CN102586433A - 一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测聋病易感基因12SrRNA1494C>T的荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增12SrRNA1494C>T及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括：基因分型标准物和内标。本发明以12SrRNA1494C>T、Amelogenin基因座为检测对象，对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T及Amelogenin基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。
药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因突变有关，在中国群体中发现了12S rRNA基因1494C＞T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C＞T突变导致的。1494C＞T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。
目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。
采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带荧光标记物的引物对12S rRNA 1494C＞T位点特异性的扩增，并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确，仅需采取少量血样或口腔拭子样本，即可进行检测，采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。
发明内容
本发明目的是提供一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒。
为了实现上述目的，采取的技术方案：一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水；
所述扩增后试剂包括：用于基因分型的对应于12S rRNA 1494C＞T检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标ROX-300；
使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0.2-0.4μM。
使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin基因座。
用于12S rRNA 1494C＞T突变检测的引物为：SEQ NO.01和SEQ NO.02。
SEQ NO.02为掺入了LNA核苷的引物(LNA核苷以斜体字表示)：
SEQ NO.1：5’-AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’
SEQ NO.2：5’-GACACACCGCCCGTCTCT-3’
用于Amelogenin基因座检测的引物为：SEQ NO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ NO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。
所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序：94-98℃ 1-5min；26-32个循环的94-98℃ 15-60s，55-65℃ 15-60s，72℃ 15-60；60℃30-60min。
对于12S rRNA 1494C＞T突变的检出，使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用：指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
附图说明
图1是经修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。
图2是未修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。
图3是经修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。
图4是未修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T检测的引物、用于Amelogenin基因座扩增的引物均采用黄色荧光染料TAMRA标记；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。其中，用于聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T检测的引物使用：经过LNA核苷单体掺入修饰的引物(SEQ NO.2：5’-GACACACCGCCCGTCTCT-3’)和普通引物(SEQ NO.2.0：5’-GACACACCGCCCGTCTCT-3’)进行扩增效果的比较。
1、待测样本100份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对12S rRNA 1494位点进行过测序检测，其中突变样本2份。
2、检材的基因组DNA提取
Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5mL离心管中，加入sdH2O 1mL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5％ Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200μL加入离心管中，振荡数秒，。于56℃水浴保温30min后，振荡数秒。95℃沸水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1 PCR扩增体系：
3.2 PCR扩增程序：
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.2μL分子量内标)×(进样数)+(9.8μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将10μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
5、结论
如图1、2所示，对于男性确诊病例，
掺入了LNA核苷单体的引物SEQ NO.2(本发明试剂盒引物)所得结果(图1)和未经修饰的SEQ NO.2.0引物所得结果(图2)一致，即在各个DNA浓度下均能获得正确的判定结果：12S rRNA 1494C＞T位点判读位置出峰，性别出X、Y双峰，均随DNA浓度的增加峰值增加，具体如下：
如图3、4所示，对于男性正常个体，
掺入了LNA核苷单体的引物SEQ NO.2(本发明试剂盒引物)所得结果(图3)和未经修饰的SEQ NO.2.0引物所得结果(图4)对12S rRNA 1494C＞T位点不一致：前者在各个DNA浓度下均不出峰；而后者当DNA的量大于2ng时，1494C＞T位点判读位置出峰，与测序结果不一致，即使用未经修饰的SEQ NO.2.0引物易出现假阳性的结果。两者对于性别的判定一致：性别出X、Y双峰，均随DNA浓度的增加峰值增加。具体如下：
因此，本发明试剂盒引物能够特异性地检出12S rRNA 1494C＞T位点突变，结果与测序结果一致，不出现假阳性。
以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配 制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。
Claims (7)
1.一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增12S rRNA 1494C＞T及Amelogenin基因座的引物、基因突变位点12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin基因座的基因分型标准物和内标。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于突变热点12S rRNA 1494C＞T检测的引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
SEQ NO.1：5’-AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’
SEQ NO.2：5’-GACACACCGCCCGTCTCT-3’
其中LNA核苷以斜体字表示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述Amelogenin基因座检测的引物为：
SEQ NO.3：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’
SEQ NO.4：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin的检测引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述12S rRNA 1494C＞T检测的引物和用于Amelogenin基因座扩增的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
7.应用权利要求1所述试剂盒检测聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T及Amelogenin基因座；用于12S rRNA 1494C＞T突变检测的引物如SEQ NO.1和SEQNO.2所示；用于Amelogenin基因座检测的引物如SEQ NO.3、SEQ NO.4所示；所述12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
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