CN101464332A - 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、谷胱甘肽二硫、D－GALACTO－HEXODIALDOSE、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护细胞膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免疫功能，可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法：如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)鉴定硒化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用硒依赖性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下：
谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢
过氧化氢+D-galacto-hexodialdose 半乳糖氧化酶 半乳糖
+氧
半乳糖+辅酶 半乳糖脱氢酶 D-半乳糖酸内酯+
还原型辅酶
这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase；EC1.11.1.9)酶(偶)联半乳糖氧化酶(galactose oxidase；EC1.1.3.9)、半乳糖脱氢酶(galactose dehydrogenases；EC1.1.1.120；EC1.1.1.48)酶促反应速率比色法/终点法。谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算硒的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
半乳糖脱氢酶 12000U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8mmol/L
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶。
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE。
试剂2
缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定硒浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
半乳糖脱氢酶 12000U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
半乳糖脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
半乳糖脱氢酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定硒浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0010；吸光度时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达0.5mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±7％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.064±0.032ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
Claims (6)
1.一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法的硒的浓度测定方法，其方法原理如下：
谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢
过氧化氢+D-galacto-hexodialdose 半乳糖氧化酶 半乳糖
+氧
半乳糖+辅酶 半乳糖脱氢酶 D-半乳糖酸内酯+
还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出硒的浓度大小测定结果。
2.一种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——4000mmol/L
辅酶 1——6mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 1000——80000U/L
半乳糖氧化酶 1000——80000U/L
半乳糖脱氢酶 1000——80000U/L
谷胱甘肽二硫 1——50mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CN102590109A (zh) * | 2012-01-13 | 2012-07-18 | 南京农业大学 | 一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法 |
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2007
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