CN102680415A - 一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法，利用草酰乙酸与固紫B结合形成红色沉淀物质，加入有机溶剂溶解沉淀后，520nm比色法测定吸光值，根据标准曲线计算样品中草酰乙酸的含量。本发明用草酰乙酸的直接显色反应替换常规方法中的酶联显色，使测定过程更加简便，实用，检测成本也更加低廉。

Description

一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种草酰乙酸的测定方法，属于有机酸代谢物生物化学检测领域。

背景技术

草酰乙酸是三羧酸循环中间体之一，也是生物代谢中的一个重要物质。在体内是以羧酸根离子的形式存在。草酰乙酸在生物体的碳、氮代谢起着重要的作用。草酰乙酸可以发生α转氨基作用，形成天冬氨酸，并进一步合成多种氨基酸，从而参与氮代谢；草酰乙酸与乙酰辅酶A缩合，形成柠檬酸，这是三羧酸循环中的关键反应之一，也是启动循环的一步，是碳代谢的主要中间物质；另外，草酰乙酸还参与糖异生作用；参与三羧酸循环的碳回补作用等等。总之，草酰乙酸在生物体的碳氮代谢和能量代谢过程中起着不可缺少的作用。测定草酰乙酸的含量对于理解细胞内的碳氮代谢过程具有重要的意义。

目前，草酰乙酸的测定主要有两类方法：一类是高效液相色谱法(见分析化学，2005，33：527-530)，该方法测定精度高，检测限低，但是液相色谱仪比较昂贵，多数实验室没有该设备；另一类就是基于酶偶联比色测定的方法：其中一种方法是将草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下形成苹果酸，这一过程需要NADH作为辅酶，形成NAD，而NADH在340nm具有特异的吸收峰，通过测定NADH的量，可以计算草酰乙酸的含量(见Arch Biochemistry Biophysics1976，175：39-53)。另一种方法就是将草酰乙酸在草酰乙酸脱羧酶作用下，形成丙酮酸，然后利用丙酮酸的酶联测定方法测定丙酮酸的含量(见Clinical Biochemistry 2006，39：74-77)，从而推算草酰乙酸的含量。即用丙酮酸氧化酶将丙酮酸氧化形成过氧化氢，再利用过氧化物酶将过氧化氢转化为氧气和水，在这一过程中加入一特异的电子受体，被氧化后形成粉红色物质，570nm比色法或用荧光(Ex/Em＝535/587)检测方法可以测定草酰乙酸的含量。利用酶法偶联就需要购买较昂贵的生化酶和相应的底物，而且测定步骤较多。目前，缺乏快速准确地测定组织、器官中草酰乙酸的含量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种宽范围、成本低、便于普及的测定生物组织和器官中草酰乙酸含量的方法。

本发明是通过如下步骤实现的：草酰乙酸与固紫B(Fast Violet B)直接反应形成一种稳定的红色的微溶于水的物质。反应一定时间后，加入有机溶剂，充分溶解红色的物质。然后利用分光光度计直接测定以上混合物在520nm的吸光值，根据草酰乙酸标准样品制作的标准曲线即可得到未知样品草酰乙酸的浓度。

用于溶解草酰乙酸和固紫B反应生成的红色物质的有机溶剂可以是乙醇、丙酮或甲醇中的一种。

固紫B用去离子水直接溶解，现配现用。浓度范围为2-50mg/mL，样品草酰乙酸含量高时使用低浓度固紫B，样品草酰乙酸含量低时使用高浓度固紫B；制作标准曲线和样品测定须使用同样浓度的固紫B。

本发明利用草酰乙酸的直接显色方法替代常规生化方法中需要其他酶进行偶联再比色的方法来测定草酰乙酸的含量。测量的步骤更加简便，测定更加迅速，在25分钟就可以完成测定，所需的设备也比较简单，所需的药品种类少，测定成本低。

附图说明

图1本发明提供的方法利用草酰乙酸标准样品测定的低浓度范围标准曲线

图2本发明提供的方法利用草酰乙酸标准样品测定的高浓度范围标准曲线

具体实施方式

以下结合具体实例进一步说明本发明。

实施例一 低浓度草酰乙酸标准曲线的制作

称取0.132克草酰乙酸，用50mL去离子水溶解，定容至1000mL，得到1mM的草酰乙酸母液。按照表1配制标准曲线制作所需的各种浓度的草酰乙酸样品。

表1 低浓度草酰乙酸标准曲线制作(100-1000uM)

取1-7号草酰乙酸标准样品200μL，加入200μL的50mg/mL固紫B溶液；30℃保温10分钟后，加入无水乙醇1600μL，混匀后静置5分钟。分光光度计测定各样品在520nm处的吸光值。绘制出如图1所示的低浓度草酰乙酸标准曲线。

实施例二 高浓度草酰乙酸标准曲线的制作

称取0.132克草酰乙酸，用10mL去离子水溶解，得到100mM的草酰乙酸母液。按照表2配制标准曲线制作所需的各种浓度的草酰乙酸样品。

表2 高浓度草酰乙酸标准曲线制作(10-100mM)

取1-7号草酰乙酸标准样品200μL，加入200μL的10mg/mL固紫B溶液中，30℃保温10分钟，加入无水乙醇1600μL，混匀后静置5分钟。分光光度计测定各样品在520nm处的吸光值。绘制出如图2所示的标准曲线。

实施例三 植物叶片草酰乙酸含量测定

植物叶片用液氮速冻后充分研磨成粉末，加入5％(体积比)的高氯酸，充分匀浆；然后再60℃温育5分钟，4℃，10,000g离心10分钟；上清液用K2CO3中和，使pH值为6-7。取提取液200μL加入等体积的20mg/mL固紫B溶液中，30℃保温10分钟，加入无水乙醇1600μL，混匀后静置5分钟。分光光度计测定红色反应产物在520nm处的吸光值，根据标准曲线即可测得样品中草酰乙酸的浓度。根据植物叶片组织的鲜重可进一步计算单位鲜重的草酰乙酸含量。

Claims (4)

1.一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法，其特征在于：草酰乙酸与固紫B反应形成稳定的红色沉淀，加入有机溶剂，充分溶解沉淀物，测定溶液在520纳米的吸光值，根据草酰乙酸标准样品制作的标准曲线即可得到样品草酰乙酸的浓度。

2.如权利要求1所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的有机溶剂指乙醇、丙酮或甲醇中的一种。

3.如权利要求1所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述标准曲线包含低浓度范围和高浓度范围两种，分别为0-1mM和10-100mM。

4.如权利要求1所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的固紫B的浓度范围为2-50mg/mL。

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