CN102676494B - 核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发公开了一种核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法。所述的固定化酶颗粒平均粒径为50微米，其核材为正十六烷，壳材为氧化钛纳米颗粒，每克氧化钛纳米颗粒含酸脱氢酶量或含过氧化氢酶量为30~180毫克，该氧化钛纳米颗粒平均粒径为80纳米。其制备过程包括以含酶的精氨酸为催化剂，多巴为终止剂，协同作用下催化钛的前驱体形成含酶的氧化钛纳米颗粒，将含酶纳米颗粒分散于油水乳化液中乳化并老化一定时间制得核壳结构固定化酶颗粒。本发明优点在于该核壳固定化酶颗粒酶催化活性高，易回收，酶活回收率高，稳定性好，适用范围广。其制备方法过程简单。

Description

核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法，属于固定化酶技术。 

背景技术

酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但游离酶稳定性差、在受热、酸、碱和有机溶剂等条件下易失活、无法重复使用，并且底物产品通常想成均相混合物，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。而固定化酶技术是目前提高酶使用效率和实现操作连续化最有效的手段之一。 

纳米材料由于其结构的特殊性，表现出一些特殊的理化特性和生物学特性，被广泛的应用于生命科学的需要领域，如固定化酶、蛋白质分离、药物载体、生物传感器等。用纳米材料作为固定化酶载体，较传统的而言，具有如下优点：良好的生物相容性；较大的比表面积，能有效地提高载酶量；较小的颗粒直径，具很小的扩散限制，在溶液中易分散。纳米材料作为新型固定化酶载体已经成功应用于多种酶的固定化。 

然而，众所周知，随着纳米材料尺寸的之间减小，其回收问题将愈显的明显。目前多采用离心（过滤）、磁性分离和包埋法，然而离心法所需转速通常很高，要在10000r/min以上；磁性分离虽然能节省能源，但目前材料仅局限在铁系，难以扩展固定化酶载体的材料；将纳米颗粒包埋于微米或毫米尺度的载体中虽容易实现回收，但底物产物在载体中的传质阻力明显增加，进而极大的降低了催化活性。因此，开发一种简便、有效地方法制备具高活性、易回收的固定化酶颗粒具有重要意义和应用价值。 

发明内容

本发明目的在于提供一种核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法，该固定化酶颗粒酶催化活性高，易回收，酶活回收率高，稳定性好，适用范围广。其制备方法过程简单。 

本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种核壳结构固定化酶颗粒，其特征在于，该固定化酶颗粒平均粒径为50微米，其核材为正十六烷（油相），壳材为氧化钛纳米颗粒，每克氧化钛纳米颗粒含酸脱氢酶量或含过氧化氢酶量为30~180毫克，该氧化钛纳米颗粒平均粒径为80纳米。 

上述固定化酶颗粒的制备方法，其特征在于包括以下特征： 

（1）   将精氨酸溶于50mM、pH6.8~7.0的tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为300mM的精氨酸溶液；配制浓度为50 mM的钛的前驱体（titanium (IV) bis(ammonium lactato) dihydroxide）水溶液；将多巴溶于50mM、pH7.0~7.5的tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为2.5mg/ml的多巴溶液，将酸脱氢酶或过氧化氢酶加入到精氨酸溶液中，使得酸脱氢酶或过氧化氢酶浓度维持在0.5mg/ml，然后按体积比1:2将钛前驱体溶液迅速加入到含酸脱氢酶或含过氧化氢酶的精氨酸溶液中，于1500rpm转速下搅拌1min，再向反应液中加入与钛前驱体溶液等体积的多巴溶液，继续搅拌10min。然后在转速为10000r/min下离心分离，离心后用去离子水洗，重复离心-水洗过程，至上清液不含精氨酸，得到含酶纳米颗粒；

（2）   将正十六烷与钛酸丁酯按体积比（10~50）:1混合均匀，按体积比40:1将50mM、pH6.8~7.0的tris-HCl缓冲液迅速加入到正十六烷-钛酸丁酯混合液中，得油水混合液，随后按照油水混合液与含酶纳米颗粒质量比2500:1将油水混合液与含酶纳米颗粒混合，乳化60s，继续搅拌60~120min，得到核壳结构固定化酶颗粒。

本发明提出的制备方法的优点在于：制备方法简便可控，条件温和，避免了极端pH对生物分子结构的破坏，该核壳结构固定化酶颗粒因维持原纳米颗粒的高分散性以及纳米颗粒独有特性，而表现出高的活性，同时油水密度差异使得该固定化酶颗粒回收非常容易，酶活回收率高，稳定性好。 

附图说明

图1为实施例1制备的核壳结构固定化酶颗粒的光学显微镜照片照片。 

图2为实施例2制备的核壳结构固定化酶颗粒的光学显微镜照片照片。 

图3为实施例3制备的核壳结构固定化酶颗粒的光学显微镜照片照片。 

图4为对比例1制备的含酶纳米颗粒的透射电镜（TEM）照片。 

具体实施方式

实施例一 

准确称取522mg精氨酸粉末溶解于去离子水中，并用去离子水定容至10mL，得到300mM精氨酸溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH为6.8~7.0。取1mL，2M的钛前驱体溶液（titanium (IV) bis(ammonium lactato) dihydroxide，从Sigma-Aldrich公司购得），用去离子水稀释，定容至40mL，得到50mM的钛的前驱体溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH为6.8~7.0。准确称取40mg 3-（3，4-二羟基苯）-L-丙氨酸（多巴）溶于去离子水中，配成浓度为2.5 mg/mL的多巴溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH值7.0~7.5；将0.5mg酸脱氢酶，加入到1ml精氨酸溶液中，然后将0.5ml钛前驱体迅速加入到上述1ml含酶的精氨酸溶液中，室温下在转速1500r/min下混合搅拌1.0min，向其中加入0.5mL多巴溶液，继续反应30min，在转速为10000r/min下离心分离，去除上清液，用去离子水洗涤离心分离，至上清液不含多巴及精氨酸。冷冻干燥，得到直径约80nm的含酶纳米颗粒。将125μl正十六烷与1.25μl钛酸丁酯混合均匀，迅速加入到5ml、50mM的tris-HCl缓冲液中，同时向其中加入2mg含酶纳米颗粒，乳化60s，然后利用试管摇床缓慢摇60min，得到核壳结构固定化酶颗粒。

实施例二 

本实施例与实施例一步骤基本相同，与其不同之处在于：钛酸丁酯的用量由1.25μl改变为3.75μl；向油水混合物中加入含酶颗粒并乳化60s后，缓慢摇动时间由60min改变为120min。

实施例三 

本实施例与实施例一步骤基本相同，与其不同之处在于：钛酸丁酯的用量由1.25μl改变为6.25μl；向油水混合物中加入含酶颗粒并乳化60s后，缓慢摇动时间由60min改变为120min。

实施例四

本实施例与实施例一步骤基本相同，与其不同之处在于：加入到精氨酸溶液中的酸脱氢酶改变为过氧化氢酶。

对比案例1 

准确称取522mg精氨酸粉末溶解于去离子水中，并用去离子水定容至10mL，得到300mM精氨酸溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH为6.8~7.0。取1mL，2M的钛前驱体溶液（titanium (IV) bis(ammonium lactato) dihydroxide，从Sigma-Aldrich公司购得），用去离子水稀释，定容至40mL，得到50mM的钛的前驱体溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH为6.8~7.0。准确称取40mg 3-（3，4-二羟基苯）-L-丙氨酸（多巴）溶于去离子水中，配成浓度为2.5 mg/mL的多巴溶液，用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH值7.0~7.5；将0.5mg酸脱氢酶，加入到1ml精氨酸溶液中，然后将0.5ml钛前驱体迅速加入到上述1ml含酶的精氨酸溶液中，室温下在转速1500r/min下混合搅拌1.0min，向其中加入0.5mL多巴溶液，继续反应30min，在转速为10000r/min下离心分离，去除上清液，用去离子水洗涤离心分离，至上清液不含多巴及精氨酸。冷冻干燥，得到直径约80nm的含酶纳米颗粒。

Claims (1)

1.一种核壳结构固定化酶颗粒制备方法，所述的核壳结构固定化酶颗粒，平均粒径为50微米，其核材为正十六烷，壳材为氧化钛纳米颗粒，每克氧化钛纳米颗粒含酸脱氢酶量或含过氧化氢酶量为30~180毫克，该氧化钛纳米颗粒平均粒径为80纳米，其特征在于包括以下特征：

(1) 将精氨酸溶于50mM、pH6.8~7.0的tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为300mM的精氨酸溶液；配制浓度为50 mM的钛的前驱体水溶液；将多巴溶于50mM、pH7.0~7.5的tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为2.5mg/ml的多巴溶液，将酸脱氢酶或过氧化氢酶加入到精氨酸溶液中，使得酸脱氢酶或过氧化氢酶浓度维持在0.5mg/ml，然后按体积比1:2将钛前驱体溶液迅速加入到含酸脱氢酶或含过氧化氢酶的精氨酸溶液中，于1500rpm转速下搅拌1min，再向反应液中加入与钛前驱体溶液等体积的多巴溶液，继续搅拌10min，然后在转速为10000r/min下离心分离，离心后用去离子水洗，重复离心-水洗过程，至上清液不含精氨酸，得到含酶纳米颗粒；

(2) 将正十六烷与钛酸丁酯按体积比（10~50）:1混合均匀，按体积比40:1将50mM、pH6.8~7.0的tris-HCl缓冲液迅速加入到正十六烷-钛酸丁酯混合液中，得油水混合液，随后按照油水混合液与含酶纳米颗粒质量比2500:1将油水混合液与含酶纳米颗粒混合，乳化60s，继续搅拌60~120min，得到核壳结构固定化酶颗粒。

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