CN102630157B - 组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的关节内应用的可注射组合物 - Google Patents
组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的关节内应用的可注射组合物 Download PDFInfo
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Abstract
关节内注射用的组合物，其包含：至少一种选自下组的黏性补充剂：透明质酸、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐；和成纤维细胞生长培养基。
Description
本发明涉及关节内注射溶液的开发以供治疗关节退化，尤其是骨关节炎。
本发明提出将黏性补充剂，例如透明质酸或其一种盐和组成明确的成纤维细胞生长培养基以及可能的另一种多糖(优选天然来源的)组合起来。
现有技术
在一些四肢关节中，关节软骨保护的相对骨末端封闭在内衬有结缔组织的囊内，称为滑膜。
滑液是填充关节腔的黏性液体；它由滑膜的成纤维细胞(滑膜细胞)分泌的透明质酸(HA)与血浆中滤出的组织间隙液组成。由于软骨中没有血管，滑液的功能是通过润滑关节以减少摩擦，吸收冲击，给关节软骨的软骨细胞提供氧和养分，和从后者中消除二氧化碳和代谢废物。
骨关节炎是一种常见的多病因退行性关节疾病，涉及关节软骨的物质丧失。随着病情发展，观察到滑液中HA的浓度和分子量降低。这种现象解释为通过透明质酸的内源性合成减少和产生自由基的炎症，该自由基造成氧化退化。
这些变化导致HA粘弹特性降低，渐渐导致其保护关节的基本功能丧失。它们可导致软骨侵蚀，关节腔内存在软骨或骨碎片，疼痛和僵硬。
黏性补充是一种良好建立的理论，包括将HA注射入关键以便帮助其更好地润滑关节、提高流动性和减少疼痛。根据骨关节炎的严重程度，例如，每周连续3-5次注射入膝盖，对于大多数病人在6个月到1年内是有效的。这种治疗相当有用，尤其是对不能忍受、或对诸如抗炎药和口服镇痛药之类的常规治疗方法不再有反应，但其疾病还不适合假肢治疗的病人。
直到现在，对黏性补充溶液的改进涉及延长HA的停留时间以便提高HA功效。
化学修饰HA、交联HA（WO 2007/070547）或将HA与多元醇组合（WO2009/024670）的方法已见诸描述以便减缓HA凝胶的体内机械或热降解或其被自由基降解。
然而，无论是否被修饰，HA黏性补充产品的半衰期只有几天，其关节内存留仍然远短于它们的治疗功效期，事实上，所述治疗功效期取决于多个累积的作用：
-对于软骨的冲击是直接的震动吸收器的角色；
-捕获关节内碎片的性能，从而减少其摩擦作用；
-抵御炎症细胞和它们所分泌的酶的保护作用；和
-对痛感受体的可能的直接作用。
因此，本领域急需开发用于治疗关节退化，尤其是骨关节炎的新治疗溶液。
发明描述
考虑到该情况，申请人采取了一种全新的方法。本发明预计应在两个不同的水平上起作用，以重建良好的关节功能，尤其是治疗关节退化，特别是骨关节炎。
因此，本发明涉及组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的注射组成物，以使关节结缔组织的细胞组分，特别是滑膜细胞和软骨细胞恢复活力，从而保证它们的细胞再生和刺激它们（透明质酸和GAG，关节的基本功能成分）的内源性合成。
更准确地说，本发明的关节内可注射组合物中可能起到黏性补充剂作用的组分选自：透明质酸、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐。
实际上，这种关节内应用中常用的黏性补充剂是透明质酸或其盐的一种。由于这个原因，在一具体的实施方式中，目标组合物仅包含透明质酸或其盐的一种作为黏性补充剂，与成纤维细胞生长培养基组合。
另一实施方式会在设想的组合物中采用透明质酸或其盐的一种作为主要的黏性补充剂，组合至少一种其它的多糖，优选天然来源的以保证其生物相容性、非致免疫的特性。所述的其它多糖优选聚硫酸化的粘多糖-特别是硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、或甚至是肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐。该组合物还包含成纤维细胞生长培养基，和可能的其它成分。
事实上，本发明因此包括将润滑和保护关节的机械作用与促进滑膜和关节软骨内细胞合成的成纤维细胞刺激的营养作用组合起来。第一种作用是由黏性补充剂确保，优选透明质酸-交联的或未交联的，或其盐的一种，-可能与一种或多种其它的天然来源多糖组合。第二种作用由如下定义的成纤维细胞生长培养基提供。
众所周知，本发明所用的透明质酸可以不同形式存在：作为盐，如酯类或酰胺之类的衍生物，和线性或化学交联的形式。所有这些形式在本发明设想之内。虽然交联提高透明质酸分子在生物体内的寿命，但这些修饰影响其物理/化学特性，生物性质和潜在的免疫原性。
如透明质酸所述，一种多糖或多种多糖(优选天然来源的)可以采用现有技术所述的交联和嫁接技术作成交联的或未交联的，嫁接的或未嫁接的。
由于关节结构需要尽可能中性的技术方案，即，仿生的技术方案，优选未交联的透明质酸及其生理上可接受的盐作为第一组分，因该分子为滑膜液的天然组分。我们利用透明质酸的生理上可接受的盐特别指代钠盐和钾盐，以及它们的混合物。
组合物中，黏性补充剂，优选透明质酸的存在浓度优选为1至100mg/ml，更优选10至25mg/ml。
本发明组合物中的第二基本成分是成纤维细胞生长培养基。
对于本发明，成纤维细胞生长培养基定义为完全培养基，不仅保持成纤维细胞活性，而且刺激其扩增和细胞内合成（胞外基质和滑液的诸组分）。
进行功能性生长试验可确定给出的培养基是否是本发明的成纤维细胞生长培养基。本领域技术人员已知的合适功能试验是利用试剂WST-1并在450nm读取结果的比色观察活细胞的密度。(Berridge,M.V.等.(1996):“利用四唑鎓盐的细胞增殖试验的生物化学和细胞基础”(The Biochemical and Cellular Basisof Cell Proliferation Assays That Use Tetrazolium Salts).Biochemica 4,15-19.)
例如，成纤维细胞生长培养基是市售可得的：即，西格玛公司(Sigma)的DMEM标准培养基，其补充有10重量％的FCS(胎牛血清)细胞生长因子。
总的来说，此类培养基包含动物或细胞来源的提取物，它们确实刺激成纤维细胞的生长，但其缺点在于缺乏确定的组成或包含诸如FCS、牛脑垂体提取物，细胞生长因子EGF(表皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、胰岛素或霍乱毒素、皮质醇、哌嗪等难以示踪的外源性元素。
本发明所用的成纤维细胞生长培养基优选不含有细胞生长因子或动物或细胞来源的生物提取物，尤其是如果它们未经示踪或不可示踪的和/或不具有确定的组成。
“未示踪”或“不可示踪的”表示所述生物材料的来源和/或随后经历的处理不能确定或检测。
事实上，所述培养基优选不包含动物或细胞来源的生物提取物，细胞化合物或生长因子或荷尔蒙。
在优选的实施方式中，通过关节内注射将与关节的天然环境最大程度相容的成纤维细胞生长培养基，即，包含仿生的和/或生物相容组分的培养基(生物体中天然存在的或对其中性的、不引起过敏或免疫反应的生物材料)引入关节。优选，该培养基优选包含结缔组织的基本物质的成分。
这样的培养基可为成纤维细胞特别提供维生素、微量元素、氨基酸、矿物盐、单糖（如葡萄糖、核糖、脱氧核糖）和/或复合糖（如HA）形式的优化营养物质，和核酸成分(形成核苷酸和核苷所需的含氮碱基和戊糖)形式的天然生长因子。优选地，它也会具有6.5至7.9的生理pH，较佳地为7.4至7.6，和280至450mOsm的克分子渗透压浓度，较佳地为300至350mOsm。
应该注意的是，HA既可以是生长培养基的组分，也可以是黏性补充剂。不同之处是HA的形式(培养基中必须是生理上的透明质酸盐)及其含量(培养基中含量低很多)。
为了刺激成纤维细胞生长，这样的培养基可补充某种物质，该物质对于生物体是外源性的但是中性、可跟踪来源的且组成明确。满足该定义的物质为，例如牛奶中提取的肽混合物，或通过先从牛奶中连续沉淀然后分离经过酶水解的某些蛋白获得的MPC复合物(牛奶肽复合物)。
脱水粉末形式的该物质优选按0.5至5mg/ml加至培养基，更优选地按4至5mg/ml。
例如，申请人已开发了满足这样定义的复合培养基，其具有了约60种精确定量的以下组分。
如下所示，此类富集培养基能体外刺激成纤维细胞生数天。此外，血清存在下，它可刺激成纤维细胞生长。因此，由于部分滑液是血浆的渗出液，它是关节内注射的特别适合的候选对象。
另外，如本申请所述，在该培养基中培育成纤维细胞提高了这些细胞抵抗氧化应激的能力，即，它具有抗氧化性。因此，在体外，富集培养液通过成纤维细胞接触呼吸链抑制剂（抗霉素A）而对线粒体过度产生活性氧（过氧化物离子）施加抑制作用。与标准DMEM中预培育的对照成纤维细胞相比，在生长培养液中预培育并经历化学氧化应激（AAPH）的人成纤维细胞的荧光氧化试验(DCFDA)的表达动力学也显著降低。成纤维细胞生长培养基的抗氧化性还表示其在保护透明质酸抵御关节内氧化降解中起作用，从而能提高该化合物的原位停留并延长黏性补充的治疗功效。
因此，本发明的“成纤维细胞生长培养基”也可称为“成纤维细胞存活和生长的全天然环境”，其必须具有以下特性：
a/明确的、可示踪的组成，仅包含生物体中天然存在的或对其中性的细胞生长因子物质（氨基酸、肽、维生素、微量元素、矿物盐、单糖和复合糖，核酸），排除任何非天然来源、组成不确定的物质或药物；
b/其本身使得成纤维细胞在培养基中存活的能力；
c/和刺激它们生长和新陈代谢（和因此细胞产生物质）的能力。
除了本申请目前使用的，本发明的组合物还可含有其它成分或赋形剂，特别是HA的衍生物或其纯化部分。然而，按照具体的实施方式，注射用的组合物仅由上述两种组分构成：首先是黏性补充剂，优选可能与一种或多种其它天然来源多糖组合的透明质酸，和第二是成纤维细胞培养基。
如上所述，该组合物用于关节内注射入对象的关节腔。
在本发明中，术语“对象”指哺乳动物，优选人，但是也可指接受兽医治疗的动物，尤其是家养动物或用于娱乐目的的动物（如狗、猫或马）。
原则上，所有的关节都可以用本发明的组合物治疗。膝盖是人对象中类特别关注的关节。对于狗，髋部是频繁治疗的关节，而对于马，优选腕关节、球节或跗关节。
根据优选的实施方式，所述组合物(优选水性的)以凝胶形式存在，因为本发明的目标是以注射剂应用。明显地，这种限制最好与上述成纤维细胞生长培养基完全匹配，从而能通过混合透明质酸配制成凝胶，而不需添加外源性赋形剂。
所述组合物更优选以单相水凝胶的形式存在，即，单一均相的水凝胶。可简单调节所得组合物的粘度，尤其是通过调节透明质酸的组成和含量以获得与滑液类似的流变特性。
例如，已经揭示本发明所述的组成物，克分子渗透压浓度为300至350mOsm、pH为7.4和7.6和分子量为1.3至1.8MDa的透明质酸浓度为10至25mg/ml的本发明组合物与所需应用完美匹配。
本发明的注射用组合物也可构成试剂盒的一部分，包括含有所述组合物的注射器。例如，所述注射器可以是2至20ml的单一剂量注射器。在这样的试剂盒中，所述组合物的2种基本组分可作为混合物存在于同一注射器内，或在2个不同的注射器内以便临时混合。
考虑可注射特征和所需治疗，此类组合物优选已灭菌的，优先低温灭菌以避免存在的组分变性。成纤维细胞生长培养基可用0.22μm膜过滤，而透明质酸用采用本领域技术人员已知的工艺单独灭菌。
另一种替换形式包括在玻璃、聚丙烯、聚乙烯或任何其它的可耐电离辐射或热辐射灭菌的材料制成的小瓶中提供粉末形式的注射用组合物(HA和成纤维细胞生长培养基)。在该实施方式中，在将产品注射入关节之前，利用（无菌）注射器，通过在小瓶中添加无菌水重建单相水凝胶。在这种情况中，产品必须在注射前2至72小时内重建。
考虑到它们互补的作用形式，本发明组合物的两种组分可混合和/或同时、分别或在整个时期给予。
本发明组合物的直接应用是治疗关节退化，尤其是骨关节炎。
因此，本发明组合物意欲用作医疗设备和/或医学产品。
附图支持的以下实施例以非穷尽的方式阐述了本发明。
附图说明
图1比较了在本发明的成纤维细胞生长培养基和没有生长因子的DMEM标准培养基(西格玛公司)中人成纤维细胞的生长。
图2显示了在不同培养基中培育后，接触氧化应激的人成纤维细胞培养物中测得的氧化现象。
具体实施例
1/在注射用组合物中利用成纤维细胞生长培养基
a)培养基组成
b)人成纤维细胞培养
方案
-将DMEM标准培养基中的人成纤维细胞以低密度接种到96-孔板中，该培养基补充了FCS(胎牛血清)细胞生长因子。
-24小时后，在本发明的纯培养基中或在不含生长因子的DMEM标准培养基中培养它们。
-实验期间不更新培养基。
-采用比色法(WST-1试剂)，测定第0时，然后测定2、4、7和9天后的活细胞密度。
结果
-9天后，只有本发明的培养基维持了成纤维细胞的生长。从第7天开始，观察到细胞生长减缓，其可解释为没有更新培养液(图1)。
-在不含FCS的DMEM培养液中，2天后观察到细胞活力降低，整个研究过程中未见细胞生长(图1)。
总之，看来本发明所用的成纤维细胞生长培养基可使细胞存活，并在没有外源性生长因子存在下刺激正常人成纤维细胞的生长。
c)提高成纤维细胞对氧化应激的抵抗力
方案
-将在补充了10％胎牛血清的DMEM中，处于生长期的正常人成纤维细胞接种入96-孔板。
-48小时后，将它们分别置于DMEM(阴性对照)，本发明的培养基或α-生育酚(阳性抗氧化对照)中2小时。
-洗涤它们，用大量ROS供体(用AAPH氧化应激)和氧化时变得有荧光的检测剂(DCFDA)培育25分钟。
-每3分钟检测荧光出现率(与细胞ROS的产生成比例)。
结果
-与DMEM阴性对照相比，显著抑制在本发明培养基(Matricium)中预培育的细胞的荧光（氧化）(图2)。本发明的培养基提高了细胞抵抗氧化应激的能力。
-对氧化应激的间接抑制效果(改善细胞的氧化还原稳态)与具有经典直接作用的抗氧化剂(捕获自由基的α-生育酚)的效果相当。
总之，该培养基通过成纤维细胞接触呼吸链抑制剂(抗霉素A)而对线粒体过量产生活性氧(过氧化物离子)施加抑制效应。与在标准DMEM中预培育的对照成纤维细胞相比，在生长培养基中预培育并经历化学氧化应激（AAPH）的人成纤维细胞的荧光氧化试验(DCFDA)的表达动力学也显著降低。
2/制备关节内注射用的可注射凝胶
-成纤维细胞生长培养基
-以1至100mg/ml的浓度添加HA，优选10至25mg/ml的浓度。
-凝胶制剂：将透明质酸(HA)溶解于成纤维细胞生长培养基。HA的浓度决定最终制品的粘度。例如，所用HA是分子量为1.3至1.8MDa的透明质酸钠。本发明的注射用凝胶不含任何添加剂，制剂的所有成分既作为赋形剂也作为活性成分。
-灭菌：成纤维细胞生长培养基进行0.22μm膜过滤，而HA用本领域技术人员已知的工艺单独灭菌。另一种替换形式包括在可耐电离辐射或热快速技术的小瓶中提供粉末形式的注射用组合物(HA和成纤维细胞生长培养基)。在将该产品注射入关节之前，通过在小瓶中添加无菌水重建单相水凝胶。
-注射方案：根据需要治疗的关节及其骨关节炎的严重程度，建议一周注射一次，3至5周。作用长度依赖于关节病损的严重程度和对象的年龄。
Claims (16)
1.关节内注射用的组合物，其包含：
未交联的透明质酸或其生理上可接受的盐作为黏性补充剂；和
成纤维细胞生长培养基；
所述成纤维细胞生长培养基的组成如下所示
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含：
至少一种其它多糖。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述至少一种其它多糖是天然来源的。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述至少一种其它多糖选自下组：硫酸软骨素、角质素、肝素、纤维素、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐。
5.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为凝胶的形式。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物为灭菌水凝胶的形式。
7.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述黏性补充剂在所述组合物中的存在浓度是1至100mg/ml。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述黏性补充剂在所述组合物中的存在浓度是10至25mg/ml。
9.注射器形式的试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的组合物。
10.医学装置，其包含权利要求1-5中任一项所述的组合物。
11.如权利要求1-4中任一项所述的组合物或如权利要求9所述的试剂盒或如权利要求10所述的医学装置，用于治疗关节退化。
12.如权利要求11所述的组合物或试剂盒或医学装置，其特征在于，用于治疗骨关节炎。
13.如权利要求1-5中任一项所述的组合物的用途，用于制备意欲治疗关节退化的医学产品。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，用于制备意欲治疗骨关节炎的医学产品。
15.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述的组合物作为同时、分别或在整个时期使用的组合产品，用于治疗关节退化。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的组合物作为同时、分别或在整个时期使用的组合产品，用于治疗骨关节炎。
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