CN102550824B

CN102550824B - 蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法

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Publication number: CN102550824B
Application number: CN 201210012490
Authority: CN
Inventors: 罗宪章; 罗晨曦
Original assignee: Individual
Current assignee: Luo Xianzhang
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2032-01-17
Also published as: CN102550824A

Abstract

本发明涉及蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，以动物蛋白或植物蛋白为原料，用盐酸水解。水解液经粗滤、微滤，滤液经纳滤膜分离系统脱酸，脱酸后的料液经超滤分离提纯。得到分子量小于1000Dalton的小肽和氨基酸，与微量元素螯合生成小肽氨基酸微量元素螯合物。本发明适合工业化生产，生产周期短，产品收率高，生产过程无三废，产品具有良好的化学稳定性，营养丰富，容易消化吸收，抗干扰，无刺激，具有改善机体免疫功能作用，是理想的食品营养强化剂和饲料添加剂。对于促进饲料工业及养殖业的发展，增进禽畜水产品的安全性，维护人类健康，具有积极而深远的意义。

Description

蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法

技术领域

本发明属于蛋白质的加工技术，同时涉及膜分离技术领域。

背景技术

蛋白质水解产物为胨、肽等，最终产物为氨基酸。肽是氨基酸的线性聚合物。通常把由2～12个氨基酸残基形成的直链肽称为低聚肽，也称为小肽、短肽、微肽，超过12个而不多于20个氨基酸残基的称寡肽，含20个以上氨基酸残基的称为多肽。现代科学研究发现，蛋白质在消化道中的消化终产物往往大部分是小肽而非游离氨基酸。小肽能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环，直接参与组织蛋白质的合成。某些具有特殊生理活性的小肽能够参与机体生理活动和代谢调节，提高动物机体的免疫能力。由于小肽结构的被阐明，生物技术、化学合成和基因工程的发展，小肽的生产和工艺有了许多改进和创新。目前，国内外生产小肽的方法主要有蛋白质降解法、化学合成法和生物工程法。生物工程法是采用DNA重组技术，从动、植物基因组中分离出带有目的基因的DNA片段，克隆到适当的载体，用特定方法将其导入受体细胞，通过细胞表达获得所需要的肽。或将外源基因插入到吞噬体基因序列之中，使肽以融合蛋白形式表达在吞噬体表面，经加工纯化获得产品，目前仅局限于多肽的生产。化学合成法有液相法和固相法。液相法不适合反应中间体溶解度较低的情况。固相法是把要合成的肽其中一端的氨基酸羧基、氨基或侧链基附着在固体载体上，然后从氨基端或羧基端逐步增长肽链的方法。优点是产品易于纯化，并可实现自动化。缺点是在肽键形成过程中产生消旋作用，产率低，成本高。蛋白质降解法是目前生产肽的主要方法，其中又分为酶解法、微生物发酵法、碱解法和酸解法。酶解法是以优质蛋白为底物，运用蛋白酶的酶解内剪切作用生产肽，生产工艺成熟。缺点是生产周期长，三废多，水解度和酶解过程的重复性难以控制，特别是任何酶制剂和酶解条件都不可避免使产品带有严重苦味，影响动物采食量。微生物发酵法是把蛋白酶的发酵生产和酶解生产结合在一起生产肽的方法。优点是降低了生产成本，产品有发酵香味。缺点是产品属多肽范畴，菌种的筛选、保藏、培养、活化、传代等操作烦琐，接种的菌种种类、总量、比例、底物浓度以及发酵条件难以控制。碱水解法由于引起氨基酸的破坏和产生消旋作用，一般不被采用。酸水解除破坏色氨酸，含硫氨基酸部分被氧化外，不会引起氨基酸的消旋作用，蛋白降解为肽的速度快，反应完全。但脱酸的关键技术难于突破，有的采用中和法去酸，然后电渗析脱盐，不但耗电多，而且脱盐不彻底，严重影响产品质量。

小肽和氨基酸用作饲料添加剂，能显著提高饲料转化率，改善动物生产性能，降低养殖成本。但动物生长必需的微量元素，都是单独添加。作为第一代的无机盐，已逐步被市场淘汰，第二代有机酸盐类生物学效价低，化学稳定性不好。第三代单一氨基酸螯合盐化学稳定性好，生物学效价提高。但由于同种氨基酸相互竞争共同吸收点位而发生拮抗作用，吸收速度慢，载体易饱和，因而达不到最理想的效果。为了促进饲料工业和养殖业的健康发展，满足对新饲料添加剂日益增长的需求，迫切需要研究和开发一种营养性、功能性兼备、化学稳定性好、生物学效价高、易消化吸收、抗干扰、无刺激、无毒害作用的新型高效的绿色饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供一种新饲料添加剂——小肽氨基酸微量元素螯合物的生产方法。本发明采用的技术方案是，蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，以动物蛋白或植物蛋白为原料，所述动物蛋白如用脱脂血粉或蚕蛹等，所述植物蛋白如豆粉、豆粕等。采用盐酸水解。水解液先粗滤，再微滤，滤液经预处理后用纳滤膜分离脱酸；脱酸后的水解液用超滤膜分离提纯，截留分子量大于1000Dalton的多肽和部分水解蛋白，得到分子量小于1000Dalton的小肽和氨基酸的混合物；再采用螯合技术，使动物生长所必需的微量元素金属离子与小肽和多种氨基酸发生配位反应，生成具有环状结构的小肽氨基酸微量元素螯合物，用作饲料添加剂。

作为本发明的一种优选，所述蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法包括以下步骤：

一、盐酸水解：将纯度至少是食品级的盐酸用去离子水稀释成重量百分比4～20％浓度的盐酸溶液，蛋白质原料与所述盐酸溶液的重量比为1∶4～5，水解温度100～120℃，搅拌，水解时间24～48h，用TCA法测定水解度；

二、过滤：盐酸水解完毕后得到的料液趁热过滤，先用耐酸板框压滤机粗滤，滤膜是由两层尼龙布强化固定的加厚滤纸，再进行微滤，微滤的过滤孔径不大于0.5μm；

三、预处理：过滤后的料液输入预处理系统，截留由于管路清洗不彻底或误操作而进入循环桶的异物，以保护膜元件；

四、纳滤脱酸：经预处理后的料液进入一级循环装置，送入一级纳滤膜分离系统进行分离，纳滤膜分离孔径为允许分子量30～70Dalton的物质通过，小于膜分离孔径的盐酸和水在压力作用下穿透膜表面形成的一级透析液进入浓盐酸回收装置收集；小肽、多肽和部分水解蛋白被膜截留，无法穿透过膜表面，从而形成截留液，返回到一级循环装置中继续循环分离，待一级循环装置中的料液PH值为1-2时，将料液送入二级循环装置，加去离子水稀释后，送入到二级纳滤膜分离系统再次进行循环分离，直到料液PH值达到6.5以上接近7为止，脱酸后的料液送入25±5℃保温循环装置中，二级透析液进入稀盐酸回收装置收集；

五、超滤分离：保温循环装置中的料液送入超滤分离系统进行分离提纯，超滤膜切割分子量为1000Dalton，分子量≤1000Dalton的小肽和氨基酸在压力作用下通过柱壁孔径形成超滤液，分子量大于1000Dalton的多肽和部分水解蛋白以浓缩液形式返回保温循环装置中，经过循环运转，保温循环装置中的料液被分成超滤液和浓缩液；

六、小肽和氨基酸与微量元素的螯合：超滤液进入螯合反应釜，按配比分别加入纯度至少为饲料级的微量元素，搅拌，控温80～90℃，螯合时间4～5h，用凝胶过滤色谱法测定螯合率，螯合完毕，经检验、灭菌、防腐处理后灌装入库。所述防腐处理优选采用0.5～1‰双乙酸钠。

工艺流程说明：

1原料要求：蛋白质原料必须新鲜、干燥、无霉变、无杂质、血粉、蚕蛹、豆粉等先行进行脱脂处理。盐酸纯度至少为食品级，最好用化学纯和分析纯盐酸，含量36～38％，水为去离子水。

2盐酸水解：盐酸用去离子水稀释成4～20％重量百分比浓度。蛋白质原料与盐酸溶液的重量比为1∶4～5，水解温度100～130℃，水解时间24～48h。用TCA法测定水解度。优选在电加热搪瓷反应釜中进行，反应釜配备摆线减速机、框(锚)式搪瓷搅拌器，搅拌转速85min，还备有热电偶控温装置和盐酸、水蒸汽冷凝回流装置。

3过滤：水解结束时开启放料阀，放出料液，趁热过滤。先粗滤，粗滤采用耐酸板框压滤机，滤膜是由两层尼龙布强化固定的加厚滤纸，滤除水解液中的较大颗粒。使用板框压滤机前，先用去离子水从过滤液进口通道压入清水，保证除滤清液外没有水从其他处漏出，以证明板框压滤机状况良好。料液经粗滤后再进行微滤，微滤压缩机采用过滤孔径为0.5μm滤芯，优选石英或陶瓷滤芯，滤除≥0.5μm的微粒，以保护膜元件。使用微滤压缩机前，先将石英或陶瓷滤芯放入5％NaoH稀溶液中进行清洗，然后用去离子水冲净，以保证最好的过滤效果。粗滤和微滤后的滤渣用KOH溶液中和后作有机肥。

4预处理：微滤后的料液用输料泵输入料液桶中，料液桶底部与纳滤膜分离系统处于同平面。料液进入料液桶后，然后由输料泵将料液抽吸到预处理系统中，截留由于管路清洗不彻底或误操作而进入循环桶的异物，以保护纳滤膜或超滤膜等膜元件。当料液的PH值超过膜元件的耐酸极限时，需加入去离子水搅拌以调节PH值。

5纳滤膜分离脱酸：料液经预处理进入一级循环桶后，由循环泵泵入到一级膜分离系统中进行分离，小于膜分离孔径的盐酸和水等，在压力作用下，穿透过膜表面，被分离开来形成了透析液，进入到浓盐酸回收桶中。而料液中大于膜分离孔径的物质，如各种氨基酸、小肽、多肽和部分水解蛋白被膜截留，无法穿透过膜表面，从而形成截留液。截留液返回到一级循环桶中继续进行循环。待分离到一定程度，用输料泵将一级循环桶中的料液泵入二级循环桶中，加去离子水进行稀释后，由循环泵泵入二级膜分离系统中进行再分离。料液中残留的盐酸、水等在压力作用下穿透过膜表面，被分离开来形成透析液进入到低浓度盐酸回收桶中收集。而料液中的各种氨基酸、小肽、多肽和部分水解蛋白被膜截留，无法穿透过膜表面，从而形成了截留液。截留液返回到二级循环桶中继续循环，直到料液内的盐酸几乎完全被回收(料液PH值达到6.5以上接近7)。回收的浓盐酸循环利用，作为下一次蛋白质原料水解时的用酸。回收的稀盐酸用作下次水解时的配料水和膜清洗用酸。

6超滤膜分离提纯：脱酸后的料液由输料泵送到25±5℃保温循环桶中，用循环泵将料液压至超滤分离系统进行分离提纯，超滤分离系统优选采用不锈钢外壳的中空纤维超滤机组，机组工作压力不大于0.6Mpa，中空纤维超滤膜内外两侧压差不大于0.3Mpa。以提高生产速度。中空纤维超滤膜的孔径大小允许分子量≤1000Dalton的小肽和氨基酸通过，在压力作用下，通过柱壁孔径形成超滤液流出，进入不锈钢螯合釜。分子量＞1000Dalton的多肽和部分水解蛋白不能通过纤维柱壁孔径，只能顺纤维柱心流动，以浓缩液形式返回保温循环桶中。经过循环泵的连续运输，保温循环桶中的料液不断通过中空纤维柱的超滤作用，使料液最后被分成超滤液和浓缩液。浓缩液进入储料桶，用作多肽蛋白饲料。7螯合：小肽氨基酸混合物全部进入螯合反应釜中，螯合反应釜优选带有搅拌装置(搅拌转速85r/min)和热电偶控温装置的不锈钢螯合釜，按配比加入纯度至少为饲料级的微量元素，最好为化学纯或分析纯，控温80～90℃，螯合时间4～5h，用凝胶过滤色谱法测定螯合度。所述配比应按照2009年6月18日国家农业部公告第1224号《饲料添加剂安全使用规范》中微量元素用量的要求。

8产品检测

8.1游离氨基酸含量的测定按NY1429-2007附录A氨基酸自动分析仪法的规定执行。

8.2小肽含量的测定，目前尚无国家标准和行业标准。但可如下进行检测：取超滤液100mL，测其比重后，倒入旋转蒸发仪的经105℃烘箱中烘至恒重的盛液瓶中，然后进行减压浓缩，最后放入105℃烘箱中烘干至恒重。可计算出溶剂(水)的质量和干物质小肽和氨基酸混合物的质量。而游离氨基酸含量已通过氨基酸自动分析仪法测得，故可得出干物质中小肽的质量和重量百分浓度。

8.3平均肽链长度的测定，测定平均肽链长度需要测定α-氨基酸(α-NH₂-N)的含量和总氮(TN)含量。用甲醛滴定法测定α-NH₂-N含量，总氮用凯式定氮法测定。然后计算平均肽链长度，公式如下：

9包装：小肽氨基酸微量元素螯合液经高温瞬间消毒灭菌后，添加0.5～1‰双乙酸钠，用25kg聚乙烯塑料桶灌装入库。

本发明技术方案带来的有益效果：

根据已有文献报道，现有技术有关小肽制备的生产方法都属酶水解法。但任何酶制剂和酶解条件都不可避免地使产品带来严重苦味，影响动物采食量，增加脱苦工序将提高生产成本，同时酶解法生产周期长，三废多，水解度和酶解过程的重复性难以控制。本发明采用酸水解法，水解速度快，生产周期短，水解时间、温度、原料配比等都能自动控制。酸水解过程产生麦拉德反应，生成浓香味风味物质，能提高动物采食量。目前国内一些厂家采用中和法去酸，然后用电渗析法脱盐，脱盐率最高为90％左右，残留盐分多，严重影响产品质量。同时电渗析耗电量大。本发明采用纳滤膜分离技术脱酸使酸回收循环利用，杜绝了环境污染，同时纳滤膜分离脱酸技术原理近似机械筛分。由于是低压反渗透，耗电少，脱酸完全彻底(PH接近7)是蛋白质酸水解法脱酸关键技术的突破。

目前市场上很多小肽饲料和饲料添加剂并不符合小肽的定义，简单地把寡肽甚至分子量较小的肽统称为小肽，忽略了小肽和寡肽、多肽的区别，引起市场混乱，小肽产品良莠不齐。本发明采用超滤膜分离提纯，使分子量≥1000Dalton的寡肽、多肽等大部分被截留，从而提高了产品中的小肽含量。

小肽氨基酸微量元素螯合物是第三代新型微量元素饲料添加剂，是动物生长所必需的微量元素与小肽、短肽、氨基酸发生配位反应生成的具有环状结构的化合物：

目前市场上作为第三代微量元素氨基酸螯合盐如赖氨酸亚铁，赖氨酸硒、蛋氨酸铜等都是单一的氨基酸螯合物，其化学稳定性比第二代有机酸盐如富马酸亚铁、柠檬酸锌、葡萄糖酸铜等好，生物学效价也较高。但由于同种氨基酸相互竞争共同吸收点位而产生拮抗作用，导致吸收速度慢，载体易饱和。近年来，国内外动物营养学家研究发现，动物机体内的微量元素金属离子大部分以蛋白盐形式存在，而小肽氨基酸微量元素螯合物接近于动物体内天然形态的微量元素存在形式。从吸收机理看，小肽氨基酸微量元素螯合物比单一氨基酸螯合盐表现出更多的优势：其一，由于小肽在组成的氨基酸数量相同时，其等电点(P^I值)相近，这就使得金属离子与小肽螯合时，形式多样，进入动物机体内“靶位”较多，不易饱和；其二，吸收点位多，无拮抗，吸收速度快；其三，合成蛋白质速度快，耗费能量少；其四，在满足机体生理机能需要后，剩余的小肽氨基酸微量元素螯合物不会被机体代谢，而是会与体液中将要被代谢掉的氨基酸或肽片段结合，组成蛋白质，在畜、禽或水产动物肌肉组织沉积或沉积到禽蛋之中，从而改善和提高生产性能。因此，小肽氨基酸微量元素螯合物具有良好的化学稳定性，生物学效价高，易消化吸收，抗干扰，无刺激，无毒害作用，而且部分功能性小肽氨基酸微量元素螯合物还具有一定的杀菌和改善机体免疫功能的作用，对提高动物生产性能和抗应激能力等具有重要作用，是一种较理想的新型的高效的绿化饲料添加剂。

下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

附图为本发明具体实施例的工艺流程框图。

具体实施方式

参见附图，反映本发明的一种具体实施方式，设备包括：配备热电偶控温装置、蒸汽冷凝回流装置和框(锚)式搪瓷搅拌器的电加热搪瓷反应釜；配备热电偶控温装置和框(锚)式搅拌器的电加热不锈钢反应釜；耐酸板框压滤机；0.5μm孔径陶瓷或石英滤芯的微滤压缩机；分离孔径为分子量30～70Dalton的两级纳滤膜分离装置和分离孔径为1000Dalton的中空纤维超滤机组；不锈钢料液桶、循环桶、回收桶、清洗桶和卫生型灭菌储罐；不锈钢输料泵、循环泵、反冲洗泵以及相应的卫生型管路系统。所述各不锈钢设备优选304或316L不锈钢型材制备。

所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法包括以下各步骤：

(1)水解：将新鲜干燥、无霉变、无杂质的脱脂血粉300kg倒入电加热搪瓷反应釜中，从备料桶抽取已配好的质量百分比浓度6％(波美度3.9)盐酸溶液注入反应釜，同时开启搅拌器，转速85r/min，待流量计读数为1200L时关闭输酸泵。热电偶控温110℃，当温度上升到100℃时，开启回流冷凝器冷却水开关，水解达24h后，每半小时抽样一次，用TAC法进行中间检测，并作好记录。

(2)过滤：蛋白质酸水解完毕，关闭电源和冷却水开关，开启反应釜放料阀，放出料液，趁热过滤。先用耐酸板框压滤机粗滤，滤液再通过微滤压缩机微滤，微滤后的料液用输料泵输入料液桶，滤渣用KOH溶液中和后作有机肥。放料完毕，用高压喷枪将90℃左右的热水冲洗反应釜。

(3)预处理：将去离子水注入料液桶，搅拌调节PH后，由输料泵输入预处理系统，截留异物后进入一级循环桶中。

(4)脱酸：开动循环泵，将一级循环桶中的料液泵入一级纳滤膜分离系统(即图中一级NF分离系统)进行脱酸，脱出的酸(透析液)进入浓盐酸回收桶收集循环利用，截留液返回到一级循环桶继续循环脱酸。用数显PH计监测料液PH值，并作出记录。待料液PH＝1～2时，用输料泵将一级循环桶中的料液泵入二级循环桶，加去离子水搅拌稀释料液后，由循环泵泵入二级纳滤膜分离系统(即图中二级NF分离系统)再进行循环脱酸。脱出的酸(透析液)进入稀盐酸回收桶收集，用作下一批次蛋白质水解时的配料水和膜清洗用酸。当料液PH值达到6.5以上时，停止脱酸，由输料泵输入25±5℃保温循环桶，同时对纳滤膜一、二级分离系统进行反冲洗。

(5)分离提纯：保温循环桶中的料液加去离子水搅拌稀释后，由循环泵泵入超滤分离系统进行循环分离提纯。分子量小于1000Dalton的小肽氨基酸在压力下通过中空纤维柱壁孔径形成超滤液，陆续进入304不锈钢反螯合釜中，浓缩液进入储料桶收集，用作多肽蛋白饲料。

(6)螯合：开启螯合釜电源，待料液温度升到80℃时，按配比将饲料级或化学纯和分析纯的微量元素分别加入到螯合釜中，搅拌转速85r/min，控温80～90℃，维持4～5h，用凝胶过滤色谱法测定螯合率。

(7)检测、包装：经过上述工序得到小肽氨基酸微量元素螯合物450升，经检测、高温瞬间消毒灭菌后，添加0.5～1‰双乙酸钠，用25kg聚乙烯塑料桶灌装入库。

Claims

1.蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，以动物蛋白或植物蛋白为原料，采用盐酸水解；水解液先粗滤，再微滤，滤液经预处理后用纳滤膜分离脱酸；脱酸后的水解液用超滤膜分离提纯，截留分子量大于1000Dalton的多肽和部分水解蛋白，得到分子量小于1000Dalton的小肽和氨基酸的混合物；再采用螯合技术，使动物生长所必需的微量元素金属离子与小肽和多种氨基酸发生配位反应，生成具有环状结构的小肽氨基酸微量元素螯合物，用作饲料添加剂；该方法包括以下各步骤：

一、盐酸水解：将纯度至少是食品级的盐酸用去离子水稀释成重量百分比4～20%浓度的盐酸溶液，蛋白质原料与所述盐酸溶液的重量比为1:4～5，水解温度100～120℃，搅拌，水解时间24～48h，用TCA法测定水解度；

六、小肽和氨基酸与微量元素的螯合：超滤液进入螯合反应釜，按配比分别加入纯度至少为饲料级的微量元素，搅拌，控温80～90℃，螯合时间4～5h，用凝胶过滤色谱法测定螯合率，螯合完毕，经检验、灭菌、防腐处理后灌装入库。

2.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，所述盐酸水解在电加热搪瓷反应釜中进行，反应釜配备热电偶控温装置、蒸汽冷凝回流装置、框式或锚式搪瓷搅拌器。

3.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，所述微滤采用0.5μm孔径陶瓷或石英滤芯的微滤压缩机；粗滤和微滤后的滤渣用KOH溶液中和后作有机肥。

4.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，纳滤脱酸所得盐酸回收循环利用，稀盐酸回收装置收集的二级透析液用作下一批次蛋白原料水解的配料水和膜清洗用酸；浓盐酸回收桶收集的一级透析液适当补充浓盐酸后，用作下一批次蛋白酸水解的原料。

5.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，超滤分离采用不锈钢外壳的中空纤维超滤机组，机组工作压力不大于0.6Mpa，中空纤维超滤膜内外两侧压差不大于0.3Mpa。

6.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，小肽和氨基酸与微量元素的螯合反应在电加热不锈钢反应釜中进行，反应釜配备热电偶控温装置、框式或锚式搅拌器。

7.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，所述浓缩液由储料装置收集，用作多肽蛋白饲料。

8.如权利要求1所述的蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法，其特征在于，采用0.5～1‰双乙酸钠进行防腐处理。