CN102590408A - 一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法，经过专属性和线性考察、精密度、稳定性等一系列考察验证，能够简便快捷的检测冠心宁注射液中的大分子物质；从HPLC图谱中可知所测5批冠心宁注射液样品未检测出分子量高于2500的大分子物质。

Description

一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法

发明领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法。

背景技术

中药注射剂化学成分复杂，种类繁多，本身又多为大分子物质，这些大分子如蛋白质、多肽、糖、鞣质、果胶等既有免疫原性，又具有免疫反应性，因此具有致敏的可能性。中药注射剂直接作用于静脉，起效快，但是一旦有副作用，就会产生严重的后果。2009年7月，国家食品药品监督管理局出台了“中药注射剂安全性再评价质量控制要点”，明确要求对于具体品种的工艺条件下可能存在、而质量研究中未检出的大类成分，应建立排除性检查方法，必要时，应建立高分子量物质检查项。本研究正是基于这一要求展开，建立了一种简便快捷的方法检测冠心宁注射液中的大分子物质，并且对于中药注射剂中的大分子物质的排除性检测方法的确立，目前尚无法规性的方法可参照。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明冠心宁注射液中大分子物质的检测方法为凝胶色谱测定方法，该方法包括如下步骤：

色谱条件：色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.5-0.12ml/min；柱温25-35℃；进样量3-8μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：108-112℃；载气(空气)流速：2.5-3.5ml/min；

精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各0.8-1.2mg/ml的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，进样测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理；

分别精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算相对标准偏差RSD；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，计算右旋糖酐对照品的最低检出限；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后进样测定，计算保留时间的相对标准偏差RSD；

分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，进样测定。

该方法中所述色谱条件优选为：色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量5μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：110℃；载气(空气)流速：3.0ml/min；

该方法中对照品溶液I的制备方法优选为：精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各1mg/ml的溶液，即得对照品溶液I；

依据凝胶色谱的分离原理：相同实验条件下，物质的分子质量越大，保留时间越短；分子质量越小，保留时间越长。蒸发光散射检测器是高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有机酸和甘油三酸酯，和示差检测器相比，不需要平衡过长的时间，操作方便。本发明冠心宁注射液中大分子物质的检测方法经过专属性和线性考察、精密度、稳定性等一系列考察验证，能够简便快捷的检测冠心宁注射液中的大分子物质；从HPLC图谱中可知所测5批冠心宁注射液样品未检测出分子量高于2500的大分子物质。。

下述实验例和实施例用于进一步证明但不限于本发明。

实验例1：

a仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪，Alltech蒸发光散射检测器，Mettler Toledo AB204-L电子天平。

右旋糖酐对照品(相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400中国药品生物制品检定所，批号140646-2000-01)，水为纯净水，冠心宁注射液5批(批号分别为100102、100202、100302、100402、100502，亚宝药业集团股份有限公司提供)。

b方法与结果

色谱条件色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量5μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：110℃；载气(空气)流速：3.0ml/min；

专属性和线性考察精密称取上述5份对照品用水溶液配制成各1mg/mL的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，分别进样，按上述色谱条件测试，图谱见图1，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理，得线性回归方程为：lgM_W＝-0.3368t_R+9.2954，r＝0.9995，测定结果见表1。结果表明：空白对照溶液在相应的保留时间处均无干扰，右旋糖酐标准溶液在相对分子质量2500～21400范围内相对分子质量与保留时间呈良好的线性关系。

表1  5种不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间

精密度考察精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，分别用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.76％，相对分子质量为10000的RSD为0.78％。表明此方法的精密度良好。

最低检出限取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，结果表明，二者在稀释到600倍时，右旋糖酐4600和10000的峰高与基线噪音的比例约为3∶1，故可判断右旋糖酐对照品的最低检出限为3.3μg/ml。

稳定性考察取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.39％，相对分子质量为10000的RSD为0.61％，表明此方法的稳定性良好。

样品测定分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，5μL进样测定，样品色谱图见图2。结果表明，所测5批冠心宁注射液样品的出峰时间均高于18min，未检测出分子量高于2500的大分子物质。

实验例2：用示差检测器方法检测冠心宁注射液中大分子物质的实验

a仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，G1362A示差检测器，Mettler Toledo XS105电子天平。

右旋糖酐对照品(相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400中国药品生物制品检定所，批号140646-2000-01)，水为纯净水，氯化钠为分析纯。冠心宁注射液5批(批号分别为100102、100202、100302、100402、100502，亚宝药业集团股份有限公司提供)，氯化钠注射液(中国大冢制药有限公司)。

b方法与结果

色谱条件色谱柱为Ultrahydrogel 250(7.8mm×300mm)；流动相0.1mol/L氯化钠溶液；流速0.3mL/min；柱温30℃；示差折光检测器40℃；进样量20μL。

专属性和线性考察精密称取上述5份对照品用氯化钠注射液配制成各约1mg/mL的溶液，同时取氯化钠注射液作空白对照溶液，分别进样，按上述条件测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理，得线性回归方程为：lgM_W＝-0.182t_R+8.3137，r＝0.9951，测定结果见表2。结果表明：空白对照溶液在相应的保留时间处均无干扰，右旋糖酐标准溶液在相对分子质量2500～21400范围内相对分子质量与保留时间呈良好的线性关系。

表2  5种不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间

精密度考察精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，分别用氯化钠注射液溶解定容，得浓度为1.94mg/mL和2.06mg/mL的溶液，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为1.05％，相对分子质量为10000的RSD为0.82％。表明此方法的精密度良好。

最低检出限取上述配制的右旋糖酐4600和10000对照品溶液，分别稀释至10倍、120倍、200倍、400倍、500倍，进样分析，结果表明，二者在稀释到500倍时，样品峰消失，故可判断右旋糖酐对照品的最低检出限为约4μg/mL。

稳定性考察取上述两种右旋糖酐对照品溶液，分别放置0、2、4、8h后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.56％，相对分子质量为10000的RSD为0.71％，表明此方法的稳定性良好。

样品测定分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，20μL进样测定。结果表明，所测5批冠心宁注射液样品的出峰时间均高于30min，未检测出分子量高于2500的大分子物质。

c分析与讨论

与本发明检测方法相比，该方法存在以下缺点：示差折光检测器平衡需要较长时间，氯化钠溶液作流动相，对照品和样品的保留时间过长，线性关系r值没有达到0.9995以上，精密度与稳定性考察的RSD值均低于本发明所建立的方法，最低检出限高于本发明所建立的方法。

实验例3：本发明检测方法检测注射用注射用益气复脉中大分子物质实验

a仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪，Alltech蒸发光散射检测器，Mettler Toledo AB204-L电子天平。

右旋糖酐对照品(相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400。中国药品生物制品检定所，批号140646-2000-01)，水为纯净水，注射用益气复脉(冻干)5批(批号分别为20100702、20100802、20100904、20101004、20101102，天津天士力之骄药业有限公司)。

b方法与结果

色谱条件色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.8mL/min；柱温30℃；进样量5μL。

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：110℃；载气(空气)流速：3.0ml/min；

专属性和线性考察精密称取上述5份对照品用水溶液配制成各约1mg/mL的溶液，同时取水溶液作空白对照溶液，分别进样，按上述条件测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理，得线性回归方程为：lgM_W＝-0.3368t_R+9.2954，r＝0.9995，测定结果见表3。结果表明：空白对照溶液在相应的保留时间处均无干扰，右旋糖酐标准溶液在相对分子质量2500～21400范围内相对分子质量与保留时间呈良好的线性关系。

表3  5种不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间

精密度考察精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，分别用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.76％，相对分子质量为10000的RSD为0.78％。表明此方法的精密度良好。

最低检出限取上述配制的右旋糖酐4600和10000对照品溶液，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，结果表明，二者在稀释到600倍时，右旋糖酐4600和10000的峰高与基线噪音的比例约为3∶1，故可判断右旋糖酐对照品的最低检出限为约3.3μg/mL。

稳定性考察取上述两种右旋糖酐对照品溶液，分别放置0、2、4、8h后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果相对分子质量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.39％，相对分子质量为10000的RSD为0.61％，表明此方法的稳定性良好。

样品测定分别取5批注射用益气复脉(冻干)，用水溶液配制成各约1mg/mL的溶液，微孔滤膜滤过，5μL进样测定。结果表明，所测5批注射用益气复脉(冻干)样品的出峰时间均在17min附近，不能清晰的判断样品中是否有分子量高于2500的大分子物质。

c分析与讨论

以上实验结果表明，相比较益气复脉(冻干)样品，本发明检测方法更适合冠心宁注射液中大分子物质的检测。

附图说明

图1：5种不同分子质量右旋糖酐对照品的液相图谱

图2：5批冠心宁注射液的测定色谱图

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：

色谱条件：色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量5μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：110℃；载气(空气)流速：3.0ml/min；

精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各1mg/ml的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，进样测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理；

分别精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算相对标准偏差RSD；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，计算右旋糖酐对照品的最低检出限；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后进样测定，计算保留时间的相对标准偏差RSD；

分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，进样测定。

实施例2：

色谱条件：色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.5ml/min；柱温35℃；进样量8μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：108℃；载气(空气)流速：2.5ml/min；

精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各1.2mg/ml的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，进样测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理；

分别精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算相对标准偏差RSD；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，计算右旋糖酐对照品的最低检出限；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后进样测定，计算保留时间的相对标准偏差RSD；

分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，进样测定。

实施例3：

色谱条件：色谱柱为TSKgel G3000PWXL(7.8mm×300mm)；流动相为水溶液；流速0.12ml/min；柱温25℃；进样量3μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：112℃；载气(空气)流速：3.5ml/min；

精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各0.8mg/ml的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，进样测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理；

分别精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算相对标准偏差RSD；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍、600倍，进样分析，计算右旋糖酐对照品的最低检出限；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后进样测定，计算保留时间的相对标准偏差RSD；

分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，进样测定。

Claims (3)

1.一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

色谱条件：色谱柱为TSKgel G3000PWXL 7.8mm×300mm；流动相为水溶液；流速0.5-0.12ml/min；柱温25-35。；进样量3-8μl；

蒸发光散射检测器条件漂移管温度：108-112℃；载气流速：2.5-3.5ml/min；

精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各0.8-1.2mg/ml的溶液，即得对照品溶液I，同时取水溶液作空白对照溶液，进样测试，以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgM_W为纵坐标进行回归处理；

分别精密称量相对分子质量为4600和10000的右旋糖酐对照品，用水溶液溶解定容，得浓度为1.95mg/mL和2.05mg/mL的溶液，即得对照品溶液II和对照品溶液III，分别连续进样6次，测定保留时间，计算相对标准偏差RSD；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、600倍，进样分析，计算右旋糖酐对照品的最低检出限；

取对照品溶液II和对照品溶液III，分别放置0、2、4、8h后进样测定，计算保留时间的相对标准偏差RSD；

分别取5批冠心宁注射液，微孔滤膜滤过，进样测定。

2.如权利要求1所述的冠心宁注射液中大分子物质的检测方法，其特征在于该方法中所述色谱条件为：色谱柱为TSKgel G3000PWXL7.8mm×300mm；流动相为水溶液；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量5μl；蒸发光散射检测器条件漂移管温度：110℃；载气流速：3.0ml/min。

3.如权利要求1或2所述的冠心宁注射液中大分子物质的检测方法，其特征在于该方法中对照品溶液I的制备方法为：精密称取相对分子质量分别为2500，4600，7100，10000，21400的右旋糖酐对照品5份，用水溶液配制成各1mg/ml的溶液，即得对照品溶液I。

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