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CN102596987B - 用于纯化粘菌素的方法和纯化的粘菌素组分 - Google Patents

用于纯化粘菌素的方法和纯化的粘菌素组分 Download PDF

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CN102596987B CN201080049616.8A CN201080049616A CN102596987B CN 102596987 B CN102596987 B CN 102596987B CN 201080049616 A CN201080049616 A CN 201080049616A CN 102596987 B CN102596987 B CN 102596987B
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Abstract

本发明涉及一种利用反相色谱法纯化粘菌素的方法，其中，粘菌素基质在乙酸和高乙醇浓度中上柱并且用低乙醇浓度洗脱。

Description

用于纯化粘菌素的方法和纯化的粘菌素组分
技术领域
本发明涉及一种纯化抗生素的方法。
背景技术
在革兰氏阴性细菌，尤其是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，中提高的多药耐药性提出了一个关键性问题。有限的治疗备选方案已经迫使传染病临床医师和微生物学家重新评估粘菌素(也称作多粘菌素E)的临床应用，粘菌素是一种与多粘菌素B相似但又不完全相同的多粘菌素抗生素。由于粘菌素具有更宽的治疗指数，因此其可具有优于多粘菌素B的明显优势。
粘菌素于1947年首次从多粘芽孢杆菌变种粘菌素(Bacillus polymyxavar.colistinus)中被分离，并且由发酵产生的多肽的混合物组成。主要组分是多粘菌素E1、E2、E3和E1-Ile(图1)。
商业上，粘菌素作为硫酸粘菌素出现，其口服用于肠道去污，并且局部施用作为用于皮肤感染的粉剂，以及作为粘菌素甲磺酸钠(colistimethatesodium)，其被肠胃外施用以及通过吸入剂使用。已经发现，与粘菌素相比，粘菌素甲磺酸钠的毒性更小且具有更少的不良副作用，但是药效仍然较低(参见Critical Care 2006，10：R27(doi：10.1186/cc3995)，作者为Falagas和Kasiokou)。
硫酸粘菌素通常被配制成软膏剂、滴耳混悬剂以及耳用溶液和眼用溶液。硫酸粘菌素也作为混悬剂或片剂被口服给予以治疗肠道感染，或用于抑制结肠菌群。
粘菌素甲磺酸钠是可被用于治疗囊性纤维变性患者中的绿脓杆菌感染的粘菌素的半合成前药，并且其最近已被用于治疗多药耐药性不动杆菌感染。粘菌素甲磺酸钠在鲍氏不动杆菌和绿脓杆菌脑膜炎/室炎中也已经被鞘内给药和室内给药。粘菌素甲磺酸钠在水溶液中容易被水解为各种甲烷磺酸衍生物，并且难以进行分析。
因为粘菌素是在50多年之前被引入临床实践的，因此它的性质从未像现代药物那样被详细记录，例如，涉及药理学、毒理学、杂质含量等的具体要求。
由于这个原因，可商购的粘菌素产品除了含有主要组分多粘菌素E1之外，还含有很多相关的活性和非活性物质/杂质，大部分来源于发酵过程。图2中示出了粘菌素的典型HPLC色谱图。
商品化粘菌素的主要组分，多粘菌素E1(Polymyxin E1)，通常构成了干产品的大约60％。粘菌素产品中一些相关的物质已经被表征(图1)，但是大多数杂质仍是未知的。由USP(United States Pharmacopoeia，美国药典)指定的硫酸粘菌素的最小效价为“不小于500μg/mg”，但是每种组分的具体抗菌活性在很大程度上还是未知的。
尽管该产品已经被使用超过50年，但是没有粘菌素的标准化定量，而且也没有人公开关于药理学和药代动力学的详细试验。因而，用于大多数感染的粘菌素最佳剂量是未知的。同样地，每种制剂的推荐“最大”剂量也是不同的。各国具有不同的粘菌素一般制备方法，而推荐剂量则取决于制造商。
硫酸粘菌素和粘菌素甲磺酸钠两者均可被静脉注射给予，以及作为气溶胶给予，但是剂量是复杂的。来自一些制造商的粘菌素甲磺酸钠处方以国际单位计，而来自其他制造商的相同产品处方以粘菌素基质(base)的毫克数计。这种完全没有任何规则或标准化的剂量使得静脉粘菌素给药对于任何内科医师来说都是一个可怕的经历。
与静脉注射治疗一起被描述的主要毒性是肾毒性(对肾脏造成损害)和神经毒性(对神经造成损害)，但是这可以反映在早期被给予了非常高的剂量，其比任何制造商目前推荐的剂量要高得多，并且对于肾脏疾病未对其进行调整。与雾化治疗一起被描述的主要毒性是支气管痉挛。
在缺少数据支持的情况下，可以推测粘菌素的一些毒性可能归因于存在于目前商品化产品中的相关物质和杂质。而且，当使用“不纯的”粘菌素作为起始原料来合成粘菌素甲磺酸(colistimethate)前药时，每一种相关物质和杂质都会形成几种甲磺酸盐衍生物的基质，从而产生非常复杂的终产物—其中每一种个别物质的毒理学性质都是使未知的。
基于上述的毒理学和药理学考虑，可以看出，使用“单组份”的各种粘菌素用于医疗目的具有很大的优势。这样的单组份粘菌素将含有非常高比例的主要组分多粘菌素E1(＞90％，与目前60％相比)，所有的主要杂质都被鉴别出并且被表征。
单组分粘菌素提供了一些优点：
1)阐明主要组分(PE1)、相关物质和杂质的毒理学贡献的可能性
2)经得起新的和更精确的药理学和药代动力学研究检验的产品
3)合成定义明确的(well-defined)衍生物的可能性，例如，不产生大量不明确(ill-defined)物质的粘菌素甲磺酸
4)对粘菌素和粘菌素甲磺酸二者开发更好的和更精确的分析方法的可能性，并简化调控程序
5)基于清楚的药理学和毒理学数据的明确用药剂量建议
6)粘菌素到需求量大的“现代”抗生素的升级
由于专利文献或公共领域中均未描述用于制备单组分粘菌素的工业规模的方法，因此开发此类产品的制造方法是发明人的目的。
其次，更长期的目的是对纯化的PE1进行体外和体内效果的重新研究以及毒理学研究，以便与多粘菌素组(group)的之前的研究进行比较。迫切地需要这样的随机和对照试验以便进一步阐明关于多粘菌素的效果和安全性的各种问题(Crit Care Clin.2008 Apr；24(2)：377-91，作者为Micholopoulos和Falagas)。
发明内容
本发明涉及一种用于纯化粘菌素组分，并且尤其是主要组分，多粘菌素E1的方法。
本发明涉及一种生产粘菌素主要组分的几乎纯制剂的方法，该主要组分是多粘菌素E1(90-98％纯度)，其被称为粘菌素单组分。
该方法是一种使用低毒性溶剂的简单的色谱方法。该方法涉及反相(RP)色谱法，其使得能够将多粘菌素E1纯化达到超过90％的纯度，随后是疏水作用色谱法(HIC)。
该方法的特征是：
·粘菌素基质在乙酸和高(4M)乙醇浓度中上RP柱
·用低(1.6-2M)乙醇浓度洗脱。
出人意料的是，该方法能够被用来从其它主要粘菌素组分中有效地分离多粘菌素E1。
涉及合适的RP-材料的鉴定工作在10×250mm的钢柱上以实验室规模进行。
Merck LiChrospher 60 RP-选择B，15μm(C8)被证明是用于以实验室规模从粘菌素基质纯化PE1的合适树脂，并且该实验室方法在50×850mm钢柱上从1克按比例放大到50克的水平。
开发了一种将粘菌素基质溶解于24％(4M)乙醇和0.1M乙酸并被分成多粘菌素E片段的方法。该主要组分PE1以60％的典型回收率和94-98％的相对色谱纯度被分离。
在欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)中，一批/一批次硫酸粘菌素的效价被定义为多粘菌素因子PE1、PE2、PE3、PE1-Ile和PE1-7MOA的总和的％含量，在“原样(as is)”的基础上由HPLC测定。这些因子的总效价应当构成不少于77.0％。此外，EP规定特定因子的最大限值(NMT；不多于)，例如PE1-Ile(NMT 10％)、PE1-7MOA(NMT 10％)、PE3(NMT10％)和主要杂质NMT 4％。
通过利用所描述的纯化方法，终产物具有如下的典型组成：PE1(94-98％)、PE2(0-0.1)、PE3(0.0)、PE1-Ile(0.2-1.0％)、PE1-7MOA(0.5-2.0％)和总剩余杂质0.5-2.0％。
附图说明
图1.硫酸粘菌素、硫酸多粘菌素E1和相关物质的主要组分的分子结构
图2.粘菌素Ph.Eur.化学标准物质的HPLC色谱图
图3.该曲线图说明了在粘菌素基质的纯化过程中作为流分(fraction)数的函数的相对色谱纯度；该曲线图中的f1-E1和f2-E1在应用的说明部分中统称为f1；eE1等于e1/e2，eeE1等于e3，而eee…是较少的未知杂质的总和
图4.该曲线图说明了在粘菌素基质的纯化过程中作为流分数的函数的各种组分的峰面积；该曲线图中的f1-E1和f2-E1在应用的说明部分中统称为f1；eE1等于e1/e2，eeE1等于e3，而eee…是较少的未知杂质的总和
图5.带有主要杂质的粘菌素单组分(P E1)的HPLC色谱图
具体实施方式
“粘菌素”意指包括抗菌肽组分的任何混合物，其中该主要组分是多粘菌素E1或其盐。
“多粘菌素E1”意指包括之前指定的粘菌素A，以及由化学文摘(Chemical Abstracts)指定的化合物7722-44-3，以及N2-(6-甲基-1-氧代辛基)-L-2，4-二氨基丁酰基-L-苏氨酰基-L-2，4-二氨基丁酰基-L-2，4-二氨基丁酰基-L-2，4-二氨基丁酰基-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L-2，4-二氨基丁酰基-L-2，4-二氨基丁酰基-L-苏氨酸环(10-4)-肽，以及粘菌素IV。
“粘菌素基质”意指包括含有30-70％多粘菌素E1的任何粘菌素。
“硫酸粘菌素”意指包括粘菌素的任何硫酸盐。
“粘菌素甲磺酸(colistimethate)”意指包括粘菌素的任何甲烷磺化衍生物。
“组合物”是包含多于两种不同化合物的任何混合物，例如，两种活性药物成分的混合物，或者活性药物成分与一种或多种药用赋形剂的混合物。
在本申请中使用的术语“组分”或“多种组分”是指组合物中的特定化合物。相应地，“较少组分”是组合物中以相对小的量存在的化合物。
“药物组合物”是适合体内使用的任何组合物。因此，这样的组合物能够被皮肤、皮下、静脉注射、肠胃外、口服给予等。
“分离”是其中将所需化合物与另外的化合物(分析地或制备地)拆分(resolve)的任何方法。
“纯化”是通过其使所需化合物的浓度增加的任何分离方法。
“色谱法”是涉及固定相和流动相的任何纯化技术。
“固定相”是包含能够保留化合物的配体(ligand)的任何表面。
“配体”是固定相的基团(moiety)，在该基团处发生化合物的结合。
“流动相”是能够在确定方向上通过或沿着固定相渗过(percolate)的任何流体、溶剂、液体或混合物。
“反相色谱法”是较强极性或带电组分在较弱极性组分之前被洗脱的任何色谱法。
“疏水作用色谱法”基于固定相的非极性配体与非极性化合物或化合物的非极性部分之间的相互作用的任何色谱法。
“高乙醇浓度”意指乙醇浓度高于或等于以体积计20％，通常为20％-30％。
“低乙醇浓度”意指乙醇浓度低于以体积计20％，通常为10-15％。
“％v/v”意指体积百分比。
商品化粘菌素基质是许多密切相关的十肽-脂肪酸酰胺的混合物，包括多粘菌素E1、多粘菌素E2、多粘菌素E3和多粘菌素E1-异亮氨酸(图1)。
从粘菌素基质中分离主要组分多粘菌素E1(PE1)的愿望引起了人们对反相(RP)HPLC方法是否适合用于其分离，并获得高相对色谱纯度(＞90％)PE1的调查研究。
文献中仅提供了非常少的RP分离方法，并且所使用的主要有机溶剂是乙腈和甲醇。这些溶剂是有毒的，并且应该在中试规模(pilot)生产和大规模生产中避免使用。然而，采用从0至60％乙醇梯度的使用硫酸粘菌素的微克水平C18-HPLC分离试验出人意料地显示出，对于多粘菌素E1的工业用途的纯化方法可以使用相对无毒的溶剂乙醇。
通过发酵和纯化生产起始材料(粘菌素基质)，并且在整装物质(未分装物质，bulk substance)硫酸粘菌素的生产中，该起始材料是中间体。该起始材料含有大约60％的PE1，批次之间有一些百分比的不同。初始目标是获得相对色谱纯度＞90％的硫酸多粘菌素E1。出于作为目标(靶标)的目的，筛选了一系列柱材料用基于乙醇的洗脱系统。
多粘菌素E1(图1)具有带有极性十肽部分和非极性脂肪酸部分的离子去污剂特性。该分子由连接到6-甲基-辛烷酰化线性三肽的环七肽组成。由于该分子含有6个1，4-二氨基丁酸(DAB)的部分，其中一个参与三肽成键(bond)，5个主要氨基基团与它们相应的氨(NH4 +)基团平衡，构成分子的强极性部分。
RP-树脂和该分子之间的分子间相互作用预期在脂肪酸基团和肽部分的非极性区域处发生。
为了监测HPLC-流分和HPLC-池(pool)，基于标准方法开发了分析型HPLC-方法。改进的方法显示了小量相关组分(f1，e1，e2)在PE1主峰之下，而这在利用传统HPLC方法时是不可见的。
实验
准备型HPLC
10×250柱：为了以毫克量级筛选柱材料，使用10×250钢柱。该柱用悬浮在96％乙醇中的各种测试树脂填充。
50×830柱：为了以克量级进行制备性纯化，如下所述使用50×850mm钢柱。所选择的柱材料，将约1kg Merck LiChrosphere 60 RP选择B(15μm)悬浮在96％乙醇中并将其填充入柱中。将其上部法兰(flange)封上(attach)并以50巴的压力降活塞向上推，直到除去所有过量的乙醇。通过施加1ml的0.1mg/ml碘化钾溶液来测试该柱，并在AUFS＝0.05且流速为55.5ml/min，在227nm处测量吸附作用。所记录的峰是一条具有令人满意的对称的窄高斯曲线。
该制备型HPLC系统由以下部分组成：
柱：具有由Dan Process A/S制造的动态轴向压缩的10×250mm不锈钢Merck柱和50×850mm不锈钢柱
泵：Waters Deltra Prep 4000，具有0.5-150ml/min的流速间隔，具有4个不同的溶剂端口，在低压侧有一个混合阀(mix-valve)
检测器：Waters 486可调吸光度检测器(Tunable Absorbance Detector)
积分仪：Merck-Hitachi D-2000色谱-积分仪(Chomato-Integrator)
流分收集器：Waters流分收集器
在230nm处检测洗脱液的吸光度，乙酸在该处存在截止(cut-off)。在较短波长处，洗脱液显示太多的干扰。将毫克量级的流分收集于25ml试管中，而将克量级的流动分收集于250ml蓝盖瓶中。
为了在每次HPLC-运行后再生10×250mm和50×850mm柱，使用含有24％乙醇和50％在0.1M CH3COOH中的1，2-丙二醇的混合物。偶尔会在50×850mm柱上观察到高反压，然后将其重新包装或用96％乙醇冲洗直至压力变得正常。
分析型HPLC
所使用的柱是Novapak 4.6×150，4μm，C18，乙腈作为流动相。CH3CN-溶液的浓度在5分钟的时间间隔内从21％(在10分钟等度运行后)增加到30％。该柱不是恒温的，而是在环境温度(23±2℃)运行。
该分析型HPLC-系统由以下部分组成：
柱：Waters Novapak 4.6×150，4μ C18和等价4.6×250柱
泵：2psc.Waters 510，带有Waters泵控制模块
检测器：Waters 490 E可编程多波长检测器
流分收集器：Waters 717，加上自动进样器
该系统由Waters软件Millenium控制。
所测试的树脂的概况：
1)Merck No.9303 LiChroprep RP-18，25-40μm，批次：L 275703 614。
2)Merck No.9324 LiChroprep RP-8，25-40μm，批次：L 240124 541。
3)Merck No.11023 LiChrospher 60 RP-选择B，15μm，(C8)，批次：L 139923 633。
4)Merck No.150385 Hibar
Figure BDA0000159609900000111
RT LiChrospher，RP-18，15μm，Cat.50014。
5)Eka Nobel Kromasil-100
Figure BDA0000159609900000112
C8，16μm，批次：DT0026。
6)ToosoHaas Amberchrom CG 71 S，35μm，批号23770319。
7)ToosoHaas No.22227 Toyopearl MD-P醚，35μm，弱疏水性
8)ToosoHaas No.22225 Toyopearl MD-P丁基，35μm，强疏水性
用于10×250柱试验的化学药品：
硫酸粘菌素，批次：A4660314，Axellia ApS，丹麦哥本哈根
粘菌素基质，批次：A1551701，Axellia ApS，丹麦哥本哈根
乙醇，96％，“Danisco蒸馏器”，Danisco A/S
甲醇，Merck LiChrosolv no.6018
二甲亚砜，Merck Uvasol No.2950
1，2-丙二醇(重蒸，reinst)，Merck no.7478
2-丙醇，LiChrosolv梯度等级，Merck No.1040
乙酸，100％G.R.Merck No.63
1-甲基吡咯烷酮-(2)z.s.Merck No.806072
三乙胺，Pierce No.25108
四氢呋喃，Fluka No.87367
乙酸铵(分析纯，p.a.)，Merck No.1116
硫酸铵(分析纯，p.a.)，Merck No.1217
硫酸98％(分析纯，p.a.)
氢氧化钠颗粒，GR，Merck No.6498
超纯水，纯化实验室，R&D，FCD，Axellia ApS，丹麦哥本哈根
Millipore，HV型薄膜过滤器，0.45μm
用于50×825柱试验的化学药品：
乙醇96％和99％，来自Danisco蒸馏器，Danisco A/S
乙酸，100％G.R.Merck No.63
氢氧化钠颗粒，GR，Merck No.6498
NaOH，27％生产部
氢氧化钾，USP XIX，Ferak Berlin No.20907
10×250柱试验：
由于与树脂的强结合、明显的拖尾(tailing)、低色谱纯度或低回收率，以下的色谱树脂被证明不适合用于分离工作：ToosoHaas AmberchromCG 71 S；ToosoHaas Toyopearl MD-P醚，35μm，ToosoHaas Toyopearl MD-P丁基，35μm；Merck LiChroprep RP-8，25-40μm；Merck Hibar
Figure BDA0000159609900000121
RTLiChrospher，RP-18，15μm；Eka Nobel Kromasil-100
Figure BDA0000159609900000122
C8，16μm
对于使用LiChroprep C18，25-40μm的第一次10×250柱试验，在60分钟内乙醇梯度从0％至60％，pH～3.5(50mM HAc)，应用11mg硫酸粘菌素，获得了约90％良好产率的相对色谱纯度(RCP)。然而，当在相同条件下通过试图在45分钟内施加10-25％乙醇梯度来减小乙醇浓度时，没有观察到分离和明显拖尾。
用5mM NH4HSO4在pH＝2.5的相似试验使得化合物在柱上完全结合。该试验和相似的试验强烈表明，粘菌素基质而不是硫酸粘菌素应当被用于选定条件的PE1纯化。
如果1，2-丙二醇(1，2-PG)作为乙醇的一部分的代替品被加入，例如，在24％乙醇和20％1，2-PG的浓度水平下，且乙酸水平(pH＝3)增加至约1％，这出人意料地得到了一种RCP约为90％的PE1产品，产率为70％。
在这些初步试验的基础上，得出了这样的结论，即乙酸对树脂(LiChroprep C18)和洗脱液之间的化合物平衡具有积极影响，并且应当使用溶解于稀乙酸的粘菌素基质而不是硫酸粘菌素。然而，使用1，2-丙二醇/乙醇混合物引起该柱材料的明显压降，并且因而认为这种特定的树脂和溶剂混合物不适合按比例放大。
显然，不仅是脂肪酸部分和非-极性氨基酸参与了柱结合，而且氨基-和铵基基团也参与了柱结合。
上述实验给出了一些出人意料的结果，例如，a)EHS-友好的溶剂乙醇作为用于粘菌素反相(RP)HPLC分离的洗脱液是有用的，和b)分离应当在乙酸存在下用粘菌素基质完成，而不是使用用于进一步纯化的硫酸粘菌素。虽然树脂LiChroprep C18表现出有希望分离的特性，但是没有证据表明其适合用于按比例放大。
所列出的可商购色谱介质是的范围很大，但是通过彻底检查和选择，我们成功地确定了一种来自Merck的适合的候选物，即LiChrospher 60 RP-选择B 15μm(C8)。
0.1M乙酸中从5至24％乙醇线性梯度的使用得到了几乎没有拖尾的有希望的分离。0.1M乙酸(pH＝3)中从5％至15％乙醇梯度取得了很好的效果，但仅具有85-90％PE1的RCP并且产率低。
当尝试反相乙醇梯度(即在高乙醇浓度施加而在较低乙醇浓度洗脱)时，出现了重大突破。所进行的具有以下参数的第一试验给出了具有90％-95％PE1和约70％产率的池(pool)。
平衡：5％乙醇在0.1M乙酸中
施加：将110mg粘菌素基质溶解于4ml在0.1M乙酸中的30％乙醇
洗脱液：15％乙醇在0.1M乙酸中，温度为60℃
温度：40℃
洗脱液流速：2.22ml/min
为了在固定相和更快洗脱之间达到粘菌素化合物的平衡，选择较高的温度，但试验显示较高的温度对结果并没有任何显著影响。柱箱和流动相二者的温度均因此而从40°/60°减小到35°/50°，池纯度和产率没有任何显著变化。最后，0.1M乙酸中5至15％乙醇梯度在30°/40°运行具有较好的结果，这证实了反相梯度实际上是相对色谱纯度、产率和拖尾情况出现较大积极变化的原因。
应注意，在开发工作中实施了经修改的分析型HPLC方法，并且该新方法显示出了一些相关物质，f1和e1/e2，以前它们均被主E1峰掩盖。
相关物质f1在PE1峰前面洗脱，而物质e1/e2作为在PE1峰的尾部具有两个左右分裂最大值的双峰洗脱。这两种物质特别地难以从PE1中分离，并且在将来的制备型HPLC方法的优化中构成了纯化的挑战。尤其参见图3和图4，其中PE1和相关物质的分离用示出了作为HPLC流分的函数(function)的组分的分布图来说明。
在图3中，将多粘菌素E1的相对色谱纯度与作为流分数的函数的相关物质进行比较。最难以从PE1中分离的相关物质是e1/e2，而E1-异亮氨酸、f1和e3(在e1/e2之后洗脱)较容易去除。图4示出了从产率角度的结果，其中组分峰的整合作为流分数的函数作图。主要的池典型地跨越流分7至12，但是可以通过缩小流分选择来增加纯度。
实施例-从粘菌素基质中纯化多粘菌素E1的步骤
实施例1-RP-HPLC纯化；小量制备规模
设备：钢柱10×250mm
Figure BDA0000159609900000151
Waters Delta Prep 4000 Prep.Chrom.系统
Waters 4000系统控制器
Waters 486可调吸光度检测器
Waters流分收集器
Merck Hitachi D-2000色谱-积分仪
树脂：LiChrospher 60 RP-选择B Merck No.11023
流速：2.22ml/min.(按比例提高至300×700mm～2L/min)
λ：230nm
AUFS：2(检测器灵敏度～最低水平)
A-缓冲液：在超纯水中12％乙醇(96％)溶解于0.10M CH3COOH中
应用溶胶：通过加入5酸当量的CH3COOH～2.5mmol～0.15ml100％CH3COOH(17M)，将粘菌素基质，600mg～0.5mmol溶解于0.10MCH3COOH中的15ml 24％乙醇(自96％)中；用2M NaOH调节至pH＝7.5；溶液经薄膜过滤(0.45μm)
1)柱的平衡：用A-缓冲液平衡
2)施加：粘菌素乙酸盐溶液(40mg/ml)以2.22ml/min施加，随后施加1ml A-缓冲液通过进料管
3)洗脱：柱子立即用A-缓冲液洗脱，并且在1ml流分～2.22ml中收集流出物
4)柱的洗涤：施加5ml 96％乙醇，随后施加A-缓冲液直到吸收已减小至零水平
5)HPLC分析：稀释样品直到E1的面积达到20-30×106AU；高粘菌素标准典型地达到20×106AU；通过使用粘菌素NovaS(运行30分钟)来分析样品
实施例2-RP-HPLC纯化：中试规模
设备：钢柱50×830mm
Figure BDA0000159609900000161
“Dan-方法”
Waters Delta Prep 4000 Prep.Chrom.系统
Waters 4000系统控制器
Waters 486可调吸光度检测器
Waters流分收集器
Merck Hitachi D-2000色谱-积分仪
树脂：LiChrospher 60 RP-选择B，Merck No：11023，1Kg
流速：65ml/min.(按比例提高至300×700mm～2L/min)
λ：230nm
AUFS：2(检测器灵敏度～最低水平)
A-缓冲液：在超纯水中12％乙醇(96％)溶解于0.10M CH3COOH中
应用溶胶：通过加入5.83酸当量的CH3COOH～245mmol～14.5ml100％CH3COOH(17M)，将粘菌素基质，50g～42mmol(按照原样(as is))溶解于1000ml 24％乙醇(96％)中；用2M NaOH调节至pH＝7.5；溶液使用硅藻土作为助滤剂经薄膜过滤(0.45μm)
离子强度：4-6mS/cm
1)柱的平衡：用A-缓冲液平衡
2)施加：在14分钟内以65ml/min施加粘菌素乙酸盐溶液(48mg/ml)，随后在0.1分钟内施加～43.5g A-缓冲液
3)洗脱：柱子用A-缓冲液洗脱直到吸收已降至渐近线0.010V±10mV，并且在18种流分～585ml持续3分钟收集流出物
4)柱的洗涤：施加24％乙醇和50％1，2丙二醇的混合物200ml(4分钟，50ml/min)，随后施加A-缓冲液直到吸收已减小至零水平
5)HPLC分析：稀释样品直到E1的面积达到20-30×106AU(5×)；高粘菌素标准典型地达到20×106AU；通过使用粘菌素NovaS(运行30分钟)来分析样品。
实施例3-总纯化和最终处理；大规模
硫酸粘菌素单组分(多粘菌素E1)是一种发酵产品，这意味着它最初的样子是发酵液。多粘菌素E1含有各种各样的杂质且从每升含有仅几克多粘菌素E1和相关物质的发酵液中被回收和纯化。
发酵液的回收物包含粘菌素(多粘菌素E1)的沉淀物和相关物质以及通过离心的初级分离物。二次纯化由反相色谱和沉淀构成，就多粘菌素E1而言产生更纯的产物。硫酸粘菌素单组分产物中存在的相关物质和杂质主要是共发酵物质。
在粘菌素的发酵过程中，生成结构上相关组分的复杂混合物，具有每一种多芽孢杆菌菌株的比例特征。例子是：
-脂肪酸链的变化，例如生成多粘菌素E1(具有6-甲基辛酸)或多粘菌素E2(具有7-甲基辛酸)，
-分子中氨基酸的取代，例如如果粘菌素中的D-亮氨酸被D-苯基丙氨酸取代，则生成相关的抗生素多粘菌素B。如果多粘菌素E1中的L-亮氨酸被异亮氨酸取代，则生成多粘菌素E1-异亮氨酸
通过制备型HPLC的纯化
制备以下缓冲液：
缓冲液I：1.6-2M乙醇和0.1-0.15M乙酸。该缓冲液在使用前通过0.45μm滤膜过滤。
缓冲液II：约6.8M 1，2-丙二醇、约4M乙醇和约0.1M乙酸。该缓冲液在使用前通过0.45μm滤膜过滤。
用约40升缓冲液I来平衡体积约48升的HPLC柱(直径30cm)。流速是0.8-1.2l/min(同样的流速被用于所有HPLC步骤)。柱子用约8升缓冲液II，随后用约50升缓冲液I再生或直到UV-信号回到基线。
称量1000-1500g的一批真空干燥的粘菌素基质，并将其悬浮于20-30升4M乙醇中。该悬浮液通过加入0.3M乙酸搅拌30分钟而被溶解。用氢氧化钠将pH调节至约7.5，并且该溶液通过0.45μm薄膜过滤器进行过滤。该粘菌素乙酸盐溶液通过HPLC柱并且结合于树脂。HPLC柱用约160升缓冲液I洗脱。按流分收集流出物。依照预先设定的规则来收集流分，而丢弃其余流分。对于多粘菌素E1而言，从流分中收集纯度至少为92％的部分。多粘菌素E1的浓缩和多余乙醇的去除通过反渗透而完成。该池被浓缩至约50g/l并随后用DI-水(约8体积)渗析。
通过疏水作用色谱法(HIC)的纯化
制备以下缓冲液：
校准缓冲液：约200mM(NH4)2SO4；用稀释的氨水将pH调节至约7
洗脱缓冲液：约200mM(NH4)2SO4；用乙酸将pH调节至约3.7
用250升校准缓冲液来平衡体积约90升的HIC柱(直径35cm)，流速约1.7l/min，随后是约200升洗脱缓冲液，流速约1.0l/min。
通过加入(NH4)2SO4将经过反渗透的粘菌素乙酸盐溶液中的盐含量调至约200mM，并用稀释的氨水将pH调节至约7。该粘菌素乙酸盐溶液的浓度是15-20g/l。该溶液通过HIC柱，流速为950-1050ml/min。洗脱用10倍床体积(bed volume)进行。流出物流分的收集通过PLC自动完成。从每个流分中取得样品并进行分析。依照预先设定规则来收集流分，产生就多粘菌素E1而言纯度为94-98％的批次。多粘菌素E1的浓缩和硫酸铵的去除通过超滤而完成，以达到10-20g/l的浓度。
粘菌素基质单组分的沉淀
溶液用DI-水稀释至10g/l并搅拌直至它均匀。用氢氧化钠将pH调节至9.6-9.8，并且当粘菌素基质单组分沉淀时继续搅拌。沉淀物在压滤机上经过滤被回收。当过滤完成时，用约800升去离子水清洗滤饼，用空气置换。从压滤机中取出粘菌素单组分滤饼并储存于冰箱中。
向硫酸粘菌素单组分的转化
将粘菌素基质单组分悬浮并溶解于DI-水中，同时搅拌。用稀硫酸将pH调节至5.0。该溶液通过0.45μm滤膜过滤。
冷冻干燥、研磨和储存
将经过滤的溶液注入不锈钢冷冻干燥托盘中，并利用PIC控制温度分布在-25℃→+45℃的范围内冷冻干燥约70小时。从冷冻干燥机中取出干燥的产物并研磨以获得所需的颗粒分布。
分析型HPLC方法
方法1：用于从发酵到粘菌素基质的过程控制的HPLC
设备：Waters自动HPLC设备，由以下组成：
泵：型号6000 A/510
注射器：WISP 712 A
检测器：型号441
预过滤器：Guard Pak，Resolve C18(可以省略)
柱：Resolve C18，10×8.5微米或Nova-Pak，4微米
柱配件：RCM 8×10
方法：等度
流动相：
缓冲液：十水硫酸钠16.1g(0.05M)、浓乙酸0.56ml(0.01M)，三乙胺20ml(0.15M)，加水至1000ml。用磷酸将pH调节至2.5。
替代缓冲液：硫酸纳0.04M、甲磺酸0.56M、三乙胺0.087M，pH为3.0。
在使用前，将170g乙腈溶解于缓冲液中制备1000ml。
该溶液用氦气除气15分钟。
分析程序：
流速：1.5ml/min，或者1.0ml/min。
温度：环境温度
注射体积：20微升，或者25微升。
检测：214nm，0.1AUFS或1.0AUFS。
运行时间：30分钟。
标准：硫酸粘菌素的有效标准品，溶解于水以制备成1mg/ml。
标准品：粘菌素基质，在0.1M盐酸中1.0mg/ml。
分析样品：稀释至含有0.5-1mg/ml。稀释剂：3％磷酸，40ml，和乙腈，60ml。如果浑浊则离心。
方法2：用于粘菌素基质以获得最终大批量产物的HPLC
设备：Waters自动HPLC设备，由以下组成：
泵：型号510
注射器：717附加自动取样器
检测器：490E
预滤器：Guard Pak，Nova-Pak，C18
柱：Nova-Pak，C18，604μm，150×4.6mm
柱室：Jones色谱型号7955
试剂：
硫酸钠，无水，预分析
三乙胺，HPLC级
甲磺酸，≥99％
超纯水
缓冲液：硫酸钠，无水，28.4g(0.10M)，三乙胺14.0ml(0.05M)，甲磺酸10.0ml(0.06M)，用超纯水定容至2000ml。
A-洗脱液：50％缓冲液，35％超纯水，15％乙腈。用甲磺酸调节至pH 2.0。
B-洗脱液：50％缓冲液，20％超纯水，30％乙腈。用甲磺酸调节至pH 2.0。
样品制备：
粘菌素乙酸盐：在0.05M乙酸中1-2g/l。搅拌30分钟并通过0.45μm薄膜过滤器过滤。
标准品：
制备两种内部标准品，一种具有高活性(2000μg/mg)而另一种具有低活性(400μg/mg)。
分析程序：
流速：0.8ml/min。
柱温：25℃
检测：214nm
时间常数：1.0秒
AUFS：1.000AU
自动归零：开
Wisp温度：25℃
注射：20μl/次(run)。
梯度程序：
洗脱液A被用作盲样，且从标准品和样品中被去除。
方法3：用于硫酸粘菌素单组分的HPLC
设备：Waters自动HPLC设备，由以下组成：
泵：型号510
注射器：717附加自动取样器
检测器：490 E
柱：Nova-Pak，C18，60
Figure BDA0000159609900000231
4μm，250×4.6mm
柱箱：Jones色谱Model 7955
试剂：
超纯水
乙腈，HPLC级
甲磺酸，≥99％
三乙胺，HPLC级
硫酸钠，无水，预分析
缓冲液：硫酸钠，无水，28.4g(0.10M)，三乙胺14.0ml(0.05M)，甲磺酸10.0ml(0.06M)，超纯水定容至2000ml。该缓冲液通过0.45μm滤膜真空过滤。
A-洗脱液：50％缓冲液，35％超纯水，15％乙腈。用甲磺酸调节至pH 2.0。
B-洗脱液：50％缓冲液，20％超纯水，30％乙腈。用甲磺酸调节至pH 2.0。
样品制备：
硫酸粘菌素单组分：在超纯水中2.8mg/ml。搅拌15分钟，并通过0.45μm滤膜过滤。
分析程序：
流速：1.0ml/min。
检测波长：214nm
柱温：25℃
注射体积：40μl
自动进样器温度：25℃
梯度程序：
Figure BDA0000159609900000241
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Claims (8)

1.通过反相色谱法纯化粘菌素的方法，其特征在于，
粘菌素基质在处于乙酸中的20%-30%的乙醇中上柱
并且
用10%-15%的乙醇洗脱，并且
其中，流动相的pH为7-8。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，上柱的所述乙醇浓度为20%-24%。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，上柱的所述乙醇浓度为24%。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在洗脱液中的所述乙醇浓度为12%。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乙酸浓度为0.1M。
6.根据权利要求1所述的方法，随后进一步是疏水作用色谱法的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流动相的pH为7.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，
上柱的所述乙醇浓度为24%，
在洗脱液中的所述乙醇浓度为12%，
所述乙酸浓度为0.1M，
所述流动相的pH为7.5，并且
固定相为C8-树脂。
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