CN102485892A - 猪gigyf2基因中一个可用于溯源的snp标记及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪GIGYF2基因中一个可用于溯源的SNP标记及其检测方法。所述的SNP标记位于猪GIGYF2基因中一段基因组DNA片段中，是通过DNA池(pool)测序获得。所述的猪GIGYF2基因中一段基因组DNA片段，如SEQ ID NO 1所示，共452bp，包含部分23内含子，且其第187位碱基处有一个碱基突变187A→187C。在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析本发明的SNP标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，初步判定本发明的SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
Description
技术领域
本发明属食品安全领域，具体涉及一种猪GIGYF2基因中一个可用于溯源的SNP标记及其检测方法。
背景技术
随着生活水平和保健意识的提高，人们越来越注重食品安全问题。猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，如何确保其安全卫生，保障消费者的身体健康和生命安全已成为全球性的热点问题。世界各国政府纷纷采取一系列的技术措施来强化对肉产品的安全管理，以期最大程度上减少食品安全事件的发生。我国各大城市也纷纷建立了肉产品的追溯系统，通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径。更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。
但是我国肉产品追溯系统所采用的标签技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点；而国外发达国家所采用的DNA溯源技术是基于个体DNA指纹图谱的生物学技术，有着绝对的不可更改性和唯一性，不受人为因素影响。而且因为DNA溯源技术容易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。
DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。
AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，一股表现为二等位基因，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。
但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一股的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征：(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小；(3)杂合度大于等于0.3。
在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，但是这些SNP标记往往集中分布在某些染色体上，如1号染色体，12号染色体等，而另外部分染色体，如5号，8号，14、15号染色体等则缺乏SNP标记，因此为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要求，我们进行新SNP标记的研究工作。
猪的GIGYF2基因位于猪的15号染色体，人类的GIGYF2基因位于第二号染色体上，由31个外显子和30个内含子组成，包含4个剪切体。研究表明GIGYF2蛋白参与酪氨酸受体信号传导途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪GIGYF2基因中一个可用于溯源的SNP标记及其检测方法。本发明的SNP标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA溯源及其检测，特别是用于猪肉产品的安全性溯源。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述的SNP标记，位于猪GIGYF2基因一段基因组DNA片段中，是通过DNA池(pool)测序获得，并在包括10个猪品种或品系的试验群体(共计213个个体)中，分析该SNP标记SNP标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
所述的猪GIGYF2基因一段基因组DNA片段，如SEQ ID NO 1所示，共452bp，包含部分23内含子，且其第187位碱基处有一个碱基突变187A→187C。在该DNA片段中，其A等位基因只有452bp一个位点，C等位基因有187bp和265bp两个位点，这两个等位基因可组成三种基因型AA，AC，CC。
所述的SNP标记的检测方法，采用PCR-RFLP方法进行，具体包括以下步骤：
(1)构建猪的DNA池(pool)；
(2)设计正、反向引物分离GIGYF2基因的DNA片段，测序并分析；
(3)突变位点检测方法的建立；
(4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计213个个体；
(5)检测SNP标记在试验群体的分布，统计分析判断是否适用于猪肉产品的DNA溯源。
其中，上述检测方法中，分离GIGYF2基因的DNA片段的正、反向引物序列分别如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示。
本发明采用DNA池检测到猪GIGYF2基因中存在的SNP标记，在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1
SNP标记的查找
(1)DNA池(pool)的构建
分别随机采集杜洛克猪、申农猪个体各2头(不分性别)的耳组织，提取DNA后，等量吸取4个个体的DNA放入同一离心管中，混匀待用。
(2)引物设计
以猪GIGYF2基因的cDNA序列(Genbank：NW 001885690)为模板，设计引物分离猪GIGYF2基因(以一头申农猪的DNA为PCR扩增的模板)，引物如下：
正向引物：5′-TTTCTCCCTAAGTCGTCG-3′(参见序列SEQ ID No 2)
反向引物：5′-CGTGCTGCTAAGTTTCTA-3′(参见序列SEQ ID No 3)
PCR反应总体积为20μl，其中猪GIGYF2基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP(上海生工生物公司)终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega公司)。
PCR扩增程序为：94℃4min，然后循环30次94℃30s，56℃退火30s，72℃30s，最后72℃延伸10min。
PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)测序分析
将得到的猪GIGYF2基因PCR产物进行纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化，送到上海生工生物有限公司测序。
经测试，该经拼接后的猪GIGYF2基因的DNA片段为452bp，其序列如SEQ ID No 1所示。经分析发现该DNA片段的第187碱基处存在一个碱基突变(187A-187C)，通过分子生物学软件分析，发现该第187碱基处的碱基突变导致Eco31I-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)多态性。
(4)RFLP检测方法的建立
酶切反应总体积10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶Eco31I为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，37℃水浴6h，称取0.6g琼脂糖溶于15.75ml DEPC(上海生工生物公司)处理水中，稍冷却(60℃)，加入5ml的5×甲醛凝胶电泳缓冲液和4.25ml的37％甲醛溶液，混匀制胶，电泳后检测酶切结果。结果发现：该DNA片段中，A等位基因只有452bp一个位点，C等位基因有187bp和265bp两个位点，这两个等位基因可组成三种基因型AA，AC，CC。
本发明的SNP标记具体是位于序列SEQ ID NO 1中的第187位碱基，其发生A→C的替代，可以用PCR-Eco31I-RFLP方法进行检测。
实施例2
等位基因的分布情况
(1)试验群体的设计
试验组：采集皮特兰(24头)、申农(32头)、大申(31头)、皮申(10头)、长申(26头)、皮大申(19头)、长大申(25头)、杜大申(7头)、杜皮申(8头)和杜皮大申(31头)个体的耳组织，提取DNA，共计213个DNA样本。
试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。
(2)基因型检测
利用正向引物：5′-TTTCTCCCTAAGTCGTCG-3′(参见序列SEQ ID No 2)
反向引物：5′-CGTGCTGCTAAGTTTCTA-3′(参见序列SEQ ID No 3)
进行扩增，用相同的RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。
(3)统计分析
记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表1所示。
表1
分析该SNP标记位点等位基因的分布情况，发现该分子标记除了在培育品种皮申中A等位基因频率和C等位基因频率相同外，在其它品种中都是A等位基因频率占明显优势外，尤其是在皮特兰品种中；在皮特兰品种、杜大申和杜皮申品系中杂合度低于0.3，皮特兰是外来品种，可能存在遗传差异，而杜大申和杜皮申品系可能是因为样本含量过小造成杂合度低；除此之外，其余品种或者品系的杂合度H均大于0.3，因此我们初步认为该SNP标记可以用于猪肉产品的DNA溯源。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (7)
1.猪GIGYF2基因的一段基因组DNA片段，其序列如SEQ ID NO 1所示，共452bp，包含部分第23内含子。
2.根据权利要求1所述的猪GIGYF2基因的一段基因组DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段第187位碱基处有一个碱基突变187A→187C。
3.根据权利要求1所述的猪GIGYF2基因的一段基因组DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段的452bp处有一A等位基因，其187bp和265bp处各有一C等位基因。
4.一种SNP标记，其特征在于，位于权利要求1或2或3所述的猪GIGYF2基因的一段基因组DNA片段中。
5.权利要求4所述的SNP标记的检测方法，其特征在于，采用PCR-Eco31I-RFLP方法进行，具体包括以下步骤：
(1)构建猪的DNA池；
(2)设计正、反引物分离猪GIGYF2基因的DNA片段，测序并分析；
(3)突变位点检测方法的建立；
(4)采集猪的10个品种或品系的耳组织样，共计213个个体；
(5)检测SNP标记在试验群体的分布，分析判断该标记是否适用于猪肉产品的DNA溯源。
6.根据权利要求5所述的SNP标记的检测方法，其特征在于，分离猪GIGYF2基因的DNA片段的正、反向引物的序列分别如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
7.权利要求4所述的SNP标记在猪肉产品DNA溯源中的应用。
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