖氨酸残基，大多数的N-末端含有游离胺基，因此可用作标记物的结合位点。在一优选实施方式中，标记残基77，所用的TNFα包含SEQ ID NO：1的77-233残基。在另一个实施方式中，标记许多伯胺基从而多重标记TNFα。
在某些情况下，不标记TNFα的某一部分，即被抗体、其片段和区域识别的那部分。换言之，TNFα抗原的某些部分可提供为抗-TNFα抗体所识别的和/或与抗-TNFα抗体、其片段和可变区结合的拓扑结构(topographical)表位或三维表位。优选这些部分游离而用于结合，因此不被标记。其包含SEQ ID NO：1的136-157和164-185残基：
Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile；和
Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-G1u-Thr-Pro-Glu-Gly.
可利用各种可检测的基团标记抗-TNFα药物。TNFα或抗-TNFα药物优选用荧光团或荧光染料标记。适合用于本发明的示例荧光团包括通过引用纳入本文作参考的“分子探针目录(Molecular Probes Catalogue)”中所列的那些(参见R.Haugland的“荧光探针和标记技术指南手册(The Handbook-A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies)”，第10版，分子探针(Molecularprobes)公司(2005))。此类示例的荧光团包括但不限于：Alexa荧光染料，如Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200151
350、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200152
405、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200153
430、Alexa Fluor488、AlexaFluor
Figure BPA00001573238200155
514、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200156
532、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200157
546、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200158
555、AlexaFluor
Figure BPA00001573238200159
568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001511
610、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001512
633、AlexaFluor
Figure BPA000015732382001513
635、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001514
647、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001515
660、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001516
680、AlexaFluor
Figure BPA000015732382001517
700、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001518
750和/或Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001519
790，以及其他荧光团，例如丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺)荧光素(5-IAF)、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸盐(TRITC)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(丙烯酰丹(acrylodan))、7-硝基苯基-2-恶-1，3，-重氮-4-基氧化物(NBD-Cl)、溴化乙锭、荧光黄、5-羧基罗丹明6G氢氯化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、德克萨斯红TM磺酰氯、BODIPYTM、萘甲叉胺磺酸酯(例如1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-(对-二磺基甲苯基)萘-2-磺酸(TNS)等等)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光黄-磷酯酰乙醇胺、德克萨斯红磷酯酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷酯酰胆碱，芴基-磷酯酰胆碱、部花青540、1-(3-砜丙基)-4-[β-[2[(二-正-丁基氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶甜菜碱(萘基苯乙烯基)、3，3’二丙基硫代羰花青(dipropylthiadicarbocyanine)(二S-C3-(5))、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶(二-5-ASP)、氰基-3-碘乙酰胺、氰基-5-正-羟基琥珀酰亚胺、氰基-7-异硫氰酸盐、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗兰、Al酞菁、恶嗪1，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙啡啶同质二聚体、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉铵(MQAE)、呋喃-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素、晕苯、金属-配体复合物、IRDye
Figure BPA00001573238200161
700DX、IRDye
Figure BPA00001573238200162
700、IRDye
Figure BPA00001573238200163
800RS、IRDye
Figure BPA00001573238200164
800CW、IRDye
Figure BPA00001573238200165
800、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682、DY780和其混合物。其他合适的荧光团包括：酶-辅因子、镧系元素、绿荧光蛋白、黄荧光蛋白、红荧光蛋白，或其突变体和衍生物。在本发明一实施方式中，这种特异性结合对的第二成员含有附着其上的可检测基团。
荧光团中的荧光基团通常选自所述染料目录，包括聚甲炔、酞菁、花青、夹氧杂蒽、芴、罗丹明、香豆素、荧光黄和BODIPYTM。
在一个实施方式中，所述荧光基团是近红外(NIR)荧光团，发射光的范围约650-约900nm。在生物学试验中采用近红外荧光技术有益，因为它可基本上消除或减少生物物质自身荧光产生的背景。近红外荧光技术的另一优点是激发光源产生的散射光极大地减少，因为散射光的强度与波长四次方的倒数成正比。背景荧光低和散射光低可导致提高信嗓比，这是高灵敏度检测所需。而且，在生物组织中近-IR区(650nm-900nm)内的光透明窗口产生的NIR荧光，为体内成像和亚细胞检测应用(需要光透射穿过生物体组分)提供了有价值的技术。在该实施方式的诸方面中，荧光基团宜选自：IRDye
Figure BPA00001573238200166
700DX、IRDye
Figure BPA00001573238200167
700、IRDye
Figure BPA00001573238200168
800RS、IRDye
Figure BPA00001573238200169
800CW、IRDye
Figure BPA000015732382001610
800、Alexa Fluor
Figure BPA000015732382001611
660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200171
700、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200172
750、Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200173
790、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682和DY780。在某些实施方式中，此种近红外基团是IRDye
Figure BPA00001573238200174
800CW、IRDye
Figure BPA00001573238200175
800、IRDye
Figure BPA00001573238200176
700DX、IRDye
Figure BPA00001573238200177
700或DynomicDY676。
可利用荧光团的化学反应衍生物进行荧光素的标记。常用的化学反应基团包括：胺反应的异硫氰酸衍生物，如FITC和TRITC(荧光黄和罗丹明的衍生物)；胺反应的琥珀酰亚胺酯，如NHS-荧光素；和巯基反应的马来酰亚胺活化的荧光素，如荧光黄-5-马来酰亚胺，它们中的许多可商品化购得。使这些反应染料的任何一种与TNFα或抗-TNFα药物反应，可导致在荧光团与TNFα之间或荧光团与抗-TNFα药物之间形成稳定的共价键。
在某些情况下，进行荧光标记反应后，常常需要去除标记靶分子物质中未反应的荧光团。这通常采用分子大小排阻层析，利用荧光团与标记的蛋白质之间分子大小不同而实现。
可从许多来源购得反应荧光染料。其可用不同反应基团获得以将各种功能基团附着于靶分子。也能在标记试剂盒中得到它们，试剂盒包括进行标记反应的所有组分。在一优选方面，采用英杰(Invitrogen)公司的Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200178
647 C2马来酰亚胺(目录号A-20347)。
可直接或间接检测抗-TNFα抗体与TNFα，或抗-药物抗体(ADA)与抗-TNFα抗体的免疫学特异性结合。直接标记物包括荧光素或冷光标签、金属、染料、放射性核素等，使之附着抗体。在某些情况下，用碘-125(125I)标记TNFα或抗-TNFα抗体可用于分别检测样品中的抗-TNFα抗体或ADA的浓度水平。在其他情况下，采用对样品中的抗-TNFα抗体或ADA分别具有特异性的化学发光TNFα试验或抗-TNFα抗体的化学发光试验，适合于灵敏地无放射活性地检测抗-TNFα抗体或ADA的浓度水平。在特定情况下，用荧光染料标记TNFα或抗-TNFα抗体也适合分别检测样品中的抗-TNFα抗体或ADA的浓度水平。荧光染料的示例包括但不限于：Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200179
染料、DAPI、荧光黄、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。可商品化购得连接有荧光染料的第二抗体，例如山羊F(ab’)2抗-人IgG-FITC可购自Tago免疫公司(Burlingame，CA)。
间接标记物包括本领域熟知的各种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。例如，可采用辣根过氧化物酶检测系统与生色底物四甲基联苯胺(TMB)，在存在过氧化氢时，以450nm检测产生的可溶性产物。例如，可采用碱性磷酸酶检测系统与产色底物对-硝基苯磷酸盐，产生405nm处容易检测的可溶性产物。类似地，可采用β-半乳糖苷酶检测系统与其产色底物邻-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)，产生410nm检测的可溶性产物。可采用脲酶检测系统与其底物，如尿素-溴甲酚紫(西格玛(Sigma)免疫化学公司；St.Louis，MO)。连接酶的有用第二抗体可获自一些商品化来源，如购自杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)(宾夕法尼亚州西格鲁甫)的山羊F(ab’)2抗-人IgG-碱性磷酸酶。
可分析直接或间接标记物产生的信息，例如用分光光度计检测产色底物产生的颜色，用幅射计数仪检测幅射光，如用γ计数器检测125I；或在存在某些波长光时用荧光计检测荧光。对于酶联抗体的检测，可用分光光度计，如EMAX微孔板读数仪(加利福尼亚州门洛帕克的分子装置公司(Molecular Devices))按照厂商说明书进行抗-TNFα抗体含量或ADA水平的定量分析。如果需要，可使本发明的试验自动化或用机器人进行，而可同时检测多个样品产生的信号。
在某些实施方式中，采用分子大小排阻层析。SEC的原理是：大小不同的颗粒将以不同速率通过静止相洗脱(过滤)。导致溶液中的颗粒依据其大小而分离。条件是，同时或近乎同时加载所有的颗粒，同样大小的颗粒在一起洗脱。每种分子大小排阻层析柱都有其可分离的分子量范围。排阻界限的定义是此范围的上端分子量，如果分子太大则不能被静止相捕获入其中。渗透界限的定义是此分离范围的下端分子量，如果分子足够小则可全部渗透入静止相的孔中，低于此(下端)分子量的所有分子都很小，它们以一条带洗脱。
在某些方面，收集恒定体积的洗脱液或组分。颗粒的大小越相似，它们越可能在同一洗脱组分中而不能分别检测。优选以光谱学技术检测收集的组分，以测定洗脱颗粒的浓度。本发明可用的光谱检测技术通常包括但不限于：荧光比色法、折射率(RI)和紫外线辐射(UV)法。在某些情况下，洗脱体积的减少大约与分子流体力学体积的对数线性相关(即较重部分先洗脱)。
在某些方面，采用所述方法检测抗-TNFα药物，例如抗体的含量，包括REMICADETM(英夫利昔单抗)、嵌合型抗-TNFα单抗、TNFR-IgFc融合蛋白ENBRELTM(依那西普)、人抗-TNFα单抗HUMIRATM(阿达木单抗)和PEG化Fab片段CIMZIA
Figure BPA00001573238200191
(赛妥珠单抗)。
在某些情况下，检测到抗-TNFα药物(如抗-TNFα抗体)后，用标准曲线测量这种抗-TNFα药物。
在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，所述方法包括：
(a)使标记抗-TNFα药物与样品接触，与自身抗体形成标记的复合物；
(b)所述标记复合物进行分子大小排阻层析以分离所述标记复合物；和
(c)检测标记复合物的存在或水平，从而检测自身抗体。
在某些情况下，所述自身抗体包括：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。
在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的方法，包括：
(a)使标记抗-TNFα药物和标记TNFα与含有或怀疑含有抗-TNFα药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFα药物，标记TNFα与自身抗体之间形成第一标记复合物，和在标记抗-TNFα药物与自身抗体之间形成第二标记复合物，其中标记抗-TNFα药物和标记TNFα所含的标记不相同；
(b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析以分离第一标记复合物与第二标记复合物；和
(c)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当存在第一标记复合物和第二标记复合物二者时检测非中和形式的自身抗体，和当只存在第二标记复合物时检测中和形式的自身抗体。
在某些情况下，所述自身抗体包括：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗-TNFα药物抗体(HAMA)。
在一相关的实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物自身抗体的方法，包括：
(a)使标记抗-TNFα药物与含有或怀疑含有抗-TNFα药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFα药物与自身抗体之间形成第一标记复合物；
(b)使第一标记复合物通过分子大小排阻层析柱，而分离第一标记复合物；
(c)检测第一标记复合物，从而检测自身抗体的存在或水平；
(d)使标记TNFα与第一标记复合物接触，形成标记抗-TNFα药物与标记TNFα之间的第二标记复合物，其中标记抗-TNFα药物和标记TNFα所含的标记不相同；
(e)第二标记复合物进行第二分子大小排阻层析，从而分离第二标记复合物；和
(f)检测第二标记复合物，从而检测存在的中和形式的自身抗体或其水平。
在某些情况下，所述自身抗体包括：人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。
在其他实施方式中，本文所述的试验方法可用于预测患自身免疫疾病(如类风湿关节炎、克罗恩病等)对象对TNFα抑制剂，具体是对抗-TNFα抗体的应答反应。在此方法中，测定所述对象的抗-TNFα抗体正确剂量或治疗有效量，即治疗浓度水平，可预计该个体是否对这种治疗会有响应。
在另一个实施方式中，本发明提供监测患自身免疫失调对象的自身免疫失调的方法。所述方法包括：测试随时间推移所述对象的抗-TNFα抗体正确剂量或治疗有效量，即治疗浓度水平。以此方式，可预计在给定的时间内该个体是否对这种治疗会有响应。
在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象，提供确定抗-TNFα药物有效量的方法，所述方法包括：
(a)测定对象第一样品中的抗-TNFα药物水平，包括：
(i)使第一样品接触一定量的标记TNFα，形成包含标记TNFα与抗-TNFα药物的第一复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而测量抗-TNFα药物的水平；
(b)测定对象第二样品中的抗-TNFα药物自身抗体水平，包括：
(i)使第二样品接触一定量的标记抗-TNFα药物α，形成包含标记抗-TNFα药物与自身抗体的第二复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平；和
(c)从步骤(a)测得的抗-TNFα药物水平减去步骤(b)测得的自身抗体水平，从而测得抗-TNFα药物的有效量。
在一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(a)(ii)中的检测，包括：
(1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度率第一图像计算标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(2)从所述第一图像计算第一复合物峰曲线下面积的积分；
(3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(1)得到的积分测得比率；和
(4)将标记TNFα含量乘步骤(3)的比率。
在一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(b)(ii)中的检测，包括：
(1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度的第二图像计算标记抗-TNFα药物峰曲线下面积的积分；
(2)从该第二图像计算第二复合物峰曲线下面积的积分；
(3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(1)得到的积分测得比率；和
(4)将标记抗-TNFα药物含量乘步骤(3)的比率。
在一相关的实施方式中，本发明提供的第一和第二样品都是血清样品。在另一相关的实施方式中，本发明提供的第一和第二样品都获自用抗-TNFα药物治疗期间的对象。在另一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(a)(ii)和/或步骤(b)(ii)中的检测，包括荧光标记物的检测。
在另一实施方式中，本发明为接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：
(a)按照本发明的方法测得抗-TNFα药物的有效量；
(b)比较抗-TNFα药物的该有效量与抗-TNFα药物的水平；和
(c)根据步骤(c)的比较，确定所述对象的后续抗-TNFα药物的剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。
在一相关的实施方式中，当抗-TNFα药物有效量低于抗-TNFα药物水平时，本发明还提供提高抗-TNFα药物的后续剂量。在一相关的实施方式中，本发明提供提高的后续抗-TNFα药物剂量，从而抗-TNFα药物的有效量约等于抗-TNFα药物的水平。
在一些其他实施方式中，本发明还提供的抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA(赛妥珠单抗)和其组合。
在某些实施方式中，抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。在某些其他实施方式中，抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。在其他实施方式中，抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。在某些其他实施方式中，抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure BPA00001573238200222
(赛妥珠单抗)。在其他实施方式中，标记TNFα是荧光团标记TNFα。在一些其他实施方式中，定量检测抗-TNFα药物。在某些实施方式中，定量检测TNFα。在其他实施方式中，先洗脱标记的复合物，然后是游离的标记抗-TNFα抗体。在某些实施方式中，分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。在一些其他实施方式中，自身抗体选自：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)或其组合。在某些实施方式中，定量检测自身抗体。
在另一实施方式中，本发明向接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物的治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括：
(a)测定所述对象第一样品中的抗-TNFα药物水平；；
(b)测定所述对象第二样品中的抗-TNFα药物自身抗体的水平；和
(c)根据抗-TNFα药物和自身抗体的水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化抗-TNFα药物的治疗和/或减轻其毒性。
在一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFα药物水平高和自身抗体水平低时，同时给予免疫抑制药物和抗-TNFα药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFα药物水平中等和自身抗体水平低时，提高抗-TNFα药物的水平和同时给予免疫抑制药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFα药物水平中等和自身抗体水平中等时，给予不同的抗-TNFα药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFα药物水平低和自身抗体水平高时，给予不同的抗-TNFα药物。在另一相关的实施方式中，给予阿达木单抗(HUMIRATM)代替英夫利昔单抗(REMICADETM)。
在一些实施方式中，短语“高水平抗-TNFα药物”包括药物水平约10-约100ng/10μL，约10-约70ng/10μL，或约10-约50ng/10μL。在其他实施方式中，短语“高水平抗-TNFα药物”包括药物水平高于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng/10μL。
在一些实施方式中，短语“中等水平抗-TNFα药物”包括药物水平约5.0-约50ng/10μL、约5.0-约30ng/10μL、约5.0-约20ng/10μL、或约5.0-约10ng/10μL。在其他实施方式中，短语“中等水平抗-TNFα药物”包括药物水平约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/10μL。
在一些实施方式中，短语“低水平抗-TNFα药物”包括药物水平约0-约10ng/10μl、约0-约8ng/10μl或约0-约5ng/10μl。在其他实施方式中，短语“低水平抗-TNFα药物”包括药物水平低于约10、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0或0.5ng/10μl。
首字母缩写词“ADA”包括短语“抗-药物抗体”。
在一些实施方式中，短语“高水平抗-TNFα抗体”包括抗-药物抗体的水平约3.0-约100ng/10μL、约3.0-约50ng/10μL、约10-约100ng/10μL、约10-约50ng/10μL或约20-约50ng/10μL。在某些其他实施方式中，短语“高水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体的水平大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng/10μl。
在一些实施方式中，短语“中等水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体的水平约0.5-约20ng/10μl、约0.5-约10ng/10μl、约2.0-约20ng/10μl、约2.0-约10ng/10μl、约2.0-约5.0ng/10μl或约2.0-约5.0ng/10μl。
在某些实施方式中，短语“低水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体水平约0.0-约5.0ng/10μl、约0.1-约5.0ng/10μl、约0.0-约2.0ng/10μl、约0.1-约2.0ng/10μl或约0.5-约2.0ng/10μl。在其他实施方式中，短语“低水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体水平低于约5.0、4.0、3.0、2.0、1.0或0.5ng/10μl。
在一些实施方式中，本发明还提供检测抗-TNFα药物的试验方法，包括：
(i)使第一样品与一定量的标记TNFα接触，形成含有标记TNFα和抗-TNFα药物的第一复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而检测抗-TNFα药物的水平。
在一些实施方式中，本发明还提供用检测自身抗体的试验方法，包括：
(i)使第二样品与一定量的标记抗-TNFα药物接触，形成含有标记抗-TNFα药物与自身抗体的第二复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平。
在一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure BPA00001573238200241
(赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。在一些其他实施方式中，抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。在一些其他实施方式中，抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure BPA00001573238200242
(赛妥珠单抗)。在另一相关实施方式中，本发明提供定量检测抗-TNFα药物的方法。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的第一和第二样品是血清。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的第一和第二样品获自用抗-TNFα药物治疗期间的对象。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的自身抗体选自：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)或其组合。在另一相关实施方式中，本发明提供定量检测自身抗体的方法。
在某些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFα药物的样品中抗-TNFα药物的存在或水平的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照与样品接触，形成标记TNFα与抗-TNFα药物的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记TNFα和标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)将标记TNFα含量除以标记内部对照含量测得第一比率；
(f)将步骤(c)得到的积分除以步骤(d)得到的积分测得第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而通过参比内部对照确定抗-TNFα药物的存在或水平。
在一相关实施方式中，本发明提供步骤(e)所测得的第一比率是约80∶1--100∶1。在另一相关实施方式中，本发明提供步骤(e)所测得的第一比率是约100∶1。在一相关实施方式中，本发明提供的标记内部对照是生物胞素-Alexa488。在某些实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约1-约25ng/100μL。在某些其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约5-约25ng/100μL、约5-约20ng/100μL、约1-约25ng/100μL、约1-约20ng/100μL、约1-约10ng/100μL或约1-约5ng/100μL。在其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约为1、5、10、15、20或25ng/100μL。
在某些实施方式中，本发明对接受抗-TNFα药物治疗的对象提供最优化抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：根据按照本发明方法得到的第一比率与第二比率的比较，确定所述对象的后续抗-TNFα药物剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。在一相关实施方式中，本发明提供的方法还包括：当第一比率约为100∶1而第二比率低于约95∶1时提高后续的抗-TNFα药物剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。在另一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure BPA00001573238200251
(赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFα药物是CIMZIA(赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure BPA00001573238200253
(赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，本发明提供的标记TNFα是荧光标记TNFα。在一相关实施方式中，本发明还提供定量检测抗-TNFα药物。在一相关实施方式中，本发明提供的标记复合物先洗脱，然后是的是游离的标记TNFα。在一相关实施方式中，本发明提供的样品是血清。在一相关实施方式中，本发明提供的样品获自接受抗-TNFα药物治疗的对象。在一相关实施方式中，本发明提供的分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。
在一些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中抗-TNFα药物自身抗体的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对照与样品接触，形成标记抗-TNFα药物与自身抗体的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记抗-TNFα药物和标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记的标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(d)多作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)将标记抗-TNFα药物含量除以标记内部对照含量测得第一比率；
(f)除以步骤(c)和步骤(d)得到的积分测得第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而通过参比内部对照测得存在的自身抗体或其水平。
在一相关实施方式中，步骤(e)测得的第一比率为约80∶1--约100∶1。在另一相关实施方式中，步骤(e)测得的第一比率为约100∶1。在一相关实施方式中，标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。在某些实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约50-200pg/100μL。在某些其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约100-约200pg/100μL、约150-约200pg/100μL、约50-约150pg/100μL或约50-约100pg/100μL。在其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素的-Alexa 488)含量约为50、75、100、125、150、175或200pg/100μL。
在一相关实施方式中，抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure BPA00001573238200261
(赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。在一相关实施方式中，抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。在一相关实施方式中，抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。在一相关实施方式中，抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure BPA00001573238200262
(赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，定量检测自身抗体。在一相关实施方式中，标记的复合物先洗脱，然后是游离的标记抗-TNFα抗体。在一相关实施方式中，样品是血清。在一相关实施方式中，样品获自接受抗-TNFα药物治疗的对象。在一相关实施方式中，分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。在一相关实施方式中，自身抗体选自：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。在一相关实施方式中，定量检测自身抗体。
在一相关实施方式中，本发明提供确定后续疗程的方法。该后续疗程包括：当抗-TNFα药物水平高和自身抗体水平低时共同给予免疫抑制药物和抗-TNFα药物。在另一相关实施方式中，所述后续治疗方案包括：当抗-TNFα药物水平中等和自身抗体水平低时，提高抗-TNFα药物的水平和同时给予免疫抑制药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括：当抗-TNFα药物水平中等和自身抗体水平中等时，给予不同的抗-TNFα药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括：当抗-TNFα药物水平低和自身抗体水平高时，给予不同的抗-TNFα药物。在另一相关的实施方式中，给予阿达木单抗(HUMIRATM)代替英夫利昔单抗(REMICADETM)。
在某些实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFα药物的存在或水平和存在抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)含一定量的标记TNFα的第一检测底物；
(b)含一定量的标记抗-TNFα药物的第二检测底物；
(c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照；
(d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对照；
(e)任选包括用于提取对象样品的工具；和
(f)任选包括如何使用该试剂盒的说明书小册子。
在一相关实施方式中，所述基质包括能沉积本发明化学物质的任何材料，包括但不限于：硝化纤维素、硅胶、薄层层析基质、木制小棍、纤维素、棉花、聚乙烯、其组合等等。在另一相关实施方式中，可将本发明所用的化学物质以有序的阵列、矩阵或矩阵阵列形式沉积在上述材料上。
在一相关实施方式中，所述试剂盒还包括检测标记TNFα、标记抗-TNFα药物和/或标记内部对照的方法。在一相关实施方式中，该试剂盒还包括检测方法，包括但不限于：荧光标记检测，UV-幅射光检测或放射性碘暴光。在一相关实施方式中，该试剂盒还包括分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)仪器。在一相关实施方式中，所述第一、第二、第三和第四检测底物选自：硝化纤维素、硅胶和分子大小排阻层析的介质。在一相关实施方式中，抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure BPA00001573238200281
(赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，标记TNFα是荧光标记TNFα。在一相关实施方式中，样品是血清。在一相关实施方式中，样品获自接受抗-TNFα药物治疗的对象。在一相关实施方式中，所述自身抗体选自：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
本发明有关物质的生理范围和水平
用REMICADETM治疗的患者中REMICADETM的治疗有效水平范围约为1-10mg REMICADETM/每kg患者体重。在一些实施方式中，REMICADETM的治疗有效水平范围约为3-8mg REMICADETM/每kg患者体重。在一些实施方式中，REMICADETM的治疗有效水平范围约为5mg REMICADETM/每kg患者体重。
典型的REMICADETM(英夫利昔单抗)剂量范围为约0.05-约80μg/ml。在一些实施方式中，REMICADETM的剂量范围为约0.05-约50μg/ml。在一些其他实施方式中，REMICADETM的剂量范围为约0.05-约30μg/ml。在一些实施方式中，REMICADETM的剂量约为30μg/ml。在一些其他实施方式中，REMICADETM的剂量约为50μg/ml。
用HUMIRATM治疗的患者中HUMIRATM的治疗有效水平范围为约0.1-约10mg HUMIRATM/每kg患者体重。在一些实施方式中，HUMIRATM的治疗有效水平范围为约0.1-约8mg HUMIRATM/每kg患者体重。在一些其他实施方式中，HUMIRATM的治疗有效水平范围约为1mg HUMIRATM/每kg患者体重。在一些实施方式中，HUMIRATM的治疗有效水平范围约为0.8mg HUMIRATM/每kg患者体重。
典型的HUMIRATM剂量范围为约0.05-约150μg/ml。在某些实施方式中，HUMIRATM的剂量范围为约0.05-约100μg/ml。在某些其他实施方式中，HUMIRATM的剂量为约0.05-约50μg/ml。在某些实施方式中，HUMIRATM的剂量约为30μg/ml。在某些实施方式中，HUMIRATM的剂量约为32μg/ml。在某些其他实施方式中，HUMIRATM的剂量约为50μg/ml。
V.示例疾病和用于治疗其的治疗抗体
在某些实施方式中，本发明采用单克隆抗体治疗剂。表1提供了已获批准或目前正在开发中的治疗用单克隆抗体的示例名单。在2006年PhRMA的题目为“418 Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal AgainstDisease(允许测试以加强针对疾病的储备的418种生物技术药物)”的报告中披露了临床开发和已获批准的单克隆抗体产品的扩大名单。
特别优选的治疗用抗体包括但不限于抗-TNFα单克隆抗体，例如(1)小鼠-人IgG1-κ轻链抗-TNFα单克隆抗体REMICADETM(英夫利昔单抗)，(2)人TNF受体2与人IgG1的融合蛋白ENBRELTM(依那西普)和(3)完全的人IgG1-κ轻链抗-TNFα单克隆抗体HUMIRATM(阿达木单抗)。构建的其他二种抗-TNFα抗体在关键的III期临床试验中对患同样疾病的一些患者显示出可靠性，这二种抗体是：(4)PEG化的人源化抗-TNFα单克隆抗体Fab片段--CIMZIACD870(赛妥珠单抗)和(5)完全的人IgG1-κ轻链抗-TNFα单克隆抗体--CNTO 148(戈利木单抗(golimlunab))。
治疗用的一类优选抗体是抗-TNFα单链单克隆抗体，可用于治疗许多自身免疫疾病，如类风湿关节炎、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎(白赫铁列夫症(Bechterew))、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、严重的银屑病、慢性眼葡萄膜炎、严重的结节病和韦格纳肉芽肿病。
除了用于检测抗-TNFα抗体的生物利用度/浓度外，本发明也适合用于检测机体内所用的任何治疗抗体的生物利用度/浓度，例如为治疗和诊断目的。以下表1也提供了与体内应用的各种治疗性单克隆抗体相关的医学指示症状(indication)名单。
在其他实施方式中，本发明方法适合用于检测治疗性抗体的自身抗体的存在或浓度水平。
因此，本发明的方法可用于最优化包括给予对象治疗性抗体的治疗(或诊断)。所述方法可用于最优化治疗(或诊断)一种或多种疾病或失调，包括以下疾病的一种或多种：
传染病，如呼吸道合胞病毒(RSV)、HIV、炭疽、念珠菌病、葡萄球菌感染、丙型肝炎。
自身免疫疾病，如类风湿关节炎、克罗恩病、B-细胞非何杰金淋巴瘤、多发性硬化症、SLE、强直性脊柱炎、狼疮、银屑病关节炎、全身性红斑狼疮。
炎性疾病，如类风湿关节炎(RA)、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎(白赫铁列夫症)、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、严重的银屑病、慢性眼葡萄膜炎、结节病、韦格纳肉芽肿病和其他炎性为主要特征的疾病。
血液病，如败血病、败血病休克、突然发作的夜间血红蛋白尿和溶血性尿毒综合征。
癌症，如结肠直肠癌、非何杰金氏淋巴瘤、慢性B-淋巴细胞白血病、可复原的大细胞淋巴瘤、头颈鳞状上皮细胞癌、治疗HER2-过表达的转移性乳腺癌、急性髓样白血病、前列腺癌(如腺癌)、小细胞肺癌、甲状腺癌、恶性黑色素瘤、实体瘤、乳腺癌、早期HER2-阳性乳腺癌、一线非鳞状上皮NSCLC癌、AML、毛细胞白血病、神经母细胞瘤、肾癌、脑癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨转移、SCLC，头颈癌、一线胰腺癌、SCLC、NSCLC、头颈癌、血癌和实体瘤、晚期实体瘤、胃肠癌、胰腺癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、非皮肤T-细胞淋巴瘤、CLL、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、表达间皮素的肿瘤、恶性胶质细胞瘤、转移性胰腺癌、血液恶性肿瘤、可复原的皮肤大细胞MAb淋巴瘤、AML、骨髓异常增生综合症。
心血管疾病，如动脉粥样硬化急性心肌梗塞、心肺分流术、心绞痛。
代谢疾病，如糖尿病、I型糖尿病。
消化道疾病，如克罗恩病、艰难梭菌(C.difficile)病，溃疡性结肠炎。
眼睛疾病，如葡萄膜炎。
遗传疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。
神经障碍性疾病，如骨关节炎疼痛和阿尔茨海默病。
呼吸道疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、鼻息肉病、儿童哮喘病。
皮肤病，如银屑病，包括慢性中等至严重的斑块状银屑病。
移植物排斥，如急性肾移植排斥、逆转心肝移植物排斥、预防肾移植物排斥、预防急性肾移植物排斥、肾移植排斥。
其他疾病，如阑尾炎诊断、肾炎、绝经后骨质疏松(骨失调)、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性细胞食道炎和花生过敏症。
在一个实施方式中，所述疾病选自上述特定疾病和失调的一种或多种。
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VI.治疗和治疗的监控
一旦按照本文所述方法确定了接受抗-TNFα药物治疗对象的诊断或预后，或预测了诊断为病理生理学上涉及TNFα的疾病和失调(例如但不限于休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病)的个体对抗-TNFα药物治疗响应的可能性，本发明还包括根据这种诊断、预后或预测，推荐治疗方案。在某些情况下，本发明还包括给予该个体治疗有效量的抗-TNFα药物，用于治疗病理生理学上涉及TNFα的疾病和失调相关的一种或多种症状。对于治疗应用，可只给予抗-TNFα药物，或联用一种或多种其他抗-TNFα药物和/或一种或多种能减轻抗-TNFα药物相关副作用的药物(如免疫抑制剂)共同给药。本文所述抗-TNFα药物的例子包括但不限于：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
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(赛妥珠单抗)、生物制剂、常规药物和其组合。这样，本发明的优点是能让临床医生实行“个体化医疗”，通过指导治疗决策、提供治疗选择的信息和最优化抗TNFα药物剂量，在正确的时间将正确的药物给予正确的患者。
如需要，可将抗-TNFα药物与合适的药物赋形剂一起给予，可以任何可接受的方式给药。例如，可经静脉内、局部、皮下、透皮、经过皮肤、肌肉内、口服、含服、舌下、经牙龈、经颚部、关节内、胃肠道外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、经直肠、经阴道，或吸入给药。“共同给药”意思是抗-TNFα药物与第二种药物(如另一种抗-TNFα药物，用于减轻抗-TNFα药物副作用的药物等)同时给药，或恰在给予第二种药物之前或之后，给予抗-TNFα药物。
可反复给予治疗有效量的抗-TNFα药物，例如至少2、3、4、5、6、7、8次或更多次，或通过连续输液给予此剂量。采用的剂型可以是固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，如药片、药丸、糖丸、胶囊、药粉、溶液、悬浮液、乳液、栓剂、保留灌肠液、霜膏、软膏、洗液、凝胶、气溶胶、泡沫液等，优选适合一次给予精确剂量的单位剂型。
本文所用的术语“单位剂型”包括物理上不连续的、适合人对象和其他动物对象一次用量的剂量单位，每个单位含预定量的经计算能产生所需作用、可被耐受和/或有效治疗的抗TNFα药物，并含合适的药物赋形剂(例如安瓿瓶)。此外，可制备更为浓缩的剂型，然后从其制备更为稀释的剂型。这种更浓缩的剂型含有实质上高于，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍的抗TNFα药物剂量。
制备这种剂型的方法是本领域技术人员已知(参见例如[雷明顿药物科学(REMINGTON’S PHARMACEURICAL SCIENCES)]，第18版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克(Mack)出版公司(1990))。此种剂型通常包含常规的药物运载体或赋形剂，还可包含其他药物制剂、运载体、辅佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。可根据具体剂型和本领域熟知方法给药途径定制合适的赋形剂(参见[雷明顿药物科学]，同上)。
合适赋形剂的例子包括但不限于：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸，如卡波姆(Carbopol)，例如卡波姆941、卡波姆980、卡波姆981等。这种剂型还可包含润滑剂，如滑石、硬脂酸镁及矿物油；增湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂如甲基-、乙基-、丙基-羟基-苯甲酸酯(即对羟基苯甲酸酯)；pH调节剂，如无机和有机酸和碱；甜味剂，和调味剂。这种剂型也可包含生物可降解的聚合物珠、葡聚糖和环糊精包裹的复合物。
对于口服给药，治疗有效量的剂型可以是片剂、胶囊、乳液、悬浮液、溶液、糖浆、喷雾剂、糖锭、粉末和缓释剂型。口服给药的合适赋形剂包括：药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在某些实施方式中，治疗有效量的剂型为：药丸、药片或胶囊，因此这种剂型可与抗-TNFα药物一起包含以下任何一种物质：稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂如淀粉及其衍生物；润滑剂如硬脂酸镁等；粘合剂如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。也可将抗-TNFα药物配制到例如设置在聚乙二醇(PEG)运载体中的栓剂中。
可将抗-TNFα药物和任选的一种或多种药学上可接受的辅佐剂溶于或分散于运载体，如盐水(如含0.9％w/v氯化钠)、葡萄糖水、甘油、乙醇等中形成溶液或悬浮液，制备液体剂型，用于口服、局部或静脉内给药。还可将抗-TNFα药物配制成保留灌肠剂。
对于局部给药，治疗有效量的剂型可以是乳液、洗液、凝胶、泡沫剂、乳膏、凝胶剂、溶液、悬浮液、软膏和透皮贴片。对于吸入给药，可以干粉或液体形式通过喷雾器递送抗-TNFα药物。对于胃肠外给药，治疗有效量的剂型可以是无菌的溶液和无菌的包装粉末。宜用pH约4.5-7.5的溶液将其配制成可注射溶液。
还可以冻干剂型提供该治疗有效量。这类剂型包含用于在给药前重建的缓冲剂，如碳酸氢盐；或所述缓冲剂包含在冻干剂型中用于用例如水重建。冻干剂型还可含合适的血管收缩药，如肾上腺素。提供的冻干剂型可以采用糖浆，任选与重建用的缓冲剂包装在一起，如此可将重建的剂型立刻给予个体。
在用于治疗病理生理学上涉及TNFα的疾病和失调时，给予的抗TNFα药物最初剂量每天可为约0.001mg/kg-约1000mg/kg。每日所用剂量的范围是约0.01-约500mg/kg、约0.1-约200mg/kg、约1-约100mg/kg、或约10-约50mg/kg。然而，可根据个体的要求，疾病、失调或抗体的严重程度和所用的抗TNFα药物类型改变剂量。例如，考虑到疾病、病症和/或症状的类型和严重程度，按照本文所述方法利用经验确定剂量。在本发明说明书中，给予个体的剂量应能充分诱导个体产生随时间推移的有益治疗反应。给予个体具体的抗TNFα药物所伴随发生的不良副作用、其性质和程度也决定了剂量大小。根据个体的具体情况确定合适的剂量在执业医师的技能范围之内。通常治疗开始时，采用低于抗TNFα药物最优剂量的较小剂量。此后，通过小量增加提高剂量直到多种情况下达到最优效果。为方便起见，如需要可将每日总剂量分成数份在该日分别给予。
本文所用的术语“抗-TNFα药物”包括所有药学上可接受的剂型，用于治疗病理生理学上涉及TNFα的疾病和失调的一种或多种症状。例如，这类抗TNFα药物可以是消旋体或异构体的混合物、结合于离子交换树脂的固相复合物等。此外，抗TNFα药物可以是溶剂合物形式。该术语还包括所述抗TNFα药物的所有药学上可接受的盐、衍生物和类似物以及其组合。例如，抗TNFα药物的药学上可接受的盐包括但不限于：酒石酸盐、琥珀酸盐、二氢氯化物盐、水杨酸盐、半琥珠酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、盐酸盐、氨基甲酸盐、硫酸盐、硝酸盐和苯甲酸盐，以及其组合等等。任何类型的抗TNFα药物都适合用于本发明的方法，如抗TNFα药物的药学上可接受的盐，抗TNFα药物的游离碱或其混合物。合适的抗TNFα药物的例子包括但不限于生物制剂、常规药物和其组合。
治疗剂包括。例如，抗-细胞因子和趋化因子抗体，如抗-肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体。抗-TNFα抗体的非限制性例子包括：嵌合性单克隆抗体，如英夫利昔单抗(Remicade)(森拓科公司，宾夕法尼亚州霍舍姆)，它是一种嵌合性IgG1抗-TNFα单克隆抗体；人源化单克隆抗体，如CDP571和PEG化CDP870；完全的人单克隆抗体，如阿达木单抗(Humira)(雅培实验公司；利伯蒂维尔伊利诺伊州)；p75融合蛋白，如依那西普(Enbrel
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)(安进公司，加州千橡；惠氏(Wyeth)制药公司；宾夕法尼亚州大学城)；小分子(如MAP激酶抑制剂)和其组合。参见Ghosh，Novartis Found Symp.，263：193-205(2004)。
其他生物制剂包括：例如，抗-细胞粘附抗体。如那他珠单抗(natalizumab，Tysabri
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)(依兰(Elan)制药公司爱尔兰都柏林；百集公司；马萨诸塞州剑桥)，它是一种抗细胞粘附分子α4-整合素的人源化单克隆抗体；和MLN-02(千年制药公司；马萨诸塞州剑桥)，它是一种人源化的抗-α4β7-整合素单克隆抗体；抗-T-细胞制剂；抗-CD3抗体，如维西利珠单抗(visilizumab维西珠单抗，(Nuvion
Figure BPA00001573238200465
)(PDL生物制药公司，内华达州因可来村)，它是一种人源化IgG2M3抗-CD3单克隆抗体；抗-CD4抗体，如普立昔单抗(，cM-T412)(森拓科公司，宾夕法尼亚州霍舍姆)，它是一种嵌合性抗-CD4单克隆抗体；抗-IL-2受体α(CD25)抗体，如达克珠单抗(Zenapax
Figure BPA00001573238200471
)(PDL BioPharma生物制药公司，InclineVillage，NV；罗氏；新泽西州纳特利)，它是一种人源化，IgG1抗-CD25单克隆抗体；和巴利昔单抗(Simulect
Figure BPA00001573238200472
)(诺华公司，瑞士巴塞尔)，它是一种嵌合性抗-CD25单克隆抗体，以及其组合。
获得个体样品的诊断、预后和/或预测信息后，也可在周期时间间隔监控个体，以评估某种治疗方案的效果。例如，可依据治疗抗体的治疗效果改变治疗抗体和/或针对所述治疗抗体的自身抗体的存在或浓度水平。在某些实施方式中，监测患者以评估响应并了解个体化治疗方法中某些药物或治疗剂的效果。此外，患者对药物无响应但抗体水平有变化，提示这些患者属于特殊人群(无响应人群)，可利用他们的抗体水平鉴定这种人群。可中止这些患者的当前治疗，更换治疗处方。
也可在周期时间间隔监测个体评估各种抗体的浓度或水平。不同时间点的抗体水平以及抗体水平随时间推移的变化速度很重要。在某些情况下，个体中的一种或多种抗体(如抗-TNFα抗体的自身抗体)的升高速率超过域值表明该个体发生并发症的风险或产生副作用的风险显著升高。从一系列测试获得的标记物变化速率(即抗体水平随时间的变化)的信息与疾病严重程度、产生疾病并发症的风险和/或副作用的风险相关。
本发明方法也提供鉴定无原发响应或低响应者的方法例如用于治疗性单克隆抗体治疗。例如，这些无原发响应或低响应者可能碰巧对治疗剂有先天或预先产生的免疫球蛋白响应。所用治疗剂是诊断用抗体时，鉴定无或低响应者可确保为每个患者选出合适的治疗剂。
本发明方法可用于，例如，鉴定继发响应衰竭的患者。继发响应衰竭者可能无症状，即唯一的症状是治疗效果差或甚至无效。在某些情况下，可用本发明方法在患者或执业医师注意到治疗效果差之前，鉴定是否会产生继发响应衰竭。可采用较高剂量治疗以确保达到正确的体内浓度，或选择替代的治疗药物，或联用。当治疗剂是诊断剂时，产生继发响应衰竭可能特别悲惨。常规采用放射标记的单克隆抗体来监测疾病，如癌症和某些传染病，此时，确定病灶的大小和/或病灶/制剂的部位，如鉴定是否存在任何继发转移和/或其部位至关重要。当未注意到发生了响应(原发或继发)衰竭，可给予该患者“全清零”评价，即假阴性结果，这可导致中止治疗且后期再出现癌症，其常常发生在更远处，可能是无法治疗的症状。
另一种类型的响应衰竭是产生与不良副作用相关的(如继发)响应衰竭。对象产生的宿主免疫应答可能伴有有害的或令人讨厌的副作用。这些可能是由于产生了能识别人或人源化治疗剂但不能区别其他宿主免疫球蛋白的抗体所致。因此，本发明的方法适合鉴定对治疗剂具有先天或已预先产生对治疗剂免疫应答的的对象和例如可能易受响应衰竭相关不良副作用伤害的对象。
本发明方法适合选择和管理涉及给予患者单克隆抗体治疗剂的治疗方案。因此，可将本文所述的测定治疗抗体浓度或生物利用度的方法纳入到治疗疾病或失调的方法中。通过用本发明方法监测治疗过程中患者的免疫学状态，可为其选择治疗剂和/或给药方案，以确保对该患者的最好治疗效果，同时确保采用昂贵的治疗剂的费用-效果良好。
本发明的方法可用于确定患者是否需要改变治疗剂(如治疗抗体)的剂量方案或替代的药物治疗。
本发明方法还包括定期评估患者的治疗剂(如治疗抗体)血清浓度或生物利用度。
本发明还提供测定患者是否对治疗剂(如治疗抗体)产生了免疫应答的方法。
本发明还提供检测患者是否由于患者衍生出抗治疗抗体的免疫球蛋白(如抗-TNFα抗体)而缺乏治疗响应的方法。
本发明还为患有用治疗抗体可治疗的疾病的患者提供选择合适的治疗药物的方法。
本发明还提供测定患者是否可能发生对治疗抗体的继发响应衰竭的预后方法。
VVI.实施例
通过具体的实施例更详细地说明本发明。提供以下实施例目的是为了说明而非以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员不难懂得，可改变或修改各种非关键的参数仍能产生基本上相同的结果。
实施例1.检测抗-TNFα生物制剂水平的新颖迁移改变试验
本实施例说明一种检测患者样品(如血清)中抗-TNFα药物浓度的新颖均质试验，采用了分子大小排阻层析来检测与荧光标记TNFα结合的抗-TNFα药物。该试验具有优点，因为它不需要洗涤步骤，所用的荧光团可用可见光或荧光光度仪检测，这降低了背景和血清的干扰，提高了检测患者中低滴度抗-TNFα药物的能力，这是由于荧光标记的检测灵敏度高并且是液相反应，从而减少了抗原表位附着固相表面(如ELISA平板)时发生变化的机会。
在一示例实施方式中，用可见光和荧光光谱检测荧光团(如Alexa647)标记TNFα。在液相响应液中孵育标记TNFα与人血清使之与血清中抗-TNFα药物结合。也在液相响应液中孵育标记TNFα与已知量的抗-TNFα药物而制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记TNFα相比，抗-TNFα药物与标记TNFα结合后导致峰向左迁移。然后将血清样品中抗-TNFα药物浓度与标准曲线和对照作比较。
图1.显示本发明采用分子大小排阻HPLC检测标记TNFα-Alexa647与HUMIRATM(阿达木单抗)之间结合试验的一个示例。如图1所示，HUMIRATM与TNFα-Alexa647的结合导致TNFα-Alexa647峰左移。
图2.显示，HUMIRATM与TNFα-Alexa647结合的剂量响应曲线。具体说，图2A显示，在分子大小排阻层析试验中，HUMIRATM以剂量依赖方式加强了TNFα-Alexa647峰的迁移。图2B显示，在分子大小排阻层析试验中，存在1％的人血清对TNFα-Alexa647峰迁移没有显著影响。图2C显示，在分子大小排阻层析试验中，混合的RF-阳性血清对TNFα-Alexa647峰迁移无显著影响。
因此，此实施例证明可用本发明方法来监测接受抗-TNFα药物，如HUMIRATM治疗的患者：(1)指导确定合适的药物剂量；(2)评价药物的药代动力学，如检测该药物是否被机体清除得太快；和(3)指导治疗决策，如是否要将目前用的抗-TNFα药物换用不同的TNFα抑制剂或另一种类型的治疗。
实施例2.检测HACA和HAHA水平的新颖迁移改变试验
本实施例说明一种检测患者样品(如血清)中自身抗体(HACA和/或HAHA)浓度的新颖均质试验，采用了分子大小排阻层析来检测与荧光标记抗-TNFα药物的这些自身抗体。该试验具有优点，因为它不需要去除低亲和力HACA和HAHA的洗涤步骤，所用的荧光团可用可见光和/或荧光光度仪检测，这降低了背景和血清的干扰，提高了检测患者中低滴度HACA和HAHA的能力，由于荧光标记的检测灵敏度高并且是液相反应，从而减少了抗原表位附着固相表面(如ELISA平板)时发生变化的机会。
检测针对抗-TNFα抑制剂生成的自身抗体(如HACA、HAHA等)的临床应用可用以下事实说明：用1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的英夫利昔单抗治疗的类风湿关节炎患者检测到HACA占53％、21％和7％。当英夫利昔单抗与氨甲喋呤联用时，自身抗体的产生率降低为15％、7％和0％，这表明同时免疫抑制剂治疗有效地降低了抗-药物应答反应，但也表明高剂量抗-TNFα药物可能导致耐受。在克罗恩病中，报告了高得多的发生率，5次输注后61％的患者有HACA。当存在HACA时临床响应缩短。参见Rutgeerts，N.Engl.J.Med.，348：601-608(2003)。对2005-2008三年期间采用英夫利昔单抗的155名患者，作了英夫利昔单抗和HACA水平的回顾研究，表明在22.6％(N＝35)患炎性肠病的患者中检测到HACA。参见Afif等人的“Clinical Utility of MeasuringInfliximab and Human Anti-Chimeric Antibody Levels in Patients withInflammatory Bowel Disease(检测炎性肠病患者英夫利昔单抗和抗-嵌合抗体水平的临床应用)”论文，刊登在Digestive Disease Week；2009年5月30日-6月3日，伊利诺伊州芝加哥。作者的结论是仅根据临床症状更改治疗可能导致不适当的治疗。
这种同质均相迁移改变试验优于目前的方法，如优于图3所示检测患者样品中自身抗体(如HACA和/或HAHA)浓度的桥连试验。因为本发明方法能检测抗体(如HACA)的浓度而无ELISA平板的非特异性结合和固相干扰问题，没有抗-TNFα药物的干扰问题(例如，用桥连试验检测HACA必须采取抗-TNFα药物的谷底水平)，也不依赖多价抗体(如用桥连试验不能检测IgG4，因为IgG4是双特异性抗体不能交联同一抗原)。如此，本发明至少在以下方面优于目前的方法：避免了使抗原吸附于固体表面(避免变性)；消除了IgG4的影响；克服了抗体的谷底问题；能检测亲和力弱的抗体；消除了无关IgG的非特异结合和提高了检测的灵敏度和特异性。
在一示例实施方式中，用荧光团(如Alexa647)标记抗-TNFα药物，用可见光或荧光光度仪之一或二者检测。在液相反应中孵育标记抗-TNFα药物与人血清使其与血清中存在HACA和HAHA结合。同时在液相反应中孵育标记抗-TNFα药物与已知量的抗-IgG抗体而制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记的药物相比，自身抗体与标记抗-TNFα药物结合导致峰向左迁移。然后将血清样品中存在的HACA和HAHA浓度与标准曲线和对照作比较。图4显示本发明检测自身抗体试验的示例略图，检测的是抗REMICADETM的HACA/HAHA浓度。在某些情况下，HACA/HAHA水平高表示应将目前用REMICADETM的治疗换用另一种抗-TNFα药物(如HUMIRATM)治疗。
此试验的原理依据：抗体结合Alexa647-标记的REMICADETM形成的复合物与游离的Alexa647-标记的REMICADETM相比，由于该复合物的分子量增加，在分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)时发生了迁移改变。
此实施例在Agilent-1200HPLC系统中进行层析，采用Bio-Sep 300x7.8mmSEC-3000柱(飞诺麦克斯(Phenomenex)公司)分子量分级范围是5,000-700,000，移动相为1X PBS，pH 7.4，流速0.5mL/分钟，紫外UV检测波长650nm。配备Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱的Agilent-1200HPLC系统前面的分析型预装柱是BioSep75x7.8mm SEC-3000柱。每次分析将体积100μL的样品加到该柱上。
在1X PBS，pH7.3洗脱缓冲液中室温孵育已知量的抗体和Alexa647-标记的REMICADETM1小时，形成抗体结合Alexa647-标记的REMICADETM复合物，然后作SE-HPLC分析。
图5显示用本发明的分子大小排阻层析试验检测抗-人IgG抗体结合REMICADETM-Alexa647的剂量响应分析。抗-人IgG抗体与REMICADETM-Alexa647的结合导致REMICADETM-Alexa647峰左移。图6显示用本发明的分子大小排阻层析试验检测抗-人IgG抗体结合REMICADETM-Alexa647的二次剂量响应分析。较高含量的抗-IgG抗体导致形成的抗-IgG/REMICADETM-Alexa647复合物以剂量依赖方式升高，表现为REMICADETM-Alexa647峰左移。图7显示抗-IgG抗体结合REMICADETM-Alexa647的剂量响应曲线。
图8显示用柱中注入100μl样品的本发明分子大小排阻层析试验检测正常人血清和HACA阳性血清中形成的REMICADETM-Alexa647免疫复合物。如图8所示，患者样品中存在的HACA结合REMICADETM-Alexa647后导致REMICADETM-Alexa647峰左移。因此，本发明的分子大小排阻层析试验有特别的优点，因为在REMICADETM存在时可用它检测HACA，虽然患者正在治疗中，可检测含弱和强结合HACA的混合液，读取迁移改变试验的结果，可延伸采用标记的REMICADETM以平衡HACA与REMICADETM的其他方法。
图9提供了采用桥连试验或本发明的迁移改变试验检测20份患者血清HACA的小结。这项比较性研究表明，本发明方法的灵敏度高于目前的方法，因为用桥连试验检测有3份样品HACA为阴性，而用本发明的迁移改变试验检测事实上为HACA阳性(参见专利：#SK07070305、SK07070595和SK07110035)。
因此，此实施例表明，可用本发明监测接受抗-TNFα药物(如REMICADETM)治疗患者，检测抗该药物的自身抗体(如HACA和/或HAHA)的存在或水平，因为这类免疫应答可伴有超敏反应和抗-TNFα药物药代动力学和生物学分布的显著改变，从而排除用该药物的进一步治疗。
结论：实施例1和2证明，可用Alexa647有效标记TNFα和抗-TNFα抗体。当孵育标记TNFα-Alexa647与抗-TNFα抗体时，标记TNFα/抗-TNFα药物复合物的保留时间发生迁移，可用HPLC检测引起这种迁移的抗-TNFα药物的含量。此外，当孵育标记抗-TNFα药物与抗-人IgG抗体时，标记抗-TNFα药物/抗-IgG抗体复合物的保留时间发生迁移，可用HPLC定量检测引起这种迁移的抗-IgG抗体的含量。而且，证明该试验系统的血清含量低对HPLC分析几乎没有什么影响。最后，可制备抗-TNFα药物和HACA/HAHA试验的标准曲线，用于定量检测患者血清中的抗-TNFα药物或HACA/HAHA水平。本发明提供的迁移改变试验在某些方面具有优点，如均质混合液，可读取试验产生的结果而检测药物和抗药物抗体二者。可制备抗-TNFα生物制剂REMICADETM和HUMIRA的标准曲线，也可制备抗-REMICADETM的HACA标准曲线。这种迁移改变试验不像ELISA，取消了在固体表面包被抗原，并且不受无关IgG非特异性结合的影响。此试验简便但非常灵敏，可用于检测患者血清中的所有抗-TNFα生物药物(如REMICADTM、HUMIRA、Enbrel和Cimzia)和中和抗体(抗-REMICADETM)。
实施例3.用新颖迁移改变试验检测患者血清中的人抗-嵌合抗体(HACA)和英夫利昔单抗(IFX)水平
摘要
背景：英夫利昔单抗(IFX)是一种治疗用嵌合型抗-TNFα单克隆抗体，在治疗自身免疫病，如类风湿关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)中证明有效。然而。通过检测人抗-嵌合抗体(HACA)在一些IFX-治疗的患者中发现有抗-IFX的抗体，这可降低该药物的治疗效果或诱导不良作用。监测患者个体中HACA和IFX的水平有助于最优化用IFX治疗的剂量。目前检测HACA的方法依据固相试验，受到以下事实的限制，即循环血液中存在的IFX掩盖了存在的HACA，因此给予一个剂量的IFX后至少8周才可进行检测。然而，由于血循环中高分子量复合物被快速清除造成这种随时间推移的变化更为混乱。为了克服这些缺点，我们开发和评价了一种检测用IFX治疗的患者血清IFX和HACA水平的新方法。
方法：开发了一种检测用IFX治疗的患者血清IFX和HACA水平的新方法，是非放射标记的分子大小排阻高效液相层析(SE)-HPLC迁移改变试验。该试验能高灵敏度地分辨和计算免疫复合物(如TNFα/IFX或IFX/HACA)，游离的TNFα或IFX和结合/游离物的比例。通过与不同浓度的IFX或混合的HACA-阳性血清孵育产生的标准曲线，可检测IFX或HACA的血清浓度。采用此新试验方法，我们检测用IFX治疗而疾病复发的IBD患者血清中的IFX和HACA水平，与用传统的ELISA桥连试验获得的结果作比较。
结果：用新颖试验生成高灵敏度的剂量响应曲线。证明在存在过量IFX时能检测到HACA。在用IFX治疗的患者117份血清中，发现有65份样品的IFX水平高于检测上限，平均值为11.0±6.9mg/mL。发现33份(28.2％)样品的HACA水平为阳性，而桥连ELISA试验只检测到24份样品为阳性。我们还鉴定到9份假阴性样品，而桥连试验测定到9份假阳性样品。发现11位患者在IFX治疗期间HACA水平升高，同时发现其IFX水平显著降低。
结论：开发的这种非放射标记的液相迁移改变试验能检测用IFX治疗患者血清中的IFX和HACA水平。该试验的灵敏度和精确度高，获得的结果可重现。优选用这种新颖试验来检测正在治疗患者的HAVA和IFX水平。
引言
肿瘤坏死因子-α(TNFα)在自身免疫疾病，如克罗恩病(CD)和类风湿关节炎(RA)的发病机制中起着关键作用。已很好地证明，用治疗抗体，如英夫利昔单抗(人-小鼠嵌合单克隆抗体IgG1κ)或阿达木单抗(完全的人单克隆抗体)封闭TNFα可减轻CD和RA病情的活动。然而，约30-40％的患者对抗-TNFα药物治疗无反应，一些患者由于缺乏足够的反应需要较高剂量或频繁调整剂量。药物在患者个体中的生物利用度和药代动力学差异可能导致治疗失败。药物的免疫原性可导致患者产生HACA/HAHA，从而导致不良反应，从轻微的过敏反应到过敏性休克。现在许多学者、药物控制机关、健康保险公司和制药厂商已认识到这些问题。此外，许多对一种抗-TNFα药物继发反应衰竭的患者通过转用其他抗-TNFα药物而受益，提示这是特异性针对用于治疗的蛋白(药物)的中和抗体的作用(Radstake等，Ann.Rheum.Dis.，68(11)：1739-45(2009))。因此监测患者的药物和HACA/HAHA水平可确保对患者个体单独选择给予的药物并且有效地延长药物治疗的时间，经济上患者极少或没有风险(Bendtzen等，Scand.J.Gastroenterol.44(7)：774-81(2009))。
已采用几种酶标记免疫试验来评估的药物和HACA/HAHA的循环水平。图10提供了目前用于检测HACA的试验与本发明新颖HACA试验相比较的小结。目前方法的一个局限性是当循环血液中存在可检测量的药物时难以检测抗体水平。与目前检测HACA的方法(给予一个剂量的IFX后至少8周才可进行检测)相反，本发明的新颖试验是一种无放射标记的液相分子大小排阻层析(SE)-HPLC试验，能检测正在用IFX治疗患者血清中的HACA和IFX水平。
以下是检测患者抗-TNFα生物制剂和抗-TNFα生物制剂的抗体血清浓度的理由：(1)对PK的临床试验研究；(2)FDA要求在临床试验期间监测患者对生物制剂的免疫应答反应；(3)通过检测HACA或HAHA，可监测患者对生物制剂的应答反应，而为每个患者指导药物剂量；和(4)当先用的药物失效后可指导换成不同的生物制剂。
方法
用SE-HPLC分析患者血清中英夫利昔单抗(IFX)的水平。按照厂商说明书用荧光团(“F1”，如Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200551
488)标记重组的人TNFα。将该标记TNFα与不同量的IFX或患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用FLD监测游离的TNFα-F1和结合的TNFα-F1免疫复合物(根据其保留时间)。从标准曲线计算出血清的IFX水平。
用SE-HPLC分析患者血清中的HACA水平。用F1标记纯化的IFX。将该标记的IFX与混合的HACA-阳性血清的不同稀释液或稀释的患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用FLD监测游离的TNFα-F1和结合的TNFα-F1免疫复合物(根据其保留时间)。利用结合与游离的IFX-F1的比率测定HACA水平。
检测血清HACA的迁移改变试验方法。此试验的原理依据是HACA结合的F1-标记的英夫利昔单抗(IFX)形成的复合物与游离的F1-标记的IFX相比，由于复合物的分子量增加，在分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)时复合物的迁移改变。在Agilent-1200HPLC系统中进行层析，采用Bio-Sep 300x7.8mmSEC-3000柱(飞诺麦克斯公司)其分子量分级范围是5,000-700,000，移动相为1XPBS，pH 7.3，流速0.5mL/分钟，用FLD检测。配备Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱的Agilent-1200HPLC系统前面的分析型预装柱是BioSep75x7.8mm
SEC-3000柱。每次分析将体积100μL的样品加到该柱上。在1X PBS，pH7.3洗脱缓冲液中室温孵育用IFX治疗患者的血清和F1-标记的IFX小时，形成HACA结合的F 1-标记的IFX复合物，然后作SE-HPLC分析。
结果
图11.显示HACA结合的IFX-F1复合物已与游离的IFX-F1分离，这是由于该复合物的分子量高导致其迁移改变。如分图c和d所示，荧光峰的保留时间从21.8分钟改变到15.5-19.0分钟。反应混合液中存在的HACA越多，层析图中游离的IFX-F1越少，形成的免疫复合物越多。图12.显示增加HACA所导致的荧光峰迁移的剂量响应曲线。HACA阳性血清，我们能够检测出1∶1000的血清稀释液的峰迁移。
图13.显示IFX结合的TNFα-F1复合物已与游离的TNFα-F1分离，这是由于该复合物的分子量高导致其迁移改变。如分图c和d所示，荧光峰的保留时间从24分钟改变到13-19.5分钟。反应混合液中存在的IFX越多，层析图中游离的TNFα-F1越少，形成的免疫复合物越多。图14.显示增加IFX所导致的TNFα-F1峰迁移的剂量响应曲线。根据增加的IFX，血清IFX的检测下限是10ng/mL。
用桥连试验检测HACA阳性和阴性患者血清样品验证本发明新颖迁移改变试验的效果(表2)。我们用该试验分析了50位健康对象和117位用IFX治疗的IBD患者的血清样品。所有50位健康对象的血清样品IFX水平低于检测下限，而65位患者样品的平均IFX浓度为11.0μg/ml。表3显示用桥连试验和迁移改变试验检测的健康对照和用IFX治疗的IBD患者血清的HACA水平。桥连试验测得的HACA阳性患者少于迁移改变试验，假阴性和假阳性更多。
表2.桥连试验与迁移改变试验测得的强阳性和阴性患者血清相对HACA 水平的相关性
  桥连试验   HPLC迁移试验   相关性
  阳性   82   81   99％
  阴性   12   12   100％
表3.用桥连试验(截取值1.69μg/ml)和HPLC迁移试验(截取值0.19，结合 与游离的IFX比例)分析患者样品的血清HACA水平
Figure BPA00001573238200561
假阴性结果是由于患者血清含有的高水平IFX干扰了桥连试验对HACA的测定，而SE-HPLC不受此影响。假阳性结果是由于患者血清含有的高水平非特异性物质干扰了桥连试验而致。
图15.显示IFX治疗期间IBD患者HACA水平与IFX浓度的关系。某些患者在IFX治疗期间早至V10(30周)即可测到HACA并持续上升。图16.显示存在IFX时用本发明试验可测到HACA。较高的血清HACA水平与可测到较低水平的IFX相关(如降低了生物利用度)。因此，用IFX治疗时能早检测到HACA可指导医生和/或患者转用其他抗-TNFα药物或提高IFX的剂量。
结论
抗-TNFα生物制剂容易用荧光团(“F1”)标记，用于检测HACA/HAHA的迁移改变试验是一种均质试验，不需要像典型的EKISA那样将抗原包被到固体表面和多次洗涤及孵育步骤。孵育F 1-标记的IFX与HACA阳性血清导致形成免疫复合物，在SE-HPLC中的洗脱位置与游离的F1-标记的IFX不同，从而定量HACA的量。存在的其他血清组分对迁移改变试验的影响甚微。不像ELISA，迁移改变试验方法不受无关IgG非特异性结合的影响并可检测IgG同种型。用本发明的试验，健康血清样品不会引起F1-标记的IFX迁移改变，发现28.2％用IFX治疗的患者有HACA。因此，本文所述的试验方法非常灵敏可用于检测患者血清中的所有生物药(如REMICADETM、HUMIRA、Enbrel和Cimzia)以及其抗体(如抗-REMICADETM、抗-HUMIRA、抗-Enbrel和抗-Cimzia)。值得注意的是，因为在存在IFX时用本发明的迁移改变试验也可检测到HACA，因此虽然用IFX治疗但能早检测到HACA可指导医生和/或患者转用其他抗-TNFα药物或提高IFX的后续剂量。
我们开发了一种新颖无放射标记的液相SE-HPLC试验可检测用IFX治疗患者血清样品中的IFX和HACA水平。此新颖试验的灵敏度、精确度和准确度高，结果可高度重现，使该试验适合常规检测大量人血清样品。不像ELISA，这种新的试验方法取消了抗原包被固体表面，不受无关IgG非特异性结合的影响。本文所述试验的这些优点减少了试验产生的假阴性和假阳性。有益的是，本发明的试验方法非常灵敏，可用于检测正在治疗患者血清中的所有生物制剂和其抗体水平。
实施例4.用新颖迁移改变试验区分患者血清中的中和与非中和人抗-嵌合抗体(HACA)
此实施例说明在存在荧光标记TNFα时，用分子大小排阻层析检测自身抗体与荧光标记抗-TNFα药物结合的新颖均质试验，能检测患者样品(如血清)中自身抗体(如HACA)的浓度和确定这些自身抗体是中和还是非中和自身抗体。这些试验具有优点，因为它不需要去除低亲和力HACA的洗涤步骤，所用的独特荧光团可用可见光或荧光光度仪检测，这降低了背景和血清的干扰，提高了检测患者中低滴度中和与非中和HACA的能力，这是由于荧光标记的检测灵敏度高并且是液相反应，从而减少了抗原表位附着固相表面(如ELISA平板)时发生变化的机会。
在一示例实施方式中，用荧光团“F1”(见图17A)标记抗-TNFα药物(如REMICADETM)，可用可见光和荧光光谱之一或二者检测此荧光团。类似地，用荧光团“F2”(见图17A)标记TNFα，也可用可见光和荧光光谱之一或二者检测此荧光团，其中“F1”与“F2”是不同的荧光团。在液相反应中孵育标记抗-TNFα药物与人血清，将标记TNFα加到反应液中，标记抗-TNFα药物、标记TNFα与血清中存在的HACA结合形成复合物(即免疫复合物)。孵育后将样品直接加载到分子大小排阻层析柱中。与自身抗体和标记抗-TNFα药物形成的二元复合物(如图17A中的“免疫-复合物2”)、单独标记的药物，或单独标记TNFα相比，自身抗体(如HACA)和标记TNFα与标记抗-TNFα药物结合后导致峰向左迁移(如图17A中的“免疫-复合物1”)。存在自身抗体(如HACA)、标记TNFα与标记抗-TNFα药物组成的这种三元复合物，可表明该血清样品中存在的自身抗体是非中和形式的自身抗体(如HACA)，因此该自身抗体不会干扰抗-TNFα药物与TNFα之间的结合。在一具体实施方式中，如图17A所示，如果血清中存在非中和HACA，将观察到F1-REMICADETM和F2-TNFα二者峰的迁移导致免疫-复合物1和免疫-复合物2的二个峰升高，和游离的F1-REMICADETM和游离的F2-TNFα峰降低。然而，当存在自身抗体(如HACA)与标记抗-TNFα药物之间的二元复合物(如图17B中的“免疫-复合物2”)又缺乏自身抗体(如HACA)、标记TNFα与标记抗-TNFα药物组成的三元复合物时，可表明该血清样品中存在的自身抗体是中和形式的自身抗体(如HACA)，这种自身抗体干扰了抗-TNFα药物与TNFα之间的结合。在一具体实施方式中，如图17B所示，如果血清中存在中和HACA，将观察到F1-REMICADETM峰的迁移导致免疫-复合物2峰升高，游离的F1-REMICADETM峰降低，而游离的F2-TNFα峰不变。在某些情况下，存在中和HACA表明，应将目前的治疗药物REMICADETM换成另一种抗-TNFα药物，如HUMIRATM。
在一可替代的实施方式中，在液相反应中先孵育标记抗-TNFα药物与人血清，使标记抗-TNFα药物与血清中存在的HACA之间形成复合物(即免疫-复合物)。孵育后将样品直接加载到第一分子大小排阻层析柱中。与单独标记的药物相比，自身抗体(如HACA)与标记抗-TNFα药物结合后导致峰向左迁移(如图18.中的“免疫-复合物2”)。然后在反应液中加入标记TNFα，检测它能否替代(如与之竞争)自身抗体(如HACA)而结合标记抗-TNFα药物，形成标记抗-TNFα药物与标记TNFα之间的复合物(即免疫-复合物)。孵育后将样品直接加载到第二分子大小排阻层析柱中。与单独标记TNFα相比，标记抗-TNFα药物与标记TNFα结合导致峰左移(如图18中的“免疫-复合物3”)。加入标记TNFα破坏了自身抗体(如HACA)与标记抗-TNFα药物之间的结合，可表明血清样品中存在的自身抗体是中和形式的自身抗体(如HACA)，该自身抗体干扰了抗-TNFα药物与TNFα之间的结合。在某些情况下，存在中和HACA表明，应将目前的治疗药物REMICADETM换成另一种抗-TNFα药物，如HUMIRATM。
实施例5.用新颖均质迁移改变试验分析患者血清中对阿达木单抗的人抗-药物抗体(ADA)
背景和目的：已证明抗-TNFα的单克隆抗体，如英夫利昔单抗(IFX)、阿达木单抗(HUMIRATM)和赛妥珠单抗能有效治疗炎性肠病(IBD)和其他炎症疾病。抗-药物抗体(ADA)可能削弱药物的效果和/或诱导不良作用。然而，不仅在用嵌合抗体英夫利昔单抗治疗的患者中，而且在用人源化抗体阿达木单抗治疗的患者中发现了ADA。监测患者个体中的ADA和药物水平有助于最优化患者的治疗和剂量。我们开发的非放射标记的液相均质迁移改变试验可精确检测患者血清中的HACA(人抗-嵌合抗体)和IFX。此试验方法克服了目前用于检测HACA的固相试验的主要局限性，即在循环血液中存在IFX时不能精确检测HACA。在本研究中，我们评价了这种新方法能否检测用人源化抗体药物阿达木单抗治疗患者的血清ADA和药物水平。
方法：此迁移改变试验依据游离抗原与抗原-抗体免疫复合物在分子大小排阻分离中的保留时间变化。将荧光标记的阿达木单抗或TNFα和内部对照与血清样品混合，检测在存在ADA或药物时游离的阿达木单抗与TNFα的迁移改变。游离的阿达木单抗或TNFα与内部对照的比率变化是形成免疫复合物的指标。与不同浓度的抗-人IgG抗体或纯化的阿达木单抗一起孵育制备标准曲线后，用其测定ADA或阿达木单抗的血清水平。采用该迁移改变试验，我们在收集的用阿达木单抗治疗无反应的IBD患者血清中检测到阿达木单抗和ADA水平。
结果：制备用抗-人IgG抗体检测标记的阿达木单抗迁移改变的剂量响应曲线。此试验的检测下限是1ng抗-人IgG。检测了50份健康对照血清的ADA，所有样品的ADA水平低于该检测下限(即标记的游离阿达木单抗无改变)。在存在外源加入的阿达木单抗时也显示检测到ADA。为了检测用阿达木单抗治疗患者的药物浓度，我们用不同量的阿达木单抗制备了标记TNFα迁移的标准曲线，其阿达木单抗的检测下限为10ng。
结论：本发明的非放射标记的液相均质迁移改变试验已用于检测用阿达木单抗治疗患者血清样品中的ADA和阿达木单抗水平。发现该试验的高灵敏度和精确度可重现，可用于评价用阿达木单抗治疗患者血清样品的ADA水平。
实施例6.用新颖专有迁移改变试验分析患者血清中对阿达木单抗的抗-药物抗体(ADA)
摘要
背景：已证明抗-TNFα药物，如英夫利昔单抗(IFX)和阿达木单抗(ADL)能有效治疗炎性肠病(IBD)。然而，所治疗患者产生的ADA削弱了药物的效果和/或诱导不良作用。的确不仅在用IFX治疗的患者中，而且在用ADL治疗的患者中发现了ADA。监测患者个体中的ADA和药物水平有助于最优化患者的治疗和剂量。我们开发的专有迁移改变试验可精确检测IFX治疗患者血清中的HACA(人抗-嵌合抗体)和IFX二者。此试验方法克服了目前用于检测HACA的固相试验的主要局限性，即在循环血液中存在IFX时不能精确检测HACA。在本研究中，我们评价了这种新方法能否检测用完全的人抗体药物ADL治疗患者的血清ADA和药物水平。
方法：此迁移改变试验依据抗原-抗体免疫复合物与游离抗原在分子大小排阻层析中的保留时间改变。将荧光标记的ADL或TNFα和内部对照与血清样品混合，检测在存在ADA或药物时标记的ADL与TNFα的迁移改变。游离的ADL或TNFα与内部对照的比率变化是形成免疫复合物的指标。与不同浓度的抗-人IgG抗体或纯化的ADL一起孵育制备标准曲线，用其测定ADA或ADA的血清水平。采用所述试验，我们在收集的用ADL治疗的IBD患者血清中检测ADL和ADA水平。
结果：制备用抗-人IgG抗体检测标记的ADL迁移改变的剂量响应曲线。此试验的检测下限是10ng抗-人IgG。检测了100份健康对照血清的ADA，所有样品的ADA水平低于该检测下限(即标记的游离ADL无改变)。114份用ADL治疗的IBD患者样品有5份显示检测到ADA。为了检测用ADL治疗患者的药物浓度，我们用不同浓度的ADL制备了标记TNFα迁移的标准曲线，其检测下限为10ng。
结论：我们用我们的专有非放射标记液相均质迁移改变试验检测用ADL治疗患者血清中的ADA和ADL水平。该试验的高灵敏度和精确度可重现，可用于评价用ADL治疗患者血清样品的ADA水平。
引言
已证明抗-肿瘤坏死因子-α(TNFα)生物制剂，如英夫利昔单抗(IFX)、依那西普、阿达木单抗(ADL)和PEG化舍托利能降低许多自身免疫疾病，包括如克罗恩病(CD)和类风湿关节炎(RA)病情的活动。然而一些患者对抗-TNFα药物治疗无反应，而其他患者由于缺乏足够的反应需要较高剂量或更频繁地给药，或进行输液反应。
治疗用抗体的免疫原性可导致患者产生抗该药物的抗体，导致治疗失效和输液反应。与完全的人源化抗体如ADL相比，嵌合抗体如IFX更加可能诱导产生针对它的抗体。在12％-44％的RA患者中流行产生抗-IFX抗体(HACA)，似乎与患者血清的IFX水平和治疗反应成反比。虽然提出完全的人源化ADL的免疫原性比小鼠抗体或嵌合抗体低，但几项研究报导产生了人-抗-人源化的抗体(HAHA)，并证明1％-87％的RA和CD患者普遍生成这种抗体(Aikawa等，“Immunogenicity of Anti-TNF-alpha agents in autoimmune diseases(自身免疫疾病中抗-TNFα药物的免疫原性)”，Clin.Rev.Allergy Immunol.，38(2-3)：82-9(2010))。
许多对一种抗-TNFα药物二次免疫反应衰竭的患者可从换用另一种抗-TNFα药物或提高剂量和/或频繁给药获益。因此监测患者的药物和抗-药物抗体(ADA)水平可保证为患者个体制定专用的给药方案。这种方法需要时可调整剂量或存在ADA水平时可中止给药。(Bendtzen等，“Individual medicine ininflammatory bowel disease：monitoring bioavailability，pharmacokinetics andimmunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies.(炎性肠病的个体化医治：监测抗-肿瘤坏死因子-α抗体的生物利用度、药代动力学和免疫原性)”Scand.J.Gastroenterol.，44(7)：774-81(2009)；Afif等，“Clinical utility of measuringinfliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients withinflammatory bowel disease.(检测炎性肠病患者英夫利昔单抗和人抗-嵌合抗体浓度的临床用途)”，Am.J.Gastroenterol.，105(5)：1133-9(2010))。
已开发了一些试验来检测HACA和HAHA。目前方法的一个局限性是当循环中药物水平高时不能可靠地检测ADA的水平。
我们开发了一种专有非放射标记液相迁移改变试验可检测用ADL治疗患者血清中的ADA和ADL水平而不受血清中存在的药物影响。
方法
孵育荧光标记(F1)-标记的ADL与患者血清形成免疫复合物。每次反应包括F1-标记小肽作为内部对照。利用不同量的抗-人IgG制备标准曲线来测定血清ADA水平。用分子大小排阻层析根据分子量分离游离的F1-标记的ADL与抗体结合复合物。利用每份样品F1-标记ADL与内部对照的比例从标准曲线推断HAHA浓度。用F1-标记TNFα以类似方法检测患者血清的ADL水平。
结果
图19.显示由于高分子量复合物的迁移改变使抗-人IgG结合F1-ADL复合物与游离F1-ADL分离。如分图c到h所示，荧光峰的保留时间从10.1分钟改变到7.3-9.5分钟。加入反应混合液中的抗-人IgG越多，层析图中游离的ADL越少而形成的复合物越多(h到c)。内部对照的保留时间为3.5分钟。
图20.显示加入抗-人IgG引起荧光峰迁移的剂量响应曲线。提高抗-人IgG的浓度降低了游离ADL与内部对照的比例是由于形成了免疫复合物。此试验检测抗-人IgG的灵敏度为10ng/ml。内部对照“F1-BioCyt”对应于Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200621
488-生物素(BioCyt)，组合了绿荧光Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200631
488荧光团与生物素和乙醛可固定的伯胺(赖氨酸)(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
图21.显示由于高分子量复合物的迁移改变使ADL结合的TNFα-F1复合物与游离的TNFα-F1分离。如分图c和j所示，荧光峰的保留时间从11.9分钟迁移到6.5-10.5分钟。加入反应混合液中的ADL越多，层析图中留下的游离TNFα-F1越少和形成的免疫复合物越多。
图22.显示加入ADL引起TNFα-F1荧光峰迁移的剂量响应曲线。根据加入的ADL(量)，检测血清ADL的下限是10ng/mL。
表4.显示用本发明迁移改变试验分析100位健康对象和用ADL治疗的114位IBD患者血清样品的ADA和ADL水平。所有100位健康对象的ADA水平低于检测下限(游离的F1-ADL不迁移)，而114位患者样品有5份ADA浓度0.012至＞20μg/ml。100位健康对象样品的平均ADA水平为0.76±1.0μg/ml(范围0-9.4μg/ml)。用ADL治疗的114位患者样品的平均ADL水平为10.8+17.8μg/ml(范围0-139μg/ml)。5份ADA阳性样品有4份测不到ADL水平。
表4.用迁移改变试验检测的患者血清ADA和ADL水平
Figure BPA00001573238200632
表5.提供对100位健康对象和用ADL治疗的114位IBD患者血清样品的进一步分析。具体说，42位患者有4位的样品ADL水平为0-4μg/ml，平均ADA浓度0.012至＞20μg/ml。4位ADA阳性患者的样品不能测到ADL水平。对于ADA检测，用ADL治疗的114位IBD患者可分成ADL水平0-4μg/ml和＞4μg/ml两类。对ADL＞4μg/ml的患者用更高剂量的ADL-F1测试以表明循环血液中ADL与ADL-F1的竞争。
表5.用迁移改变试验检测患者血清的ADA和ADL水平
Figure BPA00001573238200641
结论
用于检测HACA/IFX的迁移改变试验是一种均质试验，不需要像典型的EKISA那样将抗原包被到固体表面和多次洗涤及孵育步骤。此试验可用于检测ADA和抗-TNF药物。与ELISA方法(mg/ml范围)相比，此试验的检测患者血清的ADA和ADL的灵敏较高(μg/ml范围)。健康对照的血清样品不会引起F1-标记的ADL迁移改变，且本试验发现用ADL治疗的患者4.3％有ADA。具体地，本试验发现用0.4μg/ml ADL治疗的患者9.52％有ADA。将用较高浓度的ADL-F1进一步评价正常样品和患者样品。虽然可能由于存在游离的可溶性TNFα受体，健康血清样品会引起F1-标记TNFα迁移改变，但用ADL治疗患者的ADL平均值高得多(10.8对0.76μg/ml)。对用ADL治疗的患者早期检测到ADA和监测其ADL药物水平将使医生能最优化ADL的剂量或转用另一种适当的抗-TNFα药物，从而最优化对该患者疾病的总体治疗。
实施例7：检测REMICADETM和人抗-药物抗体的浓度水平
本实施例描述了一种检测血清样品中抗-TNFα药物，如抗-REMICADETM(英夫利昔单抗)抗体水平和检测人抗-药物抗体，如对REMICADETM(英夫利昔单抗)的人抗-嵌合抗体(HACA)的水平的方法。
步骤1：检测样品的REMICADETM(英夫利昔单抗)水平
在一个示例实施方式中，用荧光团(如Alexa647)标记TNFα，用可见光和荧光光谱之一或二者检测该荧光团。在液相反应液中孵育标记TNFα与人血清使之与血清中抗-TNFα药物结合。也在液相反应液中孵育标记TNFα与已知量的抗-TNFα药物而制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记TNFα相比，抗-TNFα药物与标记TNFα结合导致峰向左迁移。然后将血清样品中抗-TNFα药物浓度与标准曲线和对照作比较。
SE-HPLC分析患者血清的REMICADETM(英夫利昔单抗)水平。按照厂商说明书用荧光团Alexa Fluor488)标记重组的人TNFα。将该标记TNFα与不同量的REMICADETM或患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用荧光标记检测监测游离的标记TNFα和结合的标记TNFα免疫复合物(根据其保留时间)。从标准曲线计算出血清的REMICADETM水平。
以下方程式与此试验相关：
方程式I：标记的-TNFα+REMICADETM→(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物
方程式II：[REMICADETM]无标记的-TNFα-＝[(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物]
方程式III：[REMICADETM]＝[(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物]/[标记的-TNFα]×[标记的-TNFα]
步骤1中，使已知量标记的-TNFα接触含REMICADETM的血清样品。该标记的-TNFα与REMICADETM形成复合物(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物，见方程式I。由于几乎所有的REMICADETM与标记TNFα形成了复合物，在加入标记TNFα之前存在的REMICADETM浓度等于检测到的标记的-TNFα·REMICADETM 复 合物的浓度，见方程式II。通过[(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物]/[标记的-TNFα]的比率乘以[标记的-TNFα]计算出REMICADETM的浓度水平，见方程式III。计算作为分子大小排阻HPLC洗脱时间的函数的信号强度图像中(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物峰曲线下面积的积分，将此积分数除以从此图得到的标记的-TNFα峰曲线下面积积分，获得[(标记的-TNFα·REMICADETM)复合物]/[标记的-TNFα]的比率。[标记的-TNFα]是先验已知的。
步骤2：检测人抗-嵌合抗体HACA的水平
在一个示例实施方式中，用荧光团(如Alexa647)标记抗-TNFα药物，如REMICADETM，用可见光和荧光光谱之一或二者检测该荧光团。在液相反应液中孵育标记抗-TNFα药物与人血清使之与血清中存在HACA结合。也在液相反应液中孵育标记抗-TNFα药物与已知量的抗-IgG抗体或阳性患者的混合血清制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记的药物相比，该自身抗体与标记抗-TNFα药物结合导致峰向左迁移。然后将血清样品中存在的HACA浓度与标准曲线和对照作比较。
用SE-HPLC分析患者血清的HACA水平 用荧光团标记纯化的REMICADETM。将荧光标记的REMICADETM与混合的HACA-阳性血清不同稀释液或稀释的患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用荧光标记检测监测标记的REMICADETM和结合的标记的REMICADETM免疫-复合物(根据其保留时间)。如下文所述利用结合的与游离的标记REMICADETM的比率，检测HACA水平。
检测血清HACA的迁移改变试验.此试验的原理依据是抗-药物抗体，如HACA与Alexa647-标记的REMICADETM结合形成的复合物与游离的Alexa647-标记的REMICADETM相比，由于该复合物的分子量增加，其在分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)时发生了迁移改变。在Agilent-1200HPLC系统中进行层析，采用Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱(飞诺麦克斯公司)分子量分级范围5,000-700,000，移动相为1X PBS，pH 7.3，流速0.5-1.0mL/分钟，荧光标记检测，如用紫外UV波长650nm。配备Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱的Agilent-1200HPLC系统前面的分析型预装柱是BioSep75x7.8mm SEC-3000柱。每次分析将体积100μL的样品加到该柱上。通过在1XPBS，pH 7.3脱缓冲液中室温孵育REMICADETM-治疗患者的血清与标记的REMICADETM一小时，形成HACA与标记的REMICADETM结合的复合物，然后作SE-HPLC分析。
以下方程式与此试验相关：
方程式IV：REMICADETM+标记的-REMICADETM+HACA→(REMICADETM·HACA)复合物+(标记的-REMICADETM·HACA)复合物
方程式V：[REMICADETM]/[REMICADETM·HACA复合物]＝[标记的-REMICADETM]/[标记的-REMICADETM·HACA复合物]
方程式VI：[HACA]＝[REMICADETM·HACA]复合物+[标记的-REMICADETM·HACA]复合物
方程式VII：[REMICADETM·HACA复合物]＝[REMICADETM]x[标记的-REMICADETM·HACA复合物]/[标记的-REMICADETM]
方程式VIII：[标记的-REMICADETM·HACA复合物]＝[标记的-REMICADETM]×[标记的REMICADETM·HACA复合物]/[标记的-REMICADETM]
方程式IX：[REMICADETM]有效量＝[REMICADETM]-[HACA]
检测人抗-TNFα药物抗体如HACA的浓度水平 在血清样品中加入已知浓度的标记的-REMICADETM。HACA与REMICADETM或与标记的-REMICADETM形成复合物，见方程式IV。在上文步骤1中测定了[REMICADETM]。计算得到的标记的-REMICADETM·HACA复合物峰曲线下面积的积分，将此积分数除以得到的游离标记的-REMICADETM峰曲线下面积积分，获得[标记的-REMICADETM·HACA复合物]/[标记的-REMICADETM]比率。此[REMICADETM]/[REMICADETM·HACA复合物]比率等于[标记的-REMICADETM]/[标记的d-REMICADETM·HACA)复合物]的比率，见方程式V。因为HACA平衡并与REMICADETM和标记的-REMICADETM形成了的复合物，故HACA的总含量等于REMICADETM·HACA复合物含量和标记的-REMICADETM·HACA复合物含量之和，见方程式VI。由于[REMICADETM]/[REMICADETM·HACA复合物]的比率等于[标记的-REMICADETM]/[标记的d-REMICADETM·HACA复合物]的比率，通过[标记的-REMICADETM·HACA复合物)]/[标记的-REMICADETM]的比率分别乘以步骤1中测定的REMICADETM浓度，和先验已知的标记的-REMICADETM浓度，可测定[REMICADETM-HACA]复合物和[标记的-REMICADETM-HACA复合物]，见方程式VII和VIII。因此，HACA的总含量等于(1)步骤1的[REMICADETM]乘以[标记的-REMICADETM·HACA)复合物]/[标记的-REMICADETM]和，(2)先验已知的[标记的-REMICADETM]乘以[标记的-REMICADETM·HACA)复合物x]/[标记的-REMICADETM]之和。
测定REMICADETM的有效浓度水平.因为HACA与REMICADETM形成了复合物，故血清样品中可用的REMICADETM有效含量是步骤1测得的REMICADETM含量减去步骤2测得的HACA含量，见方程式IX.
计算示例.V10患者JAG，测得的[REMICADETM]为7.5μg/ml，见图16c。这个结果是通过按照步骤1和用方程式I-III获得。7.5μg/ml等于30ng/4μL。因为步骤2的测量采用了4μL样品，故分析该样品中REMICADETM的总含量为30.0ng。V10患者JAG的[标记的-EMICADETM·HACA]复合物/[标记的-REMICADETM]比率为0.25，见图16b。加入该样品中的[标记的-REMICADETM]为37.5ng/100μL。因为步骤2检测采用了100μL标记的-REMICADETM，故分析样品中标记的-REMICADETM总含量为37.5ng。采用方程式VII，REMICADETM·HACA复合物的总含量30ng乘0.25，等于7.5ng标记的-REMICADETM·HACA复合物。采用方程式VIII，标记的-REMICADETM·HACA复合物的总含量37.5ng乘0.25等于9.4ng标记的-REMICADETM·HACA复合物。采用方程式VI，HACA的总含量等于9.4ng加7.5ng之和，等于16.9ng HACA。4μL样品中存在16.9ng HACA。[HACA]为16.9ng/4μL，等于4.23μg/ml。采用方程式IX，REMICADETM的有效量等于步骤1测得的7.5μg/ml REMICADETM减去步骤2测得的4.23μg/ml HACA。此计算示例中，[REMICADETM]的有效量等于3.27μg/ml。
实施例8：检测HUMIRATM和人抗-药物抗体的浓度水平
此实施例描述了检测血清样品中HUMIRATM水平以及检测人抗-人抗体(HAHA)水平的方法.
步骤1：检测样品的HUMIRATM浓度水平
在一个示例实施方式中，用荧光团(如Alexa647)标记TNFα，用可见光和荧光光谱之一或二者检测该荧光团。在液相反应液中孵育标记TNFα与人血清使之与血清中抗-TNFα药物结合。也在液相反应液中孵育标记TNFα与已知量的抗-TNFα药物制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记TNFα相比，抗-TNFα药物与标记TNFα合导致峰向左迁移。然后将血清样品中抗-TNFα药物浓度与标准曲线和对照作比较。
用SE-HPLC分析患者血清HUMIRATM水平按照厂商说明书用荧光团Alexa Fluor
Figure BPA00001573238200681
488标记重组的人TNFα。将该标记TNFα与不同量HUMIRATM或患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用荧光标记检测监测游离的标记TNFα和结合的标记TNFα免疫-复合物(根据其保留时间)。从标准曲线计算出血清的HUMIRATM水平。
以下方程式与此试验相关：
方程式X：标记的-TNFα+HUMIRATM→(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物
方程式XI：[HUMIRATM]＝[(标记的-TNFα·HUMIRA)复合物]
方程式XII：[HUMIRATM]＝[(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物]/[标记的-TNFα]×[标记的-TNFα]
步骤1，使已知量标记的-TNFα与含HUMIRATM的血清样品接触。标记的-TNFα与HUMIRATM形成复合物(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物，见方程式X。因为几乎所有的HUMIRATM与标记的-TNFα形成复合物，故加入标记的-TNFα以前存在的[HUMIRATM]等于测得的[(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物]，见方程式XI。通过[(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物]/[标记的-TNFα]的比率乘[标记的-TNFα]计算出[HUMIRATM]，见方程式XII。计算标记的-TNFα峰曲线下面积的积分和(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物峰曲线下面积的积分，将得到的(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物积分除以标记的-TNFα得到的积分，获得[(标记的-TNFα·HUMIRATM)复合物]/[标记的-TNFα]的比率。[标记的-TNFα]是先验已知的。
步骤2：检测人抗-人抗体如HAHA的水平.在一个示例实施方式中，用荧光团(如Alexa647)标记抗-TNFα药物如HUMIRATM，用可见光和荧光光谱之一或二者检测该荧光团。在液相反应液中孵育标记抗-TNFα药物与人血清使之与血清中存在的HAHA结合。也在液相反应液中孵育标记抗-TNFα药物与已知量的抗-IgG抗体或阳性患者的混合血清制备标准曲线。孵育后直接将样品加载到分子大小排阻层析柱中。与单用标记的药物相比，自身抗体与标记抗-TNFα药物结合导致峰向左迁移。然后将血清样品中存在的HAHA浓度与标准曲线和对照作比较。
用SE-HPLC分析患者血清的HAHA水平.用荧光团标记纯化的HUMIRATM。将荧光标记的HUMIRATM与混合的HACA-阳性血清不同稀释液或稀释的患者血清室温孵育1小时。取100μL体积样品在HPLC系统上作分子大小排阻层析分析。用荧光标记检测监测游离的标记的HUMIRATM和结合的标记的HUMIRATM免疫-复合物(根据其保留时间)。如下文所述利用结合的与游离的标记的HUMIRATM比率，检测HACA水平。
检测血清HAHA的迁移改变试验 此试验的原理依据是抗体如HAHA与Alexa647-标记的HUMIRATM结合形成的复合物与游离的Alexa647-标记的HUMIRATM相比，由于该复合物的分子量增加，其在分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)时发生了迁移改变。在Agilent-1200HPLC系统中进行层析，采用Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱(飞诺麦克斯公司)分子量分级范围5,000-700,000，移动相为1X PBS，pH 7.3，流速0.5-1.0mL/分钟，荧光标记检测，如用紫外UV波长650nm。配备Bio-Sep 300x7.8mm SEC-3000柱的Agilent-1200HPLC系统前面的分析型预装柱是BioSep75x7.8mm SEC-3000柱。每次分析将体积100μL的样品加到该柱上。通过在1XPBS，pH 7.3脱缓冲液中室温孵育HUMIRA-治疗患者的血清与标记的HUMIRATM一小时，形成HAHA与标记的HUMIRATM结合的复合物，然后作SE-HPLC分析。
方程式XIII：HUMIRATM+标记的-HUMIRATM+HAHA→(HUMIRATM·HAHA)复合物+(标记的-HUMIRATM·HAHA)复合物
方程式XIV：[HUMIRATM]/[HUMIRATM·HAHA复合物]＝[标记的-HUMIRATM]/[标记的-HUMIRA·HAHA复合物]
方程式XV：[HAHA]＝[HUMIRATM·HAHA复合物]+[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]
方程式XVI：[HUMIRATM·HAHA复合物]＝[HUMIRATM]×[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]/[标记的-HUMIRATM]
方程式XVII：[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]＝[标记的-HUMIRATM]×[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]/[标记的-HUMIRATM]
方程式XVIII：[HUMIRATM]有效量＝[HUMIRATM]-[HAHA]
步骤2的计算：将已知浓度的标记的-HUMIRATM加入血清样品中，HAHA与HUMIRATM或标记的-HUMIRATM形成复合物，见方程式XIII。如上所述在步骤1中测定[HUMIRATM]。计算标记的-HUMIRATM·HAHA复合物峰曲线下面积的积分和标记的-HUMIRATM峰曲线下面积的积分，将得到的标记的-HUMIRATM·HAHA复合物积分除以得到的标记的-HUMIRATM积分，获得[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]/[标记的-HUMIRATM]的比率。[HUMIRATM]/[HUMIRATM·HAHA复合物]的比率等于[标记的-HUMIRATM]/[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]的比率，见方程式XIV。因为HAHA达到平衡，并与HUMIRA和标记的-HUMIRATM二者形成复合物，故HAHA的总含量等于HUMIRATM·HAHA复合物的含量加标记的-HUMIRATM·HAHA复合物含量之和，见方程式XV。由于[HUMIRATM]/[HUMIRATM·HAHA复合物]的比率等于[标记的-HUMIRA]/[标记的-HUMIRATM·HAHA复合物]的比率，通过步骤1测得的[标记的-HUMIRA·HAHA复合物]/[标记的-HUMIRA]比率分别乘以步骤1所测的[HUMIRATM]和先验已知的[标记的-HUMIRATM]，测得[HUMIRATM-HAHA复合物]和[标记的-HUMIRATM-HAHA复合物]的浓度，见方程式XVI和XVII。因为HAHA与HUMIRATM形成复合物，血清样品中可利用的HUMIRATM有效含量是步骤1测得的HUMIRA含量减去步骤2测得的HAHA含量，见方程式XVIII。
计算示例.患者SL03246013，见图25，测得的[HUMIRATM]为16.9μg/ml，见图25。此结果按照步骤1并用方程式X-XII获得。16.9μg/ml等于67.6ng/4μL。因为步骤2采用4μL样品，故分析样品中HUMIRATM总含量为67.6ng。患者SL03246013的[标记的-HUMIRATM·HAHA]复合物/[标记的-HUMIRATM]比率为0.055，见图25。加入样品中的[标记的-HUMIRATM]为37.5ng/100μL。因为步骤2检测采用了100μL标记的-HUMIRATM，故分析样品中标记的HUMIRATM总含量为37.5ng。采用方程式XVI，将HUMIRATM·HAHA复合物的总含量67.6ng乘0.055，等于3.71ng标记的-HUMIRATM·HAHA复合物。采用方程式XVII，将标记-HUMIRATM·HAHA复合物的总含量37.5ng乘0.055，等于2.06ng标记的-HUMIRATM·HAHA复合物。采用方程式XV，HAHA的总含量等于3.71ng加2.06ng之和，等于5.77ng HAHA。4μL样品中存在5.77ng HAHA。[HAHA]为5.77ng/4μL，等于1.44μg/ml。采用方程式XVIII，HUMIRATM的有效量等于步骤1测得的16.99μg/ml HUMIRATM减去步骤2测得的1.44μg/ml HAHA。在此计算示例中，[HUMIRATM]的有效量等于15.46μg/ml。
实施例9：测定HACA或HAHA与REMICADETM、标记的-REMICADETM、HUMIRA或标记的-HUMIRA的复合物的含量.
此实施例描述了参比内部标准，检测HACA或HAHA与REMICADETM、标记的-REMICADETM、HUMIRA或标记的-HUMIRATM形成的复合物含量的方法。
通过利用内部对照，如生物胞素-Alexa488，可鉴定和适当地分析一次实验到另一次实验时的血清人造品和变化。分析的内部对照如生物胞素-Alexa488的含量为约50-约200pg/100μL。
将荧光(F1)-标记的HUMIRATM与患者血清一起孵育形成免疫复合物。各反应包括F1-标记的小肽，如生物胞素-Alexa488作为内部对照。在一种情况下，利用不同含量的抗-人IgG制备标准曲线测定血清HAHA水平。在另一种情况下，用纯化HAHA校准的滴定的混合阳性患者血清制备标准曲线测定血清HAHA水平。在还有一种情况下，采用实施例7所述方法制备标准曲线测定血清HAHA水平。用分子大小排阻层析根据分子量使游离的标记的HUMIRA与抗体结合的复合物分离。利用每份样品游离的标记HUMIRA与内部对照的比率，从标准曲线推断HAHA的浓度。用类似方法测量含标记TNF-α的患者血清中的HAHA水平。
标记的-药物，如标记的-REMICADETM或标记的-HUMIRA与内部对照的初始比率等于100。如图23和24所示，当标记的-药物与内部对照的比率低于95时，推断标记的-药物已与抗-药物结合成分如HACA、HAHA形成了复合物。通过计算标记的-药物和内部对照的曲线下面积的积分，然后将得到的标记的-药物积分除以得到的内部对照积分，获得[标记的-药物]/[内部对照]的比率。
实施例10：检测复合的抗-TNFα药物与未复合的抗-TNFα药物的比率
通过计算复合的抗-TNFα药物与未复合的抗-TNFα药物峰曲线下面积的积分，然后用得到的复合的抗-TNFα药物的积分除以得到的未复合的抗-TNFα药物的积分，获得复合的抗-TNFα药物与未复合的抗-TNFα药物的比率。
在一实施方式中，未复合的抗-TNFα药物是REMICADETM，其在样品中的水平为约0ng-100ng。标记的-REMICADETM含量约37.5ng。
通过利用内部对照如生物胞素-Alexa488，可鉴定和适当地分析一次实验到另一次实验时的血清人造品和变化。分析的内部对照如生物胞素-Alexa488的含量为约50-200pg/100μL。
通过计算标记抗-TNFα药物与标记内部对照的曲线下面积的积分，然后将得到的标记抗-TNFα药物的积分除以得到的标记内部对照积分，获得标记抗-TNFα药物如REMICADETM或HUMIRATM与标记内部对照的比率。
从作为分子大小排阻HPLC洗脱时间的函数的信号强度图像计算(标记的-抗-TNFα药物·自身抗体)复合物峰曲线下面积的积分，将此积分除以该图像内部对照峰曲线下面积的积分，获得[(标记的-抗-TNFα药物·自身抗体)复合物]/[内部对照]的比率。在某些实施方式中，标记的-抗-TNFα药物是标记的REMICADETM。在某些实施方式中，标记的抗体-TNFα药物是标记的HUMIRATM。
实施例11：检测游离的与复合标记TNFα的比率
此实施例描述参比内部标准，检测标记的-TNFα与REMICADETM或HUMIRATM的复合物含量的方法。
通过利用内部对照，如生物胞素-Alexa488，可鉴定和适当地分析一次实验到另一次实验时的血清人造品和变化。分析的内部对照如生物胞素-Alexa488的含量为约1-约25ng/100μL。
在一实施方式中，样品中未复合标记TNFα水平为约50ng-150ng。在某些情况下，标记的-TNFα含量为约100.0ng。
将荧光(F1)-标记TNFα与患者血清一起孵育形成免疫复合物。各反应包括F1-标记的小肽，如生物胞素-Alexa488作为内部对照。通过掺入已知浓度的纯化抗-TNFα药物制备标准曲线，然后从该曲线推断确定浓度，单位为μg/mL。
标记的-TNFα与内部对照的初始比率等于100。当标记的-TNFα与内部对照的比率低于95时，推断标记的-TNFα已与抗-TNFα药物，如RemicadeTM、HumiraTM形成复合物。通过计算标记的-TNFα和内部对照的曲线下面积的积分，然后用得到的标记的-TNFα积分除以得到的内部对照积分，获得[标记的-TNFα]/[内部对照]的比率。
实施例12：通过测量抗-TNFα药物和/或抗-药物抗体(ADA)水平最优化抗-TNFα药物治疗.
此实施例描述了通过测量接受抗-TNFα药物治疗患者血清中的抗-TNFα药物(如游离的抗-TNFα治疗抗体的水平)和/或抗-药物抗体(ADA，如抗-TNFα药物的自身抗体水平)的含量(如浓度水平)，最优化抗-TNFα药物的治疗，减轻抗-TNFα药物治疗的相关毒性，和/或监测用抗-TNFα药物治疗的效果的方法。因此，本实施例所述方法提供的信息可用于指导治疗决策，如通过确定何时或如何调整或修改(例如增加或减少)抗-TNFα药物后续治疗、通过确定抗-TNFα药物(例如增加的、减少的或相同的剂量)何时或如何与一种或多种免疫抑制剂如氨甲喋呤(MTX)或硫唑嘌呤联用、和/或通过确定何时或如何改变目前疗程(如换用不同的抗-TNFα药物)。
只是为了说明，提供以下方案证明本发明方法如何根据接受抗-TNFα药物治疗对象样品中的抗-TNFα药物水平(如游离的抗-TNFα治疗抗体水平)和/或ADA水平(抗-TNFα药物的自身抗体水平)来有利地最优化治疗和最小化或降低毒性(如副作用)。抗-TNFα药物和ADA水平可用本文描述的新颖试验测量。
方案#1：抗-TNFα药物高水平与抗-药物抗体(ADA)低水平
药物水平＝10-50ng/10μl；ADA水平＝0.1-2ng/10μl。这种概况的患者样品包括10次问诊(visit 10)(“V10”)时患者BAB和JAA的样品，见图16b。
接受抗-TNFα药物治疗且具有这种特定概况的患者应该用免疫抑制药物如硫唑嘌呤(AZA)和抗-TNFα药物(如英夫利昔单抗)一起治疗。
方案#2：抗-TNFα药物中等水平与抗-药物抗体(ADA)低水平.
药物水平＝5-20ng/10μl；ADA水平＝0.1-2ng/10μl。这种概况的患者样品包括患者包括V10患者DGO、JAG和JJH的样品。见图16b。
接受抗-TNFα药物治疗具有这种特定概况的患者应该用免疫抑制药物，如硫唑嘌呤(AZA)和高剂量的抗-TNFα药物(如英夫利昔单抗)一起治疗。本领域技术人员知道目前疗程可调整为的合适的较高或较低剂量，从而最优化该药物治疗，如后续剂量高于或低于当前剂量的至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍。
方案#3：抗-TNFα药物中等水平与ADA中等水平
药物水平＝5-20ng/10μl；ADA水平＝0.5-10ng/10μl。这种类型的患者样品包括患者包括10次问诊(“V10”)时患者JMM和14次问诊(“V14”)时患者J-L的样品。见图16b。
接受抗-TNFα药物治疗且具有这种特定概况的患者应该用不同的药物治疗。一个非限制性例子是用英夫利昔单抗(IFX)治疗且IFX和ADA(即HACA)水平中等的患者应换用阿达木单抗(HUMIRATM)治疗。
方案#4：抗-TNFα药物低水平与ADA高水平
药物水平＝0-5ng/10μl；ADA水平＝3.0-50ng/10μl。这种概况的患者样品包括图16中的V14患者。
接受抗-TNFα药物治疗具有这种特定概况的患者应该用不同的药物治疗。一个非限制性例子是用英夫利昔单抗(IFX)治疗且IFX低水平和ADA(即HACA)高水平的患者应换用阿达木单抗(HUMIRATM)治疗。
虽然为了清楚理解，本说明书和实施例较详细的描述了本发明，但本领域技术人员知道可在所附权利要求书的范围内对本发明内容作某种修改和修饰。此外，本文提供的各参考文献通过引用全文纳入本文，如同各个参考文献单独纳入本文作为参考。
Figure IPA00001573237600011

Claims (84)

1.一种测定接受抗-TNFα药物治疗的对象中所述抗-TNFα药物有效量的方法，
所述方法包括：
(a)测量所述对象第一样品中的所述抗-TNFα药物的水平，包括：
(i)使所述第一样品接触一定量的标记TNFα，形成含所述标记的TNFα与所述抗-TNFα药物的第一复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测所述第一复合物，从而检测所述抗-TNFα药物的所述水平；
(b)测定所述对象第二样品中所述抗-TNFα药物的自身抗体的水平，包括：
(i)使第二样品接触一定量的标记抗-TNFα药物，形成含所述标记抗-TNFα药物与所述自身抗体的第二复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测所述第二复合物，从而检测所述自身抗体的所述水平；和
(c)从步骤(a)测得的所述抗-TNFα药物水平中减去步骤(b)测得的所述自身抗体水平，从而确定所述抗-TNFα药物的有效量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)(ii)的检测包括：
(1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度第一图像计算所述标记的TNFα峰曲线下面积的积分；
(2)从所述第一图像计算所述第一复合物峰曲线下面积的积分；
(3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(1)得到的积分确定比率；和
(4)用所述标记的TNFα的所述量乘步骤(3)的所述比率。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)(ii)的检测包括：
(1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度的第二图像计算所述标记抗-TNFα药物峰曲线下面积的积分；
(2)从所述第二图像计算所述第二复合物峰曲线下面积的积分；
(3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(1)得到的积分确定比率；和
(4)用所述标记抗-TNFα药物的所述量乘步骤(3)的所述比率。
4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均是血清样品。
5.如权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)(ii)和/或步骤(b)(ii)的所述检测包括荧光标记检测。
6.一种最优化接受抗-TNFα药物治疗的对象中抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：
(a)按照权利要求1-5任何一项所述的方法测定所述抗-TNFα药物的有效量；
(b)比较所述抗-TNFα药物的该有效量与所述抗-TNFα药物的水平；和
(c)根据步骤(b)的比较，确定所述对象的所述抗-TNFα药物的后续剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(d)当所述抗-TNFα药物的有效量低于所述抗-TNFα药物所述水平时，提高所述抗-TNFα药物的后续剂量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，提高所述抗-TNFα药物的后续剂量，使所述抗-TNFα药物的有效量约等于所述抗-TNFα药物的所述水平。
9.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)和CIMZIA
Figure FPA00001573238100021
(赛妥珠单抗)和其组合。
10.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。
11.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。
12.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。
13.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure FPA00001573238100022
(赛妥珠单抗)。
14.如权利要求1-13任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记的-TNFα是荧光标记的TNFα。
15.如权利要求1-14任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的抗-TNFα药物是定量的。
16.如权利要求1-15任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一复合物先被洗脱，然后是游离的标记TNFα。
17.如权利要求1-16任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二复合物先被洗脱，然后是游离的标记抗-TNFα药物。
18.如权利要求1-17任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
19.如权利要求1-18任何一项所述的方法，其特征在于，所述自身抗体选自下组：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
20.如权利要求1-19任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的自身抗体是定量的。
21.如权利要求1-20任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均获自用所述抗-TNFα药物治疗期间的所述对象。
22.一种在接受抗-TNFα药物治疗的对象中最优化所述抗-TNFα药物的治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括：
(a)测定所述对象第一样品中的所述抗-TNFα药物水平；
(b)测定所述对象第二样品中的所述抗-TNFα药物的自身抗体的水平；和
(c)根据所述抗-TNFα药物和所述自身抗体的水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化所述抗-TNFα药物的治疗和/或减轻其毒性。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFα药物的所述水平高和所述自身抗体的所述水平低时，所述后续疗程包括共同给予免疫抑制药物和抗-TNFα药物。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFα药物的所述水平中等和所述自身抗体的所述水平低时，所述后续疗程包括提高所述抗-TNFα药物的水平和同时给予免疫抑制药物。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFα药物的所述水平中等和所述自身抗体的所述水平中等时，所述后续疗程包括给予不同的抗-TNFα药物。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFα药物的所述水平低和所述自身抗体的所述水平高时，所述后续疗程包括给予不同的抗-TNFα药物。
27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，给予阿达木单抗(HUMIRATM)代替英夫利昔单抗(REMICADETM)。
28.如权利要求22-27任何一项所述的方法，其特征在于，采用以下试验测量所述抗-TNFα药物，所述试验包括：
(i)使所述第一样品与一定量的标记TNFα接触，形成含有所述标记TNFα和所述抗-TNFα药物的第一复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测所述第一复合物，从而测量所述抗-TNFα药物的所述水平。
29.如权利要求22-28任何一项所述的方法，其特征在于，采用以下试验测量所述自身抗体，所述试验包括：
(i)使所述第二样品与一定量的标记抗-TNFα药物接触，形成含有所述标记抗-TNFα药物与所述自身抗体的第二复合物；和
(ii)用分子大小排阻层析检测所述第二复合物，从而测量所述自身抗体的水平。
30.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA(赛妥珠单抗)和其组合。
31.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。
32.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。
33.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。
34.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure FPA00001573238100051
(赛妥珠单抗)。
35.如权利要求22-34任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的抗-TNFα药物是定量的。
36.如权利要求22-35任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的自身抗体是定量的。
37.如权利要求22-36任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均是血清样品。
38.如权利要求22-37任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均获自用所述抗-TNFα药物治疗期间的所述对象。
39.如权利要求22-38任何一项所述的方法，其特征在于，所述自身抗体选自下组：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
40.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制药物选自下组：氨甲喋呤、硫唑嘌呤，其代谢产物和其组合。
41.一种参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFα药物的样品中所述抗-TNFα药物的存在或水平的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照接触所述样品，形成所述标记TNFα与所述抗-TNFα药物的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测所述标记TNFα和所述标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)用所述标记TNFα的量除以所述标记内部对照的量，测得第一比率；
(f)用步骤(c)测得的积分除以步骤(d)测得的积分，测得第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照确定所述抗-TNFα药物的存在或水平。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约80-约100。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约100.
44.如权利要求41-43任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。
45.如权利要求41-44任何一项所述的方法，其特征在于，分析样品中所述标记内部对照为每100μL约1-约25ng。
46.一种在接受抗-TNFα药物治疗的对象中最优化所述抗-TNFα药物治疗剂量的方法，所述方法包括：
根据权利要求41-44任何一项所述方法测得的所述第一比率与第二比率的比较，确定所述对象的所述抗-TNFα药物的后续剂量，从而最优化抗-TNFα药物的治疗剂量。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：当所述第一比率约100∶1和所述第二比率低于约95∶1时，提高抗-TNFα药物的后续剂量，从而最优化所述抗-TNFα药物的治疗剂量。
48.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure FPA00001573238100061
(赛妥珠单抗)和其组合。
49.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。
50.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。
51.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。
52.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是CIMZIA
Figure FPA00001573238100062
(赛妥珠单抗)。
53.如权利要求41-52任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记TNFα是荧光标记的TNFα。
54.如权利要求41-53任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的标记抗-TNFα和标记内部对照是定量的。
55.如权利要求41-54任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合物先被洗脱，然后是游离的标记TNFα。
56.如权利要求41-55任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。
57.如权利要求41-56任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品获自接受所述抗-TNFα药物治疗期间的对象。
58.如权利要求41-57任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
59.一种参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中所述抗-TNFα药物自身抗体的存在和水平的方法，所述方法包括：
(a)使一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对照与所述样品接触，形成所述标记抗-TNFα药物与所述自身抗体的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测所述标记抗-TNFα药物和所述标记内部对照；
(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记TNFα峰曲线下面积的积分；
(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记内部对照峰曲线下面积的积分；
(e)将所述标记抗-TNFα药物的含量除以所述标记内部对照的含量，测得第一比率；
(f)除以步骤(c)和步骤(d)得到的积分，测得第二比率；和
(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照测定所述自身抗体的存在或水平。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约80-约100。
61.如权利要求59-61任何一项所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约100.
62.如权利要求59-61任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。
63.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，分析样品中所述标记内部对照为每100μL约50-约200pg。
64.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure FPA00001573238100081
(赛妥珠单抗)和其组合。
65.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADETM)。
66.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRATM)。
67.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBRELTM)。
68.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是CIMZIA(赛妥珠单抗)。
69.如权利要求59-68任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的标记抗-TNFα药物和标记内部对照是定量的。
70.如权利要求59-69任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合物先被洗脱，然后是游离的标记抗-TNFα药物。
71.如权利要求59-70任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。
72.如权利要求59-71任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品获自接受所述抗-TNFα药物治疗期间的对象。
73.如权利要求59-72任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
74.如权利要求59-73任何一项所述的方法，其特征在于，所述自身抗体选自下组：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
75.一种检测样品中抗-TNFα药物的存在或水平和抗-TNFα药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)含一定量的标记TNFα的第一检测底物；
(b)含一定量的标记抗-TNFα药物的第二检测底物；
(c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFα和一定量的标记内部对照；
(d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对照；
(e)任选的用于提取对象样品的工具；和
(f)任选的使用该试剂盒的说明书小册。
76.如权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测所述标记TNFα、所述标记抗-TNFα药物和/或所述标记内部对照所用的手段。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，所述检测手段包括：荧光标记检测、UV-幅射光检测或放射性碘暴光检测。
78.如权利要求75-77所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)仪器。
79.如权利要求75-78所述的试剂盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四检测底物选自下组：硝化纤维素、硅胶和分子大小排阻层析的介质。
80.如权利要求75-79所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组：REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、CIMZIA
Figure FPA00001573238100091
(赛妥珠单抗)和其组合。
81.如权利要求75-80任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记TNFα是荧光标记的TNFα。
82.如权利要求75-81任何一项所述的试剂盒，其特征在于，所述样品是血清。
83.如权利要求75-82所述的试剂盒，其特征在于，所述样品获自接受所述抗-TNFα药物治疗期间的对象。
84.如权利要求75-83所述的试剂盒，其特征在于，所述自身抗体选自下组：人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
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