CN102590418A

CN102590418A - 一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法

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Publication number: CN102590418A
Application number: CN2012100302159A
Authority: CN
Inventors: 孟瑾; 郑小平; 韩惠雯; 王霞; 马颖清; 何亚斌
Original assignee: NTSCHINA CO Ltd
Current assignee: NTSCHINA CO Ltd
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-02-10
Also published as: CN102590418B

Abstract

本发明公开了一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法：(1)将乳制品与水的混合液离心脱脂，去除脂肪得脱脂乳液；(2)过亲和层析柱：脱脂乳液通过预活化的亲和层析柱，用pH为6.8～7.4的磷酸钠缓冲液洗柱，用洗脱液①洗脱，收集洗脱液得进样溶液；该洗脱液①为含1.0mol/L氯化钠的磷酸钠缓冲液，pH为6.8～7.4；(3)进样溶液进行高效液相色谱法检测：高效液相色谱法的洗脱液②由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％的三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，色谱柱为C₁₈色谱柱。该测定方法具有专一性和可重复性，去除其他干扰物质及环境变化影响等优点，降低了检测费用，准确度高，简化了乳铁蛋白检测方法。

Description

一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin LF)又称“乳转铁蛋白”，是一种具有许多生理活性的铁结合性糖蛋白。它广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌或血浆中性粒细胞中。

从营养成分上看，乳清蛋白占母乳总蛋白质的80％左右。这类蛋白质的氨基酸组成全面充分且比例恰当，还含有α-乳白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白等活性成分。其中，乳铁蛋白是乳清蛋白中具有很高营养价值的活性成分。乳铁蛋白最早是由科学家Montreuij和Johansonb于1960年在母乳乳汁中发现。美国乳品协会和一些科学家的研究表明，乳铁蛋白是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。

由于乳铁蛋白的多种特殊功能，已经在许多市售的产品中使用，其中包括婴儿配方奶粉、运动及功能性食品、兽医及饲料类、漱口水和牙膏等个人护理用品。乳铁蛋白在婴儿配方中应用，是从比较母乳及牛乳之间的不同开始的。母乳中乳铁蛋白的浓度为0.20g/100ml，而在牛乳中为0.01g/100ml。在许多国家，乳铁蛋白都已经是市售的一种配料。

乳铁蛋白作为乳清蛋白中的成分，对乳清蛋白的特殊功效有重要意义，特别是添加在婴幼儿奶粉中，对婴儿的健康提供可靠的帮助。乳铁蛋白出现在动物乳，特别是初乳中，为妈咪和婴幼儿提供多种生物功能，尤其是调节免疫和对病原微生物抵御功能。大量研究证明，乳铁蛋白能促进营养成分的吸收、消化，并保护机体面受微生物侵害，促进肠道有益菌生长，为婴幼儿提供了第一道也是最重要的防线。乳铁蛋白是唯一能在肠道内运载铁离子的物质，能显著增强对铁的吸收和利用率。有效预防孕产妇及婴幼儿贫血。

目前测定乳铁蛋白含量的方法有很多种，但大致可以归为几类：一是需要借助抗体，如酶联免疫法、放射免疫扩散法和免疫印记；二是根据不同分子结构的物质对电磁辐射选择性吸收，如紫外分光光度法；三是根据离子迁移速度，如毛细管电泳技术；四是阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定含量。

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)采用ELISA测定乳铁蛋白含量具有灵敏度高、最小检测限低、样品无需纯化等特点但该法受环境和操作人员的影响较大，对于定量重复差；放射免疫扩散法的检测范围有限；准确度不高并且存在一定的放射危害；紫外分光光度法具有快速简便的特点，但误差大；而凝胶色谱法适用于高纯度的样品测定；而用阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定方法，提高了定量的准确性，但此方法的流动相中使用了大量的NaCl，对高压液相色谱仪来讲是最忌讳的，对仪器损害非常大。

因而，探寻一种成本低廉、检测快速、准确、适用于复杂体系乳制品中乳铁蛋白含量的检测方法是研究的首要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了酶联免疫吸附测定法定量重复性差、紫外分光光度法误差大、凝胶色谱法只适用于高纯度样品和高效液相色谱法测定中使用大量NaCl对仪器损害大的缺陷，提供了一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法。该测定方法改进了阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定方法，利用亲和层析柱作为提取样品的工具，使用常用的C₁₈柱进行高效液相色谱测定，测定成本低，准确度和专一度高，大大节省测定时间并且具有很高的回收率。

本发明提供了一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法，其包括下述步骤：

(1)将乳制品与水的混合液离心脱脂，去除脂肪得脱脂乳液；

(2)过亲和层析柱：所述的脱脂乳液通过预活化的亲和层析柱，用pH为6.8～7.4的磷酸钠缓冲液洗柱，用洗脱液①洗脱，收集洗脱液得进样溶液；该洗脱液①为含1.0mol/L氯化钠的磷酸钠缓冲液，pH为6.8～7.4；

(3)将所述的进样溶液进行高效液相色谱法检测：洗脱液②由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％的三氟乙酸水溶液，洗脱梯度如表1所示：

表1

时间	流动相A	流动相B
			0～26分钟	12～18v/v％	88～82v/v％
26～31分钟	80～90v/v％	20～10v/v％
			31～32分钟	85～95v/v％	15～5v/v％
32～36分钟	12～18v/v％	88～82v/v％

色谱柱为C₁₈色谱柱；其中，所述的v/v％为占所述流动相A和流动相B总体积的体积百分比。

本发明中，所述的乳制品为本领域常规的乳制品，较佳地为液体乳或乳粉。所述的液体乳为本领域常规的液体乳，可以为初乳、杀菌乳、酸牛乳或配方乳。所述的乳粉为本领域常规的乳粉，可以为全脂乳粉、脱脂乳粉、调味乳粉或婴幼儿配方乳粉。

步骤(1)中，所述乳制品与水的混合液由所述的乳制品与水混合得到。所述的乳制品为乳粉时，所述乳粉与水的混合比例较佳地为1g乳粉∶10mL水～1g乳粉∶15mL水。所述的乳制品为液体乳时，所述液体乳与水的混合比例较佳地为1g液体乳∶2.5mL水～1g液体乳∶5mL水。

步骤(1)中，所述离心的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述离心的温度较佳地为0～4℃。所述离心的转速较佳地为5000～8000r/min。所述离心的时间较佳地为10～20min。

步骤(2)中，所述的亲和层析柱为含有固相吸附剂的层析柱，较佳地为肝素(Heparin)亲和层析柱。所述的肝素亲和层析柱可为现有的各种型号和规格的肝素亲和层析柱，较佳地为1mL或5mL。本发明优选通用电气(中国)有限公司生产的HiTrap Heparin HP亲和层析柱。

步骤(2)中，所述预活化的亲和层析柱指所述的亲和层析柱经过活化处理。所述的活化处理的条件和方法为本领域常规的条件和方法，较佳地采用pH为6.8～7.4的磷酸钠缓冲液活化所述的亲和层析柱。

步骤(2)中，所述的磷酸钠缓冲液可按本领域常规方法制得，较佳地采用下述方法制备：配制50mmol/L的磷酸氢二钠溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

步骤(2)中，所述的洗脱液①可按本领域常规方法制得，较佳地采用下述方法制备：配制含50mmol/L的磷酸氢二钠和1.0mol/L氯化钠的溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

步骤(2)中，在所述的收集洗脱液后较佳地还进行过滤。所述过滤的条件和方法为本领域常规的条件和方法，较佳地采用水相过滤膜过滤。所述水相过滤膜的孔径较佳地为0.45μm。

步骤(3)中，所述的C₁₈色谱柱可为现有的各种型号和规格的C₁₈色谱柱，如4.6mm×250mm和4.6mm×150mm等径长规格均可适用。本发明优选Agilent Zorabax 300SB-C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm)。

步骤(3)中，所述的洗脱液②较佳地经过预处理。所述的预处理为采用有机相过滤膜过滤流动相A和流动相B。所述有机相过滤膜的孔径在0.45μm以下，但不包括0。

步骤(3)中，所述高效液相色谱法检测的其他条件为本领域的常规检测条件，所述的其他检测条件包括检测波长、柱温、流动相流速和进样溶液的进样量。所述的检测波长较佳地为270～290nm。所述的柱温较佳地为25～30℃。所述流动相A和流动相B的总流速较佳地为0.8～1.0mL/min。所述进样溶液的进样量较佳地为10～50μL。

本发明中，按本领域常识，所述的亲和层析柱在步骤(2)的洗脱完成后用水清洗，置于20％乙醇或0.1％叠定钠水溶液中保存，所述的亲和层析柱可重复使用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、解决了复杂乳制品体系中乳铁蛋白的快速提取和准确定量分析的问题，该法与目前常用的酶联免疫法相比，具有专一性和可重复性，去除了其他干扰物质及环境变化影响等优点，从而降低了检测费用、提高了准确度、简化了乳铁蛋白检测方法。

2、有利于乳铁蛋白在乳制品中的应用，且该法也为其他功能性乳成分的快速定量分析提供了一定的理论依据。

3、在本发明的较佳实施方式中，采用HiTrap Heparin HP亲和层析柱对样品进行分离分析，先将乳铁蛋白固定或吸附在层析介质上，去除变性剂后，乳铁蛋白在介质上成功结合，用pH为6.8～7.4的磷酸钠缓冲液洗柱，去除杂质之后，再将结合的乳铁蛋白用洗脱液①洗脱下来。这种方法避免了乳铁蛋白聚体的形成，所以得率更高，而且无需大量稀释样品，大大节省时间及提高回收率。与常规使用的阳离子交换色谱柱相比，此方法避免了离子强度对于液相色谱的损害，有利于仪器的日常维护。

附图说明

图1为乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。

图2为实施例2中婴儿奶粉中乳铁蛋白检测的HPLC图谱。

图3为HPLC法测定乳铁蛋白质量浓度的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下述实施例中，磷酸钠缓冲液通过下述方法制备：配制50mmol/L的磷酸氢二钠溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

下述实施例中，洗脱液①通过下述方法制备：配制含50mmol/L的磷酸氢二钠和1.0mol/L氯化钠的溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

下述实施例中，所使用的亲和层析柱为通用电气(中国)有限公司生产的规格为1ml的HiTrap Heparin HP亲和层析柱，所使用的色谱柱为安捷伦科技有限公司生产的Zorabax 300SB-C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm)。

实施例1～3的高效液相色谱法的检测条件：

色谱柱：Zorabax 300SB-C₁₈；流动相A：乙腈；流动相B：0.1wt％三氟乙酸水溶液；流动相A和流动相B的总流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；进样体积：20μL；柱温：30℃。

工作曲线的绘制(外标法测定物质含量)：

准确称取乳铁蛋白标准品(其HPLC曲线图见图1)，配制成浓度为10～250μg/mL的乳铁蛋白溶液，用高效液相色谱测定溶液，其在280nm处的吸收峰绘制标准曲线如下：y＝22.011x-4.1677(R²＝1，见图3)。

实施例1生鲜乳中乳铁蛋白的含量测定

(1)准确称取10g生鲜乳样品，使其完全溶解于30mL水中，定容至50ml，然后以8000r/min的离心速度在4℃下离心10min，去除脂肪得脱脂乳液；

(2)过亲和层析柱：采用pH为6.8的磷酸钠缓冲液对亲和层析柱进行预活化，取10ml脱脂乳液过该亲和层析柱，用5mL的pH为6.8的磷酸钠缓冲液洗柱，再用5mL的洗脱液①洗脱，收集洗脱液，用0.45μm孔径的水相过滤膜过滤，得进样溶液；其中，洗脱液①为含1.0mol/L的氯化钠的磷酸钠缓冲液，pH为6.8；

(3)取20μL进样溶液上机进高效液相色谱仪进行梯度洗脱，洗脱梯度如表2所示：

表2实施例1的HPLC梯度洗脱表

时间(min)	流动相A(v/v％)	流动相B(v/v％)
			0-26	12	82
26-31	80	20
			31-32	85	15
32-36	12	88
			36	12	88

采用上述测定方法对同一份生鲜乳样品进行5次测定，对照标准曲线(见图3)，其测定结果如下表3所示：：

表3实施例1的生鲜乳中乳铁蛋白含量的测定结果

序号	峰面积	保留时间(min)	含量(mg/100g样品)
				1	52.13	12.931	22.83
2	51.36	12.931	22.50
				3	53.16	12.931	23.28
4	53.11	12.931	23.26
				5	52.72	12.931	23.09

根据表3结果计算得到的相对标准偏差RSD＝1.44％。

由上式可以看出，相对偏差为1.44％，表明其重现性良好。

实施例2婴儿奶粉中乳铁蛋白的含量测定

(1)准确称取5g婴儿奶粉样品，使其完全溶解于40mL 30℃水中，定容至50ml，然后以5000r/min的离心速度在0℃下离心20min，去除脂肪得脱脂乳液；

(2)过亲和层析柱：采用pH为7.4的磷酸钠缓冲液对亲和层析柱进行预活化，取10ml脱脂乳液过该亲和层析柱，用5mL的pH为7.4的磷酸钠缓冲液洗柱，再用5mL的洗脱液①洗脱，收集洗脱液，用0.45μm孔径的水相过滤膜过滤，得进样溶液；其中，洗脱液①为含1.0mol/L的氯化钠的磷酸钠缓冲液，pH为7.4；

(3)取20μL进样溶液上机进高效液相色谱仪进行梯度洗脱，洗脱梯度如表4所示：

表4实施例2的HPLC梯度洗脱表

时间(min)	流动相A(v/v％)	流动相B(v/v％)
			0～26	18	82
26～31	90	10
			31～32	95	5
32～36	18	82
			36	18	82

采用上述测定方法对同一份婴儿奶粉样品进行5次测定，其HPLC测定结果如图2所示，对照标准曲线(见图3)，结果如下表5：

表5实施例2的婴儿奶粉中乳铁蛋白含量的测定结果

序号	峰面积	保留时间(min)	含量(mg/100g样品)
				1	126.4	12.931	54.08
2	123.0	12.931	52.96
				3	119.6	12.931	51.36
4	113.9	12.931	49.04
				5	120.4	12.931	51.71

根据表5结果计算所得的相对标准偏差RSD＝3.65％。

由上式可以看出，相对标准偏差为3.65％，表明其重现性良好。

实施例3较大婴儿奶粉中乳铁蛋白的含量测定

(1)准确称取5g较大婴儿奶粉样品，使其完全溶解于40mL 30℃水中，定容至50ml，然后以6000r/min的离心速度在4℃下离心15min，去除脂肪得脱脂乳液；

(2)过亲和层析柱：采用pH为7.0的磷酸钠缓冲液对亲和层析柱进行预活化，取10ml脱脂乳液过该亲和层析柱，用5mL的pH为7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，再用5mL的洗脱液①洗脱，收集洗脱液，用0.45μm孔径的水相过滤膜过滤，得进样溶液；其中，洗脱液①为含1.0mol/L的氯化钠的磷酸钠缓冲液，pH为7.0；

(3)取20μL进样溶液上机进高效液相色谱仪进行梯度洗脱，洗脱梯度如表6所示：

表6实施例3的HPLC梯度洗脱表

时间(min)	流动相A(v/v％)	流动相B(v/v％)
			0～26	15	85
26～31	85	15
			31～32	85	15
32	15	85
			36	15	85

采用上述测定方法对同一份较大婴儿奶粉样品进行5次测定，对照标准曲线(见图3)，其测定结果如下表7所示：

表7实施例3的较大婴儿奶粉中乳铁蛋白含量的测定结果

序号	峰面积	保留时间(min)	含量(mg/100g样品)
				1	110.2	12.931	47.44
2	114.5	12.931	49.21
				3	109.6	12.931	48.14
4	113.4	12.931	49.58
				5	112.3	12.931	47.41

根据表7结果计算所得的相对标准偏差RSD＝2.07％。

由上式可以看出，相对偏差为2.07％，表明其重现性良好。

效果实施例1回收率实验

准确称取3份实施例1的生鲜乳10g，使其完全溶解于30mL水中，定容至50ml，分别添加不同质量的乳铁蛋白(具体添加量见表8)，其它步骤同实施例1。按实施例1的高效液相色谱法条件进行回收率试验，分别重复3次。测得实施例1的样品加标回收率分别为98.6％、99.2％和100.4％，RSD分别为0.26％、0.32％和0.61％，结果见表8。

准确称取3份实施例2的婴儿奶粉5g，使其完全溶解于40mL 30℃水中，定容至50ml，分别添加不同质量的乳铁蛋白(具体添加量见表8)，其它步骤同实施例2。按实施例2的高效液相色谱法条件进行回收率试验，分别重复3次。测得实施例2的样品加标回收率分别为98.6％、100.0％和101.1％，RSD分别为2.07％、1.13％和1.43％，结果见表8。

表8实施例1和2中添加乳铁蛋白标准溶液回收率实验结果

Claims

1.一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法，其包括下述步骤：

(1)将乳制品与水的混合液离心脱脂，去除脂肪得脱脂乳液；

(3)将所述的进样溶液进行高效液相色谱法检测：用洗脱液②进行梯度洗脱，洗脱液②由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％的三氟乙酸水溶液，洗脱梯度如下表所示：

时间流动相A 流动相B 0～26分钟 12～18v/v％ 88～82v/v％ 26～31分钟 80～90v/v％ 20～10v/v％ 31～32分钟 85～95v/v％ 15～5v/v％ 32～36分钟 12～18v/v％ 88～82v/v％

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的亲和层析柱为为肝素亲和层析柱；所述的肝素亲和层析柱的规格较佳地为1mL或5mL；所述的肝素亲和层析柱较佳地为HiTrap Heparin HP亲和层析柱；所述预活化的亲和层析柱较佳地为经pH为6.8-7.4的磷酸钠缓冲液活化过的所述亲和层析柱。

3.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测的条件还包括：所述的检测波长为270～290nm，较佳地为280nm；所述的柱温为25～30℃；所述流动相A和流动相B的总流速为0.8～1.0mL/min；所述进样溶液的进样量为10～50μL。

4.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中所述的磷酸钠缓冲液采用下述方法制备：配制50mmol/L的磷酸氢二钠溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

5.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的洗脱液①采用下述方法制备：配制含50mmol/L的磷酸氢二钠和1.0mol/L氯化钠的溶液，用磷酸调节pH至6.8～7.4。

6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述的乳制品为液体乳或乳粉；所述的乳制品为乳粉时，所述乳粉与水的混合比例为1g乳粉∶10mL水～1g乳粉∶15mL水；所述的乳制品为液体乳时，所述液体乳与水的混合比例为1g液体乳∶2.5mL水～1g液体乳∶5mL水。

7.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述离心的温度为0～4℃；所述离心的转速为5000～8000r/min；所述离心的时间为10～20min。

8.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，在所述的收集洗脱液后还进行过滤；所述过滤较佳地采用水相过滤膜过滤；所述水相过滤膜的孔径较佳地为0.45μm。

9.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中所述的C₁₈色谱柱为Agilent Zorabax 300SB-C₁₈色谱柱。

10.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的洗脱液②经过预处理，所述的预处理为采用有机相过滤膜过滤流动相A和流动相B；所述有机相过滤膜的孔径较佳地在0.45μm以下，但不包括0。