CN102230921A - 一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法。即待测试样经二次水充分涡动、超声提取，离心后上清液过滤得试样液；称取γ-氨基丁酸标准品，二次水溶解并定容后作为标准储备液，进一步用二次水稀释为具有浓度梯度的标准使用液；邻苯二甲醛与2-巯基乙醇作为衍生剂，经配备有在线衍生器的高效液相色谱仪对试样处理液进行衍生，外标法定量检测。采用本发明的方法检测食品中γ-氨基丁酸的含量，快速有效，线性范围为0.5-1000mg/L，回收率达到88.2％以上，相对平均偏差(RSD)小于5％。本发明的方法为食品中γ-氨基丁酸含量的检测，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。

Description

一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，特别是涉及一种通过配备在线衍生器的高效液相色谱仪对食品中γ-氨基丁酸的含量进行检测的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)也称氨酪酸，哌啶酸，是一种非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有GABA。GABA是目前医学上研究较为深入的一种重要抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。2009年我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品，但是目前还没有制定食品中γ-氨基丁酸含量的标准检测方法。因此建立一种快速、准确、方便和经济的检测方法，有利于监控γ-氨基丁酸生产厂家产品的添加使用量，从而保障食品安全。

发明内容

目前国家并没有相应标准对GABA进行测定，而现有的方法主要有纸层析柱法、离子色谱法及毛细管电泳法，这些方法存在检出限高，线性范围窄，仪器不普及等缺点，因此，通过摸索缓冲液最佳浓度，衍生溶液的组成及浓度，在线衍生方法和最佳色谱条件而建立一种食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法非常有必要。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

本发明的一种食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法包括如下步骤：

配制0.4mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH＝10.2)：称取硼砂3.43g和硼酸0.25g，加80mL水溶解，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH＝10.20，定容100mL。

配制衍生溶液：称取0.1g邻苯二甲醛(OPA)，加入30μL 2-巯基乙醇，加入甲醇4.0mL，充分溶解，用硼酸盐缓冲溶液定容至5mL。

称取充分混匀的待测试样2.0000±0.1g(精确至0.0001g)，加入纯净水，定容至10mL，充分涡旋混匀后超声提取2min，3000r/min离心5.0min，经0.45μm滤膜过滤后由高效液相色谱进行在线衍生并分析。

称取γ-氨基丁酸标准品，用二次水溶解并定容，作为标准储备液，然后进一步用二次水稀释为具有浓度梯度的标准使用液；

利用高效液相色谱仪对标准溶液和试样处理液进行检测；

计算结果，试样中γ-氨基丁酸的计算公式为：

$X=\frac{c\×V\×1000}{m\×1000}$

式中：

X-试样中γ-氨基丁酸的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c-经查标准曲线计算所得进样液的浓度，单位为(μg/mL)；

V-试样定容体积，单位为毫升(mL)；

m-称样量，单位为克(g)。

优选地，所述缓冲液为硼酸盐缓冲溶液，浓度为0.4mol/L，pH＝10.2。

优选地，所述衍生溶液为OPA与2-巯基乙醇的混合溶液，浓度在20％。

优选地，所述待测试样的衍生方式为在线衍生。

所述利用高效液相色谱仪对试样处理液进行检测的色谱条件为：

色谱柱：Kromasil-100-5C₁₈，4.6×250mm，5μm，或相当型号色谱柱

流动相：流动相A+流动相B，梯度洗脱

流动相A：称取8g结晶乙酸钠于1L烧杯中，加1L二次水溶解，再加入220μL三乙胺，5％醋酸调pH＝7.2，加入5mL四氢呋喃，混合后，过滤备用。

流动相B：称取4g结晶乙酸钠于1L烧杯中，加200mL水溶解，5％醋酸调pH＝7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后，过滤备用。

梯度洗脱程序如下：

序号	Time	％A	％B
				1	0	92	8
2	27.5	40	60
				3	31.5	0	100
5	32.5	0	100
				6	35	92	8
7	42	92	8

流速：1.0mL/min

柱温：40℃

波长：338nm

并根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

本发明的优点是：采用本发明的方法检测食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，快速有效，线性范围0.5-1000mg/L，RSD小于5％，检出限为0.5mg/kg。由此可见，本发明的方法，为检测食品中γ-氨基丁酸的含量，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。

具体实施方式

实施例1，食品中γ-氨基丁酸含量的精密度和回收率检测：

配制0.4mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH＝10.2)：称取硼砂3.43g和硼酸0.25g，加80mL水溶解，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH＝10.20，定容100mL。

配制衍生溶液：称取0.1g邻苯二甲醛，加入30μL 2-巯基乙醇，加入甲醇4.0mL，充分溶解，用硼酸盐缓冲溶液定容至5.0mL。

称取充分混匀的待测试样2.0021g(精确至0.0001g)，加入纯净水，定容至10mL，充分涡旋混匀后超声提取2min，3000r/min离心5.0min，经0.45μm滤膜过滤后由高效液相色谱进行在线衍生并分析。

称取γ-氨基丁酸标准品100.00mg，用二次水溶解并定容至100mL的容量瓶中，混匀，浓度为1000μg/mL的标准储备液，然后再逐级稀释得到浓度为0.1、0.5、1.0、10.0、40.0、200.0μg/mL的标准使用液。

检测仪器为现有的Agilent 1200高效液相色谱仪配备紫外检测器；

检测条件为：

色谱柱：Kromasil-100-5C₁₈ 4.6×250mm，5μm，或相当型号色谱柱

流动相：流动相A+流动相B，梯度洗脱

流动相A：称取8g结晶乙酸钠于1L烧杯中，加1L水溶解，再加入220μL三乙胺，5％醋酸调pH＝7.2，加入5mL四氢呋喃，混合后，过滤备用。

流动相B：称取4g无水乙酸钠于1L烧杯中，加200mL水溶解，5％醋酸调pH＝7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后，过滤备用。

梯度洗脱程序如下：

序号	Time	％A	％B
				1	0	92	8
2	27.5	40	60
				3	31.5	0	100
5	32.5	0	100
				6	35	92	8
7	42	92	8

流速：1.0mL/min

柱温：40℃

波长：338nm

根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

计算结果，试样中γ-氨基丁酸的计算公式为：

$X=\frac{c\×V\×1000}{m\×1000}---\left(1\right)$

式中：

X-试样中γ-氨基丁酸的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c-经查标准曲线计算所得进样液的浓度，单位为(μg/mL)；

V-试样定容体积，单位为毫升(mL)；

m-称样量，单位为克(g)。

经过计算，结果为：

试样中γ-氨基丁酸的含量按公式(1)进行计算，结果如下：

显而易见，本领域的普通技术人员，可以用发明的一种通过高效液相色谱仪在线衍生对食品中γ-氨基丁酸含量进行测定。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围由各权利要求限定。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，其特征在于：所述测定方法包括如下步骤：

配制0.4mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH＝10.2)：称取硼砂3.43g和硼酸0.25g，加80mL二次水水溶解，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH＝10.2，定容至100mL。

配制邻苯二甲醛衍生溶液：称取0.1g OPA，加入30μL 2-巯基乙醇，加入甲醇4.0mL，超声溶解，用硼酸盐缓冲溶液定容至5mL。

称取充分混匀的待测试样2.0000±0.1g(精确至0.0001g)，加入二次水，定容至10mL，充分涡旋混匀后超声提取2min，3000r/min离心5.0min，经0.45μm滤膜过滤后由配备紫外检测器的高效液相色谱仪进行在线衍生并分析。

称取γ-氨基丁酸标准品，用二次水溶解并定容，作为标准储备液，然后进一步用二次水稀释为具有浓度梯度的标准使用液。

利用高效液相色谱仪对标准使用液和试样处理液进行在线衍生处理和检测，外标法定量；

计算结果，试样中γ-氨基丁酸的计算公式为：

$X=\frac{c\×V\×1000}{m\×1000}$

式中：

X-试样中γ-氨基丁酸的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c-经查标准曲线计算所得进样液的浓度，单位为(μg/mL)；

V-试样定容体积，单位为毫升(mL)；

m-称样量，单位为克(g)。

2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，其特征在于：所述0.4mol/L硼酸盐缓冲溶液，在高效液相色谱在线衍生过程中起到良好的缓冲作用。

3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，其特征在于：所述衍生溶液，包括衍生化试剂邻苯二甲醛(OPA)和2-巯基乙醇，OPA的浓度在20％左右，能达到较好的在线衍生效果。

4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，其特征在于：所述利用高效液相色谱仪对试样处理液及标准溶液进行在线衍生，在线衍生的程序如下：

  步骤   目的   吸量(μL)   吸样速度(μL/min)   1   吸缓冲液   5   200   2   洗针   0   200   3   吸样品   1   200   4   洗针   0   200   5   混合三次   6   吸衍生剂   1   200   7   洗针   0   200   8   混合15次   9   吸水   32   200   10   混合5次   11   进样

5.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法对食品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，其特征在于：所述利用高效液相色谱仪对试样处理液进行检测的色谱条件为：

色谱柱：Kromasil-100-5C₁₈ 4.6×250mm，5μm，或相当型号色谱柱流动相：流动相A+流动相B，梯度洗脱

流动相A：称取8g结晶乙酸钠于1L烧杯中，加1L水溶解，再加入220μL三乙胺，5％醋酸调pH＝7.2，加入5mL四氢呋喃，混合后，过滤备用。

流动相B：称取4g结晶乙酸钠于1L烧杯中，加200mL水溶解，5％醋酸调pH＝7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后，过滤备用。梯度洗脱程序如下：

  序号   时间min   ％A   ％B   1   0   92   8   2   27.5   40   60   3   31.5   0   100   5   32.5   0   100   6   35   92   8   7   42   92   8

流速：1.0mL/min

柱温：40℃

波长：338nm

此条件下目标物具有很好的分离效果。