CN102636467B - 基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法。本发明在石墨烯表面的磷脂分子中混合一种磷脂末端交联荧光基团fluorescein的磷脂衍生分子FL-DHPE，利用磷脂分子的两性结构，通过非共轭交联，包覆在石墨烯表面，构建出一种水溶性石墨烯复合纳米材料，并根据荧光能量转移原理，借助石墨烯的荧光淬灭性能，利用磷脂分子是磷脂酶水解底物的特征，实现了磷脂酶的定量检测，检测过程只需一步，操作简便、反应快速，成本低廉，且灵敏度高于传统方法成百上千倍，对于进一步掌控磷脂酶相关的生物体重要生命活动如细胞增殖，细胞信号传导，细胞分化以及炎症、肿瘤疾病等有着巨大的推动作用。

Description

基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法

技术领域

本发明属于一种定量检测磷脂酶的生物传感方法，具体是指，通过磷脂非共轭自组装在石墨烯表面形成双层磷脂膜包覆的水溶性石墨烯复合纳米材料，再利用磷脂酶水解修饰在石墨烯表面覆盖的磷脂后，从而引发磷脂末端的荧光基团衍生物远离石墨烯产生荧光信号增强。

背景技术

石墨烯是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，只有一个碳原子厚度的二维材料，基于其优异的光学、电学性能，近年来被科学家们研究应用于生命科学领域，但是由于石墨烯本身的超疏水结构，其在水溶液中的不溶性大大制约了石墨烯在众多重要生物学方向的应用前景。

磷脂酶是一类重要的跨膜信号转导酶，其催化磷脂水解生成的产物作为重要的脂类信号分子参与脂类新陈代谢，形成复杂的信号转导网络。因此，磷脂酶活性检测对于掌控生物体许多重要生命活动如细胞增殖，细胞信号传导，细胞分化以及炎症、肿瘤疾病等有着不可忽视的重要作用。传统的检测方法有荧光底物法、比色法、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)，磷同位素31核磁共振法(³¹P NMR spectroscopy)以及电化学方法，这些方法均灵敏度偏低，且需要繁琐的步骤或者昂贵的仪器。

发明内容

本发明旨在针对现有技术存在的不足，提出一种基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法，包括如下步骤：

(1)制备含有末端标记荧光素基团的FL-DHPE的磷脂双层脂质体；

(2)将步骤(1)制备的磷脂双层脂质体与石墨烯在超声下合成为磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料；

(3)将步骤(2)合成的石墨烯复合纳米材料与待测磷脂酶反应，通过荧光检测途径定量检测磷脂酶活性。

其中，步骤(1)所述的制备含有末端标记荧光素基团的FL-DHPE的磷脂双层脂质体是将乙醇胺末端交联上荧光素基团的荧光磷脂分子FL-DHPE和DPPC通过薄膜分散法制得磷脂双层脂质体。

其中，所述磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料中，FL-DHPE末端标记的荧光素基团与石墨烯表面的距离为2～3nm。

本发明的生物传感方法中利用磷脂分子自组装形成的脂质体与一定量的石墨烯通过超声步骤，形成双层磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料，合成方法简易，材料水溶液分散性好、稳定性佳，且在不影响石墨烯这种新型材料优异光学、电学性能的前提下完美解决石墨烯的水溶液分散性问题。在普通磷脂分子中加上一种荧光基团标记磷脂衍生分子，混合自组装在石墨烯表面，借助了石墨烯作为一个宽吸收范围的荧光淬灭剂，其荧光淬灭效率远高于常用的石墨烯替代物-氧化石墨烯，使组装在其表面的荧光磷脂分子与之发生荧光能量转移(FRET)，在磷脂酶活性作用下，包覆在石墨烯表面的磷脂分子被催化水解后磷脂分子末端的荧光基团衍生物离开合成的石墨烯复合纳米材料，产生荧光信号增强，检测过程只需一步，操作简便、反应快速，成本低廉，且灵敏度优于以往所有方法成百上千倍。

以下对本发明做进一步说明：

针对合成双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料，首先利用一种乙醇胺末端交联上荧光素(fluorescein)基团的荧光磷脂分子N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(FL-DHPE)和普通磷脂分子二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)通过经典的薄膜分散法得到磷脂双层脂质体，再与过量的石墨烯在细胞粉碎仪中以20W功率超声2小时，石墨烯借助其大面积双面芳香环层和已合成的脂质体疏水烷烃夹层通过范德华力和疏水作用力，形成双层磷脂膜包覆的石墨烯。然后，将过量的石墨烯用离心方法去除，上清液即是本文构建的双层磷脂膜修饰的石墨烯纳米复合材料，置于4℃冰箱保存备用。

针对进一步荧光分析检测磷脂酶活性，首先说明一点，基于石墨烯纳米界面能量转移特性(Nanoscale surface energy transfer，NSET)对荧光染料具有很高的淬灭效率。合成的双层磷脂酶修饰的石墨烯中，FL-DHPE末端标记的fluorescein离石墨烯表面很近(～2nm)，能实现极好的荧光共振能量转移(FRET)，导致荧光磷脂分子FL-DHPE的荧光大部分被淬灭，得到很低的荧光背景。因为本发明中合成复合材料所用的两种磷脂分子都是常见磷脂酶作用底物，能被磷脂酶催化水解，因此包覆在石墨烯上的荧光磷脂分子FL-DHPE上交联有fluorescein的一端能在磷脂酶活性的作用下，被催化水解离开FL-DHPE的疏水端，从而离开石墨烯表面造成FRET减小或消失，引发荧光增强。通过检测荧光的变化值即可以得到磷脂酶酶活性大小。

进一步的，所述基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法具体操作步骤如下：

(1)双层磷脂膜修饰的石墨烯纳米复合材料合成：本发明中脂质体的制备是将DPPC，胆固醇以及FL-DHPE(摩尔比4∶1∶1，总计3.6mg)，加入一只装有3ml氯仿溶剂的圆底烧瓶内，然后水浴控温30℃，在旋转蒸发仪上将氯仿缓慢蒸干，此时，圆底烧瓶的内壁形成一层脂质体的薄膜。再加入4mL超纯水在于60℃恒温水浴溶胀，再接着在细胞粉碎仪中，在25W功率条件下冰浴超声1小时，所得的即为磷脂双层脂质体，将母悬浮液在5000rpm的条件下离心15分钟以除去未被分散的脂质体和多层囊泡。石墨烯先通过Hummers法氧化石墨粉制得氧化石墨烯，然后进一步用肼于100℃还原24小时制得，使用前，将2mg石墨烯加入4ml超纯水中，在冰浴的条件下，用细胞粉碎仪在25W功率条件下超声1小时制备得石墨烯的悬浮液。然后，将1ml已制备好的脂质体与2ml新鲜制得的石墨烯悬浮液混合，在冰浴条件下，以20W功率用细胞粉碎仪超声2小时，所得的混合物在5000rpm的条件下离心15分钟以除去大团聚颗粒，上清液即为双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料，再用超纯水稀释成5mL于4℃条件下保存。

(2)运用双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料实现对磷脂酶的定量分析：取6μL制备好的双层磷脂膜修饰的石墨烯复合材料于微量管中，再依次加入3.5μL超纯水，5μL 30％N，N-二甲基甲酰胺，4μL缓冲溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)和1.5μL 100mM氯化钙水溶液，再加入包含有待测物的样品溶液(样品溶液用10mM Tris-HCl，pH＝8.0的缓冲溶液溶解)，充分混匀后，在37℃条件下恒温水浴2小时。反应结束后，所得的溶液用超纯水稀释至100μL，再将上述溶液移至微量荧光比色皿中，在用荧光仪扫描荧光发射光谱。

本发明有两项创新：首先是合成的双层磷脂膜非共轭包覆石墨烯很好地解决了石墨烯在水溶液中的分散性和稳定性，因为本发明中所利用的磷脂分子是两性分子，疏水的一端能和还原石墨烯表面紧密结合，亲水的一端则露在外面，因此整个复合材料是具有亲水性的。且因为是通过非共价结合，石墨烯本身的超共轭体系没有被破坏，能继续保留并进一步应用其优异的光学、电学性能，优于石墨烯氧化衍生方法，在某种程度上解决了石墨烯生物学应用的瓶颈。其次，本发明的生物传感方法借助石墨烯的超高荧光淬灭效率的特殊性能及磷脂分子的生物学活性，利用末端交联荧光基团的磷脂分子衍生物，通过荧光检测途径检测磷脂酶。

总之，本发明在石墨烯表面的磷脂分子中混合一种磷脂末端交联荧光基团fluorescein的磷脂衍生分子FL-DHPE，利用磷脂分子的两性结构，通过非共轭交联，包覆在石墨烯表面，构建出一种水溶性石墨烯复合纳米材料，并根据荧光能量转移(FRET)原理，借助石墨烯的荧光淬灭性能，利用磷脂分子是磷脂酶水解底物的特征，实现了磷脂酶的定量检测，检测过程只需一步，操作简便、反应快速，成本低廉，且灵敏度高于传统方法成百上千倍，对于进一步掌控磷脂酶相关的生物体重要生命活动如细胞增殖，细胞信号传导，细胞分化以及炎症、肿瘤疾病等有着巨大的推动作用。

具体实施方式：

实施例1：基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶C(PLC)

1)合成双层磷脂膜修饰的石墨烯纳米复合材料

称取DPPC，胆固醇以及FL-DHPE(摩尔比4∶1∶1，总计3.6mg)，加入一只装有3ml氯仿溶剂的圆底烧瓶内，然后水浴控温30℃，在旋转蒸发仪上将氯仿缓慢蒸干，此时，圆底烧瓶的内壁形成一层脂质体的薄膜。再加入4mL超纯水在于60℃恒温水浴溶胀，再接着在细胞粉碎仪中，在25W功率条件下冰浴超声1小时，所得的即为磷脂双层脂质体，将母悬浮液在5000rpm的条件下离心15分钟以除去未被分散的脂质体和多层囊泡。石墨烯先通过Hummers法氧化石墨粉制得氧化石墨烯，然后进一步用肼于100℃还原24小时制得，使用前，将2mg石墨烯加入4ml超纯水中，在冰浴的条件下，用细胞粉碎仪在25W功率条件下超声1小时制备得石墨烯的悬浮液。然后，将1ml已制备好的脂质体与2ml新鲜制得的石墨烯悬浮液混合，在冰浴条件下，以20W功率用细胞粉碎仪超声2小时，所得的混合物在5000rpm的条件下离心15分钟以除去大团聚颗粒，收集上清液，用超纯水稀释成5mL于4℃条件下保存。

2)定量检测磷脂酶C(PLC)

取6μL制备好的双层磷脂膜修饰的石墨烯复合材料于微量管中，再依次加入3.5μL超纯水，5μL 30％N，N-二甲基甲酰胺，4μL缓冲溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)和1.5μL 100mM氯化钙水溶液，再加入含有待测样PLC的溶液(样品溶液用10mMTris-HCl，pH＝8.0的缓冲溶液溶解或稀释)，充分混匀后，在37℃条件下恒温水浴2小时。反应结束后，所得的溶液用超纯水稀释至100μL，再将上述溶液移至微量荧光比色皿中，以492nm为激发波长，在用荧光仪扫描荧光发射光谱。

结果证明，初始荧光背景值很小，说明构建的双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料中石墨烯对磷脂分子末端的荧光衍生物荧光淬灭效率很高，随着PLC的加入，荧光值迅速恢复，荧光数值和PLC的浓度成正比，当PLC的浓度增加到1000U/L时，测量到达平台，检测范围为0.1U/L-1000U/L，检测下限优于已报道的PLC检测手段近百倍。

实施例2：基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶D(PLD)

1)合成双层磷脂膜修饰的石墨烯纳米复合材料

称取DPPC，胆固醇以及FL-DHPE(摩尔比4∶1∶1，总计3.6mg)，加入一只装有3ml氯仿溶剂的圆底烧瓶内，然后水浴控温30℃，在旋转蒸发仪上将氯仿缓慢蒸干，此时，圆底烧瓶的内壁形成一层脂质体的薄膜。再加入4mL超纯水在于60℃恒温水浴溶胀，再接着在细胞粉碎仪中，在25W功率条件下冰浴超声1小时，所得的即为磷脂双层脂质体，将母悬浮液在5000rpm的条件下离心15分钟以除去未被分散的脂质体和多层囊泡。石墨烯先通过Hummers法氧化石墨粉制得氧化石墨烯，然后进一步用肼于100℃还原24小时制得，使用前，将2mg石墨烯加入4ml超纯水中，在冰浴的条件下，用细胞粉碎仪在25W功率条件下超声1小时制备得石墨烯的悬浮液。然后，将1ml已制备好的脂质体与2ml新鲜制得的石墨烯悬浮液混合，在冰浴条件下，以20W功率用细胞粉碎仪超声2小时，所得的混合物在5000rpm的条件下离心15分钟以除去大团聚颗粒，收集上清液，用超纯水稀释成5mL于4℃条件下保存。

2)定量检测磷脂酶D(PLD)

取6μL制备好的双层磷脂膜修饰的石墨烯复合材料于微量管中，再依次加入3.5μL超纯水，5μL 30％N，N-二甲基甲酰胺，4μL缓冲溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)和1.5μL 100mM氯化钙水溶液，再加入含有待测样PLD的溶液(样品溶液用10mMTris-HCl，pH＝8.0的缓冲溶液溶解或稀释)，充分混匀后，在37℃条件下恒温水浴2小时。反应结束后，所得的溶液用超纯水稀释至100μL，再将上述溶液移至微量荧光比色皿中，以492nm为激发波长，在用荧光仪扫描荧光发射光谱。

结果证明，初始荧光背景值很小，说明构建的双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料中石墨烯对磷脂分子末端的荧光衍生物荧光淬灭效率很高，随着PLD的加入，荧光值迅速恢复，荧光数值和PLD的浓度成正比，当PLD的浓度增加到1000U/L时，测量到达平台，检测范围为0.025U/L-1000U/L，检测下限优于已报道的PLD检测手段上千倍。

Claims (1)

1. 一种基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法，包括如下步骤：

（1）制备含有末端标记荧光素的FL-DHPE的磷脂双层脂质体；所述磷脂双层脂质体是将DPPC、胆固醇和乙醇胺末端交联上荧光素基团的荧光磷脂分子FL-DHPE以摩尔比4：1：1通过薄膜分散法制得的磷脂双层脂质体；

（2）将步骤（1）制备的磷脂双层脂质体与石墨烯在超声下合成为磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料；且制得的所述石墨烯复合纳米材料中，FL-DHPE末端标记的荧光素基团与石墨烯表面的距离为2～3 nm；

（3）将步骤（2）合成的石墨烯复合纳米材料与待测磷脂酶反应，通过荧光检测途径定量检测磷脂酶活性；

所述待测磷脂酶为磷脂酶C或磷脂酶D。