CN102470182A - 用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施用的白蛋白融合凝血因子 - Google Patents
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本发明涉及在出血性紊乱的治疗和预防性处理中用于非静脉内施用的、包含白蛋白融合凝血因子的药物制剂以及通过将凝血因子与白蛋白融合而提高其在非静脉内施用后的体内回收的方法。
Description
发明领域
本发明涉及包含用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施用的白蛋白融合凝血因子的药物制剂以及通过将凝血因子与白蛋白融合而提高其在非静脉内施用后的体内回收(in vivo recovery)的方法。
发明背景
用于人类治疗和预防用途的若干重组治疗性多肽在市面上有售。患者通常受益于重组活性成分的特异作用模式，但目前所有市售的凝血因子均是通过静脉内给药施加的，这常常导致注射位置的感染并且是患者通常希望避免的一个措施，尤其是治疗凝血过程有缺陷的儿童时。
Balance等(WO 01/79271)描述了众多的不同治疗多肽的融合多肽，当它们与人血清白蛋白融合时预计将具有增加的体内功能半寿期和延长的储存期。文中描述了一长串潜在的融合配偶体，但几乎对所有这些多肽都没有用实验数据显示各自的白蛋白融合蛋白确实保持了生物学活性并且具有改善的特性。在此份名单中作为例子提及的治疗多肽是因子IX和FVII/FVIIa。此外还描述了FIX和FVII/FVIIa的融合，其中在白蛋白和FIX或FVII/FVIIa之间有肽接头。不过，没有披露当非静脉内施加相应的凝血因子时白蛋白融合体可改善治疗性处理。
因子VII和因子VIIa
FVII是分子量50kDa的单链糖蛋白，它作为406个氨基酸的无活性酶原由肝细胞分泌入血流中。FVII通过Arg152-Ile153处单一肽键的蛋白水解转变为它的活性形式因子VIIa，此水解导致形成了两条多肽链，N-末端轻链(24kDa)和C-末端重链(28kDa)，它们通过一个二硫桥连接在一起。与其它维生素K-依赖性凝血因子相反，在活化期间没有活化肽被裂解下来。因子VII的活化裂解可在体外完成，例如通过因子Xa，因子IXa，因子VIIa，因子XIIa，因子七激活蛋白酶(FSAP)和凝血酶。Mollerup等(Biotechnol.Bioeng.(1995)48：501-505)报告了在重链的Arg290和/或Arg315处也发生某些裂解。
因子VII以500ng/ml的浓度存在于血浆中。约1％或5ng/ml的因子VII是作为激化的因子VIIa存在。已发现因子VII的终末血浆半衰期是大约4小时，而因子VIIa的是大约2小时。
通过施加超生理水平浓度的因子VIIa，可绕开对因子VIIIa和因子IXa的需要而完成止血。因子VII之cDNA的克隆(US 4,784,950)使得有可能研发活化的因子VII作为药品。1988年因子VIIa首次被成功施用。从那时起，因子VIIa的适应症量稳步增长，显示了其成为通用止血剂来阻止出血的潜能(Erhardtsen，2002)。不过，因子VIIa约2小时的短终末半衰期和减少的体内回收限制了它的应用。
人的FIX
人的FIX是维生素K-依赖型多肽族的一个成员，它是分子量为57kDa的单链糖蛋白，以415个氨基酸的无活性酶原形式由肝细胞分泌至血流中。它包含位于多肽N-末端Gla结构域的12个γ-羧基-谷氨酸残基。这些Gla残基需要维生素K用于它们的生物合成。在Gla结构域后面有两个表皮生长因子结构域，一个活化肽和胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶结构域。FIX的进一步翻译后修饰包括羟基化(Asp 64)，N-(Asn157和Asn167)以及O-型糖基化(Ser53，Ser61，Thr159，Thr169和Thr172)、硫酸化(Tyr155)和磷酸化(Ser158)。
FIX通过在Arg145-Ala146和Arg180-Val181处水解活化肽而转变成它的活性形式因子IXa，所述水解导致形成了两条多肽链，即N-末端轻链(18kDa)和C-末端重链(28kDa)，它们通过一个二硫桥连接在一起。因子IX的活化裂解可在体外通过例如因子XIa或因子VIIa/TF来完成。因子IX以5-10μg/ml的浓度存在于人的血浆中。已发现人的因子IX的终末血浆半衰期是约15至18小时(White GC et al.1997.Recombinant factor IX.Thromb Haemost.78：261-265；Ewenstein BMet al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived andrecombinant F IX concentrates in previously treated patients withmoderate or severe hemophilia B.Transfusion 42：190-197)。
B型血友病是由因子IX的无功能或缺失引起的，其用来自血浆的因子IX浓缩物或重组形式的因子IX治疗。由于B型血友病患者常常接受至少两周一次(biweekly)的预防性施用因子IX以避免自发的出血，因此人们希望通过延长因子IX产品之半寿期来延长两次施用之间的时间间隔并避免静脉内施用因子IX。
因子VIII(FVIII)
FVIII是分子质量约260kDa的血浆糖蛋白，产生于哺乳动物的肝脏中。它是导致血液凝固的凝血级联反应的关键组分。此级联反应中的一步是因子IXa(FIXa)结合FVIII一起将因子X(FX)转变成活化形式FXa。FVIII在此步中作为辅助因子，与钙离子和磷脂一起为FIXa活性所必需。最常见的血友病紊乱是由功能性FVIII缺乏引起的，称为A型血友病。
A型血友病治疗中的一个重要进展是分离到了编码人FVIII之完整2，351个氨基酸序列的cDNA克隆(美国专利申请No.4,757,006)以及提供了人FVIII基因DNA序列和用于其产生的重组方法。
对测定自克隆cDNA的人FVIII的推断一级氨基酸序列进行分析显示它是从较大的前体多肽加工而来的异二聚体。所述异二聚体由约80kDa的C-末端轻链以金属离子依赖型缔合结合约210kDa的N-末端重链片段组成。(参阅综述Kaufman，Transfusion Med.Revs.6：235(1992))。通过由凝血酶对蛋白链进行蛋白水解性裂解使此异二聚体发生生理激活。凝血酶将重链裂解成90kDa的蛋白质，然后裂解成54kDa和44kDa片段。凝血酶还将80kDa的轻链裂解成72kDa的蛋白质。正是后一蛋白质和两个重链片段(上述54kDa和44kDa)通过钙离子结合在一起，组成了活性的FVIII。当72kDa和54kDa蛋白质进一步被凝血酶、活化蛋白C或FXa裂解时会发生失活。在血浆中，此FVIII复合物通过与50倍过量的VWF蛋白质(″VWF″)联合而得以稳定，后者看起来抑制了如上所述的FVIII的蛋白水解性破坏。
FVIII的氨基酸序列被组织入三个结构性结构域：330个氨基酸的三重A结构域、980个氨基酸的单一B结构域和150个氨基酸的双重C结构域。B结构域与其它蛋白质没有同源性，且提供了此蛋白质内25个潜在天冬酰胺(N)-连接之糖基化位点中的18个。B结构域显然在凝结中无功能并且可被缺失，而B结构域缺失的FVIII分子仍然具有促凝血活性。
Von Willebrand因子(vWF)
VWF是存在于哺乳动物血浆中的多聚粘附糖蛋白，它具有多重生理学功能。在初期止血时，VWF充当血小板表面上特异受体和胞外基质组分诸如胶原蛋白之间的中介物。此外，VWF用作促凝剂FVIII的载体和稳定蛋白。VWF以2813个氨基酸的前体分子的形式合成于内皮细胞和巨核细胞中。该前体多肽，前原VWF，由22个残基的单一肽、741个残基的原肽和在成熟血浆VWF中发现的2050个残基的多肽组成(Fischer etal.，FEBS Lett.351：345-348，1994)。在分泌入血浆时，VWF以具有不同分子大小的不同种类形式循环。这些VWF分子由2050个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。VWF通常可以一个二聚体至由50-100个二聚体组成的多聚体形式发现于血浆中(Ruggeri et al.Thromb.Haemost.82：576-584，1999)。人的VWF在人体循环中的体内半衰期是大约12至20小时。
在人类中最频繁的遗传性出血紊乱是维勒布兰德氏病(vonWillebrand′s disease，VWD)，它可用包含血浆或重组来源的VWF的浓缩物通过替代疗法进行治疗。
VWF可按例如EP 05503991中所述由人的血浆制备。在专利EP0784632中描述了用于分离重组VWF的方法。
已知VWF在体内稳定FVIII，起调节FVIII之血浆水平的关键作用，并因此是控制初级和次级止血的重要因子。此外还已知在对VWD患者静脉内施用含VWF的药物制剂后，可观察到在24小时内内源FVIII：C增加至1至3个单位每ml，证明了VWF对FVIII的体内稳定作用。
直至今日，A型血友病和VWD的标准治疗仍包括频繁的静脉内输注FVIII制剂和VWF浓缩物。B型血友病的治疗需要两周一次施用因子IX，并且在用FVIIa治疗抑制型患者时，利用每周多次施用FVIIa来避免出血。
这些替代疗法通常是有效的，不过，在例如经历预防性治疗的严重A型血友病患者中，由于因子VIII约12小时的短血浆半衰期，不得不每周约3次静脉内(i.v.)施用因子VIII。已经高于非血友病之FVIII活性的1％水平时，例如，FVIII水平提高至约0,01U/ml时，严重的A型血友病被转变成中度的A型血友病。在预防性治疗中，设计剂量给药形式以使FVIII活性的波谷水平不降到低于非血友病个体内之FVIII活性的2-3％的水平。
经由静脉内施用凝血因子是不方便的、有痛苦并且承担着感染的风险，尤其是因为这大部分是由患者自己或被诊断患A型血友病的孩子的父母在家庭治疗中完成的。此外，频繁的静脉内注射不可避免的导致了疤痕产生，妨碍了未来的输注。由于严重血友病的预防性治疗在生命的早期就开始了，对于孩子经常在小于2岁时，所以对如此小的患者每周3次注射FVIII到静脉内就更困难了。在有限的一段时间内，植入端口系统可能是一个备选方案。尽管可能发生重复感染并且在体育运动时端口可能造成不方便这些事实，它们通常仍然被认为相较于静脉内注射而言是更可选的。
因此对于避免静脉内输注凝血因子存在很大的医疗需求。
发明简述
本发明涉及在出血性紊乱的治疗和预防性处理中适于非静脉内施用、包含白蛋白融合凝血因子的药物制剂以及通过将其与白蛋白融合而在凝血因子的非静脉内施用后增加体内回收的方法。
优选凝血因子是维生素-K依赖型凝血因子及其片段和变体。更优选的是FVIIa和FIX及其片段和变体。此外非限制性地优选白蛋白-融合的FVIII和vWF、纤维蛋白原、因子II、因子X、因子XIII、凝血酶、凝血酶原和蛋白C。
优选含白蛋白融合凝血因子的制剂通过皮下施用。不过所有其它非静脉内施用形式也包括在内，例如肌肉内或皮内施用。
在本发明某些实施方案中，凝血因子可经由可被蛋白酶裂解的肽接头与白蛋白融合。
本发明的要旨具体而言通过维生素K-依赖型多肽因子VII和白蛋白得以证明。本发明还涉及其它的凝血因子。本发明还涉及编码白蛋白融合凝血因子的cDNA。编码各自凝血因子的cDNA被遗传性地与编码人血清白蛋白的cDNA序列融合，并且可通过编码可被蛋白酶裂解的居间肽接头的寡核苷酸连接。本发明还涉及将包含所述融合cDNA序列的重组表达载体用于非静脉内施用。这可以是例如经由肌肉内注射包含编码白蛋白融合凝血因子之cDNA的表达载体进行的基因治疗。
发明详述
“白蛋白融合(的)凝血因子”在本发明的意义上意指人白蛋白与凝血因子的遗传性融合体，其中所得的融合多肽的血浆半衰期相较于相同类型但非融合型的凝血因子而言有所延长，并且其中非静脉内施用后的体内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静脉内施用后的体内回收而言有所增加。
本发明优选的实施方案包括白蛋白融合的凝血因子，其中非静脉内施用后的体内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静脉内施用后的体内回收而言增加了至少10％，优选至少25％，更优选超过50％，更优选超过100％，还更优选超过200％。
“非静脉内施用后的体内回收”意指在非静脉内施用后可在血浆中发现的生物学活性凝血因子的量。
非静脉内施用后的体内回收可利用本领域众所周知的测定相应凝血因子生物学活性的分析性凝结相关检验确定为例如“曲线下的面积”，或者“血浆水平峰值”。“体内回收”在本发明的意义上是意指在施用所述产品后不久在血液或血浆中发现的产品量。因此，为了探测体内回收，通常在施用所述产品后例如15分钟、或60分钟或2小时或4小时或8小时或12小时或20小时测定其血浆含量。
“凝结相关检验”在本发明的意义上是测定凝结过程中相关的酶活性或辅助因子活性或能测定内在或外在凝结级联反应已被激活的任何检验。“凝结相关”检验因此可以是直接的凝结检验，类似aPTT，PT，或者凝血酶产生检验。不过，其它的检验，类似例如应用于特异凝血因子的显色检验也包括在内。所述检验或相应试剂的例子是利用相应凝血因子缺乏血浆(Dade Behring)的
SL(aPTT检验，DadeBehring)或
S(凝血酶原时间测定，Dade Behring)，利用例如凝血因子缺乏血浆的凝血酶产生检验试剂盒(Technoclone，Thrombinoscope)，显色检验法，象Biophen因子IX(Hyphen BioMed)，
FVIIa-rTF(Roche Diagnostics GmbH)，
因子VIII：C/4(Chromogenix)，或其它。
作为测定生物学活性凝血因子的替代，还可测定相应凝血因子的抗原的量。优选通过类似ELISA检验的技术测定抗原水平。
“凝血因子”在本发明的意义上是可有助于初级或次级止血的任何多肽。“凝血因子”包括但不局限于，由因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X，因子XI，因子XII，因子XIII，因子I，因子II(凝血酶原)，蛋白C，蛋白S，GAS6或蛋白Z组成的多肽以及它们的活化形式。此外，有效的凝血因子可以是野生型多肽或可以包含突变。糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随所选定宿主细胞和宿主细胞环境特性而变化。当提到特定氨基酸序列时，所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
白蛋白
用于此处时，“白蛋白”总体上指白蛋白多肽或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如生物学活性)的白蛋白片段或变体。特别是，“白蛋白”指人的白蛋白或其片段，尤其是本文中以SEQ ID No：1所示的成熟形式的人白蛋白或来自其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或者这些分子的类似物或变体或者其片段。
白蛋白融合蛋白质中的白蛋白部分可包含如上所述的全长HA序列，或者可能包含它的能稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。这样的片段可以是10个或更多个氨基酸长，或者可能包含来自HA序列的约15，20，25，30，50，或更多个连续氨基酸或者可能包含HA的部分或全部特定结构域。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的变体，或天然或人造的。本发明融合蛋白的治疗多肽部分也可以是如本文所述之相应治疗多肽的变体。术语“变体”包括插入、缺失和取代，其或者保守的或不保守，或天然或人造，其中所述变化基本上不改变赋予所述治疗多肽之治疗活性的活性位点或活性结构域。
特别是，本发明的白蛋白融合蛋白可包含天然存在的人白蛋白多态变体和人白蛋白片段。白蛋白可来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不局限于母鸡和鲑鱼。白蛋白连接多肽的白蛋白部分可来自与治疗多肽部分来源不同的动物。
一般而言，白蛋白片段或变体会是至少10个，优选至少40个，最优选超过70个氨基酸长。白蛋白变体优选由以下部分组成或包含以下部分：白蛋白的至少一个完整结构域或所说结构域的片段，例如结构域1(SEQ ID NO：1的氨基酸1-194)，2(SEQ ID NO：1的氨基酸195-387)，3(SEQ ID NO：1的氨基酸388-585)，1+2(SEQ ID NO：1的1-387)，2+3(SEQ ID NO：1的195-585)或1+3(SEQ ID NO：1的氨基酸1-194+SEQ ID NO：1的氨基酸388-585)。每个结构域自身是由两个同源亚结构域即1-105，120-194，195-291，316-387，388-491和512-585组成，具有包含残基Lys106至Glu119，Glu292至Val315以及Glu492至Ala511的柔性亚结构域间连接区域。
本发明之白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含HA的至少一个亚结构域或结构域或它们的保守修饰。
本发明包括作为凝血因子融合配偶体的白蛋白所有片段或变体，只要它们使得治疗性融合蛋白在血浆中的半衰期相较于非融合型凝血因子而言延长至少25％即可。
″白蛋白融合(的)凝血因子″用于此申请中意指包含非活化及活化形式的相应凝血因子的多肽。″白蛋白融合凝血因子”用于本发明时包括分别具有天然凝血因子和白蛋白之氨基酸序列的蛋白质。还包括具有轻微修饰的氨基酸序列的蛋白质，例如，包含N-末端氨基酸缺失或添加的已修饰N-末端，只要那些蛋白质基本上保持各自凝血因子的生物学活性即可。以上定义中的“白蛋白融合凝血因子”还包括可能在不同个体之间存在的天然等位基因变异。以上定义中的″白蛋白融合凝血因子”进一步包括各自凝血因子的变体和白蛋白的变体。这样的变体在一个或更多个氨基酸残基上与野生型序列不同。所述差异的例子可包括N-和/或C-末端截短了一个或多个氨基酸残基(例如，1至10个氨基酸残基)，或N-和/或C-末端添加了一个或多个额外的残基，例如在N-末端添加了甲硫氨酸残基，以及保守性的氨基酸取代，即，在具有相似特性的氨基酸组内进行取代，例如(1)小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)极性氨基酸，(4)碱性氨基酸，(5)疏水氨基酸，(6)芳香族氨基酸。所述保守取代的例子如下表所示。
表1
| (1) | 丙氨酸 甘氨酸 |
| (2) | 天冬氨酸 谷氨酸 |
| (3a) | 天冬酰胺 谷氨酰胺 |
| (3b) | 丝氨酸 苏氨酸 |
| (4) | 精氨酸 组氨酸 赖氨酸 |
| (5) | 异亮氨酸 亮氨酸 甲硫氨酸 缬氨酸 |
| (6) | 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 |
本发明融合蛋白的体内半寿期，通常以终末半寿期或β-半寿期测定，常常比非融合多肽的体内半寿期长至少约25％，优选至少约50％，更优选超过100％。
一个优选实施方案中的接头区域包含待施用的凝血因子序列或其变体，它应使得所表达融合蛋白的新抗原特性(由于在治疗性抗原内出现人蛋白质中不存在的肽而形成新的潜在免疫原表位)的风险降低。此外在凝血因子是酶原(例如，需要蛋白水解激活)的情况下，肽接头裂解的动力学将更接近地反应酶原的凝结相关活化动力学。因此，在所述优选实施方案中，酶原和相应的接头以相当的动力学被活化和相应地裂解。因此，本发明还特别涉及酶原和白蛋白的融合蛋白。
在进一步的实施方案中，接头肽包含针对一个以上蛋白酶的裂解位点。这可通过可在同一位置被不同蛋白酶裂解的接头肽或通过提供两个或更多个不同裂解位点的接头肽来实现。这在下述情况下是有利的，即其中治疗性融合蛋白必须通过蛋白水解性裂解被激活以达到酶活性，以及不同蛋白酶可能有助于此活化步骤时。例如FIX的活化即是如此，它可通过FXIa或通过FVIIa/组织因子(TF)完成。
本发明的优选实施方案是治疗性融合蛋白，其中的接头可被蛋白酶裂解，激活凝血因子，从而保证接头的裂解与凝结发生位置处凝血因子的活化相关联。
依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中一旦被激活即可被作为治疗性融合蛋白一部分的凝血因子裂解所述接头的那些融合蛋白，这样也保证了融合蛋白的裂解与凝血事件相关联。
依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中所述接头可被蛋白酶所裂解的那些融合蛋白，所述蛋白酶自身直接或间接被作为治疗性融合蛋白一部分的凝血因子的活性所激活，这样也保证了融合蛋白的裂解与凝血事件相关联。
最优选的一类治疗性融合蛋白是其中接头可被FXIa和/或被FVIIa/TF裂解且凝血因子是FIX的那些融合蛋白。
本发明的另一实施方案是用含白蛋白融合凝血因子的药物组合物进行非静脉内施用。施用模式优选皮下的，但包括所有的血管外施用途径。还包括经由上皮表面的施用(例如，在皮肤上)。特别的临床应用是通过贴片施用，这种局部的施用需要经由皮肤吸收，不过它可以是相当显著的，不仅是对表面磨损处也对完整无损的皮肤如此，它可能包括滴眼剂和鼻子处的应用。经由上皮表面的施用包括吸入，这是合适的，因为特别大的表面被蛋白质所覆盖，导致快速吸收而避免了经过肝脏。在上皮表面的施用包括保持在嘴里或舌头下的剂型，即口腔的或舌下的剂型，可能甚至如口香糖。由于嘴里的pH相对中性(与酸性的胃环境形成对照)，这对于不稳定蛋白质诸如FVIII是积极的。也可考虑阴道和甚至直肠施用，因为流出直肠的某些静脉直接进入大循环。通常这对于不能经由口服途径摄入物质的患者最有帮助，譬如年幼的孩子。
皮内注射(在皮肤内)会是更侵入性的施用方式，但仍适于无需专门人才帮助或甚至实施的治疗。皮内施用后是皮下注射(刚好在皮下下)。通常吸收相当充分并且可通过温暖或按摩注射区域增加吸收。或者可实现血管收缩，产生相反的行为，即减少吸收但延长效果。
还更侵入性的血管外的施用包括肌肉内递送(进入身体的肌肉内)。这可能通过绕开脂肪组织提供了好处，但通常比皮下注射更痛苦，尤其是对特征在于缺乏凝血系统的患者而言，为了通过注射得到改善，但存在组织损伤的风险，导致出血。
本发明的凝血因子以治疗有效剂量施用于患者，意指足够产生预期效果、阻止或减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延的剂量，但未到达产生无法忍受的不利副作用的剂量。确切剂量取决于许多因素，诸如指征、剂型、施用方式，并且必须针对每一种相应指征在预临床和临床试验中确定。
本发明的凝血因子可用于治疗家族性和获得性A型和B型血友病病例、家族性或获得性von Willebrand病、所有类型的创伤(钝的或穿透性的，导致从单一器官、骨头部分或从多发性创伤处严重出血)中的出血、外科手术时的出血包括围手术期或手术后的出血、心脏手术导致的出血包括经历体外循环的患者和小儿科心脏手术中的血稀释、大脑内出血、蛛网膜下出血、硬脑膜下或硬脑膜上出血、由于血液丢失和血液稀释造成的出血、通过非血浆体积取代导致受影响患者中凝血因子水平下降、由于弥散性血管内凝血(DIC)和消耗性凝血病、凝血细胞功能紊乱、损耗和凝血病造成的出血，由于肝硬化、肝功能障碍和暴发性肝衰竭、肝病患者的肝活组织检查造成的出血，肝脏和其它器官移植后的出血，来自胃静脉曲张和胃溃疡出血、妇科出血例如功能失调性子宫出血(DUB)、胎盘的过早剥离、低出生体重孩子的室周出血、产后出血、新生儿的致命危急状况，与烧伤相关的出血，与淀粉样变性病相关的出血，与血小板紊乱相关的造血干细胞移植，与恶性肿瘤相关的出血，与出血性病毒相关的感染，与胰腺炎相关的出血。
本发明进一步涉及如本申请书所述编码白蛋白融合凝血因子的多核苷酸的使用。术语″多核苷酸″通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或者已修饰的RNA或DNA。多核苷酸可以是单链或双链DNA、单链或双链RNA。用于此处时，术语″多核苷酸″还包括含有一个或多个被修饰碱基和/或不常见碱基例如肌苷的DNAs或RNAs。应当理解，为了满足本领域技术人员已知的许多有用的目的，可对DNA和RNA进行各种修饰。术语″多核苷酸″用于此处时包含了所述的化学、酶促或代谢性修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA化学形式，包括例如简单的和复杂的细胞。
技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，给定的多肽可以由不同的多核苷酸编码。这些“变体”包括在本发明中。
优选的，本发明的多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语“纯化的”多核苷酸指基本上没有其它核酸序列的多核苷酸，例如但不局限于其它的染色体的和染色体外的DNA和RNA。纯化的核苷酸可纯化自宿主细胞。可用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得纯化的多核苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
除此以外，本发明的另一方面是包含本发明多核苷酸的质粒或载体的使用。优选的，所述质粒或载体是表达载体。在一个具体的实施方案中，所述载体是适用于人基因治疗的转移载体。
糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随选定的宿主细胞和所述宿主细胞环境特性而变化。当提及特定的氨基酸序列时，所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
术语″重组″意指例如所述变体是通过遗传工程技术在宿主生物体内产生的。本发明的FVIII或VWF变体经常是重组变体。
所推荐变体的表达：
在合适的宿主细胞内高水平产生重组蛋白质需要将上述修饰的cDNA连同合适的调控元件一起在重组表达载体中装配成有效的转录单元内，所述表达载体可依照本领域技术人员已知的方法在各种表达系统中增殖。有效的转录调控元件可来自以动物细胞作为其天然宿主的病毒或来自动物细胞的染色体DNA。优选的，可使用来自猿猴病毒(SimianVirus)40、腺病毒、BK多形瘤病毒、人巨细胞病毒或劳氏肉瘤病毒长末端重复片段的启动子-增强子组合，或者包括动物细胞中强组成型转录基因例如β-肌动蛋白或GRP78的启动子-增强子组合。为了达到稳定的高水平的从cDNAs至mRNA的转录，转录单元应在其3’-近端部分包含编码转录终止聚腺苷酸化序列的DNA区。优选的，此序列来自猿猴病毒40(Simian Virus40)早期转录区、兔β-珠蛋白基因或人组织纤溶酶原激活剂基因。
然后将cDNAs整合入适于本发明之白蛋白融合凝血因子表达的合适宿主细胞系的基因组中。优选此细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系，以保证正确的折叠、Gla-结构域合成、二硫键形成、天冬酰胺连接糖基化、O-连接糖基化和其它翻译后修饰以及向培养基的分泌。其它翻译后修饰的例子是新生多肽链的羟基化和蛋白水解加工。可使用的细胞系的例子是猴COS-细胞、小鼠L-细胞、小鼠C127-细胞、仓鼠BHK-21细胞、人胚肾293细胞和仓鼠CHO-细胞。
可以若干不同方式将编码相应cDNAs的重组表达载体引入动物细胞系中。例如，可从基于不同动物病毒的载体建立重组表达载体。这其实例有基于杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒(优选牛乳头瘤病毒)的载体。
还可将编码相应DNAs的转录单元与另一重组基因一起引入动物细胞中，所述的另一重组基因可在这些细胞中用作显性的选择标记以方便分离特异的细胞克隆，它们已将所述重组DNA整合入其基因组中。此类型的显性选择标记基因的例子是Tn5氨基糖苷磷酸转移酶，赋予抗遗传霉素(geneticin)(G418)的抗性；潮霉素磷酸转移酶，赋予抗潮霉素的抗性；以及嘌呤霉素乙酰转移酶，赋予抗嘌呤霉素的抗性。编码这种选择标记的重组表达载体可以驻留于与编码预期蛋白质之cDNA相同的同一载体上，或者它可编码于同时引入并整合入宿主细胞基因组的分开的载体上，在不同转录单元之间常常产生紧密的物理连锁。
可与预期蛋白质之cDNA一起使用的其它类型选择标记基因是基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的各种转录单元。将此类基因引入缺少内源dhfr-活性的细胞、优选CHO-细胞(DUKX-B11，DG-44)后，它使它们能在缺少核苷的培养基中生长。所述培养基的例子是无次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham’s F12。这些dhfr-基因可与凝血因子cDNA转录单元一起引入以上类型的CHO-细胞中，其或者连接于同一载体上或者位于不同载体上，由此建立产生重组蛋白质的dhfr-阳性细胞系。
若在细胞毒性dhfr-抑制剂氨甲蝶呤存在下培养以上细胞系，则将形成抗氨甲蝶呤的新细胞系。由于被连接的dhfr和预期蛋白质的转录单元的扩增数量，这些细胞系可以增长速率产生重组蛋白质。当在浓度逐步增加的氨甲蝶呤(1-10000nM)中增殖这些细胞系时，可获得以很高速率产生预期蛋白质的新细胞系。
产生预期蛋白质的以上细胞系可大规模培养于悬浮培养物中或各种固体支持物上。这些支持物的例子是基于葡聚糖或胶原蛋白基质的微载体，或中空纤维形式或各种陶瓷材料的固相支持物。当在细胞悬浮培养物中或微载体上生长时，可作为分批培养物或灌注培养物形式进行以上细胞系的培养，在较长时期内连续生产条件培养基。因此，依照本发明，以上细胞系很适合于开发工业生产方法用于生产预期的重组蛋白质。
所述重组蛋白质当积聚于以上类型的分泌细胞的培养基中时，可通过多种生化和层析方法进行浓缩和纯化，包括利用预期蛋白质和细胞培养基中其它物质之间在大小、电荷、疏水性、溶解性、特异亲和力等方面差异的方法。
所述纯化的一个例子是使重组蛋白质吸附在固定于固相支持物上的单克隆抗体上。吸附后，用基于以上特性的各种层析技术进一步纯化所述蛋白质。
优选将本发明之修饰的生物学活性白蛋白融合凝血因子纯化至大于或等于80％的纯度，更优选大于或等于95％的纯度，尤其优选的是相对于污染的大分子、尤其是其它蛋白质和核酸而言大于99.9％纯的药用纯态，并且没有感染剂和热源剂。优选的，本发明之分离或纯化的改良生物学活性白蛋白融合凝血因子是基本上无其它多肽的，除非在准备施用与其它治疗蛋白质之组合的时候。
本发明中所述的白蛋白融合凝血因子可配制入药物制剂中供治疗用途。已纯化的蛋白质可溶于常规的生理上相容的水性缓冲液中，其中可任选的加入药用赋形剂以得到药物制剂。
这样的药用载体和赋形剂以及合适的药用剂型是本领域众所周知的(参阅例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptidesand Proteins”，Frokjaer et al.，Taylor & Francis(2000)或“Handbook of Pharmaceutical excipients”，3rd edition，Kibbe etal.，Pharmaceutical Press(2000))。特别是，包含本发明之多肽变体的药物组合物可配制成冻干的或稳定可溶的形式。可通过本领域已知的多种程序将多肽变体冻干。在使用之前通过加入一种或多种药用可接受稀释剂诸如注射用无菌水或无菌生理盐溶液使冻干的制剂重新溶解。
通过任何药用合适的非静脉内施用方式将组合物制剂递送给个体。有多种递送系统是已知的并且可用于经由任何方便途径施加组合物。优选配制本发明组合物用于皮下，肌肉内，腹膜内，脑内，肺内，鼻内或经皮肤给药，最优选依常规方法用于皮下的、肌肉内或经皮肤给药。所述剂型可通过输注或通过大剂量推注连续施加。某些剂型包括慢释放系统。
将本发明的白蛋白融合凝血因子以治疗有效剂量施用于患者，意指足够产生预期效果、阻止或减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延并且未到达产生无法忍受的不利副作用的剂量。确切剂量取决于许多因素，诸如指征、剂型、施用方式，并且必须在针对每一相应指征的预临床和临床试验中确定。
本发明的药物组合物可单独施用或与其它治疗制剂联合施用。这些制剂可掺入作为同一药物的一部分。
图注
图1：300μg/kg rVIIa-FP和
后FVII：Ag血浆浓度的时间进程(汇集；n＝3/时间点；线性尺度)
图2：300μg/kg rVIIa-FP和
后FVII：Ag血浆浓度的时间进程(汇集；n＝3/时间点；对数-线性尺度)
图3：610μg/kg rIX-FP和
后FIX：Ag血浆浓度的时间进程(汇集；n＝5/时间点；线性尺度)
图4：610μg/kg rIX-FP和后FIX：Ag血浆浓度的时间进程(汇集；n＝5/时间点；对数-线性尺度)
实施例
实施例1：大鼠中皮下施加rVIIa-FP的生物利用度评估
第一个实施例中概述的实验的目的是为了评估血管外注射是否可能是用rVIIa-FP(人)进行改良治疗的一个选择。作为血管外治疗的典型代表而言选择皮下注射。为了比较rVIIa-FP与参比制剂
的适合性，进行表2中所详细设计的非临床药代动力学研究。在对大鼠单次静脉内/皮下注射等摩尔剂量的rVIIa-FP(如WO 2007/090584中第30至31页所述产生的pFVII-937)和
后测定血浆水平的时间进程。对
而言剂量是300μg/kg。rVIIa-FP的剂量是基于根据OD测量值(280-320nm)所确定的蛋白质浓度。在校正FP的白蛋白部分后，施加了300μg(FVIIa)/kg的剂量。此时，两种产品均以就治疗有效组分FVIIa而言相同的剂量施加。选择大鼠作为此研究的动物物种，因为它代表了适于此类型研究的特征清楚且频繁使用的物种。大鼠(CD品系)由Charles River(Sulzfeld，Germany)提供，在实验期间称重约200g。将大鼠保持在标准的住房条件下。经短期麻醉，从眼窝后吸取血液样品，用柠檬酸钙抗凝得到10至20％的柠檬酸盐血液，加工成血浆并贮存于-20℃待测定FVII血浆水平。取样时间点详见表2。通过夹心ELISA，利用绵羊抗-FVII IgG(Cedarlane/Biozol)作为捕获抗体，而POD缀合的绵羊-FVII IgG(Cedarlane/Biozol)作为探测抗体，测定人FVII的血浆浓度。用标准的人血浆作为参照。rVIIa-FP的发酵、纯化和激活在其它地方有描述。
静脉内注射rVIIa-FP产生的初始血浆水平相较于用相同剂量
处理而言高大约60％(表3，图1)。只针对用rVIIa-FP进行皮下处理的组，在血浆中探测到FVII。注射后约8小时时观察到峰浓度并且在处理后1至2天再次达到基线。对于用相同剂量
进行皮下处理的组，尽管以与rVIIa-FP相同之FVIIa剂量注射
但在整个观察期间血浆水平均保持在检测极限之下(图2)。
表2：处理组
表3：FVII：Ag血浆水平的时间进程(血浆集合；n＝3/时间点)
以与rFVIIa-FP相同的剂量注射未发现血浆水平。因此令人惊奇的是发现用rVIIa-FP进行皮下处理产生了可很好探测到的FVIIa血浆水平，在注射后相当短的延滞期后(约8小时)观察到峰浓度，然后是长时的持久的衰退，即至少1-2天后。这甚至比静脉内注射后rVIIa-FP的时间进程要持久。预期的约为rVIIa-FP之50％的较低分子量将有助于其从皮下区室中再吸收。研究的结果证明出现了相反的情况。皮下施加rVIIa-FP的相对生物可利用度达到了约10％，而皮下注射
后未探测到血浆水平。
为了判断就其再吸收或向循环运输而言rVIIa-FP是否特别有利，比较rVIIa-FP和
的相对生物可利用度可能是不适当的，因为皮下施加之rVIIa-FP的AUC可能由于它的长久终末半寿期而突出，这是由于rVIIa-FP从皮下区室连续释放至循环中造成的。与
相比较，静脉内输注后的终末半寿期已延长了超过6倍。此外，rVIIa-FP和
的消除特性可能有区别地受到它们从皮下空间向循环传送或扩散的影响。因此有关此论题的明确结论可能更可靠的是基于峰浓度的评估。对于
血浆浓度从未达到25ng/mL的探测极限，然而对于所述融合蛋白而言，在注射后血浆浓度很快达到了约140ng/mL。
第一步，假定其再吸收或向循环的传送是与rVIIa-FP完全相同的，则有可能估计用
处理后预期的血浆浓度为何。通过对静脉内注射时rVIIa-FP之60％的较高恢复水平进行校正，我们可预期最高血浆水平约为90ng/mL。这明显高于探测极限，由此排除了潜在的可能在用
皮下处理后阻碍血浆中FVII观察的方法学问题。第二步，为了估计通过与白蛋白融合达到的最小利益，我们可设想最佳案例情况大体上有利于
这是基于实际上传送至血浆、但却因为在所有时间点所达到的峰浓度均停留在刚刚最低限的低于25ng/mL探测水平而观察不到这一假设。至于
可能存在于血浆中的持续时间，关于的最佳情形是假设与rVIIa-FP有完全相同的时间进程，尽管它的终末半寿期短了大约6倍。得到的关于
的AUDC是550h*ng/mL，而关于rVIIa-FP的是大约2200h*ng/mL。因此结论是，在高度有利于
的情况下，血管外注射后rVIIa-FP的体内回收比
高至少大约4倍。
实施例2：在B型血友病模型(FIX ko小鼠)中皮下施加rIX-FP的生物可利用度的评估
为了评估血管外注射是否可能是用rIX-FP(人)进行改良治疗的选项，选择血管外治疗的典型代表-皮下注射。检验所述实例的非临床药代动力学研究的设计详见表4。在对B型血友病模型单次静脉内/皮下注射610IU/kg或rIX-FP后测定血浆水平的时间进程。依照WO2007/144173如实施例1至3中所述产生rIX-FP(pFIX-1088)。用FIX：凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约25g的FIX敲除(ko)小鼠作为B型血友病模型。这些小鼠缺少FIX基因的启动子区域，因此不表达FIX(Lin et.al.1997，Blood，90，3962-3966)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中FIX活性即功能活性蛋白质进行定量来分析处理后的FIX水平。经短期麻醉，从眼窝后吸取血液样品，用柠檬酸钙抗凝得到10至20％的柠檬酸盐血液，加工成血浆并贮存于-20℃用于测定FIX血浆水平。取样时间点详见表5。通过标准的基于aPTT的方法(贝林凝血计时器)进行血浆中FIX活性的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
对FIX ko小鼠皮下注射610U/kg
导致血浆水平中FIX活性相较于静脉内注射所达到的血浆水平有小的增加(图3)。皮下施加后的生物可利用度是大约25％。皮下注射后，持续约1-2天可探测到FIX。有关rFIX-FP的结果则在若干方面明显不同：
1)皮下注射rFIX-FP后的峰浓度是对于Berinin未融合的野生型FIX所观察到的约2倍高。
2)rFIX-FP皮下施用后的生物可利用度是有关Berinin所观察到的大约2倍高(25％对45％)。
3)与Berinin相反，在后期，通过皮下rFIX-FP达到的血浆水平甚至超过了通过静脉内rFIX-FP所达到的血浆水平。
这些结果合起来证明了血管外注射对于用rIX-FP进行的改良治疗而言是有价值的选择。较高峰浓度展现了不仅针对预防性的还甚至可能在出血事件中急性替代治疗的可能性。较高的生物可利用度使得可以应用较低的剂量和注射体积，提高成本效率并改善针对患者而言的耐受性和安全性。最后，在预防性背景下，皮下施用甚至可以延长处理的时间间隔，因为达到波谷水平的时间点比静脉内注射后的要晚。
表4：处理组
表5：静脉内/皮下施加610IU/kg rIX-FP和
后FIX：凝结血浆水平的时间进程(平均±SD，n＝5/时间点)
实施例3：在A型血友病模型(FVIII ko小鼠)中皮下施加rVIII-FP的生物可利用度的评估
为了评估血管外注射是否可能是用rVIII-FP(人)进行改良治疗的一个选择，选用血管外治疗的典型代表-皮下注射。所进行的可能性非临床药代动力学研究的设计详见表7。在对A型血友病模型单次静脉内/皮下注射ReFacto或rFVIII-FP后测定血浆水平的时间进程。用FVIII：凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约25g的FVIII敲除(ko)小鼠作为A型血友病模型。这些小鼠缺少外显子16和17，因此不表达FVIII(Bi L.et al，Nature genetics，1995，Vol 10(1)，119-121；Bi L.et al，Blood，1996，Vol 88(9)，3446-3450)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中FVIII活性进行定量来分析处理后的FVIII水平。处理细节的可能概要见表8。经短期麻醉，从眼窝后吸取血液样品，用柠檬酸钙抗凝得到10至20％的柠檬酸盐血液，加工成血浆并贮存于-20℃用于测定FVIII血浆水平。有关取样时间点的可能概述详见表7。通过标准的基于aPTT的方法(贝林凝血计时器)进行血浆中FVIII活性的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
对FVIII ko小鼠皮下注射200U/kg ReFacto导致血浆水平中FVIII活性相较于静脉内注射所预期的血浆水平有小的增加。比较用rVIII-FP(人)进行的相应处理(组2和4)，得到的结果用于评估血管外注射是否是适于用rVIII-FP进行改良治疗的一个选择。
表6：处理组
表7：FVIII：凝结血浆水平之时间进程测定的可能概要(平均值±SD，n＝3-5/时间点)
实施例4：在VWD或A型血友病模型(VWF或FVIII ko小鼠)中皮下施加rVWF-FP的生物可利用度的评估
为了评估血管外注射是否可能是用rVWF-FP(人)进行改良治疗的一个选择，选用血管外治疗的典型代表-皮下注射。所进行的非临床药代动力学研究的可能性设计详见表10。如此表所详述的对组1、2和4至6进行处理，若合适的话则注射其它剂量的VWF：Ag。在对A型血友病或von Willebrand病(VWD)模型动物单次静脉内/皮下注射
P、rVWF-FP或VWF的糖基化突变体后测定血浆水平的时间进程。用相同剂量的VWF：Ag处理相应的组。用体重约25g的FVIII敲除(ko)小鼠作为A型血友病模型。这些小鼠缺少外显子16和17，因此不表达FVIII(BiL.et al，Nature genetics，1995，Vol 10(1)，119-121；Bi L.et al，Blood，1996，Vol 88(9)，3446-3450)。用体重约25g的VWF敲除(ko)小鼠作为VWF模型。这些小鼠缺少VWF基因的外显子4和5并因此不表达VWF(Denis C.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，Vol 95，9524-9529)。
处理细节见表6。经短期麻醉，从眼窝后吸取血液样品，用柠檬酸钙抗凝得到10至20％的柠檬酸盐血液，加工成血浆并贮存于-20℃用于测定FVIII活性。取样时间点详见表7。用市售ELISA检测试剂盒
Diagnostica Stago)进行血浆中人VWF：Ag的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
对小鼠皮下注射约1400U/kg VWF：Ag U/kg
P导致血浆中人VWF：Ag相较于静脉内注射后所预期的血浆水平有所增加。比较用rVWF-FP(人)进行的相应处理(组2和5)，以及用VWF糖基化突变体进行的相应处理(组3和6)，得到的结果用于评估血管外注射是否是适于用rVWF-FP和VWF糖基化突变体进行改良治疗的一个选择。
表8：可能的处理组
表9：对FVIII ko小鼠单次皮下注射500U/kg FVIII：C的不同VWF
P制剂后VWF：Ag血浆水平测定(正常的％)的可能概要(平均值±SD；n＝5，对于每一时间点)
Claims (17)
1.一种药物制剂，其中包含白蛋白融合凝血因子，用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施用。
2.权利要求1的药物制剂，其中所述凝血因子选自因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X，因子XI，因子XII，因子XIII，因子I，因子II(凝血酶原)，蛋白C，蛋白S，GAS6或蛋白Z以及它们的活化形式。
3.权利要求1至2的药物制剂，其中所述凝血因子选自因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子以及它们的活化形式。
4.权利要求1至3的药物制剂，其中所述凝血因子是因子VII或FVIIa。
5.权利要求1至4的药物制剂，其中所述出血性紊乱选自下述组中：家族性或获得性A型和B型血友病、所有类型的创伤(钝的或穿透性的，导致从单一器官、骨头部分或从多发性损伤处严重出血)中的出血、外科手术时的出血(包括围手术期或手术后的出血)、心脏手术导致的出血(包括经历体外循环的患者和小儿科心脏手术中的血液稀释)、大脑内的出血、蛛网膜下出血、硬脑膜下或硬脑膜上出血、由于血液丢失和血液稀释造成的出血、通过非血浆容积取代导致受影响患者中凝血因子水平下降、由于弥散性血管内凝血(DIC)和消耗性凝血病造成的出血、凝血细胞功能紊乱、损耗和凝血病，由于肝硬化、肝功能障碍和暴发性肝衰竭、肝病患者的肝活组织检查造成的出血，肝脏和其它器官移植后的出血，来自胃静脉曲张的出血和胃溃疡出血、妇科出血例如功能失调性子宫出血(DUB)、胎盘的过早剥离、低出生体重孩子的室周出血、产后出血、新生儿的致命危急状况的出血，与烧伤相关的出血，与淀粉样变性病相关的出血，与血小板紊乱相关的造血干细胞移植，与恶性肿瘤相关的出血，与出血性病毒相关的感染，与胰腺炎相关的出血。
6.权利要求1至5的药物制剂，其中所述非静脉内施用是皮下的、经皮的或肌肉内的施用。
7.权利要求1至6的药物制剂，其中所述非静脉内施用是皮下施用。
8.权利要求1至7的药物制剂，其中所述凝血因子经由肽接头与白蛋白连接。
9.权利要求8的药物制剂，其中所述肽接头是可蛋白水解性裂解的。
10.用于通过将凝血因子与白蛋白融合而提高凝血因子在非静脉内施用后的体内回收的方法。
11.权利要求10的方法，其中所述凝血因子选自因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X，因子XI，因子XII，因子XIII，因子I，因子II(凝血酶原)，蛋白C，蛋白S，GAS6，或蛋白Z以及它们的活化形式。
12.权利要求10和11的方法，其中所述凝血因子选自因子IX，因子VII，因子VIII或von Willebrand因子以及它们的活化形式。
13.权利要求10至12的方法，其中所述凝血因子是因子VII或因子VIIa。
14.权利要求10至13的方法，其中所述凝血因子经由肽接头与白蛋白连接。
15.权利要求10至14的方法，其中所述肽接头是可蛋白水解性裂解的。
16.权利要求10至15的方法，其中所述非静脉内施用是皮下的、经皮的或肌肉内的施用。
17.权利要求10至16的方法，其中所述非静脉内施用是皮下施用。
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