CN102690762B - 游离细胞法生物转化l-天冬氨酸生产l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法，利用自主筛选的高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-Aspartate-β-decarboxylase,EC4.1.1.12,ASD或ADL)的睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni)HY-08D来生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。可以提高L-丙氨酸的生产效率，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及L-丙氨酸的生产方法，尤其是涉及一种游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸，又名L-α-氨基丙酸(L-Alanine，L-Ala)。L-丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的21种氨基酸之一，是生命体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一。分子式为C3H7NO2，分子量89.09，其结构如下：
L-丙氨酸结构式
L-丙氨酸产品外观为白色结晶性粉末，无臭，有甜味，溶于水,微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙醇，200℃以上开始升华，熔点297℃(分解),比重1.401，5%水溶液的pH值5.5-7.0。
近年来，随着研究和开发的不断深入，L-丙氨酸在医药、食品及化工等行业得到广泛应用。
L-丙氨酸在食品工业的应用：
L-丙氨酸是食品中广泛使用的一种氨基酸类添加剂。L-丙氨酸可提高食品的营养价值，常作为营养强化剂。在各类食品饮料中加入丙氨酸可明显提高食品饮料中蛋白质的利用率，并且由于丙氨酸具有能被细胞直接吸收的特点，因此饮用后能迅速消除疲劳、振奋精神。
L-丙氨酸是一种性能良好的食品添加剂，能够提高甜度，使甜度增效，甜味柔和如同天然甜味剂。L-丙氨酸其甜味为蔗糖的1.2倍，可增强化学调味品的调味效果，改善人工甜味剂味感和有机酸的酸味，使其更接近自然味道，用于醇类饮料可使其味道醇厚，减少酵母气味。同时也可用作咸菜的腌汁和甜酱菜腌汁的添加剂。特别是与谷氨酸钠复合成混合调味品,可调制并明显改善食品风味,提供甜味,而不破坏食物保持原有的风格。
L-丙氨酸产品主要用于食品添加剂工业，而且需求量相当大。主要生产公司有美国Ajinomot及Sigma-Aidrich、日本的Musashino及Takeda、德国的Degrssa A G等。
L-丙氨酸是是合成(Alitame，L-天门冬酰-D-丙氨酰胺)的主要原料，是L-丙氨酸最重要的应用领域之一。当今世界市场上合成甜味剂中，以阿斯巴甜功效尤为突出。而以L-丙氨酸取代L-苯丙氨酸与天门冬氨酸合成新的二肽甜味剂阿力甜，其甜度是蔗糖的2000倍，较阿斯巴甜甜度又提高了许多倍。目前已在美国、欧洲、澳大利亚、新西兰以及中国等国家和地区获准使用，美国菲特公司已完成FDA要求的对实验鼠的肿瘤学试验,结果表明不产生肿瘤。
L-丙氨酸在医药上的应用：
L-丙氨酸在医药上用途广泛，是维生素B6和氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）的重要中间体，是各种氨基酸制剂的主要成分，用于生化试剂、组织培养基的制备、肝功能的测定等方面。同时L-丙氨酸也是营养剂补糖氨基酸营养输液的组成成分之一，其中复合氨基酸注射液214、氨基酸注射液2300是治疗肝病的新药，可治疗肝功能不全引起的氨基酸代谢紊乱，使肝昏迷病人苏醒，并且是一种良好的利尿药，也可以用它来制造抗癌药物。L-丙氨酸也是血液保存剂的主要成分，可提高血液保存期，防止老化。另外，L-丙氨酸在治疗如肝病引起的蛋白质合成紊乱、糖尿病、急慢性肾功能衰竭以及对维持危急病人的营养、抢救患者的生命，合成抗癌药物等方面起到了积极作用。
L-丙氨酸在其他领域的应用：
除此以外，L-丙氨酸在其它领域也有较广阔的应用前景。如以L-丙氨酸为原料合成的泛酸钙在医药、食品及饲料行业都有较广阔的应用。泛酸钙在饲料工业中用作饲料开口诱食剂，全世界总需求量已达10kt/a以上，而国内饲料级产品的生产尚属空白，开发前景十分可观。另外，L-丙氨酸还可用于生产除草剂，以及作为化妆品的添加剂。
L-丙氨酸的生产技术：
L-丙氨酸的生产技术经历了由蛋白水解提取法、发酵法到酶法转化（包括固定化细胞法和游离细胞法）的过程。
（1）蛋白水解提取法
蛋白水解提取法是最早发展起来的，是用蛋白质或以含有蛋白质的物料为原料，经酸、碱、或酶水解以后提取分离及结晶制备L-丙氨酸的方法。蛋白水解提取法的优点是原料来源丰富，投产比较容易，但产量低，副产物多，提取工艺复杂，成本高，三废较严重，难以达到工业化生产的目的，目前已不采用。
（2）发酵法
L-丙氨酸发酵法是以糖类物质为基础原料，通过微生物细胞的新陈代谢来积累产物，再经过适当的提取工艺而制成。微生物发酵法产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副反应，分离较复杂，且技术风险大，因而不适用于L-丙氨酸的大规模生产。
（3）酶法
酶法生产L-丙氨酸是现在工业化生产普遍采用的方法，原理是利用微生物培养产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，催化L-天冬氨酸脱羧反应生成L-丙氨酸。如下图：
L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-Aspartate-β-decarboxylase,EC 4.1.1.12,ASD或ADL)是一种氨基酸脱羧酶，它能催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。自从Mardashev和G1ad kova于1948年首次报道在假单胞菌属中存在该酶后，在许多微生物中，如德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae，、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、醋酸杆菌(Acetobacter sp．)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、桔青霉(Penicillium cithnum)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)中都发现此酶。此外，在无脊椎动物如蚕、小龙虾、龙虾及哺乳动物的大脑、肾脏、肝脏中也都大量存在该酶，其辅因子是5-磷酸吡哆醛，以还原型连接到酶上。L-天冬氨酸-β-脱羧酶的底物专一性不强，可对L-谷氨酸、富马酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、菸酸、叶酸、维生素C、甲酸、乙酸、丙烯酸、氨基苯磺酸、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐等多种有机酸及酸酐脱羧。该酶作用的温度范围37℃-60℃，pH 4.0-6.0。
酶法生产的具体做法有固定化细胞法和游离细胞法两种，即利用假单胞菌作为生物催化剂，采用固定化或游离细胞悬液酶解L-天冬氨酸，副产物为二氧化碳。固定化细胞法可采用卡拉胶(K-角叉聚糖胶)、聚尿烷、丝胶蛋白与戊二醛交联等将菌体细胞固定作为固体催化剂转化L-天冬氨酸为L-丙氨酸。日本早在70年代开始研究固定化细胞法生产L-丙氨酸，并在1982年将该方法工业化。固定化细胞法生产L-丙氨酸的最大优势就在于可以连续化和重复化生产。
游离细胞法是将微生物发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸实现酶法转化，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥等得到成品L-丙氨酸。1965年，日本的Chibata等测试许多微生物转化L-天冬氨酸形成L-丙氨酸的能力，发现德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)是最优良的菌株。该菌在含有富马酸铵、富马酸钠、玉米浆、蛋白胨、无机盐的培养基中在30℃下摇床培养，产生的酶活高达3.91mL CO2／h·mL。直接以培养液作酶源，100mL反应体系中加入40g固体L-天冬氨酸，在37℃下静止转化72h，L-天冬氨酸能完全转化生成L-丙氨酸。在反应混合物中添加表面活性剂能有效缩短转化时间。离子交换纯化后洗脱液中L-丙氨酸得率超过90％。通过不断研究提高转化率的方法，1979年Chibata等用同样菌种将100g L-天冬氨酸转化成66g L-丙氨酸，摩尔转化率为99％。
固定化法与游离整体细胞法生产L-丙氨酸各有优缺点，故到目前为止，游离细胞法仍显示较大的优越性。游离细胞法的生产成本低于固定化细胞法，并且设备装置要求低、投资小、生产过程简单、反应温和、易于操作控制、收率和产品纯度高，是近年来主要的研究开发热点。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种通过游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法。
本发明主要是利用一种自主筛选的高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-Aspartate-β-decarboxylase,EC 4.1.1.12,ASD或ADL)的睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni)HY-08D来生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸，转化力可达390%以上（W/V）。
本发明自主筛选的睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）HY-08D已于2012年5月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.6083。
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D经活化培养后，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活高，酶活一般可达到2.8×104U/mL~3.5×104U/mL。用于游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸，可以提高L-丙氨酸的生产效率，降低生产成本。
本发明进一步提供一种游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法，将所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸，转化培养，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。
具体步骤为：
（1）活化睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株并发酵培养得到发酵种子液；
（2）将发酵种子液接入发酵罐中，在50-150rpm，通气量10-50m3/h条件下发酵培养16-35h，获得游离细胞培养液；
（3）直接向游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，转化培养，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。
睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株的活化培养可采用本领域常用的技术手段，将其培养至对数生长期即可。通常情况下采用透气摇瓶培养得到适量的种子培养液。如果需要大规模发酵培养，可将其再进行二级种子培养，得到菌活高、数量大的二级种子培养液，再转入发酵培养基中，进行发酵培养。发酵培养优选在可控pH、可控温度、可控转速和通气量的发酵容器中进行，优选容积为5-50L的发酵罐。种子培养基和发酵培养基均含有足够睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株生长所需的碳源、氮源以及微量元素。睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株生长的最适温度在25~37℃±1℃。
一些典型的培养基的成分如下：
活化斜面培养基(g/L)：谷氨酸钠8.0~12.0，蛋白胨6.0~10.0，氯化钠3.0~7.0，硫酸镁0.8~1.2，磷酸二氢钾0.3~0.7，酵母膏3.0~7.0，牛肉膏3.0~7.0，琼脂20.0，调节pH7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/L)：谷氨酸钠13.0~17.0，蛋白胨8.0~12.0，玉米浆干粉3.0~7.0、氢氧化钠4.0~8.0，七水硫酸镁0.10~0.35、磷酸氢二钾0.08~0.15，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨9.0~15.0，玉米浆干粉2.0~5.0，谷氨酸钠10.0~15.0，氢氧化钠6.0，七水硫酸镁0.10~0.35，磷酸氢二钾0.08~0.15，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
微生物保藏信息
微生物分类命名：睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）
保藏编号：CGMCC No.6083；
保藏日期：2012年5月7日；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例1：
培养基
活化斜面培养基(g/L)：谷氨酸钠10.0，蛋白胨8.0，氯化钠5.0，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾0.5，酵母膏5.0，牛肉膏4.0，琼脂20.0，调节pH7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/L)：谷氨酸钠15.0，蛋白胨10.0，玉米浆干粉5.0、氢氧化钠6.0，七水硫酸镁0.25、磷酸氢二钾0.12，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨12.0，玉米浆干粉4.0，谷氨酸钠12.0，氢氧化钠6.0，七水硫酸镁0.30，磷酸氢二钾0.12，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
取睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D斜面菌种一环接到斜面培养基上，35℃±1℃培养18h，再取菌种一环接到150mL摇瓶培养基（接种若干瓶），150rpm，28℃培养18h。合并各瓶培养液，得到2L-10L种子培养液，接种到2吨发酵罐中，28℃，150rpm，通气量30m3/h培养24h，获得具有高L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的游离细胞培养液1.7吨，L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力3.15×104U/mL。以此培养液生物转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，96h转化L-天冬氨酸6.63吨。转化力达390%（W/V）。
实施例2
培养基
活化斜面培养基(g/L)：谷氨酸钠12.0，蛋白胨10.0，氯化钠7.0，硫酸镁1.2，磷酸二氢钾0.7，酵母膏7.0，牛肉膏3.0，琼脂20.0，调节pH7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/L)：谷氨酸钠17.0，蛋白胨12.0，玉米浆干粉7.0、氢氧化钠8.0，七水硫酸镁0.35、磷酸氢二钾0.08，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨15.0，玉米浆干粉5.0，谷氨酸钠15.0，氢氧化钠6.0，七水硫酸镁0.10，磷酸氢二钾0.15，用氢氧化钠溶液调pH至7.0。
取睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D斜面菌种一环接到斜面培养基上，25℃±1℃培养40h，再取菌种一环接到150mL摇瓶培养基（接种若干瓶），100rpm，32℃培养36h。合并各瓶培养液，得到4L-20L种子培养液，接种到4吨发酵罐中，32℃，100rpm，通气量50m3/h培养35h，获得具有高L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的游离细胞培养液3.4吨，L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力3.5×104U/mL。以此培养液生物转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，96h转化L-天冬氨酸13.26吨。转化力达410%（W/V）。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一株睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）HY-08D，保藏编号为：CGMCCNo.6083。
2.权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D用于游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
3.一种游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法，其特征在于：将权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸，转化培养，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）活化睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株并发酵培养得到发酵种子液；
（2）将发酵种子液接入发酵罐中，在50-150rpm，通气量10-50m3/h条件下发酵培养16-35h，获得游离细胞培养液；
（3）直接向游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，转化培养，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。
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