CN102597775A - 筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了肽结合试剂，例如抗体，其展示动力学调节生物信号复合物例如受体-配体复合物的结合和信号转导的能力；鉴定此类多肽结合试剂的方法，制备此类多肽结合试剂的方法，包含此类多肽结合试剂的组合物，和使用此类多肽结合试剂的方法。

Description

筛选方法

交叉参考相关申请

本申请要求2009年9月25日提交的第61/246,079号美国临时专利申请和2010年2月19提交的第61/306,324号美国临时专利申请的优先权权益，所述临时专利申请的每一个通过引用整体并入本文。

领域

本发明涉及筛选多肽结合剂例如抗体的方法，所述多肽结合剂展示动力学调节生物信号复合物例如受体-配体复合物的结合和信号转导的能力。本发明还涉及特征在于期望的动力学调节性质的特异性多肽结合剂。

附录的合并

本申请包括随本申请一起提交的2009年9月25日创建的表，附录A，“41726_SecretedProteins.txt”(大小255KB)。该ASCII文本文件中包含的材料由此根据37C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用整体并入本文。

背景

大多数抗体药物常规地通过筛选结合细胞表面受体或其同源配体的抗体，并且鉴定特异性阻断或刺激受体信号转导活性的抗体来进行鉴定。许多抗体药物通过结合配体或受体，从而消除配体结合以及激活受体的能力来阻断信号转导途径。此类阻断抗体通过阻止受体-配体复合物的形成来按化学计量介导它们的作用。相反地，某些抗体药物结合并且激活受体的信号转导。此类激动剂抗体可通过模拟配体的天然活性介导它们的作用，从而不需要配体的存在来激活信号转导。

概述

本发明提供了多肽结合剂(称为“动力学调节药物”或“动力学调节剂”)的新型种类，所述多肽结合剂具有正或负调节牵涉靶及其信号转导伴侣的细胞途径活性的期望的性质。靶和/或其信号转导伴侣可以是内源或外源化合物，性质上可以是蛋白质或非蛋白质，但其任选地可排除离子和盐。本发明还提供了鉴定此类动力学调节剂的新型方法，所述方法基于它们对于靶对其信号转导伴侣之间的结合动力学的影响，或基于所述动力学调节剂对以复合形式相对于以未复合形式存在的靶(和/或其信号转导伴侣)的差异结合。多肽结合剂可结合靶、其信号转导伴侣和/或包含靶及其信号转导伴侣的复合物。该发现使得能够设计可鉴定适合用于治疗用途的细胞途径活性的调节剂的生物物理筛选测定法。

在某些方面，提供了鉴定调节靶与其信号转导伴侣之间的结合动力学的多肽结合剂的测定法。靶的非限定性实例包括例如附录A中所示的登录号(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白。此类分泌性蛋白包括许多分泌性膜结合受体。随同的附录A列出了由Swissprot/EMBL数据库(参见，例如，Boeckmann等人“The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplementTrEMBL in 2003”，Nucleic Acids Res.31：365-370(2003)汇编的人分泌性蛋白。附录A显示了数据库中分泌性蛋白的氨基酸序列的Swissprot登录号、所述蛋白的名称(和所有首字母缩写或相关名称)以及氨基酸序列的长度。如本文中所使用的，“信号转导伴侣”是靶的结合伴侣(当其与靶结合时，形成信号复合物)或为信号复合物的部分(其可激活或抑制细胞途径)。此类动力学调节剂多肽结合剂的存在改变(增强或减小)靶对于其信号转导伴侣的表观结合亲和力，从而改变靶对于激活细胞途径的剂量-反应。可选择地，改变(增加或减小)靶对于其信号转导伴侣的结合率或改变(增加或减小)靶对于其信号转导伴侣的解离速率的动力学调节剂多肽结合剂也可改变(增加或减小)与信号转导伴侣复合的靶的停留时间，改变受体内化率和/或改变被信号转导伴侣复合物激活或去活化的信号转导蛋白的磷酸化程度。此类改变可显著改变通过靶与信号转导伴侣的复合产生的不同信号转导途径的相对激活，从而改变靶对于激活细胞途径的剂量-反应。预期此类动力学调节剂具有优于常规治疗性药物的有利方面，包括提高的安全性(safety profile)、改变的清除率、更宽的治疗窗(therapeutic window)和更低频率的给药。在靶是待给患者施用的外源化合物时，作为利用靶的辅助疗法的动力学调节剂的施用可改变(例如，减少)靶的给药的总量(每天、每周或每月)和/或频率。

本发明提供了鉴定作为多肽结合剂(不包括常规小分子药物例如具有约1000道尔顿或更低的分子量的非聚合有机化合物)的候选动力学调节药物的方法。特别地涉及的多肽结合剂的实例包括抗体，包括其抗原结合片段、肽体(peptibody)、多肽和肽(任选地缀合于其它肽部分或非肽部分)。抗体的实例包括单克隆抗体、包含两条重链和两条轻链的四聚体免疫球蛋白、单链抗体、单结构域抗体、抗体片段、scFv、Fab、CDR、啮齿类动物抗体、哺乳动物抗体、人抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

本发明提供了鉴定候选多肽结合剂例如抗体的方法，所述多肽结合剂调节信号复合物的第一组分与第二组分(靶与信号转导伴侣，或反之亦然)之间的结合。这样的第一组分和/或第二组分的实例包括附录A的分泌性蛋白(或SEQ ID NOS：1-88)和此类分泌性蛋白的内源或外源信号转导伴侣的任一种，或本文中描述的配体或受体或跨膜蛋白的任一种。在某些实施方案中，第一组分和第二组分是多肽。在示例性具体实施方案中，第一组分和第二组分是内源的。

在一个方面，鉴定候选动力学调节药物的方法包括(a)测量在测试多肽结合剂例如抗体存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数，(b)测量在所述测试多肽结合剂不存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(c)当所述测试多肽结合剂在于步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数上展示至少1.5倍差异时，将所述测试多肽结合剂鉴定为候选动力学调节药物。图1显示举例说明某些示例性实施方案的示意图。在某些实施方案中，结合亲和力或结合率参数的差异在约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍、或约1.5倍至约100倍、或约2倍至25倍、或约2倍至50倍、或约1.5倍至约25倍、或约1.5倍至约50倍之间、例如约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍、或达到500倍、或达到200倍、或达到150倍、或达到100倍、或达到90倍、或达到80倍、或达到70倍、或达到60倍、或达到50倍、或达到40倍、或达到30倍。在某些实施方案中，如果测试多肽结合剂增强所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数(例如，减小的K_D，或增加的K_A，或减小的解离速率/结合速率比率，或增加的结合速率/解离速率比率，或增加的结合速率，或减小的解离速率)，那么所述测试多肽结合剂被鉴定为候选正调节剂。在其它实施方案中，如果所述测试多肽试剂减小所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数(例如，增加的K_D，或减小的K_A，或增加的解离速率/结合速率比率，或减小的结合速率/解离速率比率，或减小的结合速率，或增加的解离速率)，那么所述测试多肽试剂被定义为候选负调节剂。

在某些可选择的实施方案中，当更强的结合率参数(例如，增加的缔合或停留时间，通过增加的结合速率或减小的解离速率)导致增加的所期望信号转导途径的相对激活时，甚至当结合亲和力未被可检测地改变时，通过确定期望倍数的结合率参数的增强，将测试多肽结合剂鉴定为候选正调节剂。当更小的结合率参数(例如，减弱的缔合或停留时间，通过减小的结合速率或增加的解离速率)导致增加的所期望信号转导途径的相对激活，甚至当结合亲和力未被可检测地改变时，通过确定结合率参数的期望的倍数减小，将测试多肽结合剂鉴定为候选正调节剂。类似地，当更强的结合率参数(例如，增加的缔合或停留时间，通过增加的结合速率或减小的解离速率)导致减小的所期望信号转导途径的相对激活时，甚至当结合亲和力未被可检测地改变时，通过确定结合率参数的期望的倍数增强，将测试多肽结合剂鉴定为候选负调节剂。当更弱的结合率参数(例如，减少的缔合或停留时间，通过减小的结合速率或增加的解离速率)导致减少的所期望信号转导途径的相对激活，甚至当结合亲和力未被可检测地改变时，通过确定结合率参数的期望的倍数减弱，将测试多肽结合剂鉴定为候选负调节剂。

在另一个方面，鉴定候选动力学调节药物的方法包括(a)(i)测量在所述第二组分存在的情况下，测试多肽结合剂例如抗体对所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或(ii)测量在所述第一组分存在的情况下，测试多肽结合剂对所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(b)(i)测量在所述第二组分不存在的情况下，所述测试多肽结合剂对所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或(ii)测量在所述第一组分不存在的情况下，所述测试多肽结合剂对所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(c)当所述测试多肽结合剂在步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数上展示1.5倍至100倍差异时，将所述测试多肽结合剂鉴定为候选动力学调节药物。图2显示举例说明某些示例性实施方案的示意图，其中在第二组分存在或不存在的情况下测量相互作用。

在某些实施方案中，步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的差异在约1.5倍(即，50％)，至任选地约1000倍，或约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍之间，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍。在某些实施方案中，如果步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数大于步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数，则所述测试多肽结合剂被鉴定为候选正调节剂。在其它实施方案中，如果步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数大于步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数，则所述测试多肽结合剂被鉴定为候选负调节剂。

可以以其中同时或相继地筛选多种多肽结合剂(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、150、200、500、1,000、10,000或25,000种)的高通量测定法的形式进行上述方法中的任何方法。在某些实施方案中，所述方法还包括任选地在测量结合亲和力或结合率参数的差异之前，测定多种测试多肽结合剂(例如抗体)对(a)所述第一组分、(b)所述第二组分或(c)包含所述第一组分和第二组分的复合物的任一种的结合亲合力。还可以以其中同时或相继地筛选多种多肽结合剂(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、150、200、500或1000种)的高通量测定法的方式进行文库的此种预筛选。在某些实施方案中，多种筛选的测试多肽结合剂是通过将一个或多个不同突变引入亲代多肽结合剂来制备的亲代多肽结合剂的变体。

在其它实施方案中，可筛选多肽结合剂与不同结合伴侣(例如诱饵受体、清除作用受体或备选信号途径组分)相比较对第一组分或第二组分作用的选择性。此类方法可包括鉴定不显著改变第一组分或第二组分对于不同结合伴侣(此类结合伴侣既不是第一组分也不是第二组分)的结合亲和力或结合率参数的多肽结合剂。

可在其中第一组分、第二组分和多肽结合剂的一种或多种存在于溶液中的测定中，或在其中第一组分、第二组分和多肽结合剂的一种或多种连接于固相(共价或非共价地)的测定中，或在其中第一组分、第二组分以及多肽结合剂的一种或多种在细胞表面上表达的测定中进行结合亲和力或结合率参数的上述测量中的任一测量。第一组分和/或第二组分各自本身可以是多种化合物的复合物。第一组分和/或第二组分(例如，靶或信号转导伴侣或反之亦然)可以是可溶性的或膜结合的配体或受体，包括但不限于7-跨膜受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)、肾上腺素能受体、神经递质受体、嗅觉受体、阿片样物质受体、趋化因子受体、视紫质、受体酪氨酸激酶、生长因子受体、整联蛋白以及toll-样受体、酶或底物。

上述方法中的任一方法还可包括重新克隆和表达，或合成和表达，或合成候选动力学调节多肽结合剂；纯化所述动力学调节剂和/或测定其序列；添加或替换Fc区域或其片段；利用无菌的药学上可接受的稀释剂将动力学调节剂或变体(例如包含亲代抗体的相同CDR的至少3个或6个CDR的抗体)配制于无菌组合物中；和/或给动物施用所述动力学调节剂或变体。

上述方法中的任一方法还可包括测量在所述测试多肽结合剂存在和不存在的情况下，由信号复合物介导的信号转导的水平，和确定所述测试多肽结合剂是否额外地是激动剂、部分激动剂、拮抗剂或部分拮抗剂。在某些实施方案中，所述激动剂或部分激动剂是变构激动剂。

在相关方面，本发明提供了通过上述方法的任一方法或本文中其它地方描述的方法的任一方法鉴定的多肽结合剂例如抗体。

在分开的方面，本发明还提供了具有期望的特征的多肽结合剂。在某些实施方案中，本发明提供了正调节剂，所述正调节剂以约10^-5M或更小，例如，10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小(其中更小的数表示更大的结合亲和力)的平衡离解常数K_D结合靶，例如附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白，和(b)能够使所述靶与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D增加至约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍，或约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍。在其它实施方案中，本发明提供了负调节剂，所述负调节剂(a)以约10^-5M或更小，例如10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小的平衡离解常数K_D结合靶，例如附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白，和(b)能够使所述靶与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D减小至2/3(即，50％)至任选地约1/1000，或约2/3至约1/100，或约1/2至1/25倍，或约1/2至约1/50，或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至少2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或1/500，或1/200，或1/150，或1/100，或1/90，或1/80，或1/70，或1/60，或1/50，或1/40，或1/30。

还可将此类多肽结合剂中的任何多肽结合剂经历纯化，以获得大体上均质的组合物，例如具有至少约90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的纯度。

本发明还提供了制备无菌药物组合物的方法(所述方法包括以例如治疗有效量向此类多肽结合剂、此类多肽结合剂的无菌组合物中加入无菌的药学上可接受的稀释剂)和施用此类无菌组合物例如以调节(增强或减弱)包含分泌性蛋白的复合物的信号转导的方法。

应理解，本文中描述的每一个特征或实施方案或组合是本发明的任何方面的非限定性的说明性实例，这样其意指可与本文中描述的任何其它特征或实施方案或组合组合。例如，当用语言例如“一个实施方案”、“某些实施方案”、“其它实施方案”、“特定的示例性实施方案”和/或“另一个实施方案”描述特征时，这些类型的实施方案的每一个是意欲与本文中描述的任何其它特征或组合特征组合而不必列出每一个可能的组合的特征的非限定性实例。此类特征或特征的组合用于本发明的任何方面。类似地，当方法描述鉴定特征在于某些特征的多肽结合剂例如抗体时，本发明也涉及特征在于那些特征的多肽结合剂。当公开落在范围内的值的实例时，设想这些实例中的任一实例作为范围的可能端点，设想这样的端点之间的任何和所有数值，并且可预期上端点与下端点的任何和所有组合。

在考虑下列本发明的详细说明后，本发明的许多另外方面和有利方面对于本领域技术人员将变得很显然，所述详细说明描述了其目前优选的实施方案。本申请中提及的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利公布通过引用整体并入本文。

附图简述

图1是举例说明在测试多肽结合剂存在或不存在的情况下进行的结合的测量的示意图。

图2是举例说明在第二复合物组分存在或不存在的情况下进行的结合的测量的示意图。

图3显示预测的动力学调节抗体在(A)不同配体浓度；(B)不同调节剂浓度(非激动剂抗体)；和(C)不同调节剂浓度(激动剂抗体)上对信号转导活性的作用。

图4显示来自检测蛋白质-蛋白质相互作用的调节的平衡溶液亲和力测量的模拟数据。

图5显示XOMA 052对IL-1β与IL-1sRI(A)以及与IL-1sRII(B)结合的亲和力的影响。

图6显示(A)XOMA 052以IL-1β对于细胞测定的EC₅₀来中和IL-1β活性，和(B，C)IL-1β与IL-1sRI的相互作用的负亲和力调节导致改变的对IL-1β的细胞剂量-反应，从而导致IC₅₀的增加。

图7显示注射抗体/IL-1β复合物后48小时保留在循环中的总IL-1β的量。

图8是T2D中不同药物类型调节IL-1β活性的图示。

图9显示来自如实施例2中所述，鉴定调节GCSF-GCSFR结合相互作用的抗体的固相亲和力测量测定的结果。

图10显示A10(B6)抗体对GCSFR-转染的BAF3细胞的GCSF依赖性结合。

图11显示来自鉴定调节hINS-INSR结合相互作用的抗体的基于细胞的亲和力测量测定的样本结果。

图12显示来自测量测试抗体对hINS-INSR结合相互作用的调节的基于细胞的亲和力测量测定的样本结果。

图13显示来自测量测试抗-INSR抗体刺激pIRS-1磷酸化的能力的测定的示例性结果。

图14是显示在固定浓度的不同测试抗体存在或不存在的情况下来自pIRS-1测定的胰岛素ECS0值的表。

图15显示饲喂高脂饮食并且用部分激动剂抗-INSR抗体处理的20周龄DIO小鼠的血糖水平：A.葡萄糖水平的线形图。B.显示在部分激动剂抗-INSR抗体注射后血糖的统计上显著降低的葡萄糖水平的条形图。

图16举例说明部分激动剂抗-INSR抗体的施用改善DIO小鼠的血糖控制：A.葡萄糖耐量测试时间过程；B.空腹血糖水平；C.葡萄糖耐量测试；曲线下面积(AUC)。

图17显示正调节剂抗-INSR抗体增强DIO小鼠的胰岛素敏感性：A.胰岛素耐量测试时间过程；B.空腹血糖水平；C.胰岛素耐量测试；曲线下面积(AUC)。

图18显示正调节剂抗-INSR抗体改善DIO小鼠的血糖控制：A.葡萄糖耐量测试时间过程；B.空腹血糖水平；C.胰岛素耐量测试；曲线下面积(AUC)。

图19举例说明与对内源配体的剂量反应相比较的来自部分变构激动剂的剂量反应(A)或在变构激动剂存在或不存在的情况下由配体产生的激活(B)。

图20显示与对内源配体的剂量反应相比较的来自正变构调节剂抗体的剂量反应(A)或在正变构调节剂抗体存在和不存在的情况下内源配体的剂量反应(B)。

图21举例说明一组单独的部分变构激动剂相对于内源配体胰岛素的激活参数。数据获自Akt在Ser473上的磷酸化％的测量。

图22举例说明在10ug/ml部分变构激动剂抗体存在的情况下，相对于在阴性对照抗体存在的情况下对内源配体的最大反应的胰岛素的激活性质。数据获自Akt在Ser473上的磷酸化％的测量。

详述

本发明提供了作为多肽结合剂的动力学调节药物、其用途以及鉴定所述动力学调节药物的多种方法。此类动力学调节剂可通过改变信号复合物组分的装配和解离的动力学速率常数(kinetic rate constant)或通过其它机制(包括改变信号复合物的结构状态(例如通过结合过渡态(transition state))和加速信号转导的激活)诱导对细胞反应的正或负作用。

信号复合物的调节可导致对信号输入的敏感性的增强或减弱以及信号转导的伴随增强或减弱。此类动力学调节剂的施用增强或减弱细胞途径的敏感性和/或细胞反应的绝对水平。本发明的动力学调节剂，取决于它们的性质，可用作调节剂、增强剂(potentiator)、调控剂(regulator)、效应物或敏化物(sensitizer)。

许多抗体药物通过结合细胞表面受体或其同源配体并且消除配体结合及激活受体的能力来阻断信号转导途径。此类阻断药物通过阻止受体-配体复合物的形成来化学计量地介导它们的作用。然而，大当被异常激活时与疾病相关的多数途径，在正常生物学中也具有正常的发育或内环境稳定(homeostatic)作用。该观察对于免疫系统尤其如此，在所述免疫系统中高效力细胞因子例如TNF-α和IL-6在病理背景中驱动炎症但在感染的控制中也具有重要的有益作用。某些疾病的成功治疗因而可能需要减弱而非完全抑制信号途径来恢复正常生理状态，从而具有可接受的副作用特征。预期由本发明提供的动力学调节剂提供此类有利方面。

其它治疗性药物通过结合细胞表面受体和改变受体的活性影响细胞信号转导途径。此类直接激动剂药物可通过模拟配体的天然活性来介导它们的作用，从而具有固有活性，即它们不需要配体的存在来介导它们的作用。其它治疗性药物通过结合配体来影响细胞信号转导途径。此类间接激动剂药物可通过改变配体稳定性或效价来介导它们的作用。

生物过程通常以连续而非二分(binary)方式被调控，从而在许多情况下，途径活性的调节可以是比完全途径阻断或刺激更适当的治疗策略。对途径活性的调节而非对完全途径阻断或刺激进行功能性的基于细胞的筛选是很费力的并且可能不容易以高通量方式来容易地进行，因为此类筛选通常需要已知浓度的测试化合物并且可能对测试化合物制剂中的任何杂质敏感。特别地，对途径活性的调节进行高通量功能性的基于细胞的筛选的能力因不能透过细胞的分子(其不能进入细胞内环境)，特别地因在所使用的产生系统中可具有不同的表达水平、纯度和稳定性的程度的重组生物分子而受到限制。此外，某些结合相互作用可能对功能性筛选的测量不具有信号转导输出(例如，在诱饵受体、诱饵底物或靶的无活性形式的情况下)，这使得难以鉴定干扰这些相互作用的试剂。

本发明克服了这些不利方面并且提供了以高通量方式鉴定期望的活性和期望的潜能的正和负动力学调节剂的方法。

定义

术语″化合物″是指任何化合物，有机的或无机的，内源或外源的，包括但不限于多肽、蛋白质、肽、小分子、核酸(例如，DNA和RNA)、碳水化合物、脂质、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、肽模拟物、聚酮(polyketides)及其衍生物、结构类似物或组合。“内源的”意指天然存在于哺乳动物中的，然而“外源的”意指非天然存在于哺乳动物中的，例如施用的外源化合物。

术语“多肽结合剂”是指能够特异性结合抗原例如靶或其信号转导伴侣，或能够以可测量的结合亲和力结合抗原的多肽。多肽结合剂的实例包括抗体、肽体、多肽和肽(任选地缀合于其它肽部分或非肽部分)。多肽结合剂可结合的抗原可包括任何蛋白质或非蛋白质分子，所述分子能够引起抗体反应，或能够以大于非特异性结合的可检测的结合亲和力结合多肽结合剂。动力学调节多肽结合剂结合的抗原可包括靶、靶的信号转导伴侣和/或包含靶和其信号转导伴侣的复合物。

术语“抗体”以最广义使用，包括完全装配的抗体、四聚体抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)₂、Fv、单链抗体、双链抗体)以及包含前述抗体的重组肽(只要它们展示期望的生物活性)。“免疫球蛋白”或“四聚体抗体”是由两条重链和两条轻链组成的四聚体糖蛋白，所述重链和轻链各自包含可变区和恒定区。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整抗体来产生。抗体片段或抗原结合部分包括，除其它以外，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微小抗体(minibody)、线性抗体；螯合重组抗体、三抗体或双抗体、内抗体(intrabody)、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原-结合-结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH抗体或其变体或衍生物，以及包含免疫球蛋白的至少一部分的多肽，所述部分足以赋予所述多肽特异性抗原结合，例如1、2、3、4、5或6个CDR序列，只要所述抗体保持期望的生物活性即可。

“单克隆抗体”是指获自大体上同源的抗体群体的抗体，即，除了可以以少量存在的可能天然发生的突变外，包括所述群体的单一抗体是相同的。

如本文中所使用的“抗体变体”是指在天然抗体可变区结构域中包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入的抗体多肽序列。变体可与未修饰的抗体大体上同源或大体上同一。

如本文中所使用的，“嵌合抗体”是指包含来源于通常源自不同物种的两种不同的抗体(参见，美国专利No.4,816,567)的序列的抗体。最常见地，嵌合抗体包含人和啮齿类动物的抗体片段，通常是人恒定区和小鼠可变区。

“中和抗体”是能够消除或显著减弱其结合的抗原的生物功能的抗体分子。因此，“中和”抗体能够消除或显著减弱生物功能，例如酶活性、配体结合或细胞内信号转导。

“分离的”抗体是已被鉴定并且与其天然环境的组分分离和从其回收的抗体。其天然环境的污染组分是可干扰所述抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化为(1)如通过Lowry法测定的，按抗体重量计高于95％，最优选按重量计高于99％，(2)足以通过使用旋杯式序列分析仪(spinning cup sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染法进行的SDS-PAGE纯化为均质)。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一个组分可以不存在。然而，通常地分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文中所使用的，“特异性结合”是“抗原特异性的”，是“特异于”抗原的或与抗原“免疫反应的”的抗体是指以大于对于相似序列的其它抗原的亲和力的亲和力结合抗原的本发明的抗体或多肽结合剂。在一个方面，本发明的多肽结合剂或其片段、变体或衍生物将以与其对其它物种(即非人物种)的相似抗原的结合亲和力相比较更大的亲和力结合人抗原，但识别并且结合靶的直系同源物的多肽结合剂在本发明的范围内。

例如，作为“特异于”其同源抗原的抗体或其片段的多肽结合剂显示抗体的可变区识别并且以可检测的偏爱性结合期望的抗原(例如，当期望的抗原是多肽时，抗体的可变区能够通过结合亲和力的可测量的差异区别抗原多肽与相同家族的其它已知多肽，尽管在家族成员之间可能存在局部序列同一性、同源性或相似性)。应理解，特异性抗体也可通过与抗体的可变区外的序列，特别地分子的恒定区中的序列的相互作用与其它蛋白质(例如，在ELISA技术中，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或其它抗体)相互作用。用于本发明的方法的测定多肽结合剂例如抗体的结合特异性的筛选测定法在本领域是公知的并且在本领域中进行常规地实施。关于此类测定法的综述，参见Harlow等人(编)，Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6章。用于本发明的抗体可使用本领域已知的任何方法来产生。

术语“表位”是指任何分子的能够被选择性结合剂在一个或多个抗原结合区上识别和结合的部分。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖类侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。本文中使用的表位可以是连续的或非连续的。

术语“衍生物”，当与本发明的多肽结合剂和多肽结合使用时，是指通过这类技术(如遍在蛋白化、至治疗剂或诊断剂的缀合、标记(例如，利用放射性核素或不同的酶)、共价聚合物连接例如PEG化(利用聚乙二醇的衍生化)和通过通常不存在于人蛋白质中的氨基酸例如鸟氨酸的化学合成产生的插入或置换)来化学修饰的多肽。衍生物保持本发明的未衍生的分子的结合性质。

“可检测的部分”或“标记”是指可通过分光光度计、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记包括³²P、³⁵S、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，常用于ELISA的)、生物素-链霉抗生物素蛋白、地高辛、半抗原和针对其的抗血清或单克隆抗体是可获得的蛋白质或具有与另一种标记的核酸分子的序列互补性的核酸分子。可检测的部分通常产生可测量的信号，例如放射性、生色或荧光信号，所述信号可用于定量样品中结合的可检测部分的量。

“肽”或“寡肽”是短氨基酸序列，通常在长度上为3至100个氨基酸残基并且包括天然存在的氨基酸残基和残基的非天然存在类似物(其可被单独使用或可与天然存在的氨基酸残基组合使用以给肽提供特殊构象特异性或特殊生物活性，例如对蛋白酶解的抗性)。肽包括肽序列的重复，可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝的头尾或头头相接排列的氨基酸序列。可将肽缀合于非肽部分，例如[扩展]。肽包括二聚体、三聚体或高级多聚体(例如，通过缀合于其它聚合物或非聚合物部分例如PEG形成的)。

“多肽”是更长的氨基酸序列，通常在长度上为100或更多个氨基酸残基，并且包括天然存在的氨基酸残基和残基的非天然存在类似物，所述类似物可被单独使用或可与天然存在的氨基酸残基组合使用以给多肽提供特殊构象特异性或特殊生物活性，例如对蛋白酶解的抗性。

如本文中所使用的，“肽”是包含一个或多个融合至所有或部分免疫球蛋白(Ig)恒定区的肽的融合多肽。参见，例如，美国专利No.6,660,843。肽可以是结合抗原的任何天然存在或重组制备或化学合成的肽。肽可以是重复的，可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝的头尾或头头相接排列的氨基酸序列。Ig恒定区的部分可包括至少一个恒定区结构域(例如，CH1、CH2、CH3和/或CH4)、多个结构域(例如，CH2和CH3)、多个拷贝的结构域(例如，CH2-CH2)、保持期望的活性的恒定结构域的任何片段，例如负责循环中免疫球蛋白的延长的半衰期的清道夫受体表位，或其任何组合。

“小”分子或“小”有机分子在本文中被定义为具有约1000道尔顿或更小的分子量的非聚合物有机化合物。

如本文中所使用的，“信号复合物”是蛋白质和/或内源或外源化合物的装配体，其可介导细胞信号的转导。信号复合物的实例包括但不限于与膜结合受体结合的配体、与底物结合的酶和与传播参与信号级联的生化反应相关的任何细胞分子。信号复合物还可包括共受体、辅因子、支架蛋白、变构调节剂和许多其它类型的参与细胞信号转导的蛋白质和分子。信号复合物可短暂形成或可长期形成。信号复合物的分子成份(constituent)或组分可随时间过去而变化并且可取决于各组分的激活状态和细胞环境。信号复合物可经历可化学修饰和调节，所述修饰和调节可诱导连串的对复合物的作用，包括转导活性的微妙改变、完全灭活和基本灭活或正调节及负调节。信号复合物的组分可以是蛋白质，例如附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白，其可与其它蛋白质和/或化合物缔合存在于复合物中(“复合的”)或与其分开地存在(“未复合的”)。

术语“治疗有效量”在本文中用于表示有效地改善或减轻与信号复合物的异常(例如，异常高或异常低)信号转导相关的疾病的症状或体征的本发明的动力学调节剂组合物的量。

如本文中所使用的，“结合”是两种或更多种不同的分子实体之间物理缔合，其因由一种或多种弱力(包括氢键、范德瓦尔斯、离子-偶极和疏水作用)和强力离子键组成的非共价相互作用的特定网络而引起。结合的水平或程度可用亲和力来测量。亲和力或“结合亲和力”是两个或更多个不同分子实体之间的结合相互作用的强度的量度，其可通过平衡结合常数或动力学结合率参数来确定。适当的常数或参数以及它们的测量单位的实例在本领域是公知的，包括但不限于平衡结合常数(K_A)，例如，约10⁵M^-1或更高，约10⁶M^-1或更高，约10⁷M^-1或更高，约10⁸M^-1或更高，约10⁹M^-1或更高，约10¹⁰M^-1或更高，约10¹¹M^-1或更高或约10¹²M^-1或更高；平衡离解常数(K_D)，例如，约10^-5M或更小，或约10^-6M或更小，或约10^-7M或更小，或约10^-8M或更小，或约10^-9M或更小，或约10^-10M或更小，或约10^-11M或更小，或约10^-12M或更小；结合速率(例如，秒^-1，mol^-1)和解离速率(例如，秒^-1))。在K_A的情况下，更高的值表示“更强”或“增强的”结合亲和力，而在K_D的情况下，更低的值表示“更强”或“增强的”结合亲和力。如本文中所使用的，“增强的”结合率参数表示增加的停留时间、更快的缔合或更慢的解离。如本文中所使用的“减弱的”结合率参数表示减少的停留时间、更慢的缔合或更快的解离。在结合速率的情况下，更高的值表示更快或更频繁的缔合，从而通常导致增强的结合亲和力。在解离速率的情况下，更低的数值通常表示更慢的解离，从而通常导致更强的结合亲和力。然而，结合速率与解离速率的比率表明结合亲和力，如在后面更详细地解释的。

可直接或间接测量两种化合物之间，例如抗体与抗原之间或信号复合物的第一组分和第二组分之间的亲和力。可使用表示亲和力和/或与亲和力成比例的替代性质进行亲和力的间接测量。此类替代性质包括：信号复合物的第一组分与第二组分的结合的量或水平，或预示着第一组分对第二组分的表观结合亲和力或与第一组分对第二组分的表观结合亲和力相关的第一组分或第二组分的生物物理特征。具体实例包括在第一组分或第二组分的亚饱和浓度上测量第一组分对第二组分的结合的量或水平。可测量的其它生物物理特征包括但不限于第一组分和第二组分之一或两者的净分子电荷、旋转活性(rotational activity)、扩散速率、解链温度(melting temperature)、静电牵引(electrostatic steering)或构象。可测量的其它生物物理特征包括测定在不同温度、pH或离子强度的影响下结合相互作用的稳定性。

测量的亲和力取决于进行测量所使用的确切条件，包括，除许多其它因素外，结合组分的浓度、测定设置、结合组分的效价、缓冲液组成、pH、离子强度和温度以及添加至结合反应的其它组分例如变构调节剂和调控剂。可将定量和定性方法用于测量结合相互作用的绝对强度和相对强度。

表观亲和力是在其中亲和力在结合反应中被条件或组分例如变构调节剂、抑制剂、结合组分效价等改变的条件下，两种或更多种不同分子实体之间的结合相互作用的强度的量度。

如本文中所使用的，“亚饱和浓度”是结合反应中显著低于结合亲和力K_D的一种或多种组分的浓度和/或在结合反应中低于占据其它组分的所有结合位点所需的浓度的一种组分的浓度。在亚饱和条件下，结合反应中显著百分比的结合组分之一具有可用的结合位点。

如本文中所使用的，“生物物理测定法”是以绝对或相对方式测量至少两种化合物之间的结合、缔合、解离、结合亲和力、结合水平或结合率参数的任何方法。生物物理测定法通常在体外进行并且可用纯化的结合组分、未纯化的组分、细胞结合的组分以及纯化的组分与细胞结合的组分的组合来进行。

激动剂是用于描述结合并且激活信号复合物组分的信号转导的一种类型的配体或药物的术语。改变信号复合物组分(例如受体)的活性的能力(也称为激动剂的功效)是区别其与拮抗剂(一种也结合信号复合物组分但不激活信号复合物组分的信号转导的受体配体)的性质。激动剂的功效可以是正的，引起信号复合物组分的活性增加，或可以是负的，引起信号复合物组分的活性的减弱。完全激动剂结合并且激活信号复合物组分，在该信号复合物上展示完全的功效。部分激动剂也结合并且激活给定的信号复合物组分，但相对于完全激动剂在所述信号复合物组分上只具有部分功效。反激动剂是结合与该信号复合物组分的激动剂相同的信号复合物组分结合位点并且逆转信号复合物组分的组成型活性的试剂。反激动剂产生激动剂的相反药理作用。共激动剂与其它共激动剂一起作用以一起产生期望的作用。

在不同方面，本文中公开的激动剂用作变构激动剂。它们结合受体的部分，所述部分与活性配体结合位点不同，并且未明显改变配体与受体的结合亲和力，例如它们使结合亲和力的改变小于2倍或3倍。它们也未明显地影响其受体的配体激活的EC50，例如它们使EC50的改变小于2倍或3倍。此类变构激动剂以最大激动剂反应组成型地激活受体，所述最大激动剂反应为配体的最大激动剂反应的80％或更低，例如15％-80％、20-80％、20-60％、20％-40％或15％-30％。在某些实施方案中，变构激动剂以最大激动剂反应组成型地激活受体，所述最大激动剂反应为配体的最大激动剂反应的至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％；和达到配体的最大激动剂反应的45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。应理解，可设想这些范围端点的任何端点的任何组合而不必引述每一个可能的组合。在其它实施方案中，本发明提供了以10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9M或更小(其中更小的数值表示更大的结合亲和力)的K_D亲和力结合受体的变构激动剂。不希望受本发明的理论束缚，变构激动剂的弱激动剂活性用于模拟天然基线配体激活水平的作用，同时允许外源施用的配体具有其正常作用。在某些实施方案中，变构激动剂是部分变构激动剂。拮抗剂阻断激动剂对受体的激活。选择性激动剂对于一种特定类型的信号复合物组分具有选择性。此外，其还可以是上述类型的任何类型。在示例性实施方案中，本发明提供了变构激动剂多肽结合剂，例如抗体，所述多肽结合剂以至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9M或更小(其中更小的数值表示更大的结合亲和力)的亲和力结合附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中的任何分泌性蛋白，和(a)当在体外测定中测量时展示为天然配体的最大激动剂活性的20％-80％的最大激动剂活性，(b)当存在时，对配体对于受体的EC50的改变不超过2倍，以及(c)当存在时，对配体对于受体的KD的改变不超过2倍。

激动剂的效力通常利用其EC50值的倒数来确定。可通过测定引起激动剂的半数最大生物反应所需的激动剂的浓度来计算给定的激动剂的EC50值。EC50值越低，激动剂的效力越大。

拮抗剂是一种类型的配体或药物，其在结合信号复合物组分(例如，受体)时本身不引发生物反应，但阻断或减弱激动剂介导的反应。拮抗剂对它们的同源信号复合物组分可具有亲和力但不具有功效，并且结合会破坏相互作用，从而抑制激动剂或反激动剂在受体上的功能。拮抗剂通过结合信号复合物组分上的活性位点或变构位点来介导它们的作用，或它们在通常不参与信号复合物组分的活性的生物调控的唯一结合位点上相互作用。拮抗剂活性可以是可逆的或不可逆的，这取决于拮抗剂-受体复合物的寿命，这从而取决于结合信号复合物组分的拮抗剂的性质。大部分拮抗剂通过与内源配体或底物在受体上的结构确定的结合位点上竞争来发挥它们的效力。

拮抗剂未显示激活它们所结合的信号复合物组分的功效。然而，一旦结合，拮抗剂可抑制激动剂、反激动剂和部分激动剂的功能。在功能性拮抗剂测定中，剂量-反应曲线测量一系列浓度的拮抗剂逆转激动剂的活性的能力的效力。拮抗剂的效力通常通过其IC50值来确定。可通过测定引起激动剂的最大生物反应的一半抑制所需的拮抗剂的浓度来计算给定的拮抗的IC50值。IC50越低，拮抗剂的效力越大。

竞争性拮抗剂在与配体或激动剂相同的结合位点(活性部位)可逆地结合信号复合物组分，但不激活信号复合物组分，从而与激动剂竞争信号复合物组分上的相同结合位点。非竞争性或变构拮抗剂结合与激动剂的结合位点分开的结合位点，通过该分开的结合位点将它们的作用施加于该信号复合物组分。因此，它们不与激动剂竞争结合。无竞争拮抗剂与非竞争性拮抗剂相异在于在它们可结合分开的变构结合位点之前，它们需要信号复合物组分激活。

鉴定动力学调节剂的方法

不受本发明的理论束缚，本公开内容提供了信号复合物的两个组分(第一组分，C1和第二组分，C2)与动力学调节剂(M)之间的相互作用的动力学干扰(kinetic perturbation)可在被数学上描述为：

K’C1C2＝KC1C2(1+M/KMC1)(1+M/KMC2)

          (1+M/K_[C1C2]M)

其中组分之间的结合平衡常数(K′_C1C2)的变化是组分之间的平衡常数(K_C1C2)、动力学调节剂浓度(M)、动力学调节剂对于复合物的亲和力(K_[C1C2]M)和动力学调节剂对于第一组分(K_MC1)或第二组分(K_MC2)的亲和力的函数。

在其中信号复合物是受体-配体复合物并且调节剂是抗体的情况下，抗体对受体-配体相互作用的动力学干扰在数学上可被描述为：

${K^{\′}}_{\mathrm{RL}}=K_{\mathrm{RL}}\frac{(1+\frac{A}{K_{\mathrm{AR}}})(1+\frac{A}{K_{\mathrm{AL}}})}{(1+\frac{A}{K_{\left[\mathrm{RL}\right]A}})}$

其中受体-配体结合平衡常数(K′_RL)的变化是受体-配体平衡常数(K_RL)、抗体浓度(A)、抗体对于复合物的亲和力(K_[RL]A)和抗体对于受体(K_AR)或配体(K_AL)的亲和力的函数。

动力学调节剂以使靶对于其信号转导伴侣的结合亲和力或结合率参数减弱或增强的方式结合靶或其信号转导伴侣、或靶与信号转导伴侣的复合物。例如，当靶是受体或配体时，配体对于其受体的结合亲和力或结合率参数在动力学调节剂存在的情况下被减弱或增强。具有完全阻断活性的动力学调节剂在该分析中代表了边界条件，因为当K_[C1C2]M充分高时，K′_C1C2接近无穷大。该模型的一个含意(implication)是当动力学调节剂的浓度([M])高于动力学调节剂/抗原相互作用的平衡离解常数(K_D)足以饱和结合配体时，信号转导调节的程度不依赖于动力学调节剂浓度([M])。因此，相互作用的调节与对于复合物的亲和力相对对于组分的亲和力的比率相关，其中[M]大于调节剂与其抗原的K_D。

本公开内容提供了：动力学调节剂与靶和/或其信号转导伴侣相互作用的生物物理性质可用于预测动力学调节剂对靶信号转导途径的功能作用。因此，可基于它们的对于以复合形式存在的靶(和/或其信号转导伴侣)相对于以未复合形式存在的靶(和/或其信号转导伴侣)的相对亲和力来鉴定改变信号转导途径的动力学调节剂。本发明预期可以以下列方式预测动力学调节剂(M)对信号复合物的两个组分(第一组分，C1和第二组分，C2)之间的相互作用的动力学干扰：

K_[C1C2]M或K_[MC2]C1或K_[MC1]C2＜K_MC2或K_MC1导致正动力学调节

K_[C1C2]M或K_[MC2]C1或K_[MC1]C2＝K_MC2或K_MC1不导致动力学调节

K_[C1C2]M或K_[MC2]C1或K_[MC1]C2＞K_MC2或K_MC1导致负动力学调节

在其中信号复合物是受体(R)-配体(L)复合物，并且动力学调节剂是抗体(A)的情况下，可以以下列方式预测动力学干扰：

K_[RL]A或K_[AL]R或K_[AR]L＜K_AL或K_AR导致正动力学调节

K_[RL]A或K_[AL]R或K_[AR]L＝K_AL或K_AR不导致动力学调节

K_[RL]A或K_[AL]R或K_[AR]L＞K_AL或K_AR导致负动力学调节

在某些实施方案中，动力学调节剂例如抗体(A)可通过其在第一组分或第二组分的任何给定的亚饱和浓度(例如配体(L)浓度)上改变结合相互作用例如受体(R)-配体(L)相互作用的能力来鉴定，如图3A中所描述的。图3A中的数据产生自可逆的相互作用模型，假定受体配体相互作用的亲和力为10pM、500pM或10nM。动力学调节剂可有效地使受体配体相互作用的亲和力和相应的剂量反应从500pM相互作用偏移至如所描绘的10pM(正调节剂)或10nM(负调节剂)。在某些实施方案中，动力学调节剂在给定的配体浓度上将产生更高水平的R-L结合，使测定曲线向左偏移(正调节)。在其它实施方案中，动力学调节剂在给定的配体浓度上产生更低水平的R-L结合，使测定曲线向右偏移(负调节)。在某些实施方案中，偏移是一致的，如图3A显示的。在其它实施方案中，偏移是不一致的，这反映了复合物中包括其它因子例如辅助蛋白、受体内化等。将图3A的500pM亲和力处的数据用于产生图3B和3C，其中描述了不同浓度的非激动剂(图3B)或激动剂(图3C)抗体对信号转导的作用，假定抗原的浓度是固定。

对于举例说明性靶，胰岛素受体的结合特征与功能作用的相互关系描述于下面表1中。

表1

显示预测的效应匹配结合特征的数据的举例说明性实例示于下面表2中。

表2

^*在胰岛素不存在的情况下该克隆的结合是明显的，但不足以强至在该测定中被精确地测量。

^#在测试抗体的饱和浓度(2-20ug/ml)下进行测定。在10ug/ml同种型对照Ab存在的情况下胰岛素EC₅₀＝0.44nM。

因此，调节剂与靶、其信号转导伴侣和/或包含靶和其信号转导伴侣的复合物之间的相互作用的结合性质通常预示着动力学调节剂对靶信号转导途径的功能作用。取决于被研究的靶，可能需要考虑某些其它因素。这些因素包括：(1)动力学调节剂的浓度、靶的浓度和/或其信号转导伴侣的浓度(例如，如果动力学调节剂浓度([M])显著大于动力学调节剂与其抗原之间的结合的K_D，则预测得到最优化)，(2)所使用的动力学调节剂的结构形式，例如单价体(monovalent)对二价体(divalent)或双价体(bivalent)，(3)靶间/靶内交联，这可限制靶的构象和/或引起靶激活，(4)动力学调节剂通过立体化学或变构机制改变信号复合物的装配或停靠或改变信号复合物的另外组分的能力，(5)信号转导途径特异性性质，例如因引入“瓶颈(bottleneck)”的疾病而引起的信号途径的改变，(6)信号转导途径的负/正反馈调节，(7)信号复合物的组分的清除/内化率的改变，(8)靶中使配体结合与激活解偶联或差异改变的改变，例如调节剂增强配体结合但将其受体捕获在脱敏状态，或调节剂减弱配体结合但诱导其正在激活的受体的构象变化。

在某些方面，本发明提供了用于测量在测试多肽试剂存在或不存在的情况下，信号复合物的第一组分对信号复合物的第二组分的差异结合的方法。在这些方面，当存在第一组分或第二组分差异的亚饱和浓度时，优选观察到差异结合。在某些优选实施方案中，可减小第一组分或第二组分的浓度以提供亚饱和条件。

在某些方面，本发明提供了用于测量测试多肽结合剂例如抗体对以复合形式和未复合形式存在的靶和/或其信号转导伴侣的差异结合的方法。在这些方面，当存在亚饱和浓度的测试多肽结合剂时，优选观察到差异结合。在某些优选实施方案中，可减小测试多肽结合剂的浓度以提供亚饱和条件。

在某些实施方案中，使用对照化合物在测试多肽试剂不存在的情况下进行测试，所述对照化合物优选为属于结构与测试多肽试剂相似的种类的化合物，但其结合对待测试的信号复合物没有影响的不同抗原。例如，测试抗体的对照可以是结合无关抗原例如钥孔血蓝蛋白(KLH)的同种型匹配的抗体。

对于正调节剂，在给定的C1的亚饱和浓度上，更高的C1亲和力将反映在正调节剂存在的情况下更高的C1对C2结合的信号上。动力学调节剂的优先结合将反映在与单独的C1或单独的C2的信号相比较更高的包含C1和C2的复合物的信号上。在某些方面，可存在动力学调节剂对C1和C2的复合物的结合，但无可测量的对单独的C1或单独的C2的结合。

对于负调节剂，在给定的C1的亚饱和浓度上，更低的C1亲和力将反映在调节剂存在的情况下更低的C1对C2结合的信号上。动力学调节剂的优先结合将反映在与动力学调节剂对C1和C2的复合物的结合的信号相比较更高的动力学调节剂对单独的C1或单独的C2的结合的信号上。

本发明提供了鉴定候选多肽结合剂例如抗体的方法，所述多肽结合剂调节信号复合物的第一组分和第二组分之间的结合。这样的第一组分和/或第二组分的实例包括附录A(或SEQ ID NOS：1-88)的分泌性蛋白的任何分泌性蛋白以及此类分泌性蛋白的内源或外源信号转导伴侣，其可以是蛋白质或非蛋白质的，但其任选地可不包括离子和盐。在某些实施方案中，第一组分和第二组分是多肽。在示例性具体实施方案中，第一组分和第二组分是内源的。

其它实例包括TNFα、CD3、CD4、CD20、VEGF-A、CD25、HER-2、EGFR、CD33、CD52、EPO、胰岛素、INSR、人生长激素、GM-CSF、G-CSF、IL-2、TPO、神经营养因子(NGF、NT-3、NT-4、GDNF)、IFNβ、TGFβ、TNFα、FGFR4、CETP、瘦素受体、IL-10、IL-10受体α、IL-10受体β、生长激素受体、IL-13受体、IL-18受体、IL-2受体α亚基、补体因子C5a、IL-17受体、IL-20受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-9受体、干扰素I型受体1(IFNAR1)、干扰素I型受体2(IFNAR2)、淋巴细胞功能抗原-3受体、单核细胞趋化蛋白1配体、NGF受体、IL-6、IL-6受体之任一种。它们的序列在本领域是公知的并且来自NCBI的基因库数据库的代表性登录号和氨基酸序列示于下面。NCBI手册[Internet].Bethesda(MD)：国立医学图书馆(US)，美国国家生物技术信息中心；2002年10月.第18章。参照序列(RefSeq)项目。提及本文中附录A或SEQ ID NOS：1-88所示的任何蛋白质包括提及其任何天然存在的人等位基因变体，例如包括与SEQ ID NO：1-88中任一项的代表性序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的氨基酸序列的那些等位基因变体，或包含由可以例如在严格杂交条件(例如在42℃下于50％甲酰胺，5X SSC，20mM Na·PO4，pH 6.8中杂交；然后在1X SSC中55℃下洗涤30分钟)下使用编码SEQ ID NOs：1-88中任一项或其片段的核酸分子(在长度上为至少约20、30、40、50或更多个碱基)从人基因组DNA或cDNA文库获得的核酸分子编码的氨基酸序列的那些等位基因变体。

在一个方面，鉴定候选动力学调节药物的方法包括(a)测量在测试多肽结合剂例如抗体存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数，(b)测量在所述测试多肽结合剂不存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(c)当所述测试多肽结合剂在于步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数上显示至少1.5倍差异时，将所述测试多肽结合剂鉴定为候选动力学调节药物。在某些实施方案中，结合亲和力或结合率参数的差异在约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍之间，或约1.5倍至约100倍之间，或约2倍至25倍之间，或约2倍至约50倍之间，或约1.5倍至约25倍之间，或约1.5倍至约50倍之间。

在某些实施方案中，如果测试多肽试剂增强所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数，则测试多肽结合剂被鉴定为候选正调节剂。在其它实施方案中，如果测试多肽试剂减弱所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数，则测试多肽试剂被鉴定为候选负调节剂。

具体的结合亲和力值或结合率参数值的改变(增加或减小)是表示“增强的”(或更强的)还是“减弱的”(或更弱的)结合亲和力或结合率参数取决于参数的值和其单位，并且在本领域是公知的。例如，在参数K_A的情况下，更高的值表示“增强的”结合亲和力，这样约10⁶M^-1的K_A比约10⁵M^-1的K_A强。作为另一个实例，在参数K_D的情况下，更低的值表示“增强的”结合亲和力，这样约10^-6M的K_D比约10^-5M的K_D更强。相反地，在K_A的情况下，更低的值表示“减弱的”结合亲和力，这样，约10⁵M^-1的K_A与约10⁶M^-1的K_A相比较是减弱的结合亲和力。作为另一个实例，在K_D的情况下，更高的值表示“减弱的”结合亲和力，这样约10^-5M的K_D与约10^-6M的K_D相比较是减弱的结合亲和力。

如本文中所使用的，“增强的”结合率参数表示增加的停留时间、更快的缔合或更慢的解离。如本文中所使用的，“减弱的”结合率参数表示减少的停留时间、更慢的缔合或更快的解离。

结合亲和力还可通过结合速率与解离速率结合率参数的比率来确定。通常，在结合率的情况下，更高的值表示更快或更强的缔合或增加的停留时间，并且通常导致更强的结合亲和力。相反地，更低的结合率的值表示更慢或更弱的缔合或减少的停留时间，并且通常导致更弱的结合亲和力。通常，在解离速率的情况下，更高的值表示更快的离解或减少的停留时间，并且通常导致更弱的结合亲和力。相反地，更低的解离速率的值表示更慢的离解或增加的停留时间，并且通常导致更强的结合亲和力。这是因为解离速率对结合速率或结合速率对解离速率的比率表示如下列公式中所示的结合亲和力。

作图：解离速率；结合速率

其中

$A+L\underset{\underset{K_{\mathrm{off}}}{\←}}{\overset{K_{\mathrm{on}}}{\→}}\mathrm{AL}$

即使当结合亲和力是不可检测的或未被显著改变时，然而，停留时间的改变，即增加的停留时间(通过增加的结合速率或减小的解离速率)或减少的停留时间(通过减小的结合速率或增加的解离速率)仍然可导致信号转导途径的差异激活。例如，在某些情况下，当受体可激活两个不同途径时，所述途径相异在于完全作用所需的受体激活的程度。一个信号途径可在低水平的受体激活或停留时间上被完全激活，而第二途径的完全激活需要更高水平的受体激活或停留时间。

在另一个方面，鉴定候选动力学调节药物的方法包括(a)(i)测量在所述第二组分存在的情况下，测试多肽结合剂例如抗体对于所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或(ii)测量在所述第一组分存在的情况下，测试多肽结合剂对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(b)(i)测量在所述第二组分不存在的情况下，所述测试多肽结合剂对于所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或(ii)测量在所述第一组分不存在的情况下所述测试多肽结合剂对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和(c)当所述测试多肽结合剂在于步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数上显示至少1.5倍(即，50％)的差异时，将所述测试多肽结合剂鉴定为候选动力学调节药物。

在某些实施方案中，如步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的至少1.5倍(即，50％)，那么测试多肽结合剂被鉴定为候选正调节剂。在具体实施方案中，步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍(步骤(a)对步骤(b))，或约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍。

在其它实施方案中，如果步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的至少1.5倍(即，50％)，那么测试多肽结合剂被鉴定为候选负调节剂。在具体实施方案中，步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍(步骤(b)对步骤(a))，或约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍.

在某些实施方案中，测量测试多肽结合剂对于单独的第一组分的结合亲和力或结合率参数。在某些实施方案中，测量测试多肽结合剂对于单独的第二组分的结合亲和力或结合率参数。

在某些实施方案中，如果选自(A)测试多肽结合剂对于包含第一组分和第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[C1C2]M，(B)第一组分对于包含多肽结合剂和第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC2]C1，或(C)第二组分对于包含多肽结合剂和第一组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC1]C2，的一个或多个结合亲和力或结合率参数的强度为选自(1)测试多肽结合剂对于单独的第二组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC2，或(2)测试多肽结合剂对于单独的第一组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC1，的一个或多个结合亲和力或结合率参数的至少1.5倍，那么测试多肽结合剂被鉴定为候选正调节剂。在某些实施方案中，(A)、(B)或(C)的任一个或多个的具体结合亲和力或结合率参数的强度为(1)或(2)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍；或可选择地，约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍。例如，在某些实施方案中，(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数强于(1)和(2)的结合亲和力或结合率参数。在某些实施方案中，(1)的结合亲和力或结合率参数比(2)的结合亲和力或结合率参数强。在其它实施方案中，(2)的结合亲和力或结合率参数比(1)的结合亲和力或结合率参数强。在某些实施方案中，测量和比较两个或更多个结合亲和力或结合率参数，例如解离速率和结合速率，或K_A和K_D，或其任何组合。

在具体的实施方案中，其中所测量的结合亲和力是平衡离解常数K_D，K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个为K_MC2或K_MC1的任一个的例如约2/3至任选地1/1000。类似地，其中所测量的结合亲和力是解离速率，(A)[C1C2]与M或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的解离速率的任一个为(1)M与C2或(2)M与C1之间的解离速率的任一个的例如约2/3至任选地1/1000。在一个示例性实施方案中，K_[C1C2]M为K_MC2的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_[MC2]C1为K_MC2的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_[MC1]C2为K_MC2的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_[C1C2]M为K_MC1的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_[MC2]C1为K_MC1的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_[MC1]C2为K_MC1的约2/3至任选地1/1000。对于(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的每一个解离速率，与(1)M与C2或(2)M与C1之间的每一个解离速率相比较，可预期类似的实例。

相反地，当所测量的结合亲和力为平衡缔合常数K_A时，K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个为K_MC2或K_MC1的任一个的例如约1.5倍至任选地1000倍。类似地，当所测量的结合亲和力为结合速率时，(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1、或(C)[MC1]与C2之间的结合速率的任一个为(1)M与C2或(2)M与C1之间的结合速率的任一个的例如约1.5倍至任选地1000倍。在一个示例性实施方案中，K_[C1C2]M为K_MC2的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_[MC2]C1为K_MC2的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_[MC1]C2为K_MC2的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_[C1C2]M为K_MC1的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_[MC2]C1为K_MC1的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_[MC1]C2为K_MC1的约1.5倍至任选地1000倍。对于(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的每一个结合速率，与(1)M与C2或(2)M与C1之间的每一个结合速率相比较，可预期类似的实例。

在某些实施方案中，如果选自(1)测试多肽结合剂对于单独的第二组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC2，或(2)测试多肽结合剂对于单独的第一组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC1，的一个或多个结合亲和力或结合率参数的强度为选自(A)测试多肽结合剂对于包含第一组分和第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[C1C2]M，(B)第一组分对于包含多肽结合剂和第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC2]C1，或(C)第二组分对于包含多肽结合剂和第一组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC1]C2，的一个或多个结合亲和力或结合率参数的至少约1.5倍，那么测试多肽结合剂被鉴定为候选负调节剂。在某些实施方案中，(1)或(2)的任一个或多个的具体结合亲和力或结合率参数的强度为(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍(即，50％)至任选地约1000倍；或可选择地，约1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到500倍，或达到200倍，或达到150倍，或达到100倍，或达到90倍，或达到80倍，或达到70倍，或达到60倍，或达到50倍，或达到40倍，或达到30倍。在某些实施方案中，(1)或(2)的任一个的结合亲和力或结合率参数都强于(A)、(B)和(C)的结合亲和力或结合率参数。在某些实施方案中，(1)的结合亲和力或结合率参数强于(2)的结合亲和力或结合率参数。在其它实施方案中，(2)的结合亲和力或结合率参数强于(1)的结合亲和力或结合率参数。在某些实施方案中，测量和比较两个或更多个结合亲和力或结合率参数，例如解离速率和结合速率，或K_A和K_D，或其任何组合。

在具体实施方案中，当所测量的结合亲和力为平衡离解常数K_D时，K_MC2或K_MC1的任一个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个的例如约2/3至任选地1/1000。类似地，当所测量的结合亲和力为解离速率时，(1)M与C2或(2)M与C1之间的解离速率的任一个为(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的解离速率的任一个的例如约2/3至任选地1/1000。在一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[C1C2]M的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[MC2]C1的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[MC1]C2的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[C1C2]M的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[MC2]C1的约2/3至任选地1/1000。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[MC1]C2的约2/3至任选地1/1000。对于(1)M与C2或(2)M与C1之间的每一个解离速率，与(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的每一个解离速率相比较，可预期类似的实例。

相反地，当结合亲和力为平衡缔合常数K_A时，K_MC2或K_MC1的任一个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个的例如约1.5倍至任选地1000倍。类似地，当所测量的结合亲和力为结合速率时，(1)M与C2或(2)M与C1之间的结合速率的任一个为(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1、或(C)[MC1]与C2之间的结合速率的任一个的例如约1.5倍至任选地1000倍。在一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[C1C2]M的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[MC2]C1的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_MC2为K_[MC1]C2的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[C1C2]M的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[MC2]C1的约1.5倍至任选地1000倍。在另一个示例性实施方案中，K_MC1为K_[MC1]C2的约1.5倍至任选地1000倍。对于(1)M与C2或(2)M与C1之间的每一个结合速率，与(A)[C1C2]与M、或(B)[MC2]与C1或(C)[MC1]与C2之间的每一个结合速率相比较，可预期类似的实例。

在这些实施方案的任一个中，可将测试多肽结合剂和第二组分与多个不同浓度的所述第一组分接触。在这些实施方案的任一个中，可将测试多肽结合剂和第一组分与多个不同浓度的所述第二组分接触。在这些实施方案的任一个中，可将多个不同浓度的测试多肽结合剂与所述第一组分和所述第二组分接触。

当测定测试多肽结合剂对第一组分与第二组分之间的结合相互作用的影响时，在某些具体实施方案中，当测试多肽结合剂的抗原是第一组分例如配体时，所述测试多肽结合剂与第一组分的浓度相比较处于饱和浓度。可选择地，当测试多肽结合剂的抗原为第二组分例如受体时，所述测试多肽结合剂与第二组分的浓度相比较处于饱和浓度。在某些实施方案中，测试多肽结合剂的浓度高于或等于测试多肽结合剂对于包含第一组分和第二组分的复合物的K_D。在其它实施方案中，第二组分的浓度低于测试多肽结合剂对于第一组分例如配体的K_D。在其它实施方案中，第一组分例如配体的浓度处于第一组分与第二组分例如受体的结合的亚饱和浓度。在某些实施方案中，第一组分例如配体的浓度在第一组分与第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。在某些实施方案中，在一个或多个浓度的第二组分例如配体存在的情况下，将一个或多个浓度的测试多肽结合剂与多个不同浓度的第一组分例如受体接触。在某些实施方案中，在一个或多个浓度的第一组分例如配体存在的情况下，将一个或多个浓度的测试多肽结合剂与多个不同浓度的第二组分例如受体接触。

当测定测试多肽结合剂与复合的靶和/或信号转导伴侣相对于对未复合的靶和/或信号转导伴侣的差异结合以鉴定正调节剂时，在某些实施方案中，测试多肽结合剂对于包含第一组分和第二组分的复合物处于饱和浓度。在某些实施方案中，测试多肽结合剂的浓度大于或等于测试多肽结合剂对于包含第一组分例如配体和第二组分例如受体的复合物的K_D。在其它实施方案中，第二组分例如受体的浓度大于第二组分例如受体对于第一组分例如配体的K_D。在其它实施方案中，第一组分例如配体的浓度对于第二组分例如受体是饱和浓度。在其它实施方案中，测试多肽结合剂对于包含第一组分和第二组分的复合物处于亚饱和浓度。在某些实施方案中，多肽结合剂的浓度在第一组分与第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。在某些实施方案中，第二组分例如受体的浓度大于第二组分例如受体对于第一组分例如配体的K_D。在某些实施方案中，第一组分例如配体的浓度对于第二组分例如受体是饱和浓度。

当测定测试多肽结合剂对复合的靶和/或信号转导伴侣相对于对未复合的靶和/或信号转导伴侣的差异结合以鉴定负调节剂时，在某些实施方案中，当测试多肽结合剂结合的抗原是第一组分例如配体时，测试多肽结合剂对于第一组分处于亚饱和浓度。当测试多肽结合剂结合的抗原是第二组分例如受体时，测试多肽结合剂对于第二组分处于亚饱和浓度。在其它实施方案中，多肽结合剂的浓度在第一组分与第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。在其它实施方案中，第二组分例如受体的浓度大于第二组分例如受体对于第一组分例如配体的K_D。在其它实施方案中，第一组分例如配体的浓度对于第二组分例如受体是饱和浓度。

在某些实施方案中，方法还包括测定多种测试多肽结合剂例如抗体与(a)第一组分、(b)第二组分或(c)包含第一组分和第二组分的复合物的任一个的结合亲和力。在某些具体实施方案中，多肽结合剂具有特征例如在于约10^-5M或更小，或约约10^-6M或更小，或约10^-7M或更小，或约10^-8M或更小的平衡离解常数K_D的结合亲和力，其中更低的K_D表示更强的结合亲和力。在某些实施方案中，所筛选的多种测试多肽结合剂是通过向亲代多肽结合剂引入一个或多个不同突变制备的亲代多肽结合剂的变体。

在其它实施方案中，可筛选多肽结合剂与不同结合伴侣(例如诱饵受体、清除受体或备用的信号途径组分)相比对第一组分或第二组分作用的选择性。此类方法可包括鉴定不显著改变第一组分或第二组分对于不同结合伴侣(这样的结合伴侣既不是第一组分也不是第二组分)的结合亲和力或结合率参数的多肽结合剂。在某些实施方案中，多肽结合剂的存在使第一组分或第二组分对于不同结合伴侣的结合亲和力或结合率参数改变不超过5倍，或不超过10倍，或不超过20倍，或不超过30倍，或不超过40倍，或不超过50倍。

上述方法的任何方法还可包括测量在测试多肽结合剂存在和不存在的情况下由信号复合物介导的信号转导的水平，和确定测试多肽结合剂是否额外地是激动剂、部分激动剂、拮抗剂或部分拮抗剂。可在本领域已知的任何体外或体内测定法(包括但不限于磷酸化测定中的信号转导、离子流测定法、分子运输测定法或基因表达测定法)中测量拮抗或激动。

在某些实施方案中，测试多肽结合剂使第一组分例如配体与第二组分例如受体的相互作用的剂量-反应曲线偏移(正或负地)。偏移可表现为至少约1.5倍，例如约1.5倍至约1000倍的增加的或减少的EC₅₀。在某些实施方案中，测试多肽结合剂不显著改变由信号复合物的第一组分与第二组分的相互作用产生的信号的最大激动剂反应。在其它实施方案中，测试多肽结合剂本身用作拮抗剂(例如，减小由所述信号复合物产生的信号转导的最大激动剂反应)或激动剂(例如，增加由所述信号复合物产生的信号转导的最大激动剂反应)。

当测试多肽结合剂用作拮抗剂或部分拮抗剂时，最大激动剂反应可被减小至例如约2/3至约1/100，或约1/2至约1/25，或约2/3至约1/50；或减小约10％、25％、50％(1.5倍)、75％、减小至1/2、1/3或1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。可选择地，当测试多肽结合剂用作激动剂或部分激动剂时，最大激动剂反应可增加例如至少约10％、25％、50％(1.5倍)、75％、增加至2倍、3倍或4、5、6、7、8、9、10倍。此外，当测试多肽结合剂用作拮抗剂或部分拮抗剂时，IC50可以为1x10^-5或更小。测试多肽结合剂可显示其它期望的特征，例如测试多肽结合剂不显著减少所述第一组分或所述第二组分或包含所述第一组分和第二组分的所述信号复合物的清除率。

在相关方面，本发明提供了通过上文中或本申请的任何地方描述的任何方法鉴定的抗体。

具有期望的特征的多肽结合剂

本发明还提供了多肽结合剂例如抗体，其具有某些期望的特征。在某些实施方案中，本发明提供了正调节剂，所述正调节剂(a)以约10^-5M或更小，例如10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小的平衡离解常数K_D结合靶，例如附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白或本文中描述的配体、受体或组分的任一种，和(b)能够将所述靶与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D增加至至少约1.5倍(即，50％)；或增加至约1.5倍至任选地约1000倍，或1.5倍至约100倍，或约2倍至25倍，或约2倍至约50倍，或约1.5倍至约25倍，或约1.5倍至约50倍，例如至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍，或达到约500倍，或达到约200倍，或达到约150倍，或达到约100倍，或达到约90倍，或达到约80倍，或达到约70倍，或达到约60倍，或达到约50倍，或达到约40倍，或达到约30倍。

在其它实施方案中，本发明提供了负调节剂，所述负调节剂(a)以约10^-5M或更小，例如10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小的平衡离解常数K_D结合靶，例如附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白或本文中描述的配体、受体或组分的任一种，和(b)能够使所述分泌性蛋白与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D减小至至多约2/3(即，50％)；或减小至约2/3至任选地约1/1000，或2/3至约1/100，或约1/2至1/25，或约1/2至约1/50，或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至多约2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或达到约1/500，或达到约1/200，或达到约1/150，或达到约1/100，或达到约1/90，或达到约1/80，或达到约1/70，或达到约1/60，或达到约1/50，或达到约1/40，或达到约1/30。

在某些实施方案中，本发明提供了增强信号复合物的第一组分(C1)与第二组分(C2)的结合的调节抗体，所述抗体特征在于下列平衡离解常数K_D的结合性质：(i)所述抗体以约10^-5M或更小，例如10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小的平衡离解常数K_D结合C1、C2或包含C1和C2的复合物(C1C2)的任一种；(ii)K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的任一个比K_AC2或K_AC1的任一个小至少约50％(1.5倍)，其中C1或C2是靶和其信号转导伴侣，任选地附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白。在某些实施方案中，K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的任一个为K_AC2或K_AC1的任一个的约2/3至任选地约1/1000；或2/3至约1/100，或约1/2至1/25、或约1/2至约1/50、或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至多约2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或达到约1/500，或达到约1/200，或达到约1/150，或达到约1/100，或达到约1/90，或达到约1/80，或达到约1/70，或达到约1/60，或达到约1/50，或达到约1/40，或达到约1/30。在某些实施方案中，K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的任一个为K_AC2和K_AC1的至多约2/3至任选地约1/1000，或2/3至约1/100，或约1/2至1/25，或约1/2至约1/50、或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至多约2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或达到约1/500，或达到约1/200，或达到约1/150，或达到约1/100，或达到约1/90，或达到约1/80，或达到约1/70，或达到约1/60，或达到约1/50，或达到约1/40，或达到约1/30。

在某些实施方案中，本发明提供了减弱信号复合物的第一组分(C1)与第二组分的结合的负调节抗体，所述抗体的特征在于下列平衡离解常数K_D的结合性质：(i)所述抗体以约10^-5M或更小，例如，10^-6M或更小，或10^-7M或更小，或10^-8M或更小的平衡离解常数K_D结合C1、C2或包含C1和C2的复合物(C1C2)的任一种，和(ii)K_AC2或K_AC1的任一个比K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的任一个低至少约50％(1.5倍)，其中C1或C2是靶和其信号转导伴侣，任选地附录A(或SEQ ID NOS：1-88)中任一项的分泌性蛋白。在某些实施方案中，K_AC2或K_AC1的任一个为K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的任一个的至多约2/3至任选地1/1000；或2/3至约1/100，或约1/2至1/25、或约1/2至约1/50、或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至多约2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或达到约1/500，或达到约1/200，或达到约1/150，或达到约1/100，或达到约1/90，或达到约1/80，或达到约1/70，或达到约1/60，或达到约1/50，或达到约1/40，或达到约1/30。在某些实施方案中，K_AC2或K_AC1的任一个为所有K_[C1C2]A、K_[AC2]C1或K_[AC1]C2的至多约2/3；或2/3至任选地约1/1000；或2/3至约1/100，或约1/2至1/25、或约1/2至约1/50、或约2/3至约1/25，或约2/3至约1/50，例如至多约2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19或1/20，或达到约1/500，或达到约1/200，或达到约1/150，或达到约1/100，或达到约1/90，或达到约1/80，或达到约1/70，或达到约1/60，或达到约1/50，或达到约1/40，或达到约1/30。

此类多肽结合剂的任一种优选是纯化的和大体上均质的，例如纯度为至少约90％、95％、97％、98％、99％或99.5％。在某些实施方案中，多肽结合剂是单克隆抗体。

本发明还提供了制备无菌药物组合物的方法(其包括以治疗有效量向此类多肽结合剂、此类多肽结合剂的无菌组合物中加入无菌的药学上可接受的稀释剂)和施用此类无菌组合物例如以调节(增强或减弱)包含所述分泌性蛋白的复合物的信号转导的方法。

信号复合物

基因的激活、代谢的改变、细胞的连续增殖和死亡以及运动的刺激或抑制是一些可由信号复合物介导的对细胞外刺激的细胞反应。基因激活导致进一步的细胞效应，因为许多响应基因的蛋白质产物包括酶和转录因子本身。作为信号转导级联的结果产生的转录因子可反过来激活更多的基因。因此初始刺激物可触发整个基因组群的表达，这反过来可导致许多复杂生理事件的激活。这些事件包括通过胰岛素刺激的增加的葡萄糖从血流的吸收和由细菌产物刺激的嗜中性粒细胞至感染部位的迁移。

神经递质是能够结合离子通道蛋白以形成复合物，从而导致它们开放以允许特定离子快速流动穿过质膜的配体。这导致细胞膜电位的改变并且对于过程例如电化学冲动的神经传导是非常重要的。例如，神经递质乙酰胆碱在某些突触上的结合打开允许Na+进入的通道并且起始神经冲动或肌肉收缩。配体可以是游离可溶的，或可见于其它细胞的表面上或细胞外基质内。这样的细胞表面或细胞外基质配体，当它们彼此接触时，例如当吞噬细胞将抗原呈递至淋巴细胞时，或在粘附于细胞基质时，如当成纤维细胞的细胞表面上的整联蛋白衔接(engage)纤连蛋白时，在细胞之间传导信号。

大多数哺乳动物细胞需要刺激以不仅控制细胞分泌而且还控制存活。在生长因子刺激不存在的情况下，程序化细胞死亡接着在大多数细胞中发生。对细胞外刺激的这类需要是在单细胞和多细胞生物体的背景中控制细胞行为所必需的。应理解信号转导途径对生物过程极为重要并且许多疾病归因于它们的失调。

信号转导可通过受体介导，所述受体可位于细胞内，例如类固醇激素、甲状腺激素、维甲酸(retinoic acid)和维生素D3的衍生物的受体，或可位于细胞表面上，或可存在于细胞表面或细胞内，例如配体门控的离子通道受体。信号转导还可通过运输小分子的跨膜转运蛋白例如葡萄糖转运蛋白，或离子通道例如钠通道、钾通道、钙通道或其它阳离子通道，或氯化物通道或碳酸氢盐通道或其它阴离子通道来介导。许多离子通道响应结合小信号分子或配体而开放或关闭。某些离子通道由细胞外配体门控；某些由细胞内配体门控。通常，配体不是当通道开放时被运输的物质。ABC(“ATP-结合盒”)转运蛋白是将配体-结合结构域暴露在一个表面和将ATP结合结构域暴露在另一个表面上的跨膜蛋白。此类ABC转运蛋白的某些实例包括囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)；磺酰脲受体(SUR)TAP，与抗原加工相关的转运蛋白；SPGP，肝细胞用于将胆汁酸的盐泵出进入胆汁的转运蛋白；和多药抗药性(MDR)转运蛋白，其将化学治疗药物泵出癌细胞，从而降低它们的效力。该家族中的基因的突变与多种疾病关联，包括：ALD基因-肾上腺脑白质营养不良、SUR基因-糖尿病、CFTR基因-囊性纤维化、MDR基因-癌症的多药抗药性。一列ABC转运蛋白、它们的别名(如果有的话)、染色体定位和假定的功能示于下面(参见Luckie等人，Current Genomics，2003，4，109-121)：

ABCA1 ABC1 9q31.1普遍存在的胆固醇流出至HDL上

ABCA2 ABC2 9q34 2脑抗药性

ABCA3 ABC3，ABCC 16p13.3肺

ABCA4 ABCR 1p22.1-p21杆细胞光感受器(Rod photoreceptor)N-亚视黄基(retinylidiene)-PE流出

ABCA5 17q24肌肉、心脏、睾丸

ABCA6 17q24肝

ABCA7 19p13.3脾、胸腺

ABCA8 17q24卵巢

ABCA9 17q24心脏

ABCA10 17q24肌肉、心脏

ABCA12 2q34胃

ABCA13 7p11-q11在所有组织中较低

ABCB1 PGY1，MDR 7p21肾上腺、肾、脑多药抗药性

ABCB2 TAP1 6p21所有细胞肽运输

ABCB3 TAP2 6p21所有细胞肽运输

ABCB4 PGY3 7q21.1肝PC运输

ABCB5 7p14普遍存在的

ABCB6 MTABC3 2q36线粒体铁运输

ABCB7 ABC7 Xq12-q13线粒体Fe/S簇运输

ABCB8 MABC1 7q36线粒体

ABCB9 12q24心脏、脑

ABCB10 MTABC2 1q42线粒体

ABCB11 SPGP 2q24肝胆汁盐运输

ABCC1 MRP1 16p13.1肺、睾丸、PBMC抗药性

ABCC2 MRP2 10q24肝 有机阴离子流出

ABCC3 MRP3 17q21.3肺、肠、肝抗药性

ABCC4 MRP4 13q32前列腺核苷运输

ABCC5 MRP5 3q27普遍存在的核苷运输

ABCC6 MRP6 16p13.1肾、肝

CFTR ABCC7 7q31.2外分泌组织氯离子通道

ABCC8 SUR1 11p15.1胰 磺酰脲受体

ABCC9 SUR2 12p12.1 心脏、肌肉

ABCC10 MRP7 6p21在所有组织中较低

ABCC11 16q11-q12在所有组织中较低

ABCC12 16q11-q12在所有组织中较低

ABCD1 ALD Xq28过氧化物酶体VLCFA运输调控

4Current Genomics，2003，第4卷，No.3Luckie等人

(表1)继续....

符号    别名    定位    表达功能

ABCD2 ALDL1，ALDR 12q11-q12过氧化物酶体

ABCD3 PXMP1，PMP70 1p22-p21过氧化物酶体

ABCD4 PMP69，P70R 14q24.3过氧化物酶体

ABCE1 OABP，RNS4I 4q31卵巢、睾丸、脾寡腺苷酸结合蛋白

ABCF1 ABC50 6p21.33普遍存在的

ABCF2 7q36普遍存在的

ABCF3 3q25普遍存在的

ABCG1 ABC8，White 21q22.3普遍存在的胆固醇运输

ABCG2 ABCP，MXR，BCRP 4q22胎盘，肠毒素流出，抗药性

ABCG4 White2 11q23 5 59肝

ABCG5 White3 2p21 17肝、肠固醇运输

ABCG8 2p21 17肝，肠固醇运输。细胞表面受体识别绝大部分细胞外信号分子。跨膜受体横跨细胞的质膜，受体的一部分在细胞的外部(细胞外结构域)，另一部分在细胞的内部(细胞内结构域)。信号转导通常因配体与其细胞外结构域的结合而发生。

配体与细胞表面受体的结合通常在细胞内部刺激一系列事件，不同类型的受体刺激不同细胞内反应。受体通常只对特异性配体的结合起作出反应。当结合时，配体通常通过诱导受体的细胞内部分的形状或构象的改变来起始信号穿过质膜的传导。通常，这样的构象改变导致受体中包含的酶促活性的激活或将结合位点暴露于细胞内的其它信号蛋白。当这些蛋白质与受体结合时，它们本身可变得具有活性并且将信号传播至细胞质中。

在真核细胞中，大多数被配体/受体相互作用激活的细胞内蛋白质通常具有酶促活性。此类酶包括酪氨酸激酶、异三聚体G蛋白、小GTP酶、各种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、磷酸酶、脂质激酶和水解酶。某些受体-刺激的酶产生特定的第二信使，包括环核苷酸例如，环AMP(cAMP)和环GMP(cGMP)、磷脂酰肌醇衍生物，例如磷脂酰肌醇-三磷酸(PIP3)、二酰甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)。其它激活的蛋白质与衔接蛋白质(adapter protein)相互作用。衔接蛋白质促进其它信号蛋白之间的相互作用，并且协调产生对特定刺激物的适当的细胞反应所必需的其它信号复合物的形成。酶和衔接蛋白质都响应多种第二信使分子。

存在许多不同种类的识别不同细胞外信号分子的跨膜受体。实例包括：G蛋白偶联受体(GPCR)例如，肾上腺素能受体、神经递质受体、嗅觉受体、阿片样物质受体、趋化因子受体和视紫质；受体酪氨酸激酶例如生长因子受体；整联蛋白；和toll-样受体。

在某些情况下，信号复合物组分可以是超过一种信号复合物的成员，所述信号复合物各自包含不同的复合物组分并且行使不同的信号转导功能(例如，配体可结合超过一种同源受体)。在某些情况下，配体可结合一种或多种诱饵受体。诱饵受体是结合配体，从而抑制其对其正常受体的结合的受体。例如，受体VEGF-1可阻止血管内皮生长因子(VEGF)结合VEGFR-2。信号复合物组分与一种结合伴侣的结合对与另一种结合伴侣的结合的差异调节应当允许生物信号转导的高度靶向调控。在某些情况下，信号复合物组分可以是以特定构象形式被捕获的突变体或变体形式，例如使得复合物组成型激活或失活。在某些情况下，受体可以以特定的构象例如配体结合的构象被捕获。在某些情况下，信号复合物组分可以是配体的突变体或变体形式，或模拟物或类似物。

测试多肽结合剂的类型和来源：肽和多肽

许多天然或随机肽或多肽的文库是商购可得的或容易合成的。可选择地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然肽或多肽的文库是可获得的或容易产生的。此外，可通过常规化学、物理和生物化学方法容易地修饰天然或合成产生的文库和化合物，并且可将所述文库和化合物用于产生组合文库。可进行另外的衍生或修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化。

能够特异性结合抗原的蛋白质支架的文库也是可获得的。此类蛋白质包括：Adnectins、Affibodies、Anticalins、DARPins、改造的Kunitz-型抑制剂、四连接素(tetranectins)、A-结构域蛋白、脂质运载蛋白(lipocalins)、重复蛋白例如锚蛋白重复蛋白、免疫蛋白、α2p8肽、昆虫防卫素A、PDZ结构域、蝎毒素、PHD指、TEM-1β-内酰胺酶、纤连蛋白III型结构域、CTLA-4、T细胞受体、knottins、新制癌菌素(neocarzinostatin)、碳水化合物结合模块4-2、绿色荧光蛋白、硫氧还蛋白(Gebauer&Skerra，Curr.Opin.Chem.Biol.13：245-55(2009)；Gill&Damle，Curr.Opin.Biotech 17：653-58(2006)；Hosse等人，Protein Sci.15：14-27(2006)；Skerra，Curr.Opin.Biotech 18：295-3-4(2007))。

用于在组合文库中进行筛选的许多不同方法在本领域是已知的，包括：生物文库、空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库法；“一珠一化合物”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。

可使用公知的技术鉴定结合信号复合物或其组分的肽而无需过度实验。在这方面，应指出用于筛选肽文库的能够特异性结合抗原的肽的技术在本领域是公知的(参见，例如，美国专利No.5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；第WO 84/03506号和第W084/03564号PCT公布；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen等人，in Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen等人，J.Immunol.Moth.，102：259-274(1987)；Schoofs等人，J.Immunol.，140：611-616(1988)，Cwirla，S.E.等人(1990)Proc.NatL Acad.Sci.USA，87：6378；Lowman，H.B.等人(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等人(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等人(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363以及Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。

可使用已知的肽合成方法化学合成肽，或可使用重组技术制备和纯化肽。肽在长度上通常为至少约3个氨基酸，可选择地在长度上为至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、7374、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多个氨基酸，其中此类肽能够优选特异性结合信号复合物或其组分。

在这方面，噬菌体(phage)展示是允许筛选大的肽文库以鉴定这类文库的能够特异性结合抗原的成员的一个公知技术。噬菌体展示是籍以将变异多肽作为与外壳蛋白融合的融合蛋白在噬菌体颗粒表面上展示的技术(Scott，J.K.和Smith，G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的功用在于可快速且高效地分选选择性地随机化的蛋白质变体(或随机克隆的cDNA)的大文库的以高亲和力结合抗原的那些序列。肽(Cwirla，S.E.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等人(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等人(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等人(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)文库在噬菌体上的展示已被用于筛选数百万种多肽或肽的具有特异性结合性质的多肽或肽(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。

虽然大多数噬菌体展示法使用丝状噬菌体，但λ形噬菌体展示系统(WO 95/34683；U.S.5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren，ZJ.等人(1998)Gene215：439；Zhu，Z.(1997)CAN 33：534；Jiang，J.等人(1997)can 128：44380；Ren，ZJ.等人(1997)CAN 127：215644；Ren，Z-J.(1996)Protein Sci.5：1833；Efimov，V.P.等人(1995)Virus Genes 10：173)和T7噬菌体展示系统(Smith，G.P.and Scott，J.K.(1993)Methods in Enzymology，217，228-257；U.S.5,766,905)也是已知的。

产生肽文库和筛选这些文库的方法也公开于美国专利No.5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中。

测试多肽结合剂：抗体的类型或来源

术语″抗体″以最广义使用，包括完全装配的抗体、四聚体抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)₂、Fv、单链抗体、双链抗体)以及包含上述抗体的重组肽，只要它们显示期望的活性即可。“免疫球蛋白”或“四聚体抗体”是由两条重链和两条链轻组成的四聚体糖蛋白，所述每条轻链和重链包含可变区和恒定区。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整抗体来产生。抗体片段或抗原结合部分包括，除其它以外，Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微小抗体、线性抗体；螯合重组抗体、三抗体或双抗体、内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原-结合-结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH抗体或其变体或衍生物，以及包含免疫球蛋白的至少一部分的多肽，所述部分足以赋予所述多肽特异性抗原结合，例如1、2、3、4、5或所有6个CDR序列，只要所述抗体保持期望的生物活性即可。

在天然存在的免疫球蛋白中，每一个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一个对具有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”链(约50-70kDa)。每一条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分界定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为卡帕(kappa)(κ)和兰姆达(lambda)(λ)轻链。重链被分类为缪(μ)、德耳塔(Δ)、伽马(γ)、阿尔法(α)和伊普西龙(ε)，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含约10多个氨基酸的“D”区。通常参见，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第7章(Paul，W.，编著，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(为了所有目的通过引用整体并入本文)。每一个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点以便完整免疫球蛋白具有两个结合位点。

每一条链重链在一个末端具有可变结构域(V_H)，后接许多恒定结构域。每一条轻链在一个末端具有可变链结构域(V_L)并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据认为特定的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917，1987)。

免疫球蛋白可变结构域展示通过三个高变区或CDR连接的相对保守的构架区(FR)的相同一般结构。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照Kabat Sequences of Proteinsof Immunological Interest(国立卫生研究院，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk，(J.Mol.Biol.196：901-917，1987)；Chothia等人，(Nature342：878-883，1989)的定义将氨基酸分配至每一个结构域。

抗体的高变区是指负责抗原结合的抗体的CDR氨基酸残基。高变区包括来自CDR的氨基酸残基(轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.公共卫生署，国立卫生研究院，Bethesda，Md.(1991)所描述的)和/或来自高变环的那些残基(轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)，如由Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述的)。

构架或FR残基是除了高变区残基外的那些可变结构域残基。

如本文中所使用的″重链可变区″是指抗体分子的区域，其包含所述抗体重链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)。重链可变区可包含所述抗体重链的1、2或3个CDR。

如本文中所使用的“轻链可变区”是指抗体分子的区域，其包含所述抗体轻链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)。轻链可变区可包含所述抗体轻链的1、2或3个CDR，所述轻链可以是卡帕或兰姆达轻链(取决于抗体)。

取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配至不同种类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，所述种类还可进一步分成亚类或同种型例如IgG1，IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。不同同种型具有不同的效应子功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有ADCC活性。本发明的抗体，如果其包含恒定结构域，则可以具有这些亚类或同种型、其变体或共有序列、或不同同种型的杂合体(例如，IgG1/IgG2杂合体)的任一种。

在示例性实施方案中，本发明的抗体可以包含人卡帕(κ)或人兰姆达(λ)轻链或来源于其的氨基酸序列或其杂合体(任选地与人重链或来源于其的序列一起)，或以单链、二聚体、四聚体(例如，两条重链和两条轻链)或其它形式一起包含重链和轻链。

单克隆抗体是指获自大体上均质的抗体群体的抗体。单克隆抗体通常是高度特异性的，并且可针对单个抗原位点，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反。除了它们的特异性外，单克隆抗体是有利的，因为它们通过均质培养(homogeneous culture)合成，未被具有不同特异性和特征的其它免疫球蛋白污染。

按照本发明使用的单克隆抗体可利用首先由Kohler等人(Nature，256：495-7，1975)描述的杂交瘤方法来制备，或可利用重组DNA法(参见，例如，美国专利No.4,816,567)来制备。单克隆抗体还可使用例如Clackson等人(Nature 352：624-628，1991)和Marks等人(J.Mol.Biol.222：581-597，1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离而来。

在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适当的宿主动物例如仓鼠或猕猴以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体(Harlow&Lane；Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，New York(1988)。

抗体的重组产生

本发明还包括编码本发明的抗体的核酸分子。在某些实施方案中，不同的核酸分子编码抗原特异性抗体的重链可变区和轻链可变区。在其它实施方案中，相同的核酸分子编码抗原特异性抗体的重链和轻链可变区。

可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针)从分泌抗体的杂交瘤细胞分离编码本发明的单克隆抗体的DNA，并且测定其序列。序列测定通常需要分离至少一部分目的基因或cDNA。通常这需要克隆编码单克隆抗体的DNA或，优选地mRNA(即，cDNA)。使用标准技术(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press，将其通过引用并入本文)进行克隆。例如，可通过逆转录polyA+mRNA，优选膜结合mRNA来构建cDNA文库，然后使用特异于人免疫球蛋白多肽基因序列的探针筛选文库。在使得能够鉴定在特定条件下彼此杂交的多核苷酸的条件下进行核苷酸探针反应和其它核苷酸杂交反应。

一组示例性条件如下：在42℃于50％甲酰胺，5X SSC，20mM Na·PO4，pH 6.8中严格杂交；然后在55℃下1X SSC中洗涤30分钟。用于计算等同杂交条件和/或选择其它条件以获得期望的严格性水平的公式是公知的。在本领域应理解，等同的严格性的条件可通过温度和缓冲液或盐浓度的变化来实现，如Ausubel等人(编)，Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1994)，pp.6.0.3至6.4.10中所描述的。杂交条件的变动可通过经验来确定或基于探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比来精确地计算。可如Sambrook等人(编)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York(1989)，pp.9.47至9.51中所述计算杂交条件。

在一个实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码目的免疫球蛋白基因区段(例如，轻链可变区段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。可容易地将扩增的序列克隆进入任何适当的载体例如表达载体、微基因(minigene)载体或噬菌体展示载体。应理解，所使用的克隆的具体方法不是至关重要的，只要可能测定目的免疫球蛋白多肽的某些部分的序列即可。如本文中所使用的，“分离的”核酸分子或“分离的”核酸序列是这样的核酸分子，所述核酸分子(1)已被鉴定并且与至少一种通常在所述核酸的天然来源中与其结合的污染性核酸分子分离，或(2)被克隆、扩增、标记或以其它方式区分背景核酸，以便目的核酸的序列可被测定，被认为是分离的。分离的核酸分子与其在自然界中被发现的形式或环境不同。因此分离的核酸分子与当其存在于天然细胞中时的核酸分子是有区别的。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达所述抗体的细胞中的核酸分子，在所述细胞中，例如，所述核酸分子存在于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置中。

用于克隆和测序的RNA的一个来源是通过从转基因小鼠获得B细胞，然后将B细胞与永生化细胞融合产生的杂交瘤。可选择地，RNA可从经免疫的动物的B细胞(或整个脾)分离而来。当使用除杂交瘤外的来源时，可能期望筛选编码具有特异性结合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。用于此类筛选的一个方法是使用噬菌体展示技术。噬菌体展示在本文中被进一步描述并且在本领域是公知的。参见，例如，Dower等人，WO 91/17271，McCafferty等人，WO 92/01047以及Caton和Koprowski，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-54(1990))，将所述文献的每一个通过引用并入本文。在一个实施方案中，分离来自经免疫的转基因小鼠的cDNA(例如，总脾cDNA)，将聚合酶链式反应用于扩增编码一部分免疫球蛋白多肽例如CDR区的cDNA序列，然后将扩增的序列插入噬菌体载体。通过标准噬菌体展示技术例如淘选鉴定编码目的肽例如具有期望的结合特征的可变区肽的cDNA。

随后测定扩增的或克隆的核酸的序列。通常测试编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列，然而有时只测定一部分可变区(例如编码CDR的部分)的序列就足够了。通常，被测序的部分在长度上为至少30个碱基，更常见地将测定编码可变区的长度的至少约1/3或至少约1/2的碱基的序列。

可对从cDNA文库分离的克隆进行测序，或当使用PCR时，在亚克隆扩增的序列或通过直接PCR后，测定扩增的区段的序列。使用标准技术(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press和Sanger，F.等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463-5467，将它们通过引用并入本文)进行测序。通过将克隆的核酸的序列与人免疫球蛋白基因和cDNA的公布的序列相比较，本领域技术人员将轻易地能够确定(取决于测序的区域)：(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链的同种型)的种系区段惯用法(germline segment usage)和(ii)重链和轻链可变区的序列，包括因N-区域添加和体细胞突变过程而产生的序列。免疫球蛋白基因序列的一个来源是美国国家生物技术信息中心，国立医学图书馆，国立卫生研究院，Bethesda，Md。

分离后，可将DNA置于表达载体中，随后将所述载体转染进入宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、人胚胎肾293细胞(例如，293E细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(所述宿主细胞否则不产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组产生在本领域是公知的。

表达控制序列是指在特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

在可选择的实施方案中，可通过直接蛋白质测序来测定目的免疫球蛋白的氨基酸序列。可按照通用密码子表设计适当的编码核苷酸序列。

可通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA或通过肽合成来制备期望的抗体的氨基酸序列变体。此类变体包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或置换。产生缺失、插入和置换的任何组合以获得终构建体，只要终构建体具有期望的特征即可。氨基酸的变化也可改变抗体的翻译后加工，例如糖基化位点的数目或位置。

利用本领域已知的多种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。此类方法包括但不限于，从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过抗体的早期制备的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定向)诱变、PCR诱变和盒式诱变进行制备。

本发明还提供了编码本发明的抗体的分离的核酸(任选地有效地连接于被宿主细胞识别的控制序列)、包含所述核酸的载体和宿主细胞以及用于产生抗体的重组技术，所述技术可包括培养宿主细胞以便表达核酸和任选地，从宿主细胞培养物或培养基回收抗体。用于抗体产生的不同系统和方法由Birch&Racher(Adv.Drug Deliv.Rev.671-685(2006))进行了综述。

为了进行抗体的重组产生，分离编码其的核酸，将所述核酸插入可复制载体以进一步克隆(DNA的扩增)或以进行表达。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码单克隆抗体的DNA，并且测定其序列。许多载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于如下序列的一个或多个序列：信号序列、复制起始点、一个或多个选择标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

用于克隆或表达存在于本文的载体中的DNA的适当宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于该目的适当的原核生物包括细菌例如革兰阴性或革兰阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺菌属(Shigella)以及杆菌属(Bacilli)例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)(例如，公开于1989年4月12日公布的DD 266,710的地衣芽胞杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如绿脓杆菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然其它菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是适合的。这些实例是举例说明性的而非限定性的。

除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是用于编码抗体的载体的适当的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(baker′s yeast)是在低等真核宿主微生物中最常使用的。然而，许多其它属、种和株系也是通常可获得的并且用于本文中，例如裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克勒克酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤氏酵母(Pichia pastors)(EP183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗体的适当宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。许多杆状病毒株系和变体以及来自宿主例如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕的相应的允许昆虫宿主细胞已被鉴定。用于转染的多种病毒株系是公共可得的，例如苜蓿银纹夜蛾的L-1变体NPV和家蚕的Bm-5变体NPV，并且此类病毒可在本文中用作根据本发明的病毒，特别地用于转染草地贪夜蛾细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、烟草、浮萍和其它植物细胞的植物细胞培养物也可用作宿主。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；用SV40转化的猴肾CV1品系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾品系(用以以悬浮培养方式生长的亚克隆的293或293细胞(Graham等人，J.Gen Virol.36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，(Biol.Reprod.23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝瘤品系(Hep G2)。

用上述用于抗体产生的表达或克隆载体转化或转染宿主细胞，将其培养于在适当情况下改良的常规培养基中以诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望的序列的基因。此外，具有多个拷贝的通过选择标记分隔的转录单位的新型载体和转染的宿主细胞系对于表达结合期望的抗原的抗体是特别有用的和优选的。

可将包含期望的抗体核酸序列的宿主细胞培养在多种培养基中。商购可得的培养基例如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基(Minimal EssentialMedium)((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)适合用于培养所述宿主细胞。此外，Ham等人(Meth.Enz.58：44，1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90103430；WO 87/00195；或第30,985号美国专利公布中描述的任何培养基可用作用于所述宿主细胞的培养基。这些培养基的任一种必要时可补充以激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通过以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能量来源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需补充物。培养条件例如温度、pH等为先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，所述培养条件对于本领域技术人员来说是显然的。

当使用重组技术时，抗体可在细胞内、周质空间中产生，或被直接分泌入培养基，包括来自微生物培养物。如果抗体在细胞内产生，作为第一步骤，通过例如离心或超滤除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解的碎片)。Better等人(Science 240：1041-43，1988；ICSU Short Reports 10：105(1990)；和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：457-461(1993)描述了用于分离被分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的方法。[也参见，(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)]。

可使用例如羟基磷灰石层析阳离子或阴离子交换层析以及亲和层析来纯化从微生物或哺乳动物细胞制备的抗体组合物，亲和层析是优选纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13，1983)。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常见地是琼脂糖，但其它基质也是可用的。机械上稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许获得比使用琼脂糖可达到的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含C_H 3结构域时，BakerbondABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)用于纯化。取决于待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术例如离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上进行的层析、肝素SEPHAROSE^TM上进行的层析、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上进行的层析、层析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也是可用的。

抗体片段

抗体片段包含一部分完整全长抗体，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；多特异性抗体片段例如双特异性、三特异性等抗体(例如，双链抗体、三链抗体、四链抗体)；微小抗体；螯合重组抗体；三抗体或双抗体；内抗体；纳米抗体；小模块免疫药物(SMIP)、结合-结构域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体；含VHH抗体；和从抗体片段形成的其它多肽。参见例如Holliger&Hudson(Nat.Biotech.23(9)1126-36(2005))

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，由V_L、V_H、C_L和C_H结构域组成的单片段，每一个片段具有单个抗原结合位点)和残留的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段(包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)，其具有两个“单链Fv”，或者“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选，Fv多肽还在V_H与V_L结构域之间包含多肽连接体(所述连接体使得能使Fv形成用于抗原结合的期望的结构)，从而导致单链抗体(scFv)，其中V_L和V_H区通过合成的连接体配对形成单价分子，所述连接体使得它们能够被产生为单蛋白质链(Bird等人，Science242：423-426，1988，and Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988).关于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。Fd片段由V_H和C_H1结构域组成。

其它抗体片段包括结构域抗体(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)，其由V_H结构域组成。双链抗体是双价抗体，在所述双价抗体中V_H和V_L结构域表达在单个多肽链上，但使用太短以至不允许相同链上的两个结构域配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点(参见例如，EP 404,097；WO 93/11161；Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993，和Poljak等人，Structure 2：1121-1123，1994)。双链抗体可以是双特异性或单特异性的。

缺乏轻链的功能性重链抗体天然存在于铰口鲨(Greenberg等人，Nature374：168-73，1995)、毯状鲨(wobbegong shark)(Nuttall等人，Mol Immunol.38：313-26，2001)和骆驼科(Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-8，1993；Nguyen等人，J.Mol.Biol.275：413，1998)例如骆驼、单峰骆驼、羊驼和骆马(llamas)中。抗原结合位点在这些动物中减少至单个结构域(VHH结构域)。这些抗体只使用重链可变区形成抗原结合区，即，这些功能性抗体是仅具有结构H₂L₂的重链的同二聚体(称为“重链抗体”或“HCAb”)。骆驼VHH据报导与包含铰链、CH2和CH3结构域但缺乏CH1结构域的IgG2和IgG3恒定区重组(Hamers-Casterman等人，同上)。例如，骆马IgG1是常规(H₂L₂)抗体同种型，其中V_H与包含铰链、CH1、CH2和CH3结构域的恒定区重组，然而骆马IgG2和IgG3是缺乏CH1结构域并且不包含轻链的唯重链同种型。已发现骆驼V_HH结构域以高亲和力结合抗原(Desmyter等人，J.Biol.Chem.276：26285-90，2001)并且在溶液中具高度稳定性(Ewert等人，Biochemistry 41：3628-36，2002)。经典的唯V_H片段难以以可溶性形式产生，但当将构架残基改变得更加VH_H样时可获得溶解度和特异性结合的改善。(参见，例如，Reichman等人，J ImmunolMethods 1999，231：25-38.)。用于产生具有骆驼重链的抗体的方法描述于例如第20050136049号和第20050037421号美国专利公布中。

抗体重链的可变结构域具有15kDa的分子量，并且被称为纳米抗体(Cortez-Retamozo等人，Cancer Research 64：2853-57，2004)。可如Conrath等人(Antimicrob Agents Chemother 45：2807-12，2001)中所述从经免疫的单峰驼或使用Revets等人，Expert Opin.Biol.Ther.5(1)：111-24(2005)中所述的重组方法产生纳米抗体文库。

双特异性Fab-scFv(″双抗体″)和三特异性Fab-(scFv)(2)(″三抗体″)的产生描述于Schoonjans等人(J Immunol.165：7050-57，2000)和Willems等人(JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786：161-76，2003)中。为了产生双抗体或三抗体，将scFv分子与VL-CL(L)和VH-CH₁(Fd)链之一或两者融合，例如，以产生三抗体(其中两个scFv与Fab的C-末端融合)，而在双抗体中，一个scFv与Fab的C-末端融合。

由通过肽连接体(无铰链的)或通过IgG铰链与CH3融合的scFv组成的“微小抗体”已描述于Olafsen等人，Protein Eng Des Sel.2004Apr；17(4)：315-23.中。

内抗体是显示细胞内表达并且可操纵细胞内蛋白质功能的单链抗体(Biocca等人，EMBO J.9：101-108，1990；Colby等人，Proc Natl Acad Sci U SA.101：17616-21，2004)。可如Mhashilkar等人(EMBO J 14：1542-51，1995)和Wheeler等人(FASEB J.17：1733-5.2003)中所述产生包含在细胞内区域保留抗体构建体的细胞信号序列的内抗体。反式抗体(Transbody)是细胞渗透性抗体，其中蛋白质转导结构域(PTD)与单链可变片段(scFv)抗体融合Heng等人(MedHypotheses.64：1105-8，2005)。

还涉及的是作为SMIP或特异于抗原的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白的抗体。这些构建体是单链多肽，其包含与进行抗体效应子功能所必需的免疫球蛋白结构域融合的抗原结合结构域。参见，例如，WO03/041600、第20030133939号美国专利公布和第20030118592号美国专利公布。

可将一个或多个CDR共价地或非共价地整合入分子以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可包含CDR作为更大的多肽链的部分，可共价地将CDR连接于另一个多肽链，或可非共价地包含CDR。CDR允许免疫粘附素特异性结合特定的目的抗原。

因此，可利用本领域已知的技术产生多种包含抗体的重链可变区或轻链可变区的1、2和/或3个CDR的组合物。

多特异性抗体

在某些实施方案中，可能期望产生具有针对相同或不同分子的至少两个不同表位的结合特异性的本发明的多特异性(例如双特异性)抗体。双特异性抗体的实例可结合抗原的两个不同表位。可选择地，可将抗原特异性抗体臂与结合细胞表面分子例如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)或IgG(FcγR)的Fc受体例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，以将细胞防御机制集中至期望的抗体。双特异性还可用于将细胞毒性剂定位至表达或吸收期望的抗原的细胞。此类抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素、抗干扰素-60、长春花生物碱、蓖麻蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)₂双特异性抗体)。

根据用于制备双特异性抗体的另一个方法，可改造一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选界面包含抗体恒定结构域的C_H3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)置换。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面产生针对大铡链的相同或相似大小的补偿“腔”。这提供了用于使异二聚体的收率增加超过其它不想要的终产物例如同二聚体的机制。参见1996年9月6日公布的WO96/27011。

双特异性抗体包括交联或“异源缀合(heteroconjugate)”抗体。例如，可将异源缀合物中的抗体之一偶联于抗生物素蛋白，将另一个偶联于生物素。可使用任何常规交联方法制备异源缀合抗体。适当的交联剂以及许多交联技术在本领域是公知，并且描述于美国专利No.4,676,980中。

用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已描述于文献中。例如，可使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等人(Science 229：81-83，1985)描述了其中将完整抗体进行蛋白水解切割以产生F(ab′)₂片段的方法。在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在的情况下还原这些片段以稳定邻近的二硫醇并且防止分子间二硫化物形成。随后将产生Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。随后通过用巯基乙胺还原将Fab′-TNB衍生物之一转化成Fab′-硫氢基，将其与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。将产生的双特异性抗体用作用于选择性固定酶的试剂。在其它实施方案中，可将直接从大肠杆菌回收的Fab′-SH片段体外化学偶联以形成双特异性抗体。(Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992))。

Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子的产生。从大肠杆菌分别分泌每一个Fab′片段，将其经历体外直接化学偶联以形成双特异性抗体。所形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞抗人乳腺肿瘤抗原的裂解活性。

还已描述了用于从重组细胞培养物制备和分离双特性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。(Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553，1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接于两个不同抗体Fab′部分。在铰链区还原抗体同二聚体以形成单体，随后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法还可用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48，1993)描述的“双链抗体”技术已提供了用于制备双特异性抗体片段的可选择的机制。

片段包含通过连接体连接于轻链可变区(V_L)的重链可变区(V_H)，所述连接体太短以至于不允许在相同链上的两个结构域配对。因此，一个片段上的V_H和V_L结构域被迫与另一个片段的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一个策略也已被报导。参见Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994).

可选择地，双特异性抗体可以是如Zapata等人，Protein Eng.8：1057-62(1995)中所述产生的“线性抗体”。线性抗体包含一对串联Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，所述片段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特性的。

在其它实施方案中，双特异性抗体可以是螯合重组抗体(CRAb)。螯合重组抗体识别抗原的邻近且非重叠的表位，并且柔性足以同时结合两个表位(Neri等人，J Mol Biol.246：367-73，1995)。

还涉及具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。(Tutt等人，J.Immunol.147：60，1991)。

嵌合和人源化抗体

因为嵌合或人源化抗体在人中的免疫原性不及亲代鼠单克隆抗体，因此可将它们用于治疗过敏性反应风险低得多的人。

可使用本领域已知的标准方法(参见Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6841-6855(1984)；和Boulianne等人，Nature 312，643-646，(1984))产生嵌合单克隆抗体，其中将小鼠单克隆抗体的可变Ig结构域与人恒定Ig结构域融合。虽然某些嵌合单克隆抗体已证明在人中免疫原性较低，但小鼠可变Ig结构仍可导致明显的人抗小鼠反应。

可通过多种方法获得人源化抗体，所述方法包括例如：(1)将非人互补决定区(CDR)移植至人构架和恒定区上(在本领域称为通过“CDR移植”人源化的过程)(2)移植完整非人可变结构域，但通过替换表面残基用人样表面“掩饰(cloaking)”它们(在本领域称为“镶饰(veneering)”的过程)，或可选择地，(3)替换经确定不可能不利地影响抗原结合或蛋白质折叠但可能在人环境中减小免疫原性的位置上的人氨基酸(在本领域称为HUMAN ENGINEERING^TM的过程)。在本发明中，人源化抗体包括“人源化的”、“镶饰的”和“HUMANENGINEERED^TM”抗体。这些方法公开于例如Jones等人，Nature 321：522525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyer等人，Science239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31：169-217(1994)；Kettleborough等人，Protein Eng.4：773-783(1991)；Studnicka等人，美国专利No.5,766,886；Studnicka等人(Protem Eng 7：805-814，1994)中，将所述每一个文献通过引用并入本文。

来自转基因动物的人抗体

还可使用转基因动物来产生针对抗原的人抗体，所述转基因动物不具有内源免疫球蛋白产生并且经改造包含人免疫球蛋白基因座。例如，WO98/24893公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中所述动物因内源重链和轻链基因座的失活而不产生功能性内源免疫球蛋白。WO 91/00906也公开了能够对免疫原产生免疫反应的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中所述抗体具有灵长类动物恒定区和/或可变区，并且其中编码内源免疫球蛋白的基因座被置换或灭活。WO 96/30498和美国专利No.6,091,001公开了Cre/Lox系统用于修饰哺乳动物的免疫球蛋白基因座例如以替换所有或一部分恒定区或可变区来形成经修饰的抗体分子的用途。WO 94/02602公开了具有已失活的内源Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利No.5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，在所述转基因小鼠中，小鼠不存在内源重链，并且表达包括一个或多个异基因(xenogeneic)恒定区的外源免疫球蛋白基因座。也参见，美国专利No.6,114,598、6,657,103和6,833,268。

通过使用上述转基因动物，可对所选择的抗原产生免疫反应，可从动物取出抗体产生性细胞，将其用于产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫方案、佐剂等在本领域是已知的，并且用于例如转基因小鼠的免疫，如WO 96/33735中所描述的。本公布公开了抗多种抗原(包括IL-6、IL-8、TNFa、人CD4、L选择蛋白、gp39和破伤风毒素)的单克隆抗体。可测试单克隆抗体的抑制或中和相应蛋白质的生物活性或生理作用的能力。WO 96/33735公开了来源于用IL-8免疫的转基因小鼠的免疫细胞的抗IL-8单克隆抗体阻断IL-8诱导的嗜中性粒细胞的功能。具有对用于免疫转基因动物的抗原具有特异性的人单克隆抗体也公开于WO 96/34096和第20030194404号美国专利申请；和第20030031667号美国专利申请中。

对于制备单克隆抗体是有用的其它转基因动物包括MedarexHuMAb-MOUSE

，描述于美国专利No.5,770,429和Fishwild等人(Nat.Biotechnol.14：845-851(1996))中，所述动物包含来自未重排的编码人抗体的重链和轻链的人抗体基因的基因序列。HuMAb-MOUSE

的免疫使得能够产生针对抗原的完全人单克隆抗体。

同样地，Ishida等人(Cloning Stem Cells.4：91-102(2002))也描述了包含百万碱基大小的人DNA片段并且整合了完整人免疫球蛋白(hIg)基因座的TransChromo小鼠(TCMOUSE^TM)。TCMOUSE^TM具有hIg的完全多样性库(diverse repertoire)，包括IgG的所有亚类(IgG1-G4)。利用不同人抗原免疫TCMOUSETM产生包括人抗体的抗体反应。

也参见Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year inImmunol.，7：33(1993)；和美国专利No.5,591,669、美国专利No.5,589,369、美国专利No.5,545,807；和第20020199213号美国专利公布。第20030092125号美国专利公布描述了用于使动物的免疫反应偏向期望的表位的方法。人抗体也可通过体外活化的B细胞来产生(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。

来自展示技术的人抗体

用于制备重组人抗体基因库和在丝状噬菌体表面上展示编码的抗体片段的技术的发展已提供了用于直接制备人抗体的方法。通过噬菌体技术产生的抗体在细菌中产生为抗原结合片段-通常Fv或Fab片段，从而缺乏效应子功能。可通过下列两个策略之一引入效应子功能：可将片段改造成完全抗体以在哺乳动物细胞中表达，或将其改造成具有能够触发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。

本发明涉及用于产生抗原特异性抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括步骤：在噬菌体上合成人抗体的文库，用抗原或其部分筛选文库，分离结合抗原的噬菌体，然后从该噬菌体获得抗体。例如，用于制备用于噬菌体展示技术的抗体文库的一个方法包括下列步骤：用抗原或其抗原性部分免疫包含免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫反应，从经免疫的动物提取抗体产生性细胞；从提取的细胞分离RNA，逆转录RNA以产生cDNA，使用引物扩增所述cDNA，将所述cDNA插入噬菌体展示载体以便在噬菌体上表达抗体。本发明的重组抗原特异性抗体可以这样获得。在另一个实例中，可从未被免疫的动物提取抗体产生性细胞，从提取的细胞分离RNA，将其逆转录以产生cDNA，使用引物扩增所述cDNA，将其插入噬菌体展示载体以便在噬菌体上表达抗体。噬菌体展示过程模拟通过在丝状噬菌体的表面上展示抗体库，随后通过它们对选择的抗原的结合来选择噬菌体进行的免疫选择。一种这样的技术公开于WO 99/10494中，该专利申请描述了使用这样方法分离MPL和msk受体的高亲和力和功能性激动性抗体。本发明的抗体可通过筛选使用人V_L和V_H cDNA(从来源于人淋巴细胞的mRAN制备的)制备的重组组合抗体文库，优选scFv噬菌体展示文库来分离。用于制备和筛选此类文库的方法在本领域是已知的。参见例如，美国专利No.5,969,108。存在商购可得的用于产生噬菌体展示文库的试剂盒(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录编号(catalog no.)27-9400-01和Stratagene SurfZAP.TM.噬菌体展示试剂盒，目录编号240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409；Kang等人的第WO 92/18619号PCT公布；Dower等人的第WO 91/17271号PCT公布；Winter等人的第WO 92/20791号PCT公布；Markland等人的第WO92/15679号PCT公布；Breitling等人的第WO 93/01288号PCT公布；McCafferty等人的第WO 92/01047号PCT公布；Garrard等人的第WO92/09690号PCT公布；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982。

在一个实施方案中，为了分离特异于抗原的具有期望的结合特征的人抗体，筛选人V_H和V_L文库以选择具有期望的特异性的抗体片段。用于该方法的抗体文库优选是如本文中和本领域中所描述的制备和筛选的scFv文库(McCafferty等人，第WO 92/01047号PCT公布，McCafferty等人(Nature348：552-554(1990))和Griffiths等人(EMBO J 12：725-734(1993))。优选使用抗原筛选scFv抗体文库。

可选择地，通过PCR对抗体的Fd片段(V_H-C_H1)和轻链(V_L-C_L)进行分开克隆，然后将其在重组噬菌体展示文库中进行随机重组，随后可针对与特定抗原的结合选择所述文库。Fab片段在噬菌体表面上表达，即物理地连接于编码它们的基因。因此，通过抗原结合选择Fab共选择了Fab编码序列，随后扩增所述序列。通过几轮抗原结合和再扩增(称为淘选的方法)，富集特异于抗原的Fab，最终将其分离。

在1994年，描述了称为“导向选择(guided selection)”的用于人源化抗体的方法。导向选择利用噬菌体展示技术的力量来人源化小鼠单克隆抗体(参见Jespers，L.S.等人，Bio/Technology 12，899-903(1994))。为此，可将小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库组合展示，随后利用抗原选择所得的杂交Fab文库。小鼠Fd片段从而提供了指导选择的模板。随后，将所选择的人轻链与人Fd片段文库组合。所得文库的选择产生完整人Fab。

已描述了多种用于从噬菌体展示文库衍生人抗体的方法(参见，例如，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；美国专利No.5,565,332和5,573,905；Clackson，T.和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。具体地，来源于噬菌体展示文库的抗体的体外选择和进化已变成强大的工具(参见Burton，D.R.，and Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)；Winter，G.等人，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；第20020004215号美国专利公布和WO 92/01047；第20030190317号美国专利公布；和美国专利No.6,054,287和5,877,293。

Watkins，“Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by CaptureLift，”Methods in Molecular Biology，Antibody Phage Display：Methods andProtocols 178：187-193(2002)和2003年3月6日公布的第20030044772号美国专利公布，描述了通过捕获提升(capture lift)筛选噬菌体表达的抗体文库或其它结合分子的方法，一种包括将候选结合分子固定在固体载体上的方法。

通过表达为噬菌体蛋白质融合物(例如，利用M13基因III)的一条链与表达为可溶性片段的互补链的缔合将Fv片段展示在噬菌体的表面。预期噬菌体可以是丝状噬菌体例如I类噬菌体：fd、M13、f1、If1、lke、ZJ/Z、Ff之一和II类噬菌体Xf、Pf1和Pf3之一。噬菌体可以是M13或fd或其衍生物。

当选择初始人V_L和V_H区段时，可进行“混合与匹配”实验(其中针对抗原结合筛选不同的初始选择的V_L和V_H区段对)以选择优选V_L/V_H对组合。此外，为了提高抗体的质量，可在类似于在天然免疫反应过程中负责抗体的亲和力成熟的体内体细胞突变过程的过程中，优选在V_H和/或V_L的CDR1、CDR2或CDR3区域的任一个内随机突变优选V_L/V_H对的V_L和V_H区段。该体外亲和力成熟可通过使用分别与V_H CDR1、CDR2和CDR3或V_LCDR1、CDR2和CDR3互补的PCR引物扩增V_L和V_H区来实现，所述引物在某些位置“搀入”4个核苷酸碱基的随机混合物以便所得的PCR产物编码已将随机突变引入V_H和/或V_L CDR3区的V_L和V_H区段。重新筛选这些随机突变的V_L和V_H区段与抗原的结合。

在从重组免疫球蛋白展示文库筛选和分离抗原特异性抗体后，可从展示包装(例如，从噬菌体基因组)回收编码选择的抗体的核酸，利用标准重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体。如果需要，还可进一步操纵所述核酸以产生本发明的其它抗体形式，如下文中所描述的。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，将编码所述抗体的DNA克隆入重组表达载体，并且引入哺乳动物宿主细胞，如本文中所描述的。

设想可在细菌或宿主细胞的增变株中进行噬菌体展示法。增变株是具有引起在其内复制的DNA相对于其亲代DNA被突变的遗传缺陷的宿主细胞。示例性增变株为NR9046mutD5和NR9046mut T1。

还设想可在辅助噬菌体中进行噬菌体展示法。这是用于感染包含缺陷噬菌体基因组的细胞并且用于互补缺陷的噬菌体。缺陷噬菌体基因组可以是去除了某些功能编码基因序列的噬菌粒或噬菌体。辅助噬菌体的实例为M13K07、M13K07基因III no.3、超级噬菌体；和展示或编码融合至外壳蛋白的结合分子的噬菌体。

还可使用WO 92/01047中公开的层次二元组合法(hierarchical dualcombinatorial approach)通过噬菌体展示筛选法来产生抗体，在所述层次二元组合法中将包含H或L链克隆的单个菌落用于感染编码其它链(L或H)的克隆的完全文库，然后按照噬菌体展示技术例如本文中公开的那些噬菌体展示技术选择所得的两链特异性结合成员。该技术也公开于Marks等人(Bio/Technology，10：779-783(1992))中。

用于在病毒、酵母、微生物和哺乳动物细胞的表面展示多肽的方法也已被用于鉴定抗原特异性抗体。参见，例如，美国专利No.5,348,867；5,723,287；6,699,658；Wittrup，Curr Op.Biotech.12：395-99(2001)；Lee等人，Trends inBiotech.21(1)45-52(2003)；Surgeeva等人，Adv.Drug Deliv.Rev.58：1622-54(2006)。还可将抗体文库与酵母蛋白质例如凝集素，有效地模拟由免疫系统的B细胞产生的抗体的细胞表面展示。

除了噬菌体展示法外，还可使用体外展示法(包括核糖体展示和mRNA展示)来分离抗体(Amstutz等人，Curr.Op.Biotech.12：400-05(2001))。使用核糖体展示来进行多肽的选择描述于Hanes等人(Proc.Natl Acad Sci USA，94：4937-4942(1997))以及属于Kawasaki的美国专利No.5,643,768和5,658,754中。核糖体展示也用于抗体的快速大规模突变分析。选择性诱变法也提供了产生具有增加的活性的抗体的方法，可使用核糖体展示技术选择所述抗体。

改变的糖基化

还可产生抗体变体，所述抗体变体相对于亲代抗体具有改变的糖基化模式，例如，缺失一个或多个在所述抗体中发现的糖基化部分，和/或添加了一个或多个不存在于所述抗体中的糖基化位点。

抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸)是糖部分至天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。这些三肽序列的任一个在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。因此，可通过改变氨基酸序列(以便其包含一个或多个这些三肽序列)来将N-连接的糖基化位点加入抗体。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟氨基酸，最常见地丝氨酸或苏氨酸(虽然也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)的连接。可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基插入原始抗体的序列来将O-连接的糖基化位点加入抗体。

Fc聚糖影响IgG与Fc受体和C1q的结合，从而对于IgG的效应子功能是非常重要的。可产生具有修饰的Fc聚糖和改变的效应子功能的抗体变体。例如，具有修饰的末端糖例如唾液酸、核心岩藻糖、二等分N-乙酰葡糖胺和甘露糖残基的抗体可具有改变的对Fc RIIIa受体的结合和改变的ADCC活性。在其它实例中，具有修饰的半乳糖残基的抗体可具有改变的对C1q的结合和改变的CDC活性(Raju，Curr.Opin.Immunol.20：471-78(2008)。

还涉及了不具有岩藻糖基化或减小的岩藻糖基化的抗体分子，所述抗体分子展示提高的ADCC活性。实现该目的多种方法在本领域是已知的。例如，ADCC效应子活性通过抗体与FcγRIII受体的结合介导，已显示所述结合依赖于CH2结构域的Asn-297上的N-连接的糖基化的糖结构。非岩藻糖基化的抗体以增加的亲和力结合该受体并且比天然岩藻糖基化抗体更高效地触发FcγRIII-介导的作用。例如，CHO细胞(其中α-1，6-岩藻糖基转移酶已被敲除)中非岩藻糖基化抗体的重组产生导致具有增加至100倍的ADCC活性的抗体(Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng.87：614-22(2004))。可通过减小岩藻糖基化途径中该酶或其它酶的活性，例如通过siRNA或反义RNA处理、改造细胞系以敲除所述酶或利用选择性糖基化抑制剂进行培养(Rothman等人，Mol Immunol.26：1113-23(1989))来实现类似作用。某些宿主细胞品系例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系天然产生具有更低的岩藻糖化水平的抗体。(Shields等人，J Biol Chem.277：26733-40(2002)；Shinkawa等人，J BiolChem.278：3466-73(2003))。平分的糖类水平的增加(例如通过在过表达GnTIII酶的细胞中重组产生抗体)也被确定增加ADCC活性(Umana等人，NatBiotechnol.17：176-80(1999))。已预测两个岩藻糖残基中只要一个不存在可足以增加ADCC活性(Ferrara等人，Biotechnol Bioeng.93：851-61(2006))。

具有改变的效应子功能的变体

设想了抗体的其它修饰。在一个方面，可能期望在效应子功能方面对本发明的抗体进行修饰，例如，以增强抗体治疗癌症的功效(Natsume等人，DrugDesign Dev’t&Ther.3：7-16(2009)。示例性效应子功能包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。用于修饰效应子功能的一个方法教导：可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区域中形成链间二硫键。所产生的同二聚体抗体可具有增强的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人(J.Exp Med.176：1191-1195(1992))和Shopes，B.(J.Immunol.148：2918-2922(1992))。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体也可使用如Wolff等人(Cancer Research 53：2560-2565(1993))中描述的异双功能交联剂来制备。可选择地，可对抗体进行工程改造，所述抗体具有双Fc区，从而可具有增强的补体溶解(complement lysis)和ADCC能力。参见Stevenson等人(Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989))。此外，已显示CDR内的序列可引起抗体结合MHC II类并且触发不想要的辅助T细胞反应。保守置换可允许抗体保持结合活性但丧失其触发不想要的T细胞反应的能力。也参见Steplewski等人(Proc Natl Acad Sci U S A.85：4852-56(1998))，所述文献描述了其中鼠可变区与人γ1、γ2、γ3和γ4恒定区连接的嵌合体。

在本发明的某些实施方案中，可能期望使用抗体片段而非完整抗体来例如增加肿瘤穿透。在该情况下，可能期望修饰抗体片段以增加其血液半衰期，例如，给抗体片段添加分子例如PEG或其它水溶性聚合物(包括多糖聚合物)以延长半衰期。这也可以例如通过将清道夫受体结合表位整合入抗体片段(例如，通过抗体片段的适当区域的突变或通过将表位整合入肽标签，随后例如，通过DNA或多肽合成将其在任一末端或在中间融合至抗体片段)来实现(参见，例如，WO96/32478)。

清道夫受体结合表位优选构成区域，在所述区域中来自Fc结构域的一个或两个环的任一或多个氨基酸残基被转移至抗体片段的类似部分。甚至更优选地，转移来自Fc结构域的一个或两个环的3个或更多个残基。更优选的，表位获得Fc区(例如，IgG的)的CH2结构域，并且被转移至抗体的CH1、CH3或VH区或超过一个这样的区域。可选择地，表位获自Fc区的CH2结构域并且被转移至抗体片段的C_L区或V_L区或两者。也参见第WO 97/34631号和第WO 96/32478号国际申请，所述申请描述了Fc变体和它们与清道夫受体的相互作用。

因此，本发明的抗体可包含人Fc部分、人共有Fc部分或保留与Fc清道夫受体相互作用的能力的其变体，包括其中参与二硫键合的半胱氨酸被修饰或除去的变体，和/或其中在N末端添加met和/或除去N端20个氨基酸的一个或多个，和/或除去与补体相互作用的区域例如C1q结合位点，和/或除去ADCC位点的变体[参见，例如，Sarmay等人，Molec.Immunol.29：633-9(1992)]。

先前的研究将人和鼠IgG上针对FcR的结合位点定主要位至由IgG残基233-239组成的下铰链区(lower hinge region)。其它研究提出另外的宽广区段，例如Gly316-Lys338(对于Fc受体I)、Lys274-Arg301和Tyr407-Arg416(对于人Fc受体III)，或在下铰链外部发现少数特异性残基例如Asn297和Glu318(对于与鼠Fc受体II相互作用的鼠IgG2b)。人IgG1Fc片段与人Fc受体IIIA的

晶体结构的报导将IgG1残基Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332描绘为参与结合Fc受体IIIA。已有人基于晶体结构建议，除了下铰链(Leu234-Gly237)外，IgG CH2结构域环FG(残基326-330)和BC(残基265-271)中的残基可能在结合Fc受体IIA中起作用。参见Shields等人(J.Biol.Chem.，276：6591-604(2001))，通过引用整体并入本文。Fc受体结合位点内的残基的突变可导致改变的效应功能，例如改变的ADCC或CDC活性，或改变的半衰期。如上所述，潜在突变包括一个或多个残基的插入、缺失或置换，包括利用丙氨酸的置换、保守置换、非保守置换或利用来自不同IgG亚类的相同位置上的对应氨基酸残基的置换(例如用该位置上的对应的IgG2残基置换IgG1残基)。

Shields等人报导参与结合所有人Fc受体的IgG1残基位于靠近铰链的CH2结构域内并且落入如下两个种类：1)可直接与所有FcR相互作用的位置包括Leu234-Pro238、Ala327和Pro329(和可能地Asp265)；2)影响糖类性质或位置的位置，包括Asp265和Asn297。影响与Fc受体II的结合的其它IgG1残基如下：(最大影响)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298，和(不太影响)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378以及Lys414。A327Q、A327S、P329A、D265A和D270A减弱结合。除了上文中针对所有FcR鉴定的残基外，减弱与Fc受体IIIA的结合40％或更多的其它IgG1残基如下：Ser239、Ser267(仅有Gly)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338和Asp376。增强与FcRIIIA的结合的变体包括T256A、K290A、S298A、E333A、K334A和A339T。Lys414显示对于FcRIIA和FcRIIB的结合减弱40％，Arg416显示对于FcRIIA和FcRIIIA的结合减弱30％，Gln419显示与FcRIIA的结合减弱30％，以及与FcRIIB的结合减少40％，Lys360显示与FcRIIIA的结合增强23％。也参见Presta等人(Biochem.Soc.Trans.30：487-490，2001)，通过引用整体并入本文，所述文献描述了IgG1的Fc区中的几个位置，所述位置被发现只增强对特定Fcγ受体(R)的结合或者同时增强与一种类型的FcγR的结合并且减弱与另一种类型的结合。随后在体外抗体-依赖细胞性细胞毒性(ADCC)测定中测试所选择的具有增强的与FcγRIIIa的结合的IgG1变体，当使用外周血单核细胞或天然杀伤细胞时，所述变体显示ADCC的增强。

例如，美国专利No.6,194,551(通过引用整体并入本文)描述了具有改变的效应子功能的变体，所述变体在人IgG Fc区中，在氨基酸位置329、331或322(使用Kabat编号)上包含突变，所述突变中的一些展示减弱的C1q结合或CDC活性。作为另一个实例，美国专利No.6,737,056(通过引用整体并入本文)描述了具有改变的效应子或Fc-γ-受体结合的变体，所述变体在人IgGFc区中，在氨基酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439(使用Kabat编号)上包含突变，所述变体中的一些展示与减弱的ADCC或CDC活性相关的受体结合特征。在这些突变中，氨基酸位置238、265、269、270、327或329上的突变据称减弱与FcRI的结合，氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439上的突变据称减弱与FcRII的结合，氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437上的突变据称减弱与FcRIII的结合。

美国专利No.5,624,821(通过引用整体并入本文)报导了鼠抗体的Clq结合活性可通过突变重链的氨基酸残基318、320或322来改变并且置换残基297(Asn)导致裂解活性的去除。

第20040132101号美国专利公布(通过引用整体并入本文)描述了在氨基酸位置240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328或332(使用Kabat编号)或位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332(使用Kabat编号)上具有突变的变体，其在位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332上的突变可减弱ADCC活性或减弱与Fcγ受体的结合。

Chappel等人(Proc Natl Acad Sci U S A.88：9036-40(1991))(通过引用整体并入本文)报导了IgG1的嗜细胞活性是其重链CH2结构域的固有特性。IgG1的氨基酸残基234-237的任何残基上的点突变显著降低或消除其活性。需要将所有IgG1残基234-237(LLGG)置换至IgG2和IgG4中来恢复完全结合活性。观察到包含完整ELLGGP序列(残基233-238)的IgG2抗体比野生型IgG1更具活性。

Isaacs等人(J Immunol.161：3862-9(1998))(通过引用整体并入本文)报导了对于FcγR结合是至关重要的基序内的突变(谷氨酸233至脯氨酸、亮氨酸/苯丙氨酸234至缬氨酸以及亮氨酸235至丙氨酸)完全阻止靶细胞的消耗。谷氨酸318至丙氨酸的突变消除了小鼠IgG2b的效应功能并且也减弱了人IgG4的效力。

Armour等人(Mol Immunol.40：585-93(2003))(通过引用整体并入本文)鉴定了IgG1变体，所述变体与激活性受体FcγRIIa反应的效率为野生型IgG1的至多1/10，但其对抑制性受体FcγRIIb的结合只减弱至1/4。氨基酸233-236的区域中和/或氨基酸位置327、330和331上产生突变。也参见WO 99/58572，通过引用整体并入本文。

Xu等人(J Biol Chem.269：3469-74(1994))(通过引用整体并入本文)报导了将IgG1 Pro331突变成Ser显示减弱的C1q结合并且实际上消除了裂解活性。相反地，在IgG4中用Pro置换Ser331赋予IgG4Pro331变体部分裂解活性(40％)。

Schuurman等人(Mol Immunol.38：1-8(2001))(通过引用整体并入本文)报导了将参与重链间键形成的铰链半胱氨酸之一Cys226突变成丝氨酸导致更稳定的重链间连接。将IgG4铰链序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成IgG1铰链序列Cys-Pro-Pro-Cys也显著地稳定了重链之间的共价相互作用。

Angal等人(Mol Immunol.30：105-8(1993))(通过引用整体并入本文)报导了将IgG4的氨基酸位置241上的丝氨酸突变成脯氨酸(在IgG1和IgG2的该位置上发现的)导致均质性抗体的产生以及与原始嵌合IgG4相比较延长了血清半衰期和改善了组织分布。

共价修饰

本发明的多肽结合剂例如抗体的共价修饰也包括在本发明的范围内。如果适用，则可通过化学合成或通过酶促或化学切割多肽结合剂来制备它们。可通过将多肽结合剂的靶向氨基酸残基与有机衍生剂(其能够与选择的侧链或N-或C-末端残基反应)反应来将多肽结合剂的其它类型的共价修饰引入分子。

半胱氨酰残基最常见地与α-卤代乙酸(和对应的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。还通过与溴化三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯(chloroacetylphosphate)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应来衍生半胱氨酰残基。

通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应来衍生组氨酰残基，因为该试剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴也是有用的；优选在pH6.0下于0.1M二甲基胂酸钠中进行反应。

将赖氨酰残基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。利用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α-氨基的残基的其它适当试剂包括酰亚胺酯例如：甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氯化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶-催化的与乙醛酸的反应。

通过与一种或几种常规试剂(其中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应来修饰精氨酰残基。精氨酸残基的衍生化因胍功能性基团的高pKa而需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可进行酪氨酰残基的特异性修饰，通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基是特别有趣的。最常见地，将N-乙酰咪唑和四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。使用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基以制备用于放射性测定的标记蛋白质。

通过与碳二亚胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R′)反应选择性修饰羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中R和R′是不同的烷基例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰残基和谷氨酰残基转化成天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基通常脱去酰胺基分别成为对应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。这些残基的脱酰胺形式落在本发明的范围内。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))、N末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。

另一种类型的共价修饰包括将糖苷化学或酶促偶联至多肽结合剂。这些方法是有利的，因为它们不需要在宿主细胞中产生多肽结合剂，所述宿主细胞具有进行N-或O-连接的糖基化的糖基化能力。取决于所使用的偶联模式，可将糖连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离硫氢基例如半胱氨酸的硫氢基，(d)游离羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO87/05330和Aplin及Wriston(CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981))中。

可化学地或酶促地除去存在于多肽结合剂上的任何糖部分。化学去糖基化需要将多肽结合剂暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。该处理导致大多数或所有糖(除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺))的切割，同时保持多肽结合剂完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人(Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987))和Edge等人(Anal.Biochem.118：131(1981))进行了描述。可通过使用多种内切-和外切-糖苷酶来进行多肽结合剂上的糖部分的酶促切割，如由Thotakura等人(Meth.Enzymol.138：350(1987))描述的。

另一个类型的多肽结合剂的共价修饰包括将多肽结合剂连接至多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油、聚氧烯烃(polyoxyalkylene)或多糖聚合物例如葡聚糖。此类方法在本领域是已知的，参见，例如美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192、4,179,337、4,766,106、4,179,337、4,495,285、4,609,546或EP 315 456。

衍生物

衍生物是指通过这样的技术如遍在蛋白化、标记(例如，利用放射性核素或多种酶)、共价聚合物连接例如PEG化(利用聚乙二醇的衍生化)和通过化学合成氨基酸例如鸟氨酸进行的插入或置换修饰的多肽结合剂，包括抗体。本发明的多肽结合剂的衍生物例如抗体也用作治疗剂并且可通过本发明的方法产生。

可共价地或通过离子键、范德瓦尔斯力或氢键将缀合的部分整合入或连接于多肽结合剂，例如放射性核素或被链霉抗生物素蛋白识别的生物素化核苷酸的整合。

可将聚乙二醇(PEG)连接于多肽结合剂以提供更长的体内半衰期。PEG基团可具有任何方便的分子量并且可以是线性或分枝的。PEG的平均分子量优选在约2千道尔顿(“kD”)至约100kDa之间，更优选约5kDa至约50kDa之间，最优选约5kDa至约10kDa之间。通常通过PEG部分上的天然或改造的反应性基团(例如，醛、氨基、巯羟基或酯基团)与多肽结合剂上的反应性基因(例如，醛、氨基或酯基团)的酰化或还原烷基化来将PEG基团连接于本发明的多肽结合剂。可使用本领域公知的技术将PEG部分添加至多肽结合剂。参见例如，第WO 96/11953号国际公布和美国专利No.4,179,337。

多肽结合剂与PEG的连接通常在水相中发生并且可通过反向分析HPLC容易地监控。通过制备型HPLC纯化PEG化的物质，然后通过分析HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱法进行表征。

抗体缀合物

可将多肽结合剂可以以“裸露”或未缀合的形式进行施用，或可被直接缀合于其它治疗剂或诊断剂，或可被间接缀合于包含这样的其它治疗剂或诊断剂的载体聚合物。在某些实施方案中，将多肽结合剂缀合于细胞毒性剂例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(例如，放射性缀合物)。适当的化学治疗剂包括：道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人(1986)同上)。适当的毒素包括：细菌毒素例如白喉毒素；植物毒素例如蓖麻蛋白；小分子毒素例如格尔德霉素(Mandler等人J.Natl.Cancer Inst.92(19)：1573-81(2000)；Mandler等人Bioorganic&amp；Med.Chem.Letters10：1025-1028(2000)；Mandler等人Bioconjugate Chem.13.786-91(2002))、类美坦素(EP 1391213；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-23(1996))、auristatins(Doronina等人，Nat.Biotech.21：778-84(2003)和加利车霉素(Lode等人Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等人Cancer Res.53：3336-3342(1993))。

可通过使用放射性同位素、亲和力标记(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)荧光或发光或生物发光标记(例如FITC或罗丹明等)、顺磁性原子等可检测地标记多肽结合剂。用于实现这样的标记的方法在本领域是公知的；例如，参见(Sternberger，L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18：315(1970)；Bayer，E.A.等人，Meth.Enzym.62：308(1979)；Engval，E.等人，Immunol.109：129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13：215(1976))。

多肽结合剂部分的缀合描述于美国专利No.6,306,393中。一般技术也描述于Shih等人，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer46：1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利No.5,057,313中。该一般方法包括将具有氧化的糖部分的多肽结合剂组分与载体聚合物(所述载体聚合物具有至少一个游离胺官能团并且载有多个药物、毒素、螯合剂、硼附加物或其它治疗剂)反应。该反应导致初始希夫碱(亚胺)键合，所述键合可通过还原成仲胺以形成终缀合物来稳定。

载体聚合物可以是例如氨基葡聚糖或至少50个氨基酸残基的多肽。用于将药物或其它试剂缀合于载体聚合物的多种技术在本领域是已知的。可使用多肽载体而非氨基葡聚糖，但多肽载体应当在链中具有至少50个氨基酸残基，优选100-5000个氨基酸残基。至少某些氨基酸应当是赖氨酸残基或谷氨酸或天冬氨酸残基。赖氨酸残基的侧氨基以及谷氨酰胺和天冬酰胺的侧羧基方便用于连接药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其它治疗剂。适当的多肽载体的实例包括多聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，以及此类氨基酸与其它氨基酸例如丝氨酸的混合聚合物，以给所得的负荷载体(loaded carrier)和缀合物赋予期望的溶解度性质。

可选择地，可通过将多肽结合剂组分与治疗剂直接缀合来制备缀合的多肽结合剂。一般方法与间接缀合方法类似，除了将治疗剂直接连接于氧化的多肽结合剂组分外。例如，可将多肽结合剂的糖部分连接于聚乙二醇以延长半衰期。

可选择地，可通过二硫键形成或使用异双功能交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)将治疗剂连接在还原的抗体组分的铰链区。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是公知的。参见，例如，Wong，Chemistry Of Protein Conjugation andCross-Linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，″Modification of Antibodies byChemical Methods″，于Monoclonal Antibodies：Principles and Applications中，Birch等人(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies″，于MonoclonalAntibodies：Production，Enineering and Clinical Application中，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。多种双功能蛋白质偶联剂在本领域是已知的，例如N-琥珀酰亚胺基-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮基衍生物(例如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。

抗体融合蛋白

制备抗体融合蛋白的方法在本领域是公知的。参见，例如，美国专利No.6,306,393。包含白细胞介素-2部分的抗体融合蛋白由Boleti等人，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等人，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank等人，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)和Hu等人，Cancer Res.56：4998(1996)进行了描述。此外，Yang等人(Hum.Antibodies Hybridomas 6：129(1995))描述了包含F(ab′)2片段和肿瘤坏死因子α部分的融合蛋白。抗体融合蛋白的其它实例由Pastan等人，Nat.Reviews Cancer 6：559-65(2006)进行了描述。

用于制备其中重组分子包含一个或多个抗体组分和毒素或化学治疗剂的抗体-毒素融合蛋白的方法对于本领域技术人员来说是已知的。例如，抗体-假单胞菌外毒素A融合蛋白已由Chaudhary等人，Nature 339：394(1989)，Brinkmann等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 88：8616(1991)，Batra等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：5867(1992)，Friedman等人，J.Immunol.150：3054(1993)，Wels等人，Int.J.Can.60：137(1995)，Fominaya等人，J.Biol.Chem.271：10560(1996)，Kuan等人，Biochemistry 35：2872(1996)和Schmidt等人，Int.J.Can.65：538(1996)进行了描述。包含白喉毒素部分的抗体-毒素融合蛋白已由Kreitman等人，Leukemia 7：553(1993)，Nicholls等人，J.Biol.Chem.268：5302(1993)，Thompson等人，J.Biol.Chem.270：28037(1995)和Vallera等人，Blood 88：2342(1996)进行了描述。Deonarain等人，Tumor Targeting1：177(1995)已描述了具有RNA酶部分的抗体-毒素融合蛋白，而Linardou等人，Cell Biophys.24-25：243(1994)产生了包含DNA酶I组分的抗体-毒素融合蛋白。白树毒素在Wang等人，第209届美国化学会会议的摘要(Abstracts ofthe 209th ACS National Meeting)，Anaheim，Calif.，1995年4月2-6日，第1部分，BIOT005的抗体-毒素融合蛋白中用作毒素部分。作为另外的实例，Dohlsten等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 91：8945(1994)报导了包含葡萄球菌属肠毒素-A的抗体-毒素融合蛋白。

适合用于此类融合蛋白的制备的毒素的实例是蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞杆菌内毒素。参见，例如，Pastan等人，Cell 47：641(1986)和Goldenberg，CA--A Cancer Journal for Clinicians44：43(1994)。其它适当的毒素对于本领域技术人员来说是已知的。

还可通过将抗体缀合于前体药物活化酶来将本发明的抗体用于ADEP，所述酶可将前体药物(例如，肽基化学治疗剂，参见WO81/01145)转化成活性抗癌药物。参见，例如，WO88/07378和美国专利No.4,975,278。

用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括任何酶，所述酶能够以这样的方式作用于前体药物以将其转化成其更具活性的细胞毒性形式。

用于本发明的酶包括但不限于：碱性磷酸酶；芳基硫酸酯酶；胞嘧啶脱氨酶、5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；D-丙氨酰羧肽酶；碳水化合物-切割酶例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；β-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可选择地，具有酶促活性的抗体，在本领域也称为抗体酶，可用于将本发明的前体药物转化成游离活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987)。可如在本文中对于抗体酶至肿瘤细胞群体的递送所描述的制备抗体-抗体酶缀合物。

可利用本领域公知的技术例如使用上面论述的异双功能交联剂将上述酶共价连接至抗体。可选择地，可使用本领域公知的重组DNA技术(参见，例如，Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984))构建融合蛋白，所述融合蛋白包含连接于本发明的酶的至少功能性活性部分的本发明的抗体的至少抗原结合区。

药物组合物的配制

为了给人或测试哺乳动物施用本发明的多肽结合剂，优选将多肽结合剂配制于包含一种或多种无菌的药学上可接受的载体的无菌组合物中。短语“药学上或药理上可接受的”是指当使用下文中描述的本领域公知的途径施用时不产生过敏或其它不利反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何或所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

利用任何适当的方法(包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内施用)施用多肽结合剂，并且若需要用于局部治疗，进行病灶内施用。胃肠外输注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、真皮内或皮下施用。优选通过注射，最优选静脉内或皮下注射给药，部分取决于施用是短暂的还是长期的。设想了其它施用方法，包括局部，特别是经皮、透膜(transmucosal)、直肠、口服或局域施用(例如通过靠近期望位点放置的导管)。

包含本发明的多肽结合剂作为活性成分的本发明的药物组合物可包含无菌的药学上可接受的载体或添加剂，取决于施用途径。此类载体或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。所使用的添加剂选自但不限于上述试剂或其组合(适当时)，取决于本发明的剂型。对于溶液或乳剂，适当的载体包括例如水溶液或酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。胃肠外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏或不挥发油。静脉内媒介物可包括不同的添加剂、防腐剂或液体、营养物或电解质补充剂。多种水性载体是适当的，例如无菌磷酸盐缓冲盐水、抑菌水、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可包括其它蛋白质以增强稳定性，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，将其经历温和化学修饰等。

通过将具有期望的纯度的多肽结合剂与任选的生理上可接受载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.编(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备多肽结合剂的治疗性制剂以用于贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度上对受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

还可将活性成分捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法(例如，分别在胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微胶囊、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中。此类技术公开于雷明顿药物科学，第16版，Osol，A.编1980)中。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过经无菌滤膜过滤来容易地实现。

多肽结合剂在此类制剂中的浓度变化很大，例如从按重量计低于约0.5％(通常为或至少约为1％)至多至15或20％，并且根据所选择的具体施用模式，主要基于终体积、粘度等来进行选择。因此，可制备用于胃肠外注射的典型药物组合物达到包含1ml无菌缓冲水和50mg多肽结合剂。可制备用于静脉内输注的典型组合物达到包含250ml的无菌林格氏溶液和150mg多肽结合剂。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显然的并且更详细地描述于例如雷明顿药物科学，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)中。多肽结合剂的有效剂量在0.01mg至1000mg/kg体重/施用的范围内。

药物组合物可以以无菌注射水溶液、油性悬浮液、用于无菌注射液或分散体的临时制备的分散体或无菌粉剂的形式存在。可使用上文中提及的那些适当的分散剂或湿润剂或悬浮剂按照已知的技术配制悬浮液。无菌注射制剂也可以是非毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物、植物油、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液的溶剂或分散介质。此外，无菌不挥发油被常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸用于注射剂的制备。

在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到可容易注射的程度的流动性。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。其在制造和贮存的条件下必须是稳定的并且必须进行防腐处理以抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。可利用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，期望包含等渗剂例如糖或氯化钠。注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。

可用摄取或吸收促进剂配制用于施用的组合物来增强它们的功效。此类促进剂包括例如水杨酸盐、甘胆酸盐/亚油酸盐、乙醇酸盐、抑肽酶、杆菌肽、SDS、癸酸盐等。参见，例如，Fix(J.Pharm.Sci.，85：1282-1285(1996))以及Oliyai和Stella(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：521-544(1993))。

生物物理测定法

可通过分子生物物理方法研究复杂的生物事件，所述方法将它们当作可按照统计力学、热力学和化学动力学来理解的相互作用单元的系统。

核磁共振(NMR)、等温滴定量热法、动态光散射、表面等离子共振技术、双偏振极化干涉测量技术通常用于评估化合物是否有效地结合测试抗原、结合的化学计量学、任何相关的构象变化和鉴定混杂抑制剂。(参见，例如，Correia J.J&Detrich H.W.(编)“Biophysical Tools for Biologists第2卷.”Methods in Cell Biol 89(2)(2008))。

荧光成像技术以及电子显微镜术、x-射线晶体学、核磁共振谱法(NMRspectroscopy)和原子力显微镜术(AFM)通常用于使生物意义的结构可见。可使用技术例如双偏振极化干涉测量技术和圆二色性测量结构的构象变化。使用光摄或AFM进行的分子的直接操纵也可用于监控其中力和距离都在纳米尺度上的生物事件。

用于生物物理学的许多技术是可获得的，包括：原子力显微镜术、生物光子学(biophotonics)、生物传感器和生物电子学、钙成像、量热法、圆二色性、低温生物学、双偏振极化干涉测量技术、电生理学、荧光、显微术、神经影像、中子自旋回波光谱法(neutron spin echo spectroscopy)、膜片钳、核磁共振波谱法、x-射线晶体学。在某些实施方案中，本发明的测定可利用可检测的部分。可检测的部分可以是能够直接或间接产生可测量信号例如放射性、生色、发光或荧光信号的任何部分，其可用于定量样品中结合的可检测的部分或标记的量。本领域已知的可检测的标记包括放射性同位素例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I、电致化学发光标记(electrochemiluminescent label)(例如与底物结合的基于钌(Ru)的催化剂等)、发光或生物发光标记(例如，铕、钒)、荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素、酶(例如，酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)、比色标记(colorimetriclabel)例如胶体金、有色玻璃或塑料珠粒(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)、顺磁性原子或磁化剂、电子致密试剂、含荧光染料的纳米或微米珠粒、纳米晶体、量子点、量子珠粒、纳米标签(nanotag)、具有荧光标记的树状聚合物、微转发器(micro-transponder)、电子供体分子或分子结构或反光颗粒。微粒可以是纳米晶体或量子点。纳米晶体是吸收光的光子，随后再发射不同波长的光子的物质(荧光基团)。此外，可将其它荧光标记或第二抗体缀合于纳米晶体。纳米晶体可从来源例如Invitrogen和Evident Technologies(Troy，N.Y.)商购获得。其它标记包括E)-5-[2-(甲氧羰基)乙烯基]胞苷，其为非荧光分子，当经历紫外线(UV)照射时产生产物3-β-D-呋喃核糖基-2，7-二氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶，该产物显示强荧光信号。条形码标记描述于第20070037195号美国专利公布中。

本领域已知的多种测定法可用于本发明，例如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法、免疫沉淀测定法、荧光共振能量转移(FRET)、电子免疫测定法、表面等离子共振技术(SPR)和纳米颗粒衍生的技术。

竞争性结合测定法依赖于标记的标准(例如，多肽结合剂所结合的抗原或其片段)与测试样品中的抗原竞争结合多肽结合剂的能力。测试样品中抗原的量与与抗体结合的标准的量成反比。为了有利于测定结合的标准的量，抗体在竞争前或竞争后通常是溶解的，以便结合的抗原可方便地与未结合的抗原分离。在可选择的实施方案中，竞争性结合测定法测量经标记的多肽结合剂与未标记的多肽结合剂竞争结合抗原或其片段的能力。

夹心测定法通常包括使用两种抗体，每一种抗体能够结合待检测和/或定量的蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定法中，测试样品中的分析物通常被固定在固相上的第一多肽结合剂结合，然后第二多肽结合剂结合所述分析物，从而形成不溶性三部分复合物。参见，例如，美国专利No.4,376,110。第二多肽结合剂本身可使用可检测部分标记(直接夹心测定法)或可使用用可检测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体(间接夹心测定法)来测量。例如，一种类型的夹心测定法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，在该情况下可检测部分是酶。参见，例如，第18章，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，John Wiley&Sons，New York，NY(1995)。

测定法的另一个实例包括荧光共振能量转移(FRET)发射。例如，用FRET供体分子标记一种化合物并且用FRET受体分子标记其结合伴侣，或反之亦然。当结合在结合伴侣之间发生时，FRET供体和FRET受体分子被拉拢靠近并且以特定波长发射荧光。可使用窄带通滤波器阻挡除标记的波长之外的所有波长。FRET分子对在本领域是商购可得的(例如，来自Invitrogen)，并且可按照制造商的方案来进行使用。使用光学成像技术例如CCD照相机来检测FRET发射。

测定法的另一个实例是生物发光共振能量转移(BRET)，例如其使用WO/06086883中描述的生物传感器。

另一种类型的测定法包括利用电子供体进行标记。用电子供体标记一种分子，并且将相互作用分子与电触点结合，或反之亦然。当结合在结合伴侣之间发生时，标记提供电子给电触点。参见，例如，Ghindilis，Biochem SocTrans.28：84-9(2000)和Dai等人，Cancer Detect Prev.29：233-40(2005)，其描述了用于电子免疫测定的方法。随后利用A至D(模拟-数字转换)交换器读取电触点并且进行定量。电子计数越高，相互作用发生越多。

能够单分子检测的标记的一个实例是将等离子共振颗粒(PRP)作为光学报告子，如Schultz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：996-1001(2000)，通过引用并入本文)中所描述的。PRP是例如直径40-100nm的金属纳米颗粒，其因金属中的导电电子的集体共振(表面等离子共振)而散射光。与纳米颗粒相关的等离子共振的强度、峰波长和谱带宽度取决于颗粒的大小、形状和材料组成以及局部环境。通过在制备过程中影响这些参数，可形成具有在可见光谱范围内的任何地方的散射峰的PRP。对于球形PRP，峰散射波长和散射效率随半径增大而增加，提供了用于产生不同着色标记的方法。通过在制备过程中调整球的终半径，例如可重现性地制备峰值散射波长在数纳米的靶向波长内的银球群。因为PRP是明亮的但为纳米尺度的，因此可将它们用作用于单分子检测的指示剂；即，视野中结合的PRP的存在可表示单个结合事件。表面等离子共振检测器系统的实例是BIAcore测定系统。参见，例如，Malmquist，J Molec Recognition，7：1-7(1994)。

还可使用纳米颗粒衍生的技术来检测分子相互作用。参见，例如，Ao等人，Anal Chem.78：1104-6(2006)，其描述了金纳米颗粒猝灭，Tang等人，Biosens Bioelectron.2005年11月30日，其描述了抗体检测中的SiO(2)/Au纳米颗粒表面，和Lieu等人，J Immunol Methods.307：34-40(2005)，其描述了用于固体基质室温磷光免疫测定法(solid substrate-room temperaturephosphorescence immunoassay)(SS-RTP-IA)的含二溴萤光素的二氧化硅纳米颗粒。

可在测定中进行结合亲和力或结合率参数的任何上述测量，在所述测定中第一组分、第二组分和多肽结合剂的一种或多种存在于溶液中，或在所述测定中将第一组分、第二组分和多肽结合剂的一种或多种连接于固相(共价地或非共价地)，或在所述测定中将第一组分、第二组分和多肽结合剂的一种或多种在细胞表面上表达。第一组分和/或第二组分各自本身可以是多个化合物的复合物。

溶液相生物物理测定法

在某些实施方案中，可使用溶液相生物物理测定法鉴定动力学调节剂。“溶液相”测定法意指其中待测量的相互作用在液体中发生的测定法。溶液亲和力测定法是测量平衡时相互作用的平衡离解常数(也称为“亲和力”或“K_D”)的有用工具。如果调节剂可结合形成复合物(例如，受体/相互作用)的蛋白质并且调节剂改变该相互作用的亲和力，那么可将溶液亲和力测定法用于测定在动力学调节剂存在和不存在的情况下相互作用的亲和力。其也可用于测量在复合物组分的固定浓度范围内对调节剂的剂量反应。

本公开内容提供了用于平衡溶液亲和力测量的新型应用。此类测定法使得能够基于它们差异调节靶-信号转导伴侣相互作用的亲和力的能力表征和分层前导候选物(lead candidate)。先前关于监控因抑制性或位阻型药物引起的亲和力的减小的工作利用过量的与结合伴侣之一预复合的药物，并且通常利用表面等离子共振(SPR)技术或放射配体测定技术来进行。在某些方面，本公开内容允许使用结合只有存在当配体或受体或其它蛋白质结合伴侣已形成它们的复合物时才存在的表位的药物。

实施例1描述了用于使用模型蛋白质-蛋白质复合物进行平衡溶液亲和力测量的方法。所有可逆结合相互作用在理论上可以是可通过药物调节的和可在与所述形式非常相似的测定中监控的亲和力。配体和受体在测定形式中的作用可被转换并且这样做可用作系统正确发挥功能的验证。可使用任何相互作用伴侣对而不仅仅是受体-配体对。

此类技术用作用于定量待研究的游离(未结合的)结合伴侣的定量的高敏感性方法。当利用固定浓度的一种结合伴侣(B)进行该分析并且另一种结合伴侣(A)在在高于和低于相互作用的K_D值的至少一个对数的宽浓度范围内变化时，则可测量未结合的B的量，然后将数据与产生相互作用的KD值的模型拟合。可在不同浓度的动力学调节药物存在或不存在的情况下进行该实验，从而允许详细地表征亲和力增强。通过测量游离结合伴侣B而非目的药物，可不依赖于药物-复合物相互作用测定A-B相互作用亲和力的监控。

此类测定可用于筛选调节结合相互作用的亲和力的药物。这可用于药物疗法和更灵敏的诊断和分析测定法的开发。此外，所述测定允许甚至对于识别只在复合物已形成后才产生的表位的药物，详尽地表征亲和力调节的程度。本公开内容允许针对它们在亲和力调节中的效力分层和分级多种药物候选物。

固相生物物理测定法

在某些实施方案中，可使用固相生物物理测定法鉴定动力学调节剂。“固相”意指可将本发明的测试化合物或复合物组分附着于其上的非水性、惰性基质。本文中包括的固相的实例包括部分或完全由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇、金属硅、金属合金、anopol、聚合物、尼龙或微阵列例如蛋白质芯片形成的固相。在某些实施方案中，取决于上下文，固相可包括测试板的孔、过滤器、膜、色谱树脂或珠粒。该术语还包括分开的颗粒的不连续固相，例如美国专利No.4,275,149中描述的那些固相。

在某些实施方案中，使用本领域已知的任何方法将测试化合物或复合物组分附着至或连接至固相，所述方法包括但不限于共价键合或通过选择性结合对(例如，生物素与抗生物素蛋白、谷胱甘肽与GST、组氨酸标签与Ni)的间接附着。

许多固相测定形式在本领域是已知的，包括微量培养板、珠粒、树脂、芯片等。例如，FMAT^TM(荧光微体积数字图象测定技术(fluorimetricmicrovolume assay technology)；Applied Biosystems，Foster City，CA)系统可使用与具有荧光标记的或生物素化的配体的珠粒结合的细胞或受体。这具有用作完全均相测定形式的潜能。可使用Luminex^TM系统(Luminex Corp.，Austin，TX)应用实际上相同的形式，其中使用相似的基于珠粒的系统。FMAT^TM与Luminex^TM测定形式之间的主要差异在于检测的方法。Luminex^TM平台使珠粒流过光学流动池以测量来自珠粒的荧光发射，FMAT^TM使非常靠近微量板的孔的底的狭窄平面中的荧光成像。可选择地电化学发光系统因它们的高灵敏性和均相的能力而可容易地适用于筛选亲和力调节剂。这些系统，例如Tricorder^TM(BioVeris Corp.，Washington D.C.)使用钌衍生的电化学检测技术。可针对该系统进行最优化的测定形式与其它系统相似，主要差异在于电化学发光标记技术和检测仪器的使用。

适当的测定法包括经设计用以检测相互作用调节剂对标记的(例如，生物素化的)靶对于其结合伴侣的亲和力的调节的基于微量板的测定法。测定可以是均相的或半均相的。均相测定是其中将所有组分混合在一起，温育，然后分析的测定。半均相测定是其中大部分反应作为复杂混合物发生，但在加入终试剂和分析之前需要清洗步骤，与典型的分步装配夹心测定法(其中加入每一种组分，然后在在加入下一种组分之前将其清洗掉)相反。在某些实施方案中，测定法是免疫测定法。在某些实施方案中，测定法是半均相酶免疫测定法(EIA)，其允许通过使用捕获在EIA板上的标记的(例如，生物素化的)分析物的量作为读出来监控结合伴侣的平衡结合常数的调节。在平衡，或几乎平衡的环境中在充分低于饱和度的标记的分析物的浓度上，平衡亲和力常数的变化导致或多或少的分析物保留在微量板上。

在某些实施方案中，可如下构建用于动力学调节剂的测定法。将分析物的结合伴侣固定在微量板例如EIA板上。然后用无关蛋白质或封闭试剂(例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、ChemiBlock^TM(Millipore，Billerica，MA)、无关IgG等或封闭试剂的任何组合)封闭板。在封闭后，洗涤板，然后向孔中加入调节剂、标记的分析物(例如生物素化的分析物)和缀合于可检测部分例如酶或荧光基团的第二检测试剂(例如，链霉抗生物素蛋白)的混合物。多种可检测的部分在本领域是已知的，包括酶例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，其作用于多种比色、荧光或发光底物。铕可用于时间分辨荧光检测，荧光基团可用于直接荧光。也可使用具有多种标记的抗配体检测抗体，这避免对生物素化配体的需要，只要所使用的抗体可检测受体-结合的配体即可。在其它实施方案中，可使用被直接缀合于荧光基团或比色酶的配体。

通常将板温育数小时以允许多种相互作用达到平衡。温育后，洗涤板，立即用报告底物(例如比色、荧光或发光底物)进行显影。捕获在板上的标记的分析物越多，来自第二检测试剂(例如，链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶)的信号越强。如果调节剂增强相互作用的亲和力，那么结合于板的标记的(例如生物素化的)分析物的量将比在动力学调节剂不存在的情况下的所述量更大。如果调节剂减弱相互作用的亲和力，那么结合于板的标记的(例如生物素化的)分析物的量比在动力学调节剂不存在的情况下的所述量更小。

微量板测定法可于用于以几种方式监控亲和力调节。在某些实施方案中，使用固定的多肽结合剂浓度，并且在多个孔上滴定标记的分析物。这将亲和力调节作用显示为滴定曲线相对于在动力学调节剂不存在的情况下的相同分析物的滴定曲线的偏移。

在某些实施方案中，当在调节剂不存在的情况下进行标记的分析物的滴定时，可选用于单一标记分析物浓度测定的浓度。该浓度应当落在正好高于分析物的滴定曲线的底部(EC_10-20)。这允许配体-受体相互作用的亲和力的任何增强调节以产生测试的信号的可容易观察的偏移。一旦确定标记的分析物的敏感浓度，可以以筛选模式进行测定，在所述筛选模式中，在单点分析中测试粗制或纯化的调节剂样品的亲和力调节作用。同样地，也在标记的分析物的固定浓度上通过调节剂的滴定进行测定以显示调节剂作用的剂量反应。

在某些实施方案中，分析物分子的标记(例如，生物素化)可影响该分子的结合亲和力或稳定性。如果情况如此，那么可利用其中将未标记的分析物用于实验/平衡相的可选择的测定形式。当在检测前清洗掉样品时，可加入步骤(其中加入最优化量的标记的分析物进行更短的时间量，将其清洗掉，然后检测)。这可允许在平衡相中被结合的分析物用作标记的分析物的竞争剂。由于平衡步骤中预结合的未标记的分析物的量更高，从而减弱了标记的分析物结合板的能力，因此亲和力增强抗体产生更弱的测定信号。也使用第二报告分子或加入分层的检测试剂以增强信号来开发半均相测定的其它形式。这些类型的改进对于本领域技术人员来说是已知的。示例性固相亲和力测定法描述于实施例2中。

基于细胞的生物物理测定法

在某些实施方案中，使用基于细胞的生物物理测定法来鉴定动力学调节剂。“基于细胞的”意指其中待测试的信号复合物的至少一个组分存在于细胞表面上的测定法。此类测定法对于检测牵涉构象敏感性蛋白质的结合相互作用的调节剂可以是特别有利的，所述构象敏感性蛋白质是例如跨膜受体，包括：G蛋白偶联受体(GPCR；例如蕈毒碱乙酰胆碱受体、腺苷受体、肾上腺受体、GABA受体、血管紧张素受体、大麻素受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、亲代谢性谷氨酸盐受体、组胺受体、嗅觉受体、阿片样物质受体、毛柳苷受体、胰泌素受体、血清素受体、生长抑素受体、钙敏感受体、趋化因子受体、1-磷酸-鞘氨醇(S1P)受体)；受体酪氨酸激酶(例如红细胞生成素受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子1受体、Eph受体)；鸟苷酸环化酶受体(例如钠尿肽的受体、鸟苷蛋白受体)；和离子型受体(例如烟碱样乙酰胆碱受体受体、甘氨酸受体、5-HT₃受体、P2X受体)。许多人质膜受体列于由斯坦福大学的研究小组维持的人质膜受体组(Human PlasmaMembrane Receptome)数据库中(Ben-Shlomo等人，“Signaling Receptome：AGenomic and Evolutionary Perspective of Plasma Membrane receptors Involvedin Signal Transduction”(Science Signaling STKE，Vol.2003，Issue 187，pp.re9，2003年6月17日)；也参见Ben-Shlomo等人，Molecular Endocrinology 21(8)：2009-2014)；公布和数据库的每一个条目通过引用整体并入本文。关于受体酪氨酸激酶受体(Grassot等人，2003，“RTKdb：database of receptor tyrosinekinase”Nucleic Acids Res 31：353-358)、G蛋白偶联受体(Horn等人，2003，“GPCRDB information system for G protein-coupled receptors”Nucleic AcidsRes 31：294-297)、嗅觉受体(Skoufos等人，2000，“Olfactory receptor database：a sensory chemoreceptor resource”Nucleic Acids Res 28：341-343)、促甲状腺素受体突变(Fuhrer等人，2003“The thyrotropin receptor mutation database：2003年更新”Thyroid 13：1123-1126)、细胞核受体(Patterson等人，1994“Theandrogen receptor gene mutations database”Nucleic Acids Res 22：3560-3562；Gottlieb等人，1998，“The androgen receptor gene mutations database”NucleicAcids Res 26：234-238)和内分泌干扰素受体(Nakata等人，1999，“Developmentof the receptor database(RDB)：application to the endocrine disruptor problem”Bioinformatics 15：544-552)的数据库的其它数据库是已知的；将这些公布和数据库的每一个的每一个条目通过引用整体并入本文。由加利福尼亚-洛杉矶大学的研究小组维持的配体-受体伴侣数据库(http://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/DLRP.cgi)包括趋化因子、TNF、成纤维细胞生长因子(FGF)和TGFβ配体的受体的亚组；将公布和数据库的每一个条目通过引用整体并入本文。细胞信号转导数据库联盟(Alliance for Cellular Signalingdatabase)包含关于许多信号转导基因的详尽信息；将公布和数据库的每一个条目通过引用整体并入本文。同样地，反应组(reactome)数据库(Joshi-Tope等人，2005“Reactome：a knowledgebase of biological pathways”Nucleic AcidsRes 33：D428-D432)和人蛋白质参照数据库(Human Protein ReferenceDatabase)(Peri等人，2003，“Development of human protein reference database asan initial platform for approaching systems biology in humans，”Genome Res13：2363-2371)代表了人生物学中核心途径和反应的蛋白质-蛋白质相互作用的专业来源；将这些公布和数据库的每一个的每一个条目通过引用整体并入本文。

可使用多种细胞类型，只要待调节的信号复合物的一个组分存在于膜表面上或膜中即可。细胞可从内源或外源基因表达信号复合物组分。用于将外源基因引入宿组细胞以便宿主细胞表达所述基因产物的方法在本领域是公知的。[参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor，New York(2001)]。可使用贴壁或悬浮细胞。可使用原代细胞培养物、细胞系或改造的细胞系。适当的细胞类型可包括：CHO、IM-9、HEK 293和3T3。

可使用几种测定形式。在某些实施方案中，可使用受体占据测定法(receptor occupancy assay)。在某些实施方案中，对细胞进行血清饥饿以除去任何结合的配体，然后测量在配体存在或不存在的情况下调节剂对预温育的细胞的结合。可使用任何适当的检测系统来检测调节剂结合。例如，可用亲和力或表位标签标记调节剂，然后用同源结合种类例如金属离子、谷胱甘肽、抗-标签抗体检测所述调节剂。适当的标签在本领域是公知的，包括：c-myc、FLAG、poly-His、V5、HA、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、钙调蛋白-结合肽(CBP)、共价但可分离的NorpD肽(CYD)、strep-标签、蛋白C的重链(HPC)和麦芽糖-结合蛋白(MBP)。可选择地，可用缀合于检测试剂例如比色酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)、荧光蛋白(例如，藻红蛋白)、荧光染料(例如，AlexaFluor

，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)或其它适当的试剂的特异性抗体例如物种特异性抗体或抗-Fc抗体检测调节剂。预期正动力学调节剂对于暴露于配体的细胞显示比对于未暴露于配体的细胞更大的结合亲和力。预期负动力学调节剂对于暴露于配体细胞显示比对于未暴露于配体的细胞更低的结合亲和力。示例性受体占据测定法示于实施例4中。

在其它实施方案中，标记的配体测定法可用于测量在测试多肽结合剂存在或不存在的情况下配体对细胞的差异结合。标记的配体测定法的实例描述于实施例5中。

信号转导测定法

在本公开内容的生物物理筛选中鉴定的试剂的正或负调节活性可通过测量在测试多肽结合剂存在或不存在的情况下信号转导的水平来确认。

信号转导是指细胞籍以将一种类型的信号或刺激转化成另一种信号或刺激的任何过程。细胞内信号转导主要通过第二信使分子例如：钙；亲脂分子例如二酰甘油、神经酰胺、类花生酸和溶血磷脂酸；一氧化氮来进行。因此第二信使的水平或定位的变化可用于测量信号转导。

常见信号转导途径的实例包括：cAMP依赖性途径(在人中，cAMP通过激活蛋白激酶A来工作)、MAPK/ERK途径(将细胞内反应与生长因子对细胞表面受体的结合偶联的途径)；和IP3/DAG途径(磷脂酶C切割磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)产生二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸酯(IP3)。DAG保持与膜结合，IP3作为可溶性结构被释放入细胞溶胶。随后IP3通过细胞溶胶扩散以结合IP3受体(内质网中的特定钙通道)。这些通道特异于钙并且只允许钙移动通过。这引起钙的细胞溶胶浓度增加，从而引起细胞内变化和活性的级联反应。此外，钙和DAG一起作用以激活蛋白激酶C，该酶继续磷酸化其它分子，导致改变的细胞活性)。

信号转导测定法可以例如检测细胞蛋白质的水平、定位、相互作用或翻译后修饰。基因表达也可用于测量信号转导。

用于测量由信号复合物介导的信号转导的水平的许多测定法在本领域是可获得的。参见，例如：Dove，Nat.Methods 3：223-229(2006)；

测定的选择将取决于待调节的信号转导途径的性质。可获得的测定试剂盒包括：用于测定c-Fos、c-Jun、G蛋白、G蛋白嵌合体克隆、GPCR、NF-kBp50、NF-kB p50/p65、NF-kB p65和p38MAPK的试剂盒；磷蛋白测定试剂盒，例如用于磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸；用于测定第二信使例如钙、cAMP、cGMP和PIP3的试剂盒；用于测定小GTP酶例如Cdc42、Rac、Rap、Ras和Rho的试剂盒；和STAT测定试剂盒(参见例如www.biocompare.com)。可获得的试剂盒包括ELISA和检测非磷酸化的或磷酸化的目的蛋白质的磷酸特异性ELISA，提取亚细胞组分的分离试剂盒，利用许多检测方法的酶促测定法和靶向测定法。试剂盒可获得用于测量途径例如与细胞凋亡、细胞骨架/细胞外基质、神经科学、一氧化氮/细胞应激、蛋白质磷酸化相关的那些途径的信号转导(参见例如sigmaaldrich.com)。

可在单个配体或测试化合物浓度点上测量测试化合物对信号转导活性的作用。可选择地或此外，可使用多个配体或测试化合物浓度点进行信号转导测定。

用于测量信号转导的示例性方法包括但不限于钙流测定法(calcium fluxassay)、磷酸化测定法、基因表达测定法、分子运输测定法和本领域技术人员已知的其它方法。

用于测定因细胞信号转导而导致的细胞内钙的变化的方法在本领域是公知的。参见，例如，Walsh等人J.Biol.Chem.，283：16971-16984，2008和Janas等人，Clin Exp Immunol.139：439-446，2005。简而言之，首先用抑制细胞中钙积累的试剂培养适当的细胞，所述试剂是例如吲哚美辛、荧光染料例如URA-2、FLUO-3、FLUO-4、钙-3、钙4、钙5和钙绿-1/AM(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，Rhod-4NW(ABD Bioquest，Sunnyvale，CA)(所述荧光染料报告因钙结合时荧光信号的改变而起的细胞内钙的增加)或生物传感器发光蛋白例如水母荧光蛋白和PHOTINA

(Perkin Elmer，Waltham，MA)(其提供了响应细胞内钙的升高的发光信号)。随后将细胞与本发明的多肽接触，使用这样的技术如流式细胞术、荧光成像板读数器(Fluorometric Imaging PlateReader)(FLIPR)、共聚集荧光显微镜、钙芯片法(例如，Cell Kinetics，Lod，Israel)或本领域已知的其它钙检测法测定细胞内钙水平的变化。

酪氨酸或丝氨酸磷酸化测定法常用于测定参与受体激活的细胞途径的激活，用于检测磷酸酪氨酸的方法在本领域可容易地获得。取样方案公开于例如Walsh等人，J.Biol.Chem.，283：16971-16984，2008和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，Ch.18.4.1-18.4.7，1997中。将适当的细胞与本发明的多肽接触，进行足以诱导细胞激活的时间，例如15至30分钟，将细胞裂解，在SDS-PAGE凝胶上分辨蛋白质。随后用抗磷酸酪氨酸或抗磷酸丝氨酸抗体探测凝胶，使用本领域已知的技术例如化学发光来估量水平、类型和蛋白质特异性磷酸化。磷酸化的诱导也可在测定法(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和其它基于微量板的测定法例如，可获自Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)的试剂盒，或来自BD Biosciences，(San Jose，CA)或Millipore(Billerica，MA)的基于流式细胞术的测定法)中，使用对磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸具有特异性的抗体以及对处于磷酸化状态的受体和/或其它蛋白质具有特异性的抗体来测量。

用于检测基因表达的方法在本领域是公知的。使用本领域已知的技术测定通过将细胞与本发明的多肽接触诱导的基因表达，所述技术包括但不限于下游信号转导事件的mRNA或目的转录物的Northern印迹检测、报告基因测定法、差异显示、扣除DNA测定法(subtractive DNA assay)和基因表达系列分析(SAGE)(参见例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，第4和25章，1996，2001和2007)。此外，基因阵列例如GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0阵列也可用于测定细胞群体或受试者在与本发明的多肽接触后的基因表达水平。

使用本领域已知的技术测定通过将细胞与本发明的多肽接触诱导的分子运输，所述技术包括但不限于脂筏测定法(lipid raft assay)和胞饮测定法。在一个实施方案中，将细胞与本发明的多肽接触进行足以允许信号诱导的时期，裂解细胞，通过蔗糖密度梯度离心分离脂质与非脂质材料。信号蛋白可从于蔗糖梯度中解析的不同脂筏级分分离，本发明的多肽的影响信号转导的能力通过与本发明的多肽接触之前和之后分离的脂筏的膜结合蛋白质组成的变化来测定。参见例如，Petrie等人，J Immunol.165：1220-7，2000；Chamberlain等人，Proc Natl Acad Sci U S A.98：5619-24，2001；Janas等人，Clin ExpImmunol.139：439-446，2005。分子的胞饮和运输可使用电子显微镜镜术，通过测量[¹⁴C]蔗糖的吸收(Chow等人，The FASEB Journal.12：823-830，1998)，使用流式细胞术以及本领域已知的其它技术来测定。

胞饮测定法的实例示于实施例6中。

在某些方面，将生物物理筛选与功能筛选组合以鉴定只具有动力学调节性质(即无进一步的拮抗剂或激动剂性质)的多肽结合剂，或鉴定额外具有激动性或拮抗性性质的动力学调节剂。具有动力学调节和激动性性质的药物可影响内源靶的亲和力和功效，从而显著扩展了针对给定的靶的治疗干预可能性的全部组成(repertoire)。

从现有化合物产生动力学调节药物的方法

可在本文中描述的测定法中测试任何多肽结合剂以测定它们的动力学调节性质。在一个实施方案中，如果多肽结合剂被确定为不具有动力调节性质，那么可将其与其抗原一起用于复合物中，以进行免疫、淘选等，以获得结合其它多肽结合剂，所述多肽结合剂结合不同表位并且可以更可能地产生动力学调节作用。

亲代多肽结合剂的变体可通过使用本领域技术人员已知的任何方法引入突变或化学衍生(包括缀合)来产生。随后可在本文中公开的测定法中筛选变体，以鉴定具有期望的动力学调节性质的那些变体。亲代多肽结合剂可以不具有动力学调节活性，或可以优选具有期望增强、减弱或以某种其它方式改变的现有动力学调节性质。

用于产生亲代药物或药物候选物的许多方法在本领域是可获得的。

制备氨基酸序列变体

设想了产生包含抗体的1、2、3、4、5和/或6个CDR或多肽结合剂的经修饰的多肽组合物，其中CDR或非CDR区被改变以提供增加的对抗原的特异性或亲和力，或以提供增强的靶与其信号转导伴侣之间的结合亲和力的调节。例如，抗体CDR内的位点通常可以例如这样来进行连续修饰：首先用保守选择进行置换(例如，疏水性氨基酸置换不同的疏水性氨基酸)，接着用更不相似的选择进行置换(例如，疏水性氨基酸置换带电荷的氨基酸)，然后可在靶向位点上产生缺失或插入。例如，通过使用围绕CDR的保守构架序列，产生与这些共有序列互补的PCR引物来扩增位于引物区域之间的抗原特异性CDR序列。用于克隆和表达核苷酸以及多肽序列的技术在本领域已良好地建立[参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，New York(1989)]。将扩增的CDR序列连接入适当的质粒。包含1、2、3、4、5和/或6个克隆的CDR的质粒任选地包含编码连接于CDR的区域的额外多肽。

筛选包含修饰的CDR的多肽结合剂对原始抗原的结合亲和力。此外，进一步测试抗体或多肽中和其抗原的活性的能力。例如，可如实施例中所示分析本发明的多肽以测定它们干扰靶的生物活性的能力。

可通过在下文中更详细描述的保守或非保守氨基酸置换进行修饰。“插入”或“缺失”优选在约1至20个氨基酸，更优选1至10个氨基酸的范围内。可通过使用重组DNA技术在抗体多肽分子中系统性产生氨基酸的置换来引入变异，然后测定所得的重组变体的活性。可在在来自不同物种的核酸(可变位置)不同的位点上或在高度保守区域(恒定区)中的位点上产生核酸改变。用于改变抗体序列和表达用于本发明的抗体多肽组合物的方法在下文中进行了更详细描述。

氨基酸序列插入包括长度在1个残基至包含100个或更多个残基的多肽之间的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与表位标签或清道夫受体表位融合的抗体(包括抗体片段)。抗体分子的其它插入变体包括在例如N端或C端与增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合。

术语“已附加表位的”是指与附加表位融合的抗体。附加表位多肽具有足够的残基来提供可针对其产生抗其的抗体的表位，但仍足够短以便其不干扰抗体的活性。附加表位优选是充分唯一的以便针对其的抗体基本上不与其它表位交叉反应。适当的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基并且通常为约8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。实例包括flu血凝素(HA)标签多肽及其抗体12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人，Mol.Cell.Biol.5：3610-16(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人，Protein Engineering 3：547-53(1990))。其它示例性标签是多组氨酸序列，通常约6个组氨酸残基，其允许使用镍螯合来分离所标记的化合物。本领域公知且常规使用的其它标记和标签例如FLAG

标签(Eastman Kodak，Rochester，NY)包括在本发明中。

如本文中所使用的，术语“清道夫受体结合表位”是指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区域的表位。

另一个类型的变体是氨基酸置换变体。此类变体使抗体分子内的至少一个氨基酸残基被除去，同时在其位置上插入不同的残基。设想了高变区或CDR区或构架区的任一个内的置换诱变。保守置换包括用其种类的另一个成员置换氨基酸。非保守置换包括用另一种类的成员置换这些种类之一的成员。

基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质产生保守氨基酸置换。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、缬氨酸(Val，V)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和甲硫氨酸(Met，M)；极性中性氨基酸包括甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；和带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。

不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可通常被丝氨酸置换，以提高分子的氧化稳定性和阻止异常交联。相反地，可向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性(特别地当抗体是抗体片段例如Fv片段时)。

亲和成熟

亲和成熟通常包括制备和筛选在亲代抗体的CDR内具有置换的抗体变体，选择具有改良的生物性质例如相对于亲代抗体更强的结合亲和力的变体。用于产生此类置换变体的常规方法是使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每一个位点上产生所有可能的氨基酸置换。所产生的抗体变体作为与包装在每一个颗粒内的M13的基因III产物的融合物以单价形式从线形状噬菌体颗粒展示。随后筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。参见例如，WO 92/01047、WO 93/112366、WO 95/15388和WO 93/19172。

目前的抗体亲和力成熟法属于两个诱变类型：随机性的和非随机性的。易错PCR、增变细菌株(Low等人，J.Mol.Biol.260，359-68(1996))和饱和诱变(Nishimiya等人，.J.Biol.Chem.275：12813-20(2000)；Chowdhury，P.S.Methods Mol.Biol.178，269-85(2002))是随机诱变法的典型实例(Rajpal等人，Proc Natl Acad Sci U S A.102：8466-71(2005))。非随机技术通常使用丙氨酸扫描或定向诱变来产生特定变体的有限集合。某些方法在下文中进行更详细地描述。

通过淘选法进行的亲和力成熟—重组抗体的亲和力成熟通常通过在递减量的抗原存在的情况下进行几轮候选抗体的淘选来进行。每轮递减抗体量选择具有最高的针对抗原的亲和力的抗体，从而从起始材料的大库产生高亲和力的抗体。通过淘选进行的亲和力成熟在本领域是公知的并且描述于例如Huls等人(Cancer Immunol Immunother.50：163-71(2001))中。使用噬菌体展示技术进行亲和力成熟的方法描述于本文中其它地方并且在本领域是已知的(参见例如，Daugherty等人，Proc Natl Acad Sci U S A.97：2029-34(2000))。

精确(Look-through)诱变—精确诱变(LTM)(Rajpal等人，Proc Natl AcadSci U S A.102：8466-71(2005))提供了用于快速定位抗体结合位点的方法。关于LTM，代表由20个天然氨基酸提供的主要侧链化学的9个氨基酸被选择用以剖析功能侧链对抗体的所有6个CDR中的每一个位置上的结合的贡献。LTM在CDR内产生一系列位置单突变，其中每一个“野生型”残基被9个选择的氨基酸之一系统置换。组合突变的CDR以产生增加复杂性和大小而不阻止所有变体的定量展示的组合单链可变片段(scFv)文库。在阳性选择后，对具有更强的结合亲和力的克隆进行测序，定位有益的突变。

易错PCR—易错PCR包括随机化不同选择轮之间的核酸。随机化可因所使用的聚合酶的固有错误率而以较低比率发生，但可在转录过程中使用具有高固有错误率的聚合酶(Hawkins等人，J Mol Biol.226：889-96(1992))通过易错PCR(Zaccolo等人，.J.Mol.Biol.285：775-783(1999))增强。在突变循环后，使用本领域的常规方法选择具有更强的对于抗原的结合亲和力的克隆。

DNA改组—核酸改组是用于更短或更小的多核苷酸的体外或体内同源重组以产生变异多核苷酸的方法。DNA改组已描述于美国专利No.6,605,449、美国专利6,489,145、WO 02/092780和Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747-51(1994)中。通常，DNA改组由3个步骤组成：利用DNA酶I对待改组的基因进行片段化，随机杂交片段以及在DNA聚合酶存在的情况下通过PCR装配或填充片段化基因(有性PCR)，和利用常规PCR扩增装配的产物。

DNA改组与易错PCR相异在于其是反向链式反应。在易错PCR中，聚合酶起始位点的数目和分子的数目呈指数增加。相反地，在随机多核苷酸的核酸装配或改组中，起始位点的数目和随机多核苷酸的数目(但非大小)随时间过去减少。

在抗体的情况下，DNA改组允许例如所有CDR1与所有CDR2与所有CDR3自由组合缔合。预期多个家族的序列可在相同的反应中被改组。此外，改组通常保留相对顺序，以便例如CDR1不会在CDR2的位置上被发现。稀有改组体(shufflant)可包含大量最好(例如最高亲和力)的CDR并且可基于它们的优良亲和力选择这些稀有改组体。

可用于DNA改组的模板多核苷酸可以是DNA或RNA。取决于待重组或装配的基因或更短或更小的多核苷酸的大小，其可具有不同的长度。优选，模板多核苷酸为50bp至50kb。模板多核苷酸通常应当是双链。

预期可在基因选择的初始步骤中，将具有与模板多核苷酸同一的区域和与模板多核苷酸异源的区域的单链或双链核酸多核苷酸加入模板多核苷酸。还预期可在初始步骤中将两个不同的但相关的多核苷酸模板混合。

丙氨酸扫描—可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重大贡献的高变区残基。Cunningham和Wells(Science 244：1081-1085(1989))。鉴定靶向残基的残基或组(例如，带电残基例如arg、asp、his、lys和glu)，利用中性或带负电荷的氨基酸(最常见地丙氨酸或多聚丙氨酸)置换所述残基以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在置换位点或对置换位点引入另外或其它变体细化对所述置换显示功能敏感性的那些氨基酸位置。

计算机辅助设计—可选择地，或此外，有益地分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点，或使用计算机软件建立此类接触点的模型。此类接触残基和相邻残基是用于根据本文中建立的技术进行置换的候选残基。当产生此类变体后，将一小组变体经历本文中描述的筛选，选择在一个或多个相关测定中具有优良性质的抗体以进一步开发。

动力学调节药物的有利方面

与标准治疗例如竞争性拮抗剂、激动剂和配体置换相比较，预期动力学调节药物提供了作为治疗剂的几个有利方面。此类有利方面可包括下面概述的有利方面。

(1)自限性活性。在饱和水平上，动力学调节药物因对药物的活性的不依赖于浓度的限制而具有减小的毒效应的潜能。具有有限的协同性的调节剂对它们的作用具有天花板水平，无论施用的剂量是多少。与常规药物不同，动力学调节剂达到超出其调节剂的浓度的增加对功能没有额外的作用的饱和。该作用受到调节剂与内源信号复合物组分(例如配体)之间的协同性(正或负)的程度限制。协同地确定的边界(cooperativity-defined boundary)在给药方案方面增强了动力学调节药物的安全特征。因此，可以以比常规药物频率高得多的剂量施予动力学调节药物，同时维持有利的总体安全特征，从而因维持药物的持续饱和水平的能力而提供增强的功效。

(2)复合物组分依赖性激活/抑制限制了副作用。与激动剂或拮抗剂不同，动力学调节剂在内源复合物组分(例如配体)不存在的情况下是无活性的并且只有当适当的，例如当复合物组分(例如配体)存在时才具有活性。如果动力学调节剂不具有可察觉的激动作用或拮抗作用，那么其可提供另一种优于常规配体的有力的治疗有利优势，即只当内源激动剂存在时才选择性调高或调低反应的能力。这些性质使得动力学调节药物能够增加靶的内源时空调节。

(3)因更大的靶选择性、组织或亚型特异性而导致的体内减小的脱靶效应。动力学调节药物可结合除复合物组分之间相互作用的位点外的位点。此类变构结合位点未面临与正构位点相同的进化压力，因此更具多样性。因此，可通过靶向变构位点获得更大的选择性。当在整个靶亚型中正构位点的序列高度保守时，这是特别有利的。

(4)更宽的治疗窗。正动力学调节剂可区别激活和非激活的受体状态，然而激动剂无差别地激活所有受体状态。不具有可察觉的激动作用的动力学调节剂从而具有比激动剂更宽的治疗窗。此外，正动力学调节剂可具有减小的对受体脱敏和/或耐受性的易感性，这可显著扩展可能的治疗应用的范围。负动力学调节剂使得能够减弱信号转导而不完全阻断其。这可以是有用的，例如，在受体介导病理功能同时介导生理上有用的功能的情况下。

实施例

实施例1

使用平衡溶液亲和力测量法测定在测试化合物存在或不存在的情况下 受体-配体的亲和力

A.模型系统

本实施例描述了用于使用模型信号复合物，例如受体-配体复合物进行的平衡溶液亲和力测量的方法。此处所述的模型系统使用具有固定的配体的珠粒，这样可用抗受体Cy5配体标记的多克隆抗体测定和检测游离受体。

将结合伴侣之一(在该情况下为配体)固定于固相，所述固相可利用自动搅拌器悬浮，从而允许形成小型柱床。通常支持物是聚甲基甲丙烯酸酯(PMMA)、琼脂糖或其它相容性材料的珠粒。利用荧光标记的、生物素化的或以其它方式加标签的分子检测处于其结合状态的其它结合伴侣(在该情况下为受体)。

来自Sapidyne Instruments的KinExa^TM仪可用于利用动力学排除测定法(kinetic exclusion assay)(KinExA)进行亲和力分析。简而言之，将相互作用的复合物组分(在该情况下为受体与配体)在测试多肽结合剂存在或不存在的情况下以不同的已知浓度混合在一起，使其达到平衡。将包含配体、游离受体和配体-受体复合物的样品牵引快速通过小珠粒柱，所述小珠粒柱已偶联或包被有复合物组分之一(在该情况下为配体或等同竞争性结合剂)。游离受体与珠粒上的配体结合。然后将针对受体的第二标记例如Cy5荧光标记的第二抗体通过柱子。标记的第二抗体结合已结合的受体。缓冲液清洗除去过量标记，使珠粒柱上的荧光信号与原始样品中游离受体的量成正比。将珠粒床置于荧光检测器附近以允许荧光信号水平读出。

制备一批具有固定的配体的珠粒。可使用多种珠粒类型，包括PMMA、琼脂糖、聚苯乙烯等。可使用本领域技术人员已知的多种方法将配体偶联至珠粒。以低于预测的受体-配体相互作用的K_D的浓度制备受体的原液。应当用多个浓度的无配体的受体进行实验以测定可使用的受体的最低浓度。在测定中通过不断降低受体浓度，亲和力测定变得愈来愈精确。对于500pM的相互作用，50pM的受体浓度应当允许精确的K_D测量。必须使用足够的受体来获得足够的信号和提供所需的动态范围。

当测定最优化的受体浓度时，制备具有和不具有测试化合物的受体的2X原液(如果最终的期望浓度是50pM，那么配制100pM的溶液)。

产生2X浓度的配体的一系列稀释物。该稀释物系列应当理想地包含为相互作用的K_D值的至少10倍和至多1/10的点。12个点的滴定+零-配体样品通常足以涵盖该类型的1∶2稀释度系列的范围。

将等体积的配体滴定系列与受体和受体+测试化合物样品混合，使这些物质达到平衡。取决于相互作用的动力学，这可花费数小时至数周的时间。如果相互作用的动力学的任何一个是已知的，可将它们用于估计达到平衡的时间。反应以很慢的但指数的速率接近真实平衡，这样就可能不必等待高亲和力相互作用达到真实平衡，因为在数天中其通常完成超过95％。然而，重要地理解该关系并且批判性地评价其。

一旦达到所需温育时间，立即制备Cy5标记的抗-受体抗体的稀释物。重要地标记的分子能够结合其配体(在该情况下为受体)，当其与其结合伴侣(在该情况下为配体)结合时，否则测定将几乎不具有或不具有信号。对于此处描述的测定形式，1ug/mL的抗-受体Cy5标记的多克隆抗体的溶液是适当的。

将KinExa样品入口管放入样品瓶内。随后KinExa仪分析每一个样品中的游离受体的浓度，将其以游离受体％对配体浓度作图。将曲线与模型拟合，测定K_D值。使用下列公式产生的示例性结果示于图4中，其中R是受体浓度，L是配体浓度。

B.IL-1β信号复合物

IL-1β高效细胞因子，其驱动急性期炎症反应并且在先天性免疫应答中具有关键作用。虽然高水平的IL-1β牵涉炎症性疾病例如类风湿性关节炎、炎性肠病、急性呼吸窘迫综合征和2型糖尿病，但低水平对胰腺β细胞功能、增殖和存活、肠上皮细胞存活以及对损伤的神经元反应具有有益作用。如在许多受体-配体系统中一样，IL-1β信号转导是复杂的，多个配体与几个受体的膜结合和可溶性形式相互作用(Dinarello，Arthritis Rheum.52(7)：1960-1967，2005)。IL-1β信号转导活性由单个受体、IL-1受体I型(IL-1RI)和其共受体IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)介导。第二IL-1家族成员IL-1α通过相同的受体复合物发出信号，但未牵涉炎症性疾病。IL-1β活性在严格的生理控制之下，多个负调节的水平包括：过量IL-1β的中和和胞吞作用由诱饵受体IL-1受体II型(IL-1RII)介导；循环IL-1β的抑制由其受体的多个可溶性形式(sRI、RII和sRAcP)介导；和由抑制性IL-1同源物IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)产生的竞争性抑制。该受体-配体系统的复杂性对抗-IL-1β抗体的产生提出挑战。有人提出调节该途径的最佳治疗剂可选择性地使高水平IL-1β信号转导降至更低的有益的水平，同时允许可溶性受体中和IL-1β活性以及受体-介导的途径清除IL-1β而不干扰IL-1α信号转导或IL-1Ra活性。

生物物理测定

设置KinExA测定以测量在测试化合物(抗-IL-1β抗体XOMA052，参见U.S.7,531,166)存在或不存在的情况下游离配体(IL-1β)在配体-受体(IL-1sRI或IL-1sRII)混合物的样品中的浓度。

使用KinExA技术(Sapidyne，Inc)测定IL-1β±XOMA 052结合可溶性IL-1受体(IL-1sRI：R&D Systems，cat#260-100/CF，和IL-1sRII：R&DSystems，cat#263-2R-050/CF)的平衡离解常数(K_D)。通过用1％BSA样品缓冲液将150nM至4pM的PBS(0.01M磷酸盐，pH 7.4，0.15M NaCl，0.02％叠氮化物)中的可溶性受体系列稀释成单独的或与XOMA 052混合的IL-1β的恒定结合位点浓度(1至5nM)来进行平衡实验。为了获得K_D-控制的数据，结合位点浓度不超过K_D两倍(IL-1β＝1nM和IL-1β±XOMA 052＝5nM)。对于所有其中存在XOMA 052的实验，使抗体浓度对IL-1β维持在100倍摩尔过量以确保所有细胞因子被XOMA 052结合。在测定开始之前将IL-1β(±XOMA052)+受体混合物在室温下(～22℃)温育12-2小时以允许复合物形成达到平衡。在温育期后，将包含受体、IL-1β±XOMA 052和IL-1sR/IL-1β复合物±XOMA 052的混合物抽吸通过固相(由受体-封闭抗-IL-1β抗体-偶联珠粒组成)以捕获未与受体结合的IL-1β(±XOMA 052)。验证捕获抗体与受体而非与XOMA 052完全竞争。捕获的IL-1β与保留在平衡反应中的未被受体结合的游离IL-1β的浓度成正比，样品缓冲液中使用多克隆抗-IL-1β抗体(R&DSystems，AB-201-NA)，然后使用藻红蛋白-缀合的抗-山羊IgG二抗(JacksonImmunoResearch laboratory cat#705-116-147)进行检测。将结合信号转化成作为在受体不存在的情况下的对照的比例的相对值。对于所有平衡实验测量每一个样品的两个重复。使用KinExA软件(2.4版；Sapidyne Instruments)将平衡滴定数据与1∶1结合模型拟合。重复这些测量总共5次(对于sRI)和3次(对于sRII)。结果显示XOMA 052使IL-1β结合IL-1sRI的结合亲和力从2nM减弱至10nM，但对IL-1β结合IL-1sRII的结合亲和力没有影响，所述结合亲和力保持在2nM(图5)。使用表面等离子共振术(SPR)的测量与这些结果一致。

可进行该测定法的另一个变型以给潜在药物候选物彼此之间分级。当已进行完全K_D溶液平衡实验后，产生曲线的对数线性部分上的信号所需的条件是已知的。选择略低于在动力学调节药物不存在的情况下的相互作用的EC₅₀值的配体浓度。随后可在几个浓度上测试各药物候选物。这允许分析对药物的剂量反应和潜在药物候选物之间的相对效力的比较。

功能测定

进行功能测定以确认预测：信号复合物组分的亲和力的减小将引起对IL-1β的细胞剂量-反应的偏移。

MRC-5IL-6释放测定

将MRC-5人肺成纤维细胞(ATCC，Manassas，VA)以5000个细胞/孔于具有10％胎牛血清(FBS；Hyclone)的MEM完全生长培养基(Invitrogen)中接种至无菌96孔组织培养板中。在于37℃下用5％CO₂温育过夜后，除去上清液，并且替换为包含指定浓度的重组人IL-1β(Peprotech，cat.200-001B)+对照IL-1β-封闭抗体(WO 2006/081139)、抗体-KLH(钥孔血蓝蛋白)同种型对照抗体(IgG2；克隆KLH8.G2(XOMA))或XOMA 052的任一种的培养基。

进行抗体效力测定(图6A)，其中在加入至MRC-5细胞之前用指定的抗体在37℃下预温育重组人IL-1β，进行1小时，以100pg/ml的终浓度加入IL-1β。

使用递增量的在加入至MRC-5细胞之前用100倍摩尔过量的抗体在室温下预温育过夜的IL-β进行IL-1β剂量-反应测定(图6B)。

在于37℃用5％CO₂温育20小时后，取出细胞上清液，将其按照估计的IL-6浓度稀释，按照制造商的说明书利用ELISA(Quantikine^TM human IL-6ELISA，R&D Systems，cat#D6050)测定其中的人IL-6。以一式二份或一式三份建立和测定所有样品。

全血IL-8诱导测定

利用静脉穿刺术将正常人血收集至含有硫酸肝素的收集管中。使用递增量的在加入至全血之前在含有10％FBS的RPMI(Invitrogen)中用10倍摩尔过量的XOMA 052在37℃预温育1小时的IL-β进行IL-1β剂量-反应测定。将样品在37℃于96孔圆底板(Corning Costar，cat#3799)中温育6小时，随后以0.5％的终浓度用Triton X-100裂解10分钟。将裂解物以2000rpm离心5分钟以除去碎片，然后转移至干净的板中。在重复离心步骤后，将裂解物转移至-80℃冰箱中进行过夜贮存。第二天上午，使裂解物解冻，按照制剂商的说明书利用ELISA(Quantikine human IL-8ELISA，R&D Systems，cat#D8000C)测试其中的人IL-8。以一式二份或一式三分建立和测定所有样品。结果示于图6C中。

结果

虽然XOMA 052对IL-1β的结合在高浓度的IL-1β下不消除信号复合物形成，然而其在生理和病理相关浓度上是IL-1β活性的强有力抑制剂。XOMA052在MRC-5细胞因子释放测定中完全中和100pg/mL的IL-1β，观察到低pM范围内的IC₅₀。这与利用对照封闭抗体(图6A)观察到的中和相当，并且效力为重组IL-1ra的约10倍。

动力学干扰模型预测信号复合物组分的亲和力的减小引起对IL-1β的细胞剂量-反应的偏移。当XOMA 052对IL-1β的浓度处于摩尔过量时，所述抗体在MRC-5细胞IL-6释放测定中使IL-1β的剂量反应曲线的EC₅₀相对于在同种型对照抗体存在的情况下IL-1β的剂量反应曲线的EC₅₀增加至60倍(815pM相对12pM的EC₅₀值)。在相同条件下，IL-1β封闭抗体在宽广的IL-1β浓度范围上几乎完全消除细胞反应(图6B)。

在全血中在IL-8表达的刺激中(图6C)，在大鼠NRKE细胞中在cinq1表达的刺激中以及在PBMC中在IL-8表达的刺激中看到类似的对于XOMA052的剂量-反应偏移，证明该效应对于特定的测定系统不是唯一的。因此，在其中高水平的IL-1β引起病状(例如，在胰腺β细胞中)的生理条件下，XOMA052将中和过量的IL-1β，同时潜在地允许持续的低水平有益的信号转导。此外，XOMA 052可允许与IL-1β活性的完全阻断相比较更好的先天性免疫系统对感染的反应性。当抗体的浓度足够高以至结合所有可获得的IL-1β时，由XOMA 052介导的信号转导的减弱的程度不依赖于抗体的浓度。在这些条件下，伴随的信号输出只取决于配体的浓度。

虽然减小IL-1β对于IL-1RI的亲和力引起信号转导的减弱，但对IL-1RII的高效结合的维持非常重要，因为IL-1RII在响应细胞上用作诱饵受体以减弱对IL-1β的敏感性。此外，IL-1RII介导的IL-1β的中和是重要的用于清除IL-1β的途径。当治疗性抗体对其目的抗原的结合中断生理清除途径时，抗体的延长的半衰期和高亲和力可引起抗体/抗原复合物的积累。虽然此类复合物通常是无活性的，但其可以是维持抗体的过量水平以确保与抗体解离的任何抗原被游离抗体迅速再结合所必需的。

我们已显示虽然XOMA 052减弱IL-1β结合IL-1RI的亲和力，但其不类似地减弱其对IL-1RII的结合。此外，XOMA 052不阻断sRAcP对IL-1β/sRII复合的结合。IL-1β/XOMA 052复合结合IL-1RII和RAcP的能力可允许通过正常生理机制清除和中和细胞因子，从而减少长寿命复合物的积累。此外，中和可溶性受体对XOMA 052/IL-1β复合物的结合的保留应当允许这些分子调节活性，从而避免在它们的清除之前由复合物产生的潜在系统活性。

为了测试IL-1β/XOMA 052复合物结合IL-1受体的能力是否影响清除率，我们用游离的(与非结合同种型对照抗体一起温育的)或用XOMA 052或对照封闭抗-IL-1β抗体(BM5)预复合的重组人IL-1β注射小鼠，在48小时后按照试剂盒说明书利用ELISA(BD OptEIA^TM人IL-1βELISA组，BDBiosciences，San Jose，CA，cat#557953)测量循环中保留的总的可测量的IL-1β的量。在两个分开的实验中，用100μl每一种用人IL-1β预复合的抗体(1mg/kg抗体和20ng IL-1β/小鼠)静脉内注射(n＝4/组)C57B/6小鼠。48小时后BM5-IL-1β和XOMA 052-IL-1β-复合的抗体的循环水平的数据示于图7中。在研究1中，至注射后48小时，7.7％的与BM5复合的IL-1β保留在循环中；然而，在相同的时期中，只有1.7％的XOMA 052-IL-1β复合物得到保留(p＝0.006)。在研究2中，至注射后48小时，8.1％的与BM5复合的IL-1β保留在循环中，然而只有1.8％的XOMA 052-IL-1β复合物得到保留(p＝0.02)。虽然与任一抗体复合的IL-1β比游离IL-1β更慢地从循环清除，但与XOMA052结合的IL-1β比与封闭抗体结合的IL-1β更快速地清除。在48小时后，与与封闭抗体结合的IL-1β相比较在血清中检测到低至平均5/23的与XOMA052结合的IL-1β。在相同的时间上，总抗体的浓度彼此不同，这表明差异不是因不同抗体的差异清除导致的。

我们在此处概述的减弱而非阻断IL-1β的方法可对2型糖尿病的疾病缓和所需的IL-1β信号转导的最佳减弱产生重要的见识，所述糖尿病逐渐被视为炎症性疾病。有证据表明高水平IL-1β通过引起β细胞功能障碍和细胞凋亡而成为该疾病的病理学的基础。然而，低水平的IL-1β活性是刺激的胰岛素释放的最高水平以及β细胞增殖和存活所必需的。利用ANAKINRA

(rhuIL-1ra)治疗患者增强了胰岛素分泌和血糖控制，但因药物的快速清除而需要频繁给药。完全中和IL-1β活性的封闭抗体将不允许IL-1β的低水平信号转导。动力学调节(或调控)抗体例如XOMA 052应当减少IL-1β活性，从而在IL-1β的更高浓度上允许更低水平的信号转导，从而在T2D患者中在有益的范围内调控IL-1β活性(参见图8)。

我们已在此处描述了重组抗体，所述重组抗体差异调节配体结合多种受体的亲和力，从而允许配体活性的背景依赖性减弱。人们逐渐理解，许多受体-配体系统由多个配体和受体组成，所述系统产生复杂的背景依赖性细胞效应。对于某些受体系统，这些效应在低水平上是有益的，但在高水平上是病理性的，并且在机制上难以通过单克隆抗体治疗达到。在治疗上将抗体用作“变阻器(rheostat)”而非“二分式开关(binary switch)”的能力将额外水平的微妙及复杂引入设计用于调节疾病相关靶的活性的治疗性抗体。

实施例2

使用固相亲和力测量方法鉴定动力学调节剂

此处描述的测定法可用于任何两个相互途径的结合剂，其中一个可被标记(例如，生物素化)并且另一个可被固定在EIA板上。本实施例使用结合其受体(GCSFR)的粒细胞集落刺激因子(GCSF)作为模型系统。用于该系统的方法描述于下文中。如果要使用不同系统可能需要最优化的多个条件包括：板包被条件(时间、温度、浓度和缓冲液)、分析物标记条件以及标记的(例如，生物素化的)分析物的浓度。

使用下文中描述的测定法鉴定GCSF-GCSFR结合相互作用的抗体调节剂。

使用PEG₄生物素(Pierce Protein Research Products cat#21329，Rockford，IL)通过激活的NHS化学方法将纯化的GCSF(R&D Systems Minneapolis，MN)生物素化。以100uL/孔将2ug/mL的PBS中的GCSFR(R&D SystemsMinneapolis，MN)包被在EIA板(Nunc，Rochester，NY)上，在振荡器上于37℃下温育1小时。随后用牛血清白蛋白(BSA)和ChemiBlock^TM(Millipore Billerica，MA)封闭溶液将板在振荡器上于室温下封闭至少半小时。不干扰反应物并且充分封闭EIA板上的非特异性结合的任何封闭溶液可用于该测定。

在稀释板上制备样品。可以以周质提取物(PPE)的形式筛选来自从用GCSF/GCSFR复合物(Biosite Inc.，San Diego，CA)免疫的小鼠产生的Omniclonal^TM噬菌体展示文库的Fab片段。为了进行单点测定，将PPE样品与以0.15ug/mL于封闭缓冲液中制备的生物素化的GCSF以1∶1混合，然后将50uL该溶液加至EIA板上。纯化来自单点测定的潜在命中(图9A)，使用配体的滴定以1.8ug/mL Fab浓度进一步测试(图9B)，或以0.075ug/mL的固定配体浓度在不同的滴定上进行测试(图9C)。将50uL/孔的该抗体-GCSF-生物素溶液加入已封闭的EIA板，在振荡器上于室温下温育超过1小时。将单独的PBS和封闭缓冲液的阴性对照包括在该单点测定中以确定约0.83OD405nm的本底信号水平。还将5ug/mL的纯化的Fab F5包括为阳性对照，从筛选的早期轮选择所述Fab F5。随后将50uL的5ug/mL的封闭缓冲液中的链霉抗生物素标记的碱性磷酸酶(Zymed South San Francisco，CA)加至所有孔中。生物素化的分析物和抗体混合物保留在孔中并且不被去除或洗掉。随后将板在振荡器上于室温下再温育超过1小时(在大多数测定中使用3-4小时的总反应时间；然而更长的温育允许更慢的反应获得平衡)。随后彻底清洗板，利用100uL/孔的对-硝基苯基磷酸盐(PNPP；Pierce Protein Research ProductsRockford，IL)显影。在使板显影5至15分钟后，使用100uL/孔的1M NaOH终止反应。在微量板读数器上于405nm处读取吸光度。

图9A显示一式三份的抗-GCSF/GCSFR Fab PPE的筛选测定中单点的结果。在几种在生物素化GCSF:Fab混合物的固定浓度上测试的Fab克隆存在的情况下观察到与对照相比较生物素化的GSCF对GCSFR结合的增强或抑制，表示通过筛选对正和负调节抗体的鉴定。图9B显示在正调节Fab、B2(E4)之一存在和不存在的情况下GCSF-生物素的滴定的结果。生物素化的GCSF结合曲线在抗体B2(E4)存在的情况下向左偏移。这表明在所述抗体存在的情况下增强的配体受体相互作用的亲和力。图9C显示针对固定浓度的生物素化的GCSF，其它正调节Fab、B4(F5)以及弱调节或非调节Fab B6(A10)的滴定的结果。B4(F5)Fab以抗体剂量依赖性方式增强生物素化的GCSF对板结合的受体的结合。

实施例3

使用细胞结合测量法鉴定GCSF-GCSFR结合的动力学调节剂

本实施例描述了基于FACS的测定法测量在配体(重组人GCSF(rhGCSF)，R&D Systems，Minneapolis，MN)存在或不存在的情况下测试化合物(例如抗体)对GCSR转染的细胞的差异结合的用途。在ELISA测定中筛选来自噬菌体文库(参见实施例2)的抗-GCSF/GCSFR抗体以鉴定特异于对GCSF-GCSFR复合物的结合的抗体。因为这些抗体是复合物特异性的，因此数学模型预测它们将调节GCSF对GCSFR结合的动力学。

BaF3是不对人GCSF反应但对该家族的其它细胞因子反应的鼠淋巴细胞细胞系。将该细胞系维持在RPMI(Gibco/Invitrogen)/10％FBS(Hyclone/Thermo Scientific，Waltham，MA)/+2ng/mL  鼠IL-3(R&DSystems)中。使用电穿孔将人GCSFR基因(Origene，Rockville，MD)稳定地转染入BaF3细胞系(Alexion AAC 621)，然后利用G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行选择。使用缀合有藻红蛋白的抗-GCSFRα(CD114)抗体[554538(LMM741)BD Biosciences，San Jose，CA]通过FACS分析确认表达。用人GCSF刺激转染的细胞导致增殖性反应，表明了功能配体/受体相互作用。

用PBS/2％FBS/0.1％叠氮化物洗涤BaF3/GCSFR细胞(1x10⁶个细胞/样品)2次，随后用稀释至相同缓冲液中的rhGCSF在冰上温育15分钟。在rhGCSF(0、1、10或100ng/mL)存在或不存在的情况下加入5ug/mL的GCSF/GCSFR测试抗体，在冰上温育1小时，然后加入10ug/mL藻红蛋白标记的山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，在冰上再温育1小时。如果测试抗体结合GCSF/GCSFR复合物，那么第二抗体结合所述测试抗体并且使细胞染色。观察到几种测试抗体在GCSF存在的情况下但非在GCSF不存在的情况下结合BaF3/GCSFR细胞。这些抗体经显示不结合GCSFR或GCSF，从而只结合GCSF/GCSFR信号复合物，这表明它们可正调节GCSF/GCSFR复合物的信号转导。抗体A10(B6)的示例性数据(参见实施例2)示于图10中。利用浓度递增的rhGCSF和固定浓度的A10(B6)处理细胞导致与用rhGCSF和无关抗体(KLH8-G2)染色的细胞相比较测定中平均荧光指数(MFI)读出的剂量依赖性增加。

实施例4

使用基于细胞的抗体亲和力测量法鉴定INS-INSR结合的动力学调节剂

本实施例描述了基于流式细胞术(FACS)的测定法用于测量在人胰岛素(hINS)存在或不存在的情况下抗体对细胞的差异结合的用途。在测定中筛选来自噬菌体展示文库的抗-胰岛素受体(INSR)抗体以鉴定INS-INSR结合的调节剂。

IM-9细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并且维持在RPMI1640+10％FBS中。在用于测定之前，在无血清RPMI 1640中清洗细胞，计数，在RPMI 1640+0.5％BSA(Sigma-Aldrich)中将浓度调整至2x10⁶个细胞/ml。将细胞在该培养基中培养过夜，这样被称为“血清饥饿的”。将这些细胞洗涤1次，以2x10⁶个细胞/ml重悬浮于含有0.5％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中。

将暴露于胰岛素的细胞重悬浮于补充有70nM人胰岛素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的FACS缓冲液中。将两个细胞群体(+hINS)或(-hINS)于4℃下温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤1次，然后以2x10⁶个细胞/ml重悬浮于FACS缓冲液中。将25微升的细胞等分涂铺在96孔板中，与25ul抗体或PPE混合，在冰上温育1小时。

随后用FACS缓冲洗涤细胞1次，通过加入25ul适当的缀合有荧光染料的第二抗体来检测抗体的结合。如果利用含有myc-标记的抗体的PPE进行初始温育，那么向孔中加入25ul抗-c-myc抗体(Roche)1/1000稀释物，将细胞在冰上温育30分钟。随后用FACS缓冲液洗涤细胞1次，通过加入缀合有藻红蛋白的抗-小鼠IgG来显示抗-c-myc的结合。在最后15分钟的冰上温育后，洗涤细胞，将沉淀重悬浮于FACS缓冲液中。在FACScan^TM(Becton-Dickinson，Milipitas，CA)上分析细胞，在FlowJo^TM(Treestar，Ashland，OR)和Microsoft Excel^TM中分析数据。

本测定允许检测4种类型的抗体，其实例示于图11中：

1.当将它们暴露于人胰岛素时只结合IM-9细胞(专门结合INS/INSR复合物)的抗体

2.当将它们暴露于人胰岛素时更强地结合IM-9细胞(优先结合INS/INSR复合物)的抗体

3.当将它们暴露于人胰岛素时不太强地结合IM-9细胞(优先结合未复合的INSR)的抗体

4.不依赖于IM9细胞对人胰岛素的暴露结合IM-9细胞(同样地结合未复合的INSR和INS/INSR复合物)的抗体

如果抗体对INS/INSR复合物的结合：抗体对未复合的INSR的结合的比率大于1.3，那么将抗体评定为预测的正调节剂。如果抗体对INS/INSR复合物的结合：抗体对未复合的INSR的结合的比率小于0.6，那么抗体被评定为预测的负调节剂。如果抗体对INS/INSR复合物的结合：抗体对未复合的INSR的结合的比率大于0.9但小于1.1，那么抗体被评定为预测的非调节剂。

如上所述(除了使用适应悬浮培养的用hINSR或muINSR转染的CHO-K1而非IM-9细胞外)进行实验，将暴露于胰岛素的细胞重悬浮于补充有150nM而非70nM的人胰岛素的FACS缓冲液中。

综述许多在功能测定中具有正或负调节活性的抗-INSR抗体的FACS结合数据。发现负调节剂具有约0.7或更小的结合比率+胰岛素/-胰岛素，大部分具有0.5或更小的比率。发现正调节剂具有约1.0或更多的结合比率+胰岛素/-胰岛素，大部分具有1.3或更多的比率。结合比率示于下面表3中。因此在配体存在或不存在的情况下，调节抗体对受体的差异结合活性的比率通常预示着其调节功能(正或负)。

表3

实施例5

使用基于细胞的配体亲合力测量法鉴定动力学调节剂

本实施例描述了基于FACS测定法测量在测试化合物(抗INSR抗体)存在或不存在的情况下配体(人胰岛素)对细胞的差异结合的用途。在测定中筛选来自噬菌体展示文库的INSR抗体以鉴定INS-INSR复合物的调节剂。

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得IM 9细胞，将其维持在RPMI1640+10％FBS中。在用于测定之前，在无血清RPMI 1640中洗涤细胞，计数，在RPMI 1640+0.5％BSA(Sigma-Aldrich)中将其浓度调整至2x10⁶个细胞/ml。将细胞在该培养基中培养过夜，这样被称为“血清饥饿的”。洗涤这些细胞一次，将其以2x10⁶个细胞/ml重悬于包含0.5％BSA的PBS(结合缓冲液)中。

将血清饥饿的细胞在室温下预暴露于INSR抗体15分钟，随后用不同浓度的购自R&D Systems的生物素化的人胰岛素在室温下再温育另外30分钟。通过向该混合物中加入链霉抗生物素-藻红蛋白的1/100稀释物，在室温下再进行15分钟来显现生物素化的胰岛素的结合。随后用结合缓冲液洗涤细胞一次，将其重悬浮于等体积的含有0.5％BSA、0.1％叠氮化钠和2％多聚甲醛的PB S中。在FACScan^TM(Becton-Dickinson，Milipitas，CA)上分析细胞，在FlowJo^TM(Treestar，Ashland，OR)和Microsoft Excel^TM中分析数据。

图12显示在不同的胰岛素浓度上在抗-INSR抗体存在或不存在的情况下生物素化的胰岛素对IM9细胞的结合。抗体83-7增强生物素化的胰岛素的结合；抗体MA-20减弱了生物素化胰岛素的结合；对照小鼠IgG对生物素化的胰岛素的结合没有影响。

实施例6

使用磷酸化测定法确认动力学调节

被INSR磷酸化的底物蛋白包括称为胰岛素受体底物1(IRS-1)的蛋白质。形成pIRS-1的IRS-1磷酸化最终导致胰岛素应答组织外膜上的高亲和力葡萄糖转运蛋白(Glut4)分子的增加，从而导致葡萄糖从血液至这些组织中的吸收增加。使用Luminex技术平台(Luminex Corp.，Austin，TX)开发pIRS-1测定法。开发了测试的两个模式：(a)在固定浓度的胰岛素上滴定测试抗体，和(b)在固定浓度的抗体上滴定胰岛素。在测定中测试基于它们对复合的INSR和未复合的INSR(参见实施例4和5)的差异结合选择的抗胰岛素受体(INSR)抗体以鉴定INS-INSR复合物的调节剂。

细胞处理和裂解

将IM-9细胞血清饥饿16至20小时，然后计数，离心，用PBS洗涤一次，将其以约2x10⁶个细胞/ml重悬浮于RPMI+0.5％Sigma Cohn V BSA(于4℃下贮存的过滤灭菌的10％的RPMI中的原液)中。

在RPMI+0.5％BSA中制备胰岛素的2X浓缩液(Sigma1-9278(10mg/ml)1.77mM于4℃下贮存的液体原液)的稀释物。标准胰岛素滴度可包括例如：6.25nM、1.56nM、0.39nM、0.097nM、0.024nM、0.006nM、0.0015nM、0nM的4倍系列稀释。

按照制造商的说明书将Milliplex MAP Cell Signalling缓冲液和检测试剂盒(Millipore目录编号48-602)以及Phospho-IRS-1MAP Mates(Millipore目录编号46-627)用于检测pIRS-1水平。简而言之，制备含有50ul/孔的2X处理培养基(含有0.5％BSA+/-测试抗体的RPMI)的V形底板，每孔加入重悬浮于50ul RPMI+0.5％BSA中的1x10⁶个细胞血清饥饿的IM-9细胞。在胰岛素处理之前，(a)作为单一抗体浓度的大体积(bulk)抗体/细胞混合物(随后用于含有胰岛素的系列稀释物的孔)，或(b)通过将细胞直接加入含有抗体的系列稀释物和搀入0.1nM的胰岛素的孔进行抗体预处理，进行15分钟。将板置于37℃培养箱中，以1500rpm在RT下离心持续3分钟的处理时间(总共15分钟)。通过倒置和轻轻地吸掉除去上清液，通过使用多通道移液器用100ul按照下面表1制备的100ul裂解缓冲液(在即将使用前加入不稳定组分，即蛋白酶抑制剂和benzonase)研磨3次来裂解处理的细胞沉淀。将板在振荡器上于室温下放置30分钟，以3000rpm离心10分钟以澄清裂解物，除去可能在研磨过程中产生的任何气泡。取出50ul澄清的裂解物，将其以1∶1稀释于50uL的来自检测试剂盒的测试缓冲液-1(AB-1)中，研磨2至3次以进行混合，将50ul加至25ul/孔的稀释的珠粒的顶上的滤板膜上(参见上文)。

表1：裂解缓冲液组分

滤板膜(Millipore Catalog#MABVN1250)用25ul AB-1/孔预湿润。使用Millipore多头抽真空装置从滤板抽吸预湿润缓冲液，小心不要使膜干燥，任何剩余的液体从滤板的底部形成印迹。每孔加入25ul的1X珠粒悬浮液(pIRS-1珠粒(Millipore目录编号46-627)(通过从20X浓缩物稀释至AB-1缓冲液中并且可选地涡旋和超声3次，每次5秒来预制备的)。

用板密封器覆盖滤板，用铝铂覆盖以防止曝光，在板振荡器上(在Labline上设置7-8，Bellco板振荡器或相似型号)于室温下温育2小时或可选地在4℃温育过夜。

Luminex检测

抽吸滤板，它们的底形成印迹。珠粒保留在孔中，用100ul AB-1洗涤，将其在振荡器上放置1-2分钟。抽吸板，然后重复清洗步骤。

加入25ul/孔1X生物素化的检测抗体(从20X原液稀释至AB-1缓冲液中)，将板在振荡器上于室温下温育1小时。抽吸板，使它们的底形成印迹。加入25ul/孔的从25X原液稀释至AB-1缓冲液中的1X链霉抗生物素蛋白藻红蛋白，将板在振荡器上于室温下温育15分钟。向每一个孔中加入25ul扩增缓冲液(Millipore目录编号48-602)，然后将板在振荡器上于室温下再温育15分钟。抽吸板，将珠粒重悬浮于150uL AB-1中，在Luminex

仪上读数。

结果

图13显示在固定浓度的代表性测试抗体存在的情况下来自胰岛素的滴定的pIRS-1测定结果。对MFI进行标准化以便将曲线拟合最大值调整至100％。某些抗体(正调节剂)使胰岛素滴定曲线偏移至左边。其它抗体(负调节剂)使胰岛素滴定曲线偏移至右边。观察到调节的不同量级。图13中的数据显示抗体产生增加至9倍，或在胰岛素敏感性方面下降至1/24。

图14是显示在固定浓度的不同测试抗体存在或不存在的情况下来自pIRS-1测定的胰岛素EC50值的表。按照EC50比率+Ab/-Ab给结果分级。

实施例7

TNF-α/TNFR结合的动力学调节剂的鉴定

TNFα调节剂的期望的性质将是减弱TNFα的病理水平的信号转导同时允许足够的信号转导支持先天免疫反应。此类TNFα调节剂的鉴定通过选择减小TNFα对于其一种或两种受体的亲和力的多肽结合剂(例如抗体)来实现。减小的TNFα对于其受体的亲和力反映在许多标准分析测量上，例如更快的解离速率、更慢的结合速率、更慢的缔合常数和更高的离解常数。备选地，这可通过多肽结合剂相对于TNFα-TNFR对单独的TNFα的优先结合(例如，更强的结合信号)来检测。对于TNFα-TNFR复合物的结合信号的不存在表示完全阻断和未被被选择。

本实施例描述了测定法测量在测试化合物(TNFα结合多肽)存在或不存在的情况下配体(人TNFα)对TNFR1或TNFR2的差异结合的用途。因为TNFR1和TNFR2据认为在生物途径中起着不同作用，因此可能期望选择性调节这两个受体的活性(例如，TNFα主要通过与TNFR1相互作用减小炎症反应，而TNFR2的表达在炎症性结肠炎模型中提供了保护作用；TNFR1的上调在缺血预处理(ischemic preconditioning)模型中提供了神经保护作用)。TNFα对两个受体的结合的选择性调节可在不同疾病中提供益处(Schneider等人Eur.J.Immunol.39(7)：1743-53(2009)；Mukai等人，J.Biochem.146(2)：167-72(2009)；Pradillo等人J.Cereb.Flow Metab.25(2)：193-203(2005))。从来源例如首次用于实验的噬菌体展示文库和杂交瘤重新获得TNFα-结合多肽，或者将所述所述结合多肽产生为TNFα结合多肽的已知的变体例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、HUMICADE^TM、戈利木单抗、atacicept和依那西普。

可使用下文描述的测定法鉴定TNFα-TNFR结合相互作用的抗体调节剂。

使用PEG₄生物素(Pierce Protein Research Products cat#21329，Rockford，IL)通过激活的NHS化学方法将纯化的TNF(cat#210-TA-010，R&D SvstemsMinneapolis，MN)生物素化。以100uL/孔将2ug/mL的PBS中的TNFR1或TNFR2(cat#636-R1-025或1089-R2-025，R&D Systems Minneapolis，MN)包被在EIA板(Nunc，Rochester，NY)上，在振荡器上于37℃下温育1小时。随后用牛血清白蛋白(BSA)和ChemiBlock^TM(Millipore Billerica，MA)封闭溶液将板在振荡器上于室温下封闭至少半小时。不干扰反应物并且充分封闭EIA板上的非特异性结合的任何封闭溶液可用于该测定。

在稀释板上制备样品。可以以周质提取物(PPE)或杂交瘤上清液的形式筛选TNFα-结合scFv或Fab。为了进行单点测定，将PPE样品与以0.15ug/mL于封闭缓冲液中制备的生物素化的TNF以1∶1混合，然后将50uL该溶液加至EIA板上。纯化来自单点测定的潜在命中，使用配体的滴定进一步测试，或以固定配体浓度上在不同的滴定上进行测试。将50uL/孔的该抗体-TNF-生物素溶液加入已封闭的EIA板，在振荡器上于室温下温育超过1小时。将单独的PBS和封闭缓冲液的阴性对照包括在该单点测定中以确定本底信号水平。生物素化的分析物和抗体混合物保留在孔中并且不被去除或洗掉。随后将板在振荡器上于室温下再温育超过1小时(在大多数测定中使用3-4小时的总反应时间；然而更长的温育允许更慢的反应获得平衡)。随后彻底清洗板，利用100uL/孔的对-硝基苯基磷酸盐(PNPP；Pierce Protein Research ProductsRockford，IL)显影。在使板显影5至15分钟后，使用100uL/孔的1M NaOH终止反应。在微量板读数器上于405nm处读取吸光度。

进行功能测定以确认信号复合物组分的亲和力的减小可引起针对TNFα的细胞剂量-反应的偏移。多种基于细胞的测定法可用于该目的，包括例如美国专利7,524,502和7,179,893以及美国申请2009/0155205中描述的测定法。

中和L929细胞的TNFα-诱导的细胞毒性

将TNFα-敏感性L929小鼠成纤维细胞于含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中以5x10⁴个细胞的密度接种在96孔组织培养板中。通过将L929细胞加入含有重组TNFα(500pg/mL)的RPMI+FBS培养基中，在37℃下与期望的测试浓度的抗-TNFα抗体或抗-KLH(钥孔血蓝蛋白)同种型对照抗体一起预温育1小时来进行抗体效力测定。使用递增量的TNFα进行TNFα剂量-反应测定，所述TNFα在加入至L929细胞之前用100倍摩尔过量的抗体在室温下预温育过夜。随后将板37℃下于5％CO₂中温育过夜(18-24小时)。

为了测定对TNFα-诱导的细胞的细胞毒性的作用，从每一个孔取出100uL培养基，加入50uL 5mg/mL的PBS中的3，(4，4-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-溴化四唑(MTT；Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。随后将在37℃下温育4小时。然后向每一个孔中加入50uL 20％十二烷基硫酸钠(SDS)，将板在37℃下温育过夜。测量570/630nm处的光密度，绘制每一个样品的曲线，利用标准方法测定IC₅₀。以一式二份或一式三分建立和测定所有样品。

对HUVEC上ELAM-1和/或ICAM-1表达的抑制

TNFα诱导内皮细胞粘附分子例如ELAM-1和ICAM-1的表面表达。在体外测定中测试抗-TNFα抗体中和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中TNFα刺激的膜结合ICAM-1和/或ELAM-1的产生的能力。

简而言之，将HUVEC(ATCC No.CRL 1730)在TNFα和不同浓度的测试或对照抗体存在的情况下培养在96孔板中。随后使用商购可得的检测试剂，通过细胞裂解和酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估膜结合ICAM-1和/或ELAM-1的定量相对表达。将HUVEC以5x10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中，通过在37℃、5％CO₂下温育至少2小时使其附着于板。

通过加入至含有重组TNFα的HUVEC培养基中，用期望的测试浓度的抗-TNFα抗体或抗-KLH(钥孔血蓝蛋白)同种型对照抗体在37℃预温育1小时来进行抗体效力测定。使用递增量的在加入HUVEC之前在室温下用100倍摩尔过量的抗体预温育过夜的TNFα进行TNFα剂量-反应测定。随后将板在37℃下5％CO₂中温育24小时。在温育后，除去培养基，用PBS洗涤细胞。裂解细胞，测定裂解物中ICAM-1和/或ELAM-1的存在。为了进行测定，使用商购可得的试剂(例如，sICAM-1 Module set；Bender Medsystems，Towcester，UK)通过标准ELISA分析澄清的裂解物中可溶性ICAM-1或ELAM-1的存在。以一式二份或一式三份重复建立和测定所有样品。

Hs 27细胞中TNFα诱导的IL-6的上调的抑制

通过暴露于TNFα可诱导人包皮成纤维细胞产生IL-6。通过用重组TNFα和测试抗体共温育细胞，然后使用商购可得的IL-6检测系统测定随后分泌入培养基的IL-6水平来评估抗-TNFα抗体抑制该表达的上调的能力。

TNFα-敏感性人包皮成纤维细胞Hs 27(例如，来自欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)(ECACC no.94041901))以2x10⁴个细胞的密度于含有10％胎牛血清的DMEM+Glutamax培养基中接种在96孔组织培养板中，通过在37℃温育过夜将其粘附于板。通过加入至含有重组TNFα的Hs 27培养基中，用期望的测试浓度的抗-TNFα抗体或抗-KLH(钥孔血蓝蛋白)同种型对照抗体在37℃预温育1小时来进行抗体效力测定。使用递增量的在加入至Hs 27细胞之前在室温下用100倍摩尔过量的抗体预温育过夜的TNFα进行TNFα剂量-反应测定。随后将板在37℃、5％CO₂中温育过夜(18-24小时)。温育后，从板中取出培养基，将其转移至U形底96孔板以进行测定。使用商业ELISA系统(例如，R&D Systems，如上所述的)分析培养基中IL-6的存在。以一式二份或一式分份建立和测定所有样品。

实施例8

部分激动剂抗-INSR抗体对DIO小鼠的血糖控制的作用

在饮食诱导肥胖(DIO)模型中，C57BL/6小鼠可在约12-14周的高脂肪饮食(HFD)后产生胰岛素抗性。在该模型中评估显示在体外表现为部分激动剂或正调节剂的抗-INSR抗体以确定此类抗体是否体内增强胰岛素敏感性和/或血糖控制。

为了确定部分激动剂抗-INSR抗体是否降低空腹血糖，使20周龄DIO小鼠(对于HFD，14周；n＝8/组)禁食5小时，用部分激动剂抗体Ab030和Ab037或同种型对照(5mg/kg)进行静脉内攻击。在其它对照研究中，用胰岛素(0.5U/kg)处理DIO小鼠，或用同种型对照(5mg/kg)给饲喂正常饮食(ND)的年龄匹配的小鼠施用。在注射前(时间＝0)和施用后1、2和4小时获取血糖样品。与年龄匹配的对照相比较，在1小时的时间点上在DIO小鼠(HFD-饲喂的/同种型对照)中观察到增加的血糖，这与饲喂HFD的动物中的胰岛素抗性一致(图15A)。胰岛素或部分激动剂抗体的任一种的施用导致统计上显著的血糖的减小(p＜0.05；单尾t-检验)(图15B)。没有一种抗体在任何时间点上诱导低血糖症(定义为低于36mg/dL的血糖)。这些结果表明抗-INSR部分激动剂抗体安全有效地降低空腹血糖。

为了进一步评估部分激动剂抗-INSR抗体对血糖控制的作用，用Ab037(0.1、1.0或9mg/kg)或同种型对照(1.0mg/kg)腹膜内(IP)注射18周龄DIO小鼠(对于HFD，12周；n＝8/组)。作为另外的对照，用同种型对照(1.0mg/kg)给年龄匹配的对照小鼠施用，或给DIO小鼠施用胰岛素(0.75U/kg；IP)。通过使动物禁食16小时(始于抗体施用后约8小时)，注射葡萄糖(1.0U/kg)，然后跟踪血糖2小时以上来在抗体施用(胰岛素后30分钟)后24小时进行葡糖耐量试验(GTT)。在该实验中，HFD对空腹血糖(图16B)或快速注射后峰值血糖(图16A)没有显著影响。然而，在DIO小鼠中，部分激动剂抗体相对同种型对照(当以1.0mg/kg或高于1.0mg/kg的剂量施用时)显著降低空腹血糖(图16B)和在9.0mg/kg上减少GTT曲线下面积(AUC)(图16C)。

该结果证明抗-INSR部分激动剂抗体可在体内降低空腹血糖并且改善血糖控制。

实施例9

正调节剂抗-INSR抗体对DIO小鼠的血糖控制的作用

为了确定正调节剂抗-INSR抗体是否在体内增强胰岛素敏感性，给18周龄DIO小鼠(n＝8/组)腹膜内注射Ab001(正调节剂)(0.1、1.0或10mg/kg)、部分激动剂抗体(Ab037)(10mg/kg)或同种型对照(1.0mg/kg)。施用同种型对照(1.0mg/kg)的饲喂ND的年龄匹配的小鼠用作另外的对照(图17A)。24小时后，通过在5小时禁食后施用胰岛素(0.5U/kg)来进行胰岛素耐量试验(ITT)，监控血糖水平2小时以上。HFD对空腹血糖(图17B)或ITT AUC(图17C)相对于常规饮食没有显著影响，并且部分激动剂抗体(Ab037)和正调节剂抗体(Ab001)施用都不导致相对于同种型对照处理的DIO动物统计上显著更低的AUC ITT(图17C)。部分激动剂抗体Ab037显著降低空腹血糖，而正调节剂抗体Ab001诱导朝向降低的空腹血糖的非统计上显著的剂量依赖性趋势。

在接下来的一周，在额外施用一剂抗体后在相同动物上进行GTT(图18A)。在该研究中，HFD导致与对照饲喂的动物相比较空腹血糖(图18B)和GTT AUC(图18C)的非统计上显著的增加。与同种型对照处理的DIO小鼠相比较，部分激动剂抗体和正调节剂抗体在所有测试的剂量上显著降低了空腹血糖。此外，部分激动剂抗体和正调节剂抗体相对于同种型对照在10mg/kg上显著减少GTT AUG。

这些结果表明对INSR具有特异性的部分激动剂和正调节剂抗体改善了糖尿病受试者的血糖控制。

实施例10

抗受体的变构激动剂抗体的淘选

展示比对游离受体更大的对受体/配体的复合物的结合的激动剂抗体的选择增加了鉴定不与配体竞争并且不阻断或减少配体对受体的变构位点的结合的抗体的概率。结合靶受体上与内源结合位点不同的位点的该类型的抗体称为变构激动剂(Kenakin等人，J Receptors and Signal Transduction，27：247-259，2007；Jahns等人，J Am Coil Cardiol.36：1280-87，2000；May等人，Ann Rev Toxicol.47：1-51，2007).

上述筛选激动剂抗体的方法对于变构激动剂的筛选也是有用的。测试抗体与受体配体复合物的优先结合与变构活性一致，然而测试抗体与游离受体的优先结合与同胰岛素竞争变构位点的抗体一致。所述筛选用于通过消除一些(如果不是所有的话)竞争性激动剂来富集变构激动剂的候选克隆库。

变构抗体不太可能干扰配体的结合亲和力和功效，从而不太可能干扰最大配体信号转导或对配体的最大敏感性。变构抗体可展示一系列来自弱部分激动剂的激动至与内源配体相似的激动水平。部分变构激动剂可引发最大信号转导反应，所述反应在量级上显著低于内源配体的最大反应。在某些应用中，在持续的次最大信号激活优于最大信号激活的情况下，部分激动剂抗体优于完全激动剂抗体。从图19和图20中显示的剂量反应曲线的比较来看，部分变构激动剂与正变构调节剂之间的区别特征是很明显的，所述图显示了部分变构激动剂(图19)和正变构调节剂(敏化剂)抗体(图20)的不同结合曲线，如使用对INSR具有特异性的抗体举例说明的。

图19A举例说明了与对内源配体(胰岛素)的剂量反应相比较的来自部分变构激动剂的剂量反应的实例，图19B显示了在变构激动剂存在或不存在的情况下通过配体产生的激活。图20A显示与对内源配体的剂量反应相比较来自正变构调节剂抗体的剂量反应，而图20B显示在结合INSR的正变构调节剂抗体存在和不存在的情况下内源配体(胰岛素)的剂量反应曲线。图21提供了一组部分变构激动剂相对于内源配体的激活参数。由部分变构激动剂产生的信号激活的性质与获自相同初步筛选方法的变构调节剂的不同。

非竞争性部分变构激动剂抗体可提供优于竞争性激动剂的治疗有利方面，其中有益地是，具有通过部分激动剂和内源配体同时产生的独立信号激活。例如，不受理论束缚，部分变构激动剂可用于信号转导途径的基础激活同时仍然允许响应内源配体水平的短暂波动。在某些情况下，在其中该种类的部分变构激动剂存在的条件下，内源配体的剂量反应将展示基线(组成型的或基础的)信号转导水平的增加以及将达到相同或更大的对内源配体的最大反应而几乎无或无配体EC50的显著改变。例如，图19B显示在部分变构激动剂存在和不存在的情况下内源配体的剂量反应，图22显示相对于在阴性对照抗体存在的情况下对内源配体的最大反应，在部分变构激动子抗体存在的情况下的胰岛素的最大激活。图22显示部分变构激动剂抗体Ab037和Ab040当与相同测定内的阴性对照抗体相比较时对通过胰岛素产生的剂量反应的EC50和Akt在Ser473上的最大磷酸化几乎没有或没有显著影响。

实施例21

测量抗-INSR抗体对胰岛素对于INSR的结合亲和力的调节的测定

为了测定调节抗体影响胰岛素对胰岛素受体的结合的能力，在针对INSR的单克隆抗体存在和不存在的情况下测量未修饰的胰岛素结合在经血清饥饿的CHOK1细胞(hINSR8-CHOK1)的表面上表达的人INSR的亲和力。KinExA测定法已被开发用以测量细胞培养基中极低水平的胰岛素。该测定法使得胰岛素与表达INSR的细胞的结合可通过测定胰岛素从细胞培养基消耗的水平来进行测量。随着胰岛素开始结合细胞，细胞培养基中胰岛素的浓度下降。通过使用表达INSR的细胞的滴定和测量游离胰岛素％，可使用KinExA软件估计INS-INSR相互作用的亲和力。该测定法被用于测量由不同抗-INSR抗体显示的对胰岛素结合活性的调节的程度。

使hINSR8-CHOK1细胞经历血清饥饿过夜，随后通过沉淀细胞且以2X最高稀释度的终测定浓度(3.5x10⁷至2.0x10⁷个细胞/mL于含有500μg/mLBSA和0.1％叠氮化钠(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的PBS的测定稀释缓冲液(Teknova，Hollister CA)中)的浓度重悬浮来制备用于测定。制备细胞的2倍系列稀释物，产生10个点的稀释物系列，也使用无细胞对照。将细胞悬浮液等分入聚丙烯测定管，每管2mL体积。对于这些细胞悬浮液，向每一个管中加入1mL的40ug/mL测试抗体(或对于Ab078，100ug/mL)，轻轻混合，在冰上温育30-45分钟。与阴性对照人IgG2抗-KLH抗体相比较测试所使用的抗体。向每一个管中加入1mL 200pM胰岛素以建立50pM(300pg/mL)的终胰岛素浓度(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将样品在4℃温育过夜，进行18小时，随后离心以沉淀细胞，取出上清液以进行测试。

使用用抗胰岛素单克隆抗体包被的珠粒进行KinExA 3000分析。将2克聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)珠粒(Sāpidyne，Boise，ID)悬浮于9mL包含65ug/mL的克隆D6C4小鼠抗胰岛素单克隆抗体(Fitzgerald Industries，Acton MA)的测定缓冲液PBS中。将珠粒在室温下旋转6小时，随后将其静置。用含有50mg/mL BSA级分V(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS替换上清液，于4℃下旋转过夜。所使用的检测溶液是0.15μg/mL的具有1ug/mL链霉抗生物素蛋白-PE(Invitrogen，Carlsbad，CA)的测定稀释缓冲液中的生物素化的小鼠抗胰岛素克隆D3E7(Fitzgerald Industries，Acton MA)。在KinExA 3000上，以0.25mL/分钟注射样品，进行240秒，随后在电泳缓冲液(具有0.05％叠氮化钠的PBS)中漂洗60秒，随后注射检测溶液，进行240秒，然后以1mL/分钟进行最终90秒的洗涤。测量早期初始时间点与接近电泳结束的时间点的电压差，将其用于计算亲和力。细胞上的INSR浓度经估计为2.5x10⁵个受体/细胞。使用KinExA软件(Sāpidyne，Boise ID)测定亲和力，通过在Prism(GraphPad Software，La Jolla CA.)中进行非线性拟合来计算EC50。

许多抗-INSR抗体增强胰岛素对于细胞的亲和力，如下面表4中所显示的。所测试的抗体之一将胰岛素对于细胞的亲和力减小至约1/3。

表4

胰岛素亲和力和IC50表

这些数据举例说明了本文中描述的筛选方法产生增强胰岛素对于胰岛素受体的结合亲和力的正调节剂抗体。

根据上述内容，应理解，虽然为了举例说明已在本文中描述了本发明的具体实施方案，但可进行实施方案的各种变动、变化和组合而不偏离本发明的精神和范围。此类变动、变化和组合意欲由下列权利要求包括。

Claims (152)

1.一种鉴定调节信号复合物的第一组分与第二组分之间的结合的候选动力学调节抗体的方法，包括如下步骤：

(a)测量在测试抗体存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数，

(b)测量在所述测试抗体不存在的情况下，所述第一组分对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和

(c)当所述测试抗体在步骤(a)和(b)测量的结合亲和力或结合率参数上显示1.5倍至1000倍差异，则将所述测试抗体鉴定为候选动力学调节抗体。

2.权利要求1所述的方法，其中如果所述测试抗体使所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数增强至约1.5倍至1000倍，则所述测试抗体被鉴定为候选正调节抗体。

3.权利要求2所述的方法，其中所述测试抗体使所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数增强至约2倍至200倍。

4.权利要求1所述的方法，其中如果所述测试抗体使所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数减弱至约2/3至1/1000倍，则所述测试抗体被鉴定为候选负调节抗体。

5.权利要求4所述的方法，其中所述测试抗体使所述第一组分与所述第二组分之间的结合亲和力或结合率参数减弱至约1/2至1/200倍。

6.一种鉴定调节信号复合物的第一组分与第二组分之间的结合的候选动力学调节抗体的方法，包括如下步骤：

(a)(i)测量在所述第二组分存在的情况下测试抗体对于所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或(ii)测量在所述第一组分存在的情况下测试抗体对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和

(b)(i)测量在所述第二组分不存在的情况下，所述测试抗体对于所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，或

(ii)测量在所述第一组分不存在的情况下所述测试抗体对于所述第二组分的结合亲和力或结合率参数；和

(c)当所述测试抗体在步骤(a)和(b)中测量的结合亲和力或结合率参数上显示1.5倍至1000倍差异时，将所述测试抗体鉴定为候选动力学调节抗体。

7.权利要求6所述的方法，其中如果步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍至1000倍，则所述测试抗体被鉴定为候选正调节抗体。

8.权利要求7所述的方法，其中步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率常数的约2倍至200倍。

9.权利要求6的方法，其中如果步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍至1000倍，则所述测试抗体被鉴定为候选负调节抗体。

10.权利要求9所述的方法，其步骤(b)中测量的结合亲和力或结合率参数的强度为步骤(a)中测量的结合亲和力或结合率参数的约2倍至200倍。

11.权利要求6-10中任一项所述的方法，其中测量所述测试抗体对于单独的所述第一组分的结合亲和率或结合率参数。

12.权利要求6-11中任一项所述的方法，其中测量所述测试抗体对于单独的所述第二组分的结合亲和力或结合率参数。

12A.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述测试抗体对于包含第一组分和第二组分的复合物的结合亲和力KD为约10^-5M^-1或更小，并且所述测试抗体不可检测地结合单独的所述第一组分或单独的所述第二组分。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中如果选自(A)所述测试抗体对于包含所述第一组分(C1)和所述第二组分(C2)的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[C1C2]M，(B)所述第一组分对于包含抗体和所述第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC2]C1，或(C)所述第二组分对于包含抗体和所述第一组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC1]C2，的结合亲和力或结合率参数的强度为选自(1)所述测试抗体对于单独的所述第二组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC2，或(2)所述测试抗体对于单独的所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC1，的约1.5倍至1000倍，那么所述测试抗体(M)被鉴定为候选正调节抗体。

14.权利要求13所述的方法，其中(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为(1)或(2)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的约2倍或200倍。

15.权利要求13所述的方法，其中(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为(1)和(2)两者的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍至1000倍。

16.权利要求13所述的方法，其中(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为(1)和(2)两者的结合亲和力或结合率参数的约2倍至200倍。

17.权利要求13-16中任一项所述的方法，其中(1)的结合亲和力或结合率参数强于(2)的结合亲和力或结合率参数。

18.权利要求13-16中任一项所述的方法，其中(2)的结合亲和力或结合率参数强于(1)的结合亲和或结合率参数。

19.权利要求13所述的方法，其中所述结合亲和力为平衡离解常数K_D，并且K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个为K_MC2或K_MC1的任一个或多个的约2/3至1/1000。

20.权利要求19所述的方法，其中K_[C1C2]A为K_MC2的约2/3至1/1000。

21.权利要求19所述的方法，其中K_[AC2]C1为K_MC2的约2/3至1/1000。

22.权利要求19所述的方法，其中K_[AC1]C2为K_MC2的约2/3至1/1000。

23.权利要求19所述的方法，其中K_[C1C2]A为K_MC1的约2/3至1/1000。

24.权利要求19所述的方法，其中K_[AC2]C1为K_MC1的2/3至1/1000。

25.权利要求19所述的方法，其中K_[AC1]C2为K_MC1的约2/3至1/1000。

26.权利要求13所述的方法，其中所述结合亲和力是平衡缔合常数K_A，并且K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个为K_MC2或K_MC1的任一个或多个的约1.5倍至1000倍。

27.权利要求1-12所述的方法，其中如果选自(1)测试抗体对于单独的所述第二组分(C2)的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC2，(2)测试抗体对于单独的所述第一组分(C1)的结合亲和力或结合率参数，任选地K_MC1，的结合亲和力或结合率参数的强度为选自(A)测试抗体对于包含所述第一组分和第二组分的复合物的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[C1C2]M，(B)所述第一组分对于包含所述抗体和所述第二组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC2]C1，或(C)所述第二组分对于包含所述抗体和所述第一组分的结合亲和力或结合率参数，任选地K_[MC1]C2，的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍至1000倍，则所述测试抗体(M)被鉴定为候选负调节抗体。

28.权利要求27所述的方法，其中(1)或(2)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为(A)、(B)或(C)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的约2倍或200倍。

29.权利要求27所述的方法，其中(1)或(2)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为所有(A)、(B)和(C)的结合亲和力或结合率参数的约1.5倍至1000倍。

30.权利要求27所述的方法，其中(1)或(2)的任一个或多个的结合亲和力或结合率参数的强度为所有(A)、(B)和(C)的结合亲和力或结合率参数的约2倍至200倍。

31.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中(1)的结合亲和力或结合率参数强于(2)的结合亲和力或结合率参数。

32.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中(2)的结合亲和力或结合率参数强于(1)的结合亲和力或结合率参数。

33.权利要求27所述的方法，其中所述结合亲和力是平衡离解常数K_D，，并且K_MC2或K_MC1的任一个为K_[C1C2]M、K_[C2]C1或K_[MC1]C2的任一个的约2/3至1/1000。

34.权利要求33所述的方法，其中K_MC2为K_[C1C2]M的约2/3至1/1000。

35.权利要求33所述的方法，其中K_MC2为K_[MC2]C1的约2/3至1/1000。

36.权利要求33所述的方法，其中K_MC2为K_[MC1]C2的约2/3至1/1000。

37.权利要求33所述的方法，其中K_MC1为K_[C1C2]M的约2/3至1/1000。

38.权利要求33所述的方法，其中K_MC1为K_[MC2]C1的约2/3至1/1000。

39.权利要求33所述的方法，其中K_MC1为K_[MC1]C2的约2/3至1/1000。

40.权利要求27所述的方法，其中所述结合亲和力为平衡缔合常数K_A，并且K_MC2或K_MC1的任一个或多个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个的约1.5倍至1000倍。

41.权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中，将所述测试抗体和所述第二组分与多个不同浓度的所述第一组分接触。

42.权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中，将所述测试抗体和所述第一组分与多个不同浓度的所述第二组分接触。

43.权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中，将多个不同浓度的所述测试抗体与所述第一组分和所述第二组分接触。

44.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述测试抗体结合的抗原是所述第一组分并且所述测试抗体与所述第一组分的浓度相比较处于饱和浓度。

45.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述测试抗体结合的抗原是所述第二组分并且所述测试抗体与所述第二组分的浓度相比较处于饱和浓度。

46.权利要求44或45所述的方法，其中所述测试抗体的浓度大于或等于所述测试抗体对于包含所述第一组分和所述第二组分的复合物的K_D。

47.权利要求46所述的方法，其中所述第二组分的浓度低于所述测试抗体对于所述第一组分的K_D。

48.权利要求47所述的方法，其中所述第一组分的浓度对于所述第一组分对所述第二组分的结合处于饱和浓度。

49.权利要求48所述的方法，其中所述第一组分的浓度在所述第一组分与所述第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。

50.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中在一个或多个浓度的所述第二组分存在的情况下将一个或多个浓度的所述测试抗体与多个不同浓度的所述第一组分接触。

51.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中在一个或多个浓度的所述第一组分存在的情况下将一个或多个浓度的所述测试抗体与多个不同浓度的所述第二组分接触。

52.权利要求7-8或13-26中任一项所述的方法，其中所述测试抗体对于包含所述第一组分和所述第二组分的复合物处于饱和浓度。

53.权利要求52所述的方法，其中所述测试抗体的浓度大于或等于所述测试抗体对于包含所述第一组分和所述第二组分的复合物的K_D。

54.权利要求53所述的方法，其中所述第二组分的浓度大于所述第二组分对于所述第一组分的K_D。

55.权利要求54所述的方法，其中所述第一组分的浓度对于所述第二组分为饱和浓度。

56.权利要求7-8或13-26中任一项所述的方法，其中所述测试抗体对于包含所述第一组分和所述第二组分的复合物处于饱和浓度。

57.权利要求56所述的方法，其中所述抗体的浓度在所述第一组分与所述第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。

58.权利要求57所述的方法，其中所述第二组分的浓度大于所述第二组分对于所述第一组分的K_D。

59.权利要求58所述的方法，其中所述第一组分的浓度对于所述第二组分处于饱和浓度。

60.权利要求9-10或27-40中任一项所述的方法，其中所述测试抗体结合的抗原是所述第一组分并且所述测试抗体对于所述第一组分处于饱和浓度。

61.权利要求60所述的方法，其中所述抗体的浓度在所述第一组分与所述第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。

62.权利要求61所述的方法，其中所述第二组分的浓度大于所述第二组分对于所述第一组分的K_D。

63.权利要求62所述的方法，其中所述第一组分的浓度对于所述第二组分处于饱和浓度。

64.权利要求9-10或27-40中任一项所述的方法，其中所述测试抗体结合的抗原是所述第二组分并且所述测试抗体对于所述第二组分处于饱和浓度。

65.权利要求60所述的方法，其中所述抗体的浓度在所述第一组分与所述第二组分的相互作用的约EC₂₀至EC₈₀的范围内。

66.权利要求61所述的方法，其中所述第二组分的浓度大于所述第二组分对于所述第一组分的K_D。

67.权利要求62所述的方法，其中所述第一组分的浓度对于所述第二组分而言为饱和浓度。

68.权利要求1-67中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)之前，测定多个测试抗体对包含所述第一组分和所述第二组分的复合物的结合亲和力，任选地具有为10^-5M的平衡离解常数K_D或更强的结合亲和力。

69.权利要求1-68中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)之前，测定多个测试抗体对所述第一组分的结合亲和力，任选地具有为10^-5M的平衡离解常数K_D或更强的结合亲和力。

70.权利要求1-69中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)之前，测定多个测试抗体对所述第二组分的结合亲和力，任选地具有为10^-5M的平衡离解常数K_D或更强的结合亲和力。

71.权利要求1-70中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)之前，通过将一个或多个不同的突变引入亲代抗体来产生多种测试抗体，所述测试抗体是亲代抗体的变体。

72.权利要求1-71中任一项所述的方法，其还包括测量在所述测试抗体存在和不存在的情况下，所述第一组分对于结合伴侣的结合亲和力或结合率参数，其中所述结合伴侣不是所述第二组分。

73.权利要求72所述的方法，其中所述结合伴侣是诱饵受体、清除受体或备用信号途径组分。

74.权利要求72或73所述的方法，其包括鉴定不显著改变所述第一组分对于所述结合伴侣的结合亲和力或结合率参数的测试抗体。

75.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试抗体选自抗体片段、scFv、Fab、CDR、啮齿类动物抗体、哺乳动物抗体、人抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

76.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试抗体是单克隆抗体。

77.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力或结合率参数选自前述任一项的平衡缔合常数K_A、平衡离解常数K_D、结合速率、解离速率和替代参数。

78.权利要求77所述的方法，其中所述替代参数是所述第一组分在亚饱和浓度的所述第一组分或所述第二组分下对所述第二组分的结合的量或水平。

79.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试抗体、所述第一组分或所述第二组分全部存在于溶液中。

80.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述测试抗体、所述第一组分和所述第二组分之一连接于固相。

81.权利要求80所述的方法，其中所述连接是非共价的。

82.权利要求80所述的方法，其中将所述测试抗体、所述第一组分和所述第二组分之一包被在珠粒上。

83.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分或所述第二组分的至少一种在细胞表面上表达。

84.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分在细胞表面上表达并且所述第二组分在不同细胞表面上表达。

85.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是可溶性配体并且所述第二组分是膜结合受体。

86.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是膜结合受体并且所述第二组分是可溶性配体。

87.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是膜结合配体并且所述第二组分是膜结合受体。

88.权利要求86或87所述的方法，其中所述膜结合受体选自7-跨膜受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、肾上腺素能受体、神经递质受体、嗅觉受体、阿片样物质受体、趋化因子受体、视紫质、受体酪氨酸激酶、生长因子受体、整联蛋白和toll样受体。

89.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是酶并且所述第二组分是所述酶的底物。

90.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是两种或更多种化合物的复合物。

91.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二组分是两种或更多种化合物的复合物。

92.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是细胞因子或趋化因子并且所述第二组分是所述第一组分的受体。

93.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是生长因子并且所述第二组分是所述第一组分的受体。

94.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是IL-1β并且所述第二组分是I型IL-1受体(IL-1RI)。

95.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括测量在所述测试抗体存在和不存在的情况下，所述第一组分和/或所述第二组分对于第三组分的结合亲和力或结合率参数。

96.权利要求95的方法，其中所述第一组分是IL-1β，所述第二组分是IL-1RI，并且所述第三组分是IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)。

97.权利要求96所述的方法，其还包括鉴定测试抗体，在所述测试抗体存在或不存在的情况下，所述测试抗体在IL-1β与IL-1RAcP之间的结合亲和力或结合率参数上未展示超过2倍差异。

98.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是GCSF并且所述第二组分是GCSFR。

99.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是GCSFR并且所述第二组分是GCSF。

100.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是TNFα并且所述第二组分是TNFR1或2。

101.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组分是TNFR1或2并且所述第二组分是TNFα。

102.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括重新克隆和表达步骤(c)中鉴定的抗体。

103.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括纯化步骤(c)中鉴定的抗体。

104.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括测定步骤(c)中鉴定的抗体的序列。

105.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括添加或替换Fc区域或其片段。

106.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括利用无菌的药学上可接受的稀释剂将包含步骤(c)中鉴定的所述测试抗体的至少3个CDR的抗体配制在无菌组合物中。

107.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括给动物施用包含步骤(c)中鉴定的所述测试抗体的至少3个CDR的抗体。

108.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括测量在所述测试抗体存在和不存在的情况下由所述信号复合物介导的信号转导的水平。

109.权利要求108所述的方法，其中在磷酸化测量、离子流测定、分子运输测定或基因表达测定中测量由所述信号复合物介导的信号转导的水平。

110.权利要求108-109中任一项所述的方法，其中所述测试抗体使所述信号复合物的所述第一组分的EC₅₀增加至约1.5倍至约1000倍。

111.权利要求108-109中任一项所述的方法，其中所述测试抗体未显著改变对由所述第一组分产生的信号转导的最大激动剂反应。

112.权利要求108-109中任一项所述的方法，其中所述测试抗体使对由所述信号复合物产生的信号转导的最大激动剂反应减小至约2/3至1/1000。

113.权利要求108-109中任一项所述的方法，其中所述测试抗体使由所述信号复合物产生的信号转导的EC50减小至约2/3至1/1000。

114.权利要求108-109中任一项所述的方法，其中所述候选抗体增加对由所述第一组分产生的信号转导的最大激动剂反应至少10％。

115.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述候选抗体未显著地减少对所述第一组分、所述第二组分或包含所述第一和所述第二组分的复合物的清除。

116.由前述权利要求中任一项所述的方法鉴定的抗体。

117.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合SEQ IDNOS：1-88中任一项的分泌蛋白质，其能够使所述分泌蛋白质与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D增加至约1.5至1000倍。

118.权利要求117所述的抗体，其中所述正调节抗体能够使所述分泌蛋白质与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D增加至约2倍至200倍。

119.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合SEQ IDNOS：1-88中任一项的分泌蛋白质，其能够使所述分泌蛋白质与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D减小至2/3至1/1000。

120.权利要求119所述的抗体，其中所述负调节抗体能够使所述分泌蛋白质与其信号转导伴侣之间的结合亲和力K_D减小至约1/2至1/200。

121.一种正调节抗体(M)，其增强所述第一组分(C1)对信号复合物的所述第二组分(C2)的结合，所述抗体特征在于下列平衡离解常数K_D的结合性质：(i)所述抗体以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合C1、C2或包含C1和C2的复合物(C1C2)的至少一种，和(ii)K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个为K_MC2或K_MC1的任一个或多个的约2/3至1/1000，其中C1或C2为SEQ ID NOS：1-88中任一项的分泌蛋白质。

122.权利要求121所述的正调节抗体，其中K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个为K_MC2或K_MC1的任一个的约1/2至1/200。

123.权利要求121所述的正调节抗体，其中K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个为K_MC2或K_MC1的约2/3至1/1000。

124.一种负调节抗体(M)，其减弱所述第一组分(C1)对信号复合物的所述第二组分(C2)的结合，所述抗体的特征在于下列平衡离解常数K_D的结合性质：(i)所述抗体以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合C1、C2或包含C1和C2的复合物(C1C2)的任一种，和(ii)K_MC2或K_MC1的任一个或多个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个的约2/3至1/1000，其中C1或C2为SEQ ID NOS：1-88中任一项的分泌蛋白质。

125.权利要求124的负调节抗体，其中K_AC2或K_AC1的任一个或多个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的任一个或多个的约1/2至1/200。

126.权利要求124的负调节抗体，其中K_AC2或K_AC1的任一个或多个为K_[C1C2]M、K_[MC2]C1或K_[MC1]C2的约2/3至1/1000。

127.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)IL-1β、(ii)IL-1R1或(iii)包含IL-1β和IL-1R1的复合物的任一种，所述抗体能够使IL-1β与IL-1R1之间的结合亲和力K_D增强至约1.5倍至1000倍。

128.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)IL-1β、(ii)IL-1R1或(iii)包含IL-1β和IL-1R1的复合物的任一种，所述抗体能够使IL-1β与IL-1R1之间的结合亲和力K_D减弱至约2/3至1/1000。

129.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)TNFα、(ii)TNFR1或(iii)包含TNFα和TNFR1的复合物的任一种，所述抗体能够使TNFα与TNFR1之间的结合亲和力K_D增强至约1.5倍至1000倍。

130.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)TNFα、(ii)TNFR1或(iii)包含TNFα和TNFR1的复合物的任一种，所述抗体能够使TNFα与TNFR1之间的结合亲和力K_D减弱至约2/3至1/1000。

131.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)TNFα、(ii)TNFR1或(iii)包含TNFα和TNFR2的复合物的任一种，所述抗体能够使TNFα与TNFR2之间的结合亲和力K_D增强至约1.5倍至1000倍。

132.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)TNFα、(ii)TNFR1或(iii)包含TNFα和TNFR2的复合物的任一种，所述抗体能够使TNFα与TNFR2之间的结合亲和力K_D减弱至约2/3至1/1000。

133.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)GCSF、(ii)GCSFR或(iii)包含GCSF和GCSFR的复合物的任一种，所述抗体能够使GCSF与GCSFR之间的结合亲和力K_D增强至约1.5倍至1000倍。

134.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)GCSF、(ii)GCSFR或(iii)包含GCSF和GCSFR的复合物的任一种，所述抗体能够使GCSF与GCSFR之间的结合亲和力K_D减弱至约2/3至1/1000。

135.一种正调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)胰岛素、(ii)胰岛素受体或(iii)包含胰岛素和胰岛素受体的复合物的任一种，所述抗体能够使胰岛素与胰岛素受体之间的结合亲和力K_D增强至约1.5倍至1000倍。

136.一种负调节抗体，其以10^-5M或更小的平衡离解常数K_D结合(i)胰岛素、(ii)胰岛素受体或(iii)包含胰岛素和胰岛素受体的复合物的任一种，所述抗体能够使胰岛素与胰岛素受体之间的结合亲和力K_D减弱至约2/3至1/1000。

137.权利要求117-136中任一项所述的抗体，其为纯化的单克隆抗体。

138.编码权利要求116-137所述的抗体的任一个的多核苷酸。

139.编码权利要求116-137所述的抗体的任一个的重链的多核苷酸。

140.编码权利要求116-137所述的抗体的任一个的轻链的多核苷酸。

141.包含权利要求138-140所述中任一项的多核苷酸的宿主细胞。

142.包含权利要求139和140所述的多核苷酸的宿主细胞。

143.一种产生抗体的方法，包括在适合的条件下将权利要求141-142所述的宿主细胞培养在培养基中，然后从所述宿主细胞或培养基分离所述抗体。

144.由权利要求143所述的方法产生的抗体。

145.一种制备无菌药物组合物的方法，包括将无菌的药学上可接受的稀释剂添加至前述权利要求120-141或148中任一项所述的抗体中。

146.一种无菌组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体和无菌的药学上可接受的稀释剂。

147.一种给哺乳动物施用组合物的方法，包括施用权利要求146所述的无菌组合物。

148.权利要求147所述的方法，其中所述施用增强包含所述分泌蛋白质的复合物的信号转导。

149.权利要求147所述的方法，其中所述施用减弱包含所述分泌蛋白质的复合物的信号转导。

150.权利要求72所述的方法，其中所述第一组分是IL-1β，所述第二组分是IL-1R1，并且所述结合伴侣是IL-1R2或IL-1辅助蛋白。

151.权利要求72所述的方法，其中所述第一组分是TNFα，所述第二组分是TNFR1，并且所述结合伴侣是TNFR2。

152.权利要求72所述的方法，其中所述第一组分是TNFα，所述第二组分是TNFR2，并且所述结合伴侣是TNFR1。

Images