CN102565419A - 肌红蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成。本发明具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种肌红蛋白检测试剂盒。
背景技术
肌红蛋白(myoglobin，MB)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白，分子量为17.8kD，由于分子量较小，当心肌或骨骼肌损伤时，MB会从肌肉组织释放到循环血中，并且能经肾小球滤过，出现在尿中。因此血液和尿中MB测定可用于某些肌病和心脏病的诊断，如急性心肌梗死(AMI)、急性肌损伤、急慢性肾衰竭、严重充血性心力衰竭、长时间休克、肌营养不良、肌萎缩和多发性肌炎等疾病。
AMI是一种严重危及人类生命的疾病，目前AMI检测的主要生化标志物有肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDL)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌红蛋白和心肌肌钙蛋白I(cTnI)等，但CK-MB、LDL、cTnT、cTnI在诊断心肌梗死时的敏感性都不如MB高。MB在AMI后2～4h内，血中浓度迅速升高，8～10h后达到最高峰，研究表明MB阴性特别有助于排除AMI，可协助AMI早期诊断。由于MB在血液中的半衰期短，升高后24h内即恢复至正常水平，因此可作为观察有无再梗死及梗死有无扩展的指标。另外，MB还可作为AMI溶栓中评价再灌注与否的较敏感指标。
现有的MB检测方法主要有放射性免疫法、酶联免疫法，化学发光法和酶联荧光分析法。放射性免疫法使用放射性同位素，会造成环境污染；酶联免疫法测定周期长，不适合急诊的快速检测；化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需要专门仪器和专业人员操作，只适用于中心实验室使用，不适合中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。而胶乳增强免疫比浊法操作简单，经济，无污染，可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用，特别是对急诊能实现快速定量检测，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物含量。
而抗体包被到胶乳上，一般可采用物理吸附法和化学偶联法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，从而导致检测结果假阳性或假性升高。目前，采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体会随机偶联到胶乳生物不同部位，将导致抗体损失结合力，增加了抗体用量和生产成本；若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的肌红蛋白检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种肌红蛋白检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中。
所述的肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在R2中的浓度为0.08％～0.28％(即0.08～0.28克/100ml)。
本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配制R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种即可，可以为相同的缓冲液，可以为不同缓冲液。
本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)，其平均粒径在0.01～1.5μm(10～1500nm)之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm(50～500nm)之间。
本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体及单克隆抗体。
在本发明所述的MB检测试剂盒中，还包含MB校准。
本发明所述的试剂R2是用MB抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适量的缓冲液中。
上述步骤(3)中肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08～0.28％即0.08～0.28克/100ml。
本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：
步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳(原料)＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳＝50～250∶100(重量比)；
步骤(2)中高碘酸钠∶步骤(1)中的胶乳(原料)＝0.5～3∶100(重量比)；高碘酸钠和抗体的用量比＝1～15∶10(重量比)
步骤(3)中抗体(氧化后抗体)∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100(重量比)。
本发明所述试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被MB抗体的胶乳颗粒，与标本中MB发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中MB的含量。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
2.本发明采用的MB检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得MB的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
3.本发明试剂盒中的试剂R2的制备是采用一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用定向化学偶联法将MB抗体包被到胶乳颗粒上；本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上，不易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。而且该方法不会发生抗体结合力损失的情况，可大大减少抗体用量，降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1MB检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：
1.MB抗体：多克隆抗体(市售)。
2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为150～250nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(市售)进行实验。
本实施例的主要试剂的配制如下：
试剂R1：含1.5％PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的甘氨酸缓冲液，该试剂为无色透明溶液。
试剂R2：用抗人MB抗体致敏粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下：
1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.1M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；
2.然后加入0.22ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(配制的溶液中EDAC的浓度为10mg/ml)混合完全，室温混和15min；
3.再加入0.88ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(配制的溶液中己二酸二酰肼的浓度为83mg/ml)，4℃反应过夜；
4.然后用0.1M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；
5.取2ml抗体(2mg/ml)溶液，加入0.3ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，
6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4℃反应过夜；
7.然后加入0.32ml 10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；
8.再加入0.4ml 10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；
9.然后用0.15M，pH7.5的甘氨酸溶液洗涤3次，再加入0.15M，pH7.5的甘氨酸溶液(含1％BSA，0.2％NaN3的甘氨酸缓冲液)至胶乳(结合抗体以后的胶乳重量)终浓度为0.18％(质量体积比即0.18克/100ml)。
肌红蛋白校准品：在缓冲溶液中加入不同含量肌红蛋白，除菌过滤，所述的肌红蛋白校准品中肌红蛋白含量控制在0～700ug/L之间，这些校准品均为无色透明液体。
实施例2 MB的测定
检测工具：日立7060型自动分析仪。
分析方法：两点终点法；主波长：570nm，副波长：800nm：样品量：6ul(微升)；R1：200ul；R2：50ul；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度A1；于3～5min时加入R2，于5min后读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
计算方法：多点定标，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
实施例3 MB检测试剂盒性能评价
1.分析灵敏度评估
采用5％牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次，计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告方法的检测限。从表1可见，灵敏度为1.59ug/L。
表1
2.高值线性评估
将1份低值血清(20ug/L)和1份高值血清(800ug/L)按9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶9(样本顺序编号为2～10号，1号样本为未混合前的低值血清)比例混合，制备出10个不同浓度样本，每个样本重复测定2次，从表2可见，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到700ug/L，判定依据r2≥0.990。
表2
| 样本号 | 理论值(ug/L) | 测定值(ug/L) |
| 1 | 20 | 19 |
| 2 | 98 | 97 |
| 3 | 176 | 174 |
| 4 | 254 | 255 |
| 5 | 332 | 330 |
| 6 | 410 | 408 |
| 7 | 488 | 482 |
| 8 | 566 | 563 |
| 9 | 644 | 643 |
| 10 | 722 | 700 |
3.精密度评估
使用2个不同肌红蛋白含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为2.98％和1.59％(见表3)，而批间相对极差为5.8％(见表4)。
表3
| 样品1 | 样品2 | |
| 测定次数 | 20 | 20 |
| 平均值(ug/L) | 156 | 423 |
| 最小值(ug/L) | 149 | 411 |
| 最大值(ug/L) | 164 | 434 |
| 标准差(SD) | 4.648 | 6.750 |
| 变异系数(CV％) | 2.98 | 1.59 |
表4
4.准确性(回收实验)评估
选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份。在其中2份样本中加入不同量的待测物标准，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。对回收样本和基础样本进行3次重复测定分析，取其均值进行计算。(见表5)
表5
5.干扰试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，试验结果表明胆红素、血红蛋白、甘油三酯以及类风湿性因子的浓度分别在30mg/dl、600mg/dl、1000mg/dl以及400IU/ml以下时，对检测结果无显著干扰(以肌红蛋白的回收率在90％～110％之间为准)。(见表6)。
表6
Claims (9)
1.一种肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成。
2.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08～0.28g/100ml。
3.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法。
4.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm。
6.根据权利要求5所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。
7.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中还包含肌红蛋白校准品。
8.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2是用肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒即胶乳中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球，置于适量的缓冲液中。
9.根据权利要求8所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中所述的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳的重量比＝0.5～5∶100，己二酸二酰肼∶胶乳的重量比＝50～250∶100；步骤(2)中所述的高碘酸钠∶步骤(1)中胶乳的重量比＝0.5～3∶100，高碘酸钠∶抗体的重量比＝1～15∶10；步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒的重量比＝2～22∶100，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒的重量比＝25～50∶100。
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