CN102605052A - 一种聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2 235delC及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括：基因分型标准物和内标。本发明首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术，实现对耳聋基因位点GJB2 235delC的高灵敏度特异性同时检测，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。
在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50％。目前，在该基因已经发现了100多种突变类型，然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14％，约22.2％的中国耳聋患者与该突变有关。进行婚育前、产前、新生儿GJB2 235delC耳聋基因检查，对前期指导和提供及时的救助都具有重要意义。
目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligasedetection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquidchromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。
采用荧光标记技术、毛细管电泳技术、多重PCR复合扩增，通过带不同荧光标记物的多对引物同时对GJB2 235delC特异性的扩增，并在这些引物中掺入核酸类似物以提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。
发明内容
本发明目的是提供一种同时检测聋病易感基因GJB2 235delC及Amelogenin基因座荧光检测试剂盒。
为了实现上述目的，采取的技术方案：一种检测聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs的混合物，Taq酶，5对引物混合物以及超纯水；
所述扩增后试剂包括：内标ROX-300和用于基因分型的各基因突变位点对应的基因分型标准物；
使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0.2-0.4μM。
使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增GJB2 235delC及Amelogenin基因座。
用于GJB2 235delC检测的引物为：
SEQ NO.1：5’-CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’
SEQ NO.2：5’-GCCTGCAGCTGATCTTCGT-3’
其中LNA核苷以斜体字表示。
用于Amelogenin基因座检测的引物为：
SEQ NO.3：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’
SEQ NO.4：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。
所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序：94-98℃ 1-5min；26-32个循环的94-98℃ 15-60s，55-65℃ 15-60s，72℃ 15-60；60℃30-60min。
使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用：指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
附图说明
图1是本发明的试剂盒对突变个体、正常个体血斑来源DNA扩增后的分型结果；未经修饰的引物对正常个体血斑来源DNA扩增后的分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因GJB2 235delC检测的引物采用绿色荧光染料HEX标记，用于Amelogenin基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。
1、待测样本100份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对GJB2 235位点进行过测序检测，其中突变样本5份。
2、检材的基因组DNA提取
Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5mL离心管中，加入sdH2O 1mL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5％Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200μL加入离心管中，振荡数秒，。于56℃水浴保温30min后，振荡数秒。95℃沸水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1 PCR扩增体系：
3.2 PCR扩增程序：
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.2μL分子量内标)×(进样数)+(9.8μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将10μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
5、结论
举例如图1所示：
第一行：确诊病例，女，GJB2 235delC位点判读位置(237bp)出现峰值1300H的检测峰，同时另一条染色体正常出G2峰(238bp，1300H)，性别出X单峰(105bp，2400H)；
第二行：确诊病例，男，GJB2 235delC位点判读位置(237bp)出现峰值1000H的检测峰，同时另一条染色体正常出G2峰(238bp，1100H)，性别出X、Y双峰(105bp、1300H和111bp、1400H)。
第三行：正常个体，男，GJB2 235delC位点判读位置(237bp)不出峰，仅G2位置现峰值2000H的检测峰，性别出X、Y双峰(105bp、800H和111bp、600H)。
第四行：使用未经修饰的引物对正常男性个体进行扩增检测，GJB2 235delC位点判读位置(237bp)易出现小峰，如图峰值为900H，给判读带来困难。
与测序方法相比较：本发明对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的；未出现假阳性结果。而使用未经修饰的引物对正常男性个体进行扩增检测，GJB2 235delC位点判读位置易出现小峰，即出现假阳性，与测序结果不一致，结果错误。
以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。
Claims (6)
1.一种聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增235delC及Amelogenin基因座的引物、内标和各基因突变位点对应的基因分型标准物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
用于GJB2 235delC检测的引物为：
SEQ NO.1：5’-CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’
SEQ NO.2：5’-GCCTGCAGCTGATCTTCGT-3’
其中LNA核苷以斜体字表示；
用于Amelogenin基因座检测的引物为：
SEQ NO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’
SEQ NO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述GJB2 235delC及Amelogenin基因座的检测引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述GJB2 235delC及Amelogenin基因座检测的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述GJB2 235delC及Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
6.应用权利要求1所述试剂盒检测聋病易感基因GJB2 235delC的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因GJB2 235delC及Amelogenin基因座；用于GJB2 235delC检测的引物如SEQ NO.1、SEQ NO.2所示；用于Amelogenin基因座检测的引物如SEQ NO.3、SEQ NO.4所示；所述各基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
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