CN102448319A

CN102448319A - 发酵的大豆基食品

Info

Publication number: CN102448319A
Application number: CN201080022808XA
Authority: CN
Inventors: C.H.贝克曼; M-S.科伊奇; M.梅勒马; J.W.桑德斯
Original assignee: Unilever Nederland BV
Current assignee: Unilever Nederland BV
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2012-05-09
Also published as: ZA201107801B; MX2011012486A; BRPI1007568A2; WO2010136320A1; AR076595A1; BRPI1007568A8

Abstract

使用嗜热乳酸菌以及嗜温乳酸菌发酵包含大豆蛋白和碳水化合物的底物的方法。

Description

发酵的大豆基食品

发明领域

本发明涉及含发酵的（或培养的）大豆的产品，尤其是发酵的大豆基饮料领域。

发明背景

消费者已愈发认识到蛋白质及其在健康饮食中的作用。这种新的理解具有深远影响，刺激消费者对蛋白质强化的更健康饮料的兴趣和需求。由于饮料是将蛋白质加入饮食的一种便利的方式，制造商继续配制新的产品以努力地使更广泛的消费族群更易获取蛋白质。

两种最流行的饮用蛋白质是乳蛋白和大豆蛋白以及它们的各种分离衍生物。据美国食品药品管理局称，摄入富含大豆蛋白的食品可降低胆固醇，提高运动表现，甚至有助于对抗糖尿病。此外，考虑到一方面与越来越多消费者发生对乳成分的过度敏感和/或不耐受相关的问题和对适合（严格）素食者的产品的需求以及另一方面一些制造商遇到的与这种商品相关的提高的乳蛋白价格和供应问题，对用大豆蛋白代替乳品的兴趣提高。大豆蛋白已被提议根据其体系部分或完全代替乳蛋白，并且已经开发出完全基于大豆蛋白的类似乳品的产品。

考虑到大豆蛋白的经文献证实的健康好处，在饮料中掺入足量的大豆蛋白是合意的。但是，在例如饮料中掺入大豆蛋白带来若干挑战。在饮料中掺入大豆蛋白已知带来显著的余味和特有的“豆腥”味。已提出旨在除去这些不合意的异味的用于分离大豆蛋白的不同类型的方法。但是，不幸地，几乎不可能从大豆蛋白源，如大豆浓缩物和大豆分离物中完全除去典型大豆“异味”。此外，在大多数产品用途中，大豆异味的强度在加工和储存过程中提高，可能是由于由前体分子形成异味化合物。

US 3,364,034描述了从植物蛋白材料中除去特有风味和/或气味以提供基本无味产品的方法，包括：用选自乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬柠檬酸明串珠菌、Pediococcus cerivisiae、卵状假单胞菌、Pseudomonae fragi、产气杆菌、乳链球菌的细菌接种所述蛋白质材料，在有益于细菌生长的条件下培养16-144小时；和在使所述材料基本无味后终止所述细菌生长。

US 4,664,919描述了制造酸奶状食品的方法，包括用Streptococcus sojalactis发酵豆乳。在该美国专利中观察到，由此获得的酸奶状产品没有豆乳特有的“生”味且其具有良好味道。其进一步陈述，上述链球菌菌株能够除去大豆的“生”味且形成的二乙酰基和丙酮的量大于其它乳酸菌。关于Streptococcus sojalactis提供的数据表明该微生物能在30-40℃的温度下生长，但在20℃或更低或45℃或更高的温度下不生长。

US 6,599,543涉及制备发酵豆乳的方法，包括：使脱壳和去胚轴的全豆与温水或热水接触；从大豆中除去温水或热水可溶的组分；粉碎大豆以制浆；从浆中除去不可溶组分以制造豆乳，将双歧杆菌属、保加利亚乳杆菌属和选自嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的一个菌株的乳酸菌接种到该豆乳中，将可被乳酸菌利用的一种或多种糖添加到该豆乳中，并使豆乳发酵产生发酵豆乳。如US 6,599,543教导从大豆中除去胚轴是费力和昂贵的。EP-A 0 386 817描述了制备发酵豆乳的方法，其包括下列步骤：

a) 用形成胞外多糖的乳酸菌接种豆乳；

b) 培养该接种豆乳；和

c) 回收发酵产品。

该欧洲专利申请的实施例1描述了如何用形成胞外多糖的乳酸菌（乳脂链球菌）的培养物在25℃下发酵含有0.5重量%外加乳糖的100毫升豆乳15小时，此后pH降至4.6。在发酵后，获得具有高粘稠度且几乎没有豆腥味的产品。

EP-A 1 145 648描述了制备具有降低的诱发胀气的寡糖含量和保守(conserved)异黄酮含量的乳酸发酵大豆蛋白性食品成分的方法，所述方法包括：

a) 提供含有大豆蛋白、诱发胀气的寡糖和异黄酮的含水粗制大豆材料；和

b) 用（1）有效地将诱发胀气的寡糖水解成可发酵糖的糖苷酶活性源和（2）使该可发酵糖发酵的产乳酸培养物同时处理该含水粗制大豆材料。

实施例2描述了如何用大约5%的乳酸培养物（乳酸乳球菌和乳脂链球菌的混合物）和大约0.01%的α-半乳糖苷酶同时接种脱脂大豆粉在水中的30%固含量浆料。使该接种浆料在35℃下保持4小时，在此期间pH从6.6降至5.3。

JP-A-2004-261003描述了通过发酵豆乳和通过在发酵之前、之中或之后添加palatinose（异麦芽酮糖）来制备发酵豆乳的方法。在该日本申请中观察到，通过用乳酸菌和双歧杆菌的组合发酵豆乳，可以将豆乳固有的草味降至一定程度，但特别由于乙酸（其是发酵的代谢产物）的味道和气味，不能总是产生令人满意的结果。在发酵豆乳中掺入palatinose以抑制在乳酸发酵或乙酸发酵过程中生成的不合意的味道、发酵味、涩味和乙酸味。该日本专利申请的实施例描述了由在发酵之前和/或之后添加了异麦芽酮糖和蔗糖的豆乳制备发酵饮料酸奶。在这些实施例中使用包含德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的起子培养物。该日本申请中公开的饮料酸奶极甜，因为它们含有多于8重量%的外加二糖（异麦芽酮糖和/或蔗糖）。

Murti TW等人, Journal of Food Science (1993), 58(1), 第153-157页描述了在不存在或存在双歧杆菌的情况下用链球菌、乳杆菌接种豆乳和牛乳并在发酵过程中监测许多挥发性化合物的浓度的实验。结果表明，在豆乳在42℃下发酵的过程中，在4小时后正己醛浓度从2.31 ppm降至0.55 ppm（无双歧杆菌）或0.45 ppm（含双歧杆菌）。发酵4小时后的乳酸含量为至少0.4重量%。

EP 1145648公开了造成腹部不适的那些寡糖的含量降低的低成本大豆蛋白性食品成分。这可以通过用包含瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌的乳品培养物或包含干酪乳杆菌和乳脂链球菌的乳品培养物发酵大豆粉来实现。

需要被加工成具有较低量的不想要的气味组分（与并非如此加工的产品相比）的含大豆蛋白的食品，并且优选该方法应能产生具有类似乳品的风味特征或更淡的风味特征的产品（根据条件）。这种更淡的特征允许加工成各种其它产品。优选这应可用数量有限的不同成分实现以便于加工。因此目标在于可将味道状况调节至所需味道状况，即淡味或乳味或两者之间。

发明概述

现在已经发现，通过改变含大豆蛋白的底物的风味的方法，至少部分可实现上述目的，所述方法包括下列步骤：

- 提供包含0.5-15重量%的溶解大豆蛋白和至少0.1 重量%的碳水化合物的灭菌或巴氏杀菌的含水液体，所述大豆蛋白衍生自尚未去胚轴的大豆，

- 用选自嗜温乳酸菌（LAB）的细菌以10⁵至10⁹ Cfu/ml底物的量接种所述含大豆蛋白的液体，该嗜温乳酸菌（LAB）选自乳酸乳球菌（包括乳(lactis)亚种、乳脂(cremoris)亚种和二乙酰乳酸变种(biovar diacetylactis)）、短乳杆菌、发酵乳杆菌、清酒乳杆菌、旧金山乳杆菌、假肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，和用嗜热乳酸菌（LAB）以10⁵至10⁹ Cfu/ml底物的量接种所述含大豆蛋白的液体，

- 通过在20至45℃的温度下培养0.5-24小时，发酵该接种的含水液体，

和其中：

o 同时进行用所述嗜温LAB和嗜热LAB接种，或

o 首先用嗜热LAB接种，随后用所述嗜温LAB接种，两次接种之间的时间段小于1小时，或

o 首先用所述嗜温LAB接种，随后用嗜热LAB接种，两次接种之间的时间段小于0.4小时，

其中所述嗜温LAB的细菌和嗜热LAB的细菌以10:1至1:100，优选1:1至1:40的嗜温LAB与嗜热LAB的Cfu比例接种。

发明详述

本方法使用衍生自尚未去胚轴的大豆的大豆蛋白（因此避免额外工艺步骤）。因此，上述大豆分离物、大豆浓缩物和/或大豆粉衍生自仍包含胚轴的任选脱壳大豆。大豆蛋白源的后几种来源最优选衍生自仍包含胚轴的脱壳大豆。本文所用的术语“去胚轴大豆”是指已除去胚轴的大豆。胚轴是用于种子植物的发芽幼苗的一部分的植物学术语。随着植物胚胎在发芽时生长，其长出被称作胚根的茎轴，胚根变成初生根并向下插入土壤。在胚根出现后，胚轴出现并将生长锥提高至高于地面，孕育胚胎叶（被称作子叶）和胚芽，其产生最初的真叶。胚轴是幼小植物的最初延伸器官并发育成茎。

不同于US 6,599,543教导的方法，本方法不要求底物中的大豆蛋白衍生自已除去胚轴的大豆。这是显著优点，因为其允许使用可被认为比去胚轴大豆更天然的大豆源，而且其可得到大豆蛋白材料中的某些有益组分，例如异黄酮的更高含量。

用嗜热乳酸菌发酵含大豆蛋白的底物可已知为未处理时受异味困扰的这种大豆蛋白制品提供有益的风味组分。此类正面“乳品”和“酸奶”香调的存在可以在一定程度上遮蔽大豆异味，但需要改进，也因为此类嗜热菌具有有限的降低所存在的造成一部分异味的组分的含量的能力。令人惊讶地，发现在将嗜温培养物添加到嗜热培养物混合物中时更有效地除去不想要的大豆异味。

另外，令人惊讶地发现，如果确保存在充足嗜热乳酸菌，嗜温乳酸菌不会完全抑制嗜热乳酸菌的正面作用，因为嗜温乳酸菌还已知使用嗜热乳酸菌产生的一些产物作为它们的代谢的一部分。还令人惊讶地发现，根据反应条件（例如发酵时间），可制成具有更乳味特征或更淡味特征的产品，对这两者而言，都降低异味组分的含量。这带来能仅使用两种不同的乳酸菌菌株制造具有不同味道状况的各种产品的益处，从加工角度看这无疑是一个优点，因为其使用有限数量的必须贮备的菌株实现制造灵活性。

在本发明的方法中，嗜温LAB选自乳酸乳球菌（包括乳亚种、乳脂亚种和二乙酰乳酸变种）、短乳杆菌、发酵乳杆菌、清酒乳杆菌、旧金山乳杆菌、假肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。这些被发现降低一种或多种异味组分，同时它们仍可与产生正面风味的嗜热乳酸菌合并，而对由这些嗜热组分产生正面风味组分没有太多有害作用。“嗜温”在本文中被理解为具有25至37℃的最适生长温度。

在本发明的方法中发现，在嗜热LAB选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌时，该组合表现良好。“嗜热”在本文中被理解为是具有高于40℃和低于50℃，优选40-46℃，更优选41-45℃的最适生长温度的培养物。

本文所用的术语“乳酸菌”是指产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢最终产物的耐酸、不形成孢子、不呼吸的杆形革兰氏阳性细菌或球菌。本文所用的术语“乳酸菌”不包括双歧杆菌。

在本发明的方法中，嗜温LAB的细菌和嗜热LAB的细菌以10:1至1:100，优选1:1至1:40，更优选1:1至1:20的嗜温LAB与嗜热LAB的Cfu比例接种。该比率例如取决于发酵时间，因此在短发酵，例如3小时（产生中性pH产物）和长发酵，例如8至24小时（产生酸性最终产物）的情况下具体比率可以变化。

实际发酵本身优选在25至40℃下进行，因为在这样的温度下，两者都生长并实现所需风味效应。

发酵持续时间在此通常在1-12小时，更优选2-10小时的范围内。根据另一优选实施方案，发酵时间不超过14小时，其再更优选不超过10小时，最优选不超过8小时。

对发酵有益的是，存在至少一些碳水化合物，优选简单糖，如单糖和二糖。这些材料通常已是大豆蛋白制品的一部分，或它们可能需要原样添加。在这点上，优选的是，在发酵开始时，被接种的底物包含至少0.1重量%的碳水化合物，优选包含0.1重量%至10重量%，更优选0.2重量%至5重量%的碳水化合物。在这点上，优选的碳水化合物是葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖、乳糖及其组合。但是，由于本方法不使用高量甜味剂遮蔽大豆异味就能够制备合意味道的饮料，因此，有利地，在发酵之前、之中或之后添加少于6重量%的二糖。根据一个特别优选的实施方案，在密封容器中的发酵产品含有少于5重量%二糖，最优选少于4重量%二糖。根据另一优选实施方案，包装的发酵产品含有少于8重量%的单糖和/或二糖，最优选少于5重量%的单糖和/或二糖。

关于要接种的底物中存在的大豆蛋白的含量：据信，该方法在宽范围的大豆蛋白浓度下表现良好。供人食用的大多数商品含有1至5%蛋白质，但该方法可以很好地在更低或更高的蛋白质浓度下进行。在后一情况下，可以在浓缩底物上进行发酵，其在食用之前以一种或另一形式稀释。在浓缩大豆蛋白上的这种方法可能更经济。在这点上，被接种的液体优选包含0.1至10重量%的量的大豆蛋白，这优选为0.2至5重量%。

本文所用的“大豆蛋白含量”是指发酵产品中所含的大豆蛋白和大豆蛋白衍生的肽的总量。该发酵产品可基于大豆蛋白、基于大豆蛋白水解产物或其组合。如技术人员所理解，在发酵过程中可能发生肽键的（酶促）水解。

在本方法中发酵的底物，即含有0.5-15重量%的溶解大豆蛋白的含水液体优选由选自大豆分离物、大豆浓缩物、大豆粉及其组合的大豆蛋白源制备。根据一个特别优选的实施方案，后几种大豆蛋白源获自表现出极低脂肪氧合酶活性，例如小于15 kU/mg的脂肪氧合酶活性的大豆。大豆蛋白源更优选衍生自表现出小于10 kU/mg，最优选小于8 kU/mg的脂肪氧合酶活性的大豆。同样地，由具有小于5 kU/克大豆蛋白的脂肪氧合酶活性的大豆蛋白源制备本发明的含水液体是有利的。该大豆蛋白源最优选具有小于1 kU/克大豆蛋白的脂肪氧合酶活性。

合适地使用如Anthon和Barrett（J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 32-37）充分描述的专用于由亚油酸生成的氢过氧化物的染料偶联检测法分光光度测定脂肪氧合酶活性。

本方法有利地用于产生可用作饮料生产的基料的发酵含水液体。在如此制成的产品是饮料的情况下，其具有相对低的粘度，例如在7℃的温度下在100 s^-1下小于50 mPa.s，最优选在100 s^-1下小于25 mPa.s的粘度。在100 s^-1下50 mPa.s的粘度是指该产品比水粘50倍和比奶粘大约25倍。可以合适地借助流变仪AR1000 (TA Instruments, Etten-Leur, the Netherlands)使用40毫米直径、2%角锥度测量系统测量粘度。应使用稳态剪切法，将剪切速率从0.01提高至250/s。测量温度为7℃，仅使用在100 s^-1下的数据点。

C₅-C₉正烷醛和(E)-2-己烯醛是据信主要造成在大豆基产品中常发现的“豆腥”异味的气味分子。本发明人已发现，可以使用本文阐述的方法以非常有效的方式除去典型的大豆相关异味。

如二乙酰基和乙醛之类的组分在存在时可能给予该含大豆蛋白的产品更像乳品的特征。因此，除除去上述“豆腥”异味分子外还产生这些化合物之一或优选两者的发酵可产生具有乳品特征的改进的风味状况，而除除去上述“豆腥”异味分子外不产生或仅低量产生二乙酰和乙醛之一或优选两者的发酵可产生具有更淡味特征的改进的风味状况。由此，可以改进风味状况，还能调整至更淡味或更乳味特征。

通过使用本发明的方法，与根据本发明发酵之前大豆蛋白材料中的这些含量相比，可以在发酵过程中实现风味化合物浓度的下列变化：

· 正己醛浓度降低至少40%，优选至少50%；

· 正戊醛浓度、正庚醛浓度和正壬醛浓度中的至少两种降低至少30%。

同样地，在发酵过程中，(E)-2-己烯醛浓度降低至少20%，优选至少30%。据发现，通过实现这样的降低，产品被察觉到具有低得多的通常与大豆蛋白材料相关的异味水平。

根据进一步的所需用途，本发明的方法优选进一步包括如此发酵的含水组合物的灭菌或巴氏杀菌步骤。也优选将通过本方法获得的发酵产品灌装到容器中，随后密封该容器。任选地，在需要酸性产品时，在灌装到容器中之前向该发酵产品中加入食用酸以将pH调节至小于4.5，且其中在灌装到容器中之前、之中或之后不对该发酵产品施以灭菌或巴氏杀菌。

如果需要如此，在发酵达到产物抑制防止乳酸菌进一步产生乳酸的程度之前，向发酵产品中加入食用酸。

本发明的方法尤其适合制备包含大豆蛋白的饮料，但该方法也可用于制备凝固产品，如凝固酸奶。

借助下列非限制性实施例进一步例示本发明。

实施例

分析方法

通过固相微萃取（SPME）接着GC-MS分析异味挥发物和二乙酰基

将2克样品置于20毫升顶空瓶中并用气密盖密封。借助固相微萃取分析样品。所用纤维：Carboxen/PDMS 85 μm，来自Supelco。在配有Gerstel CIS-4注射器和具有SPME选项的Gerstel MPS-2自动取样器的Agilent GC/MS（MS: LECO Pegasus IV TOF；15次扫描/秒；m/z: 29-250，在1700 V下）上进行分析。柱：VF-5；50m ^* 0.2 mm ^* 0.33 μm。

GC程序：

· 40℃(2 min) -(3°/min)->160℃(0 min)-(20°/min)->250℃ (2 min)

· 气体：氦气

· 流速：1毫升/分钟，恒定流速。

SPME取样时间：在40℃下35分钟

解吸：在170℃下40分钟

不分流(split-less)时间：2分钟。

乙醛的定量分析

将1克样品置于密封150毫升玻璃顶空瓶中。所有样品一式三份分析。通过将乙醛以0、0.2、0.5、2和5 ppm的含量添加到根据实施例1制成的1克大豆基料中，构造外部校准水平。

通过对照添加量绘制离子45（针对乙醛）的峰面积，构造校准线。这些校准线随后用于测定发酵大豆样品中的乙醛量。

在lonicon Analytik PTR-MS（质子传递反应-质谱法）上进行分析。

在1小时均衡时间后，将顶空以33毫升/分钟抽吸到加热输送线路中，其中20毫升/分钟进入电离源，历时0.5分钟。设定漂移压力（drift pressure）（2.2毫巴）、电压（600V）和温度（70℃）以运行在140Td的E/N下的电离条件。

离子质量和监测样品上的乙醛用的停留时间为：

· 在PTR-MS上的监测的离子：45

· 停留时间：500 ms。

感官分析

由专业尝味小组（n＝10）用对大豆和酸奶强度的分级试验评价/闻嗅该发酵产品。

脂肪氧合酶活性

使用如Anthon和Barrett（J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 32-37）充分描述的专用于由亚油酸生成的氢过氧化物的染料偶联检测法分光光度测定脂肪氧合酶活性。

通过在20毫升100 mM pH 6.0 Na₂HPO₄缓冲剂 + 1% w/v NaCl中均化100毫克脱脂大豆磨碎物，随后在4℃下以15,000 rpm离心30分钟和经0.2微米过滤器过滤上清液，获得酶提取物。

向500微升10 mM 3-(二甲基氨基)苯甲酸在100 mM pH 6.0 Na₂HPO₄中的溶液中加入20微升分散在1.4% w/v Tween 20中的27 mM亚油酸和10微升酶提取物。在5分钟后，加入500微升含有0.2 mM 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙和0.1毫克/毫升牛血红蛋白的溶液。

在另外5分钟后，加入500微升1% w/v十二烷基硫酸钠以终止反应。随后测量在598 nm下的吸光度。可以在单个4.5毫升1厘米光程比色皿中进行上述作用。

通过使具有认可活性的来自Sigma-Aldrich的大豆脂肪氧合酶的稀释物反应，制造标准曲线。这用于计算大豆提取物的活性。减去空白读数，其使用在95℃下加热30分钟的变性酶提取物获得。1单位活性是来自亚油酸的氢过氧化作用的在598纳米下每分钟0.001吸光度单位的提高。

活菌计数

通过在MRS琼脂上平板计数含有短乳杆菌、旧金山乳杆菌的样品的适当稀释物和在30℃下厌氧培养3天，测定培养物中的活菌数。使用M17琼脂和在30℃（FD-0013）或37℃（YF-L01）下厌氧培养3天，计数乳酸乳球菌（FD-0013）和嗜热链球菌（YF-L01）混合培养物。数目以每毫升产物的集落形成单位（Cfu/ml）表示。

菌株

短乳杆菌Lb20（CBS122084，依据布达佩斯条约保藏在Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands）

嗜热链球菌YF-L01 DF（可以以此名称获自Chr Hansen, Denmark的商业培养物）

旧金山乳杆菌ATCC27651（免费获自ATCC）

复合乳酸乳球菌培养物FD-0013（可以以编码FD-0013获自Chr Hansen, Denmark）

德氏乳杆菌乳亚种Lb05-14（CBS109270，依据布达佩斯条约保藏在Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands）。

实施例1

嗜热链球菌和短乳杆菌的组合

A：原材料

通过将5.5% Sunopta SSFR粉末（造成2.5%蛋白质的蛋白质浓度）和0.5%蔗糖溶解在水中，制备大豆基料。通过在120℃下热处理12秒来使该混合物防腐，无菌包装并冷却以在5℃下进一步储存。

B：发酵

通过在MRS肉汤中在30℃下培养整夜，制备短乳杆菌Lb20（CBS122084，保藏在Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands）的预培养物。通过在Peptone Physiological盐溶液中洗涤和再悬浮细胞，获得其两倍浓缩培养物。将A下制成的大豆基料加热至30℃并用如此获得的短乳杆菌Lb20的1%浓缩细胞制品接种。

如此获得的含有Lb20的大豆蛋白制品在5分钟内用YF-L01 DF进一步接种并在30℃下培养多达24小时。YF-L01 DF（可以以此名称获自Chr Hansen, Denmark的嗜热链球菌的商业培养物）以冷冻丸粒形式提供并以0.02%计量加入所述大豆基料中。

作为对照物，仅用YF-L01 DF接种一个大豆蛋白样品（与上述A下相同的浓度），也在30℃下培养多达24小时。

仅用YF-L01 DF或用YF-L01 DF和短乳杆菌Lb20的组合接种后，以规则时间间隔测量大豆基料的pH。在接种后(t=0)，在3和8小时后通过在MRS琼脂上平板接种适当稀释物和在30℃下培养2天（为了量化乳杆菌），测量培养物的活菌计数（每毫升的集落形成单位，Cfu/ml）。通过在含有0.5%葡萄糖的M17琼脂上平板接种样品和在37℃下培养2天，量化链球菌。（表 1.1和1.2）。

表1.1 用短乳杆菌和YF-L01发酵的大豆基料的活菌计数。

接种

Cfu/ml MRS

Cfu/ml M17

培养物1/嗜温

培养物2/嗜热

0h

3h

8h

0h

3h

8h

短乳杆菌

&

YF-L01 DF

2.35E+07

3.75E+07

7.30E+07

1.97E+07

1.20E+08

1.67E+08

无

&

YF-L01 DF

1.97E+07

6.55E+07

7.80E+07

表1.2 用短乳杆菌和YF-L01发酵的大豆基料的酸化

。

大豆基料用短乳杆菌以大约2x10⁷ Cfu/ml和嗜热链球菌以大约2x10⁷ Cfu/ml接种。因此，对于短乳杆菌和嗜热链球菌的组合，组合培养物的比率为1:1。

pH测量表明，YF-L01独自在少于3小时内将大豆基料酸化至pH 6.0且产物在30℃下24小时后具有大约4.5的pH。短乳杆菌和YF-L01的混合培养物在3小时内实现酸化至pH 6.0且产物在24小时后具有4.6的pH。嗜热培养物的活菌计数（在M17琼脂上的嗜热链球菌）在与该混合物比较时在该组合中提高至两倍高的水平。在3、8或24小时发酵后收获的300毫升产品通过在水浴中在85℃下培养30分钟来巴氏杀菌，随后评测挥发物和气味。

C：挥发物

对用短乳杆菌Lb20和YF-L01的组合培养物发酵的样品的等分试样和仅用YF-L01发酵的样品的等分试样施以SPME，接着GC-MS分析。发现在用组合培养物发酵的过程中，都被确定为造成异味的戊醛、己醛、庚醛、壬醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和2-庚酮的峰面积如表1.3中所示显著降低。

表1.3 用短乳杆菌和YF-L01发酵的大豆产品中的大豆异味。

	与仅用YF-L01发酵相比3小时后的峰面积降低（%）	与仅用YF-L01发酵相比8小时后的峰面积降低（%）	与仅用YF-L01发酵相比24小时后的峰面积降低（%）
				(E,E)-2,4-癸二烯醛	6%	29%	63%
(E,E)-2,4-庚二烯醛	3%	43%	70%
				(E)-2-己烯醛	45%	44%	30%
(E)-2-壬烯醛	31%	41%	48%
				庚醛	15%	29%	10%
2-庚酮	61%	69%	73%
				己醛	16%	15%	1%
壬醛	15%	39%	47%
				戊醛	29%	40%	47%

分析进一步表明，在用短乳杆菌Lb20和YF-L01的组合发酵的过程中二乙酰基和乙醛的浓度（通过PTR-MS量化）如表1.4中所示改变。

表1.4 用短乳杆菌和YF-L01发酵的大豆产品中的乳味。

	在3小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的降低	在8小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的降低	在24小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的降低
				二乙酰基	6%	29%	76%
乙醛	0.5 ppm	1.5 ppm	1.7 ppm

因此，挥发物分析表明，与仅用嗜热生物体发酵相比，含有短乳杆菌Lb20（嗜温培养物）和嗜热链球菌YF-L01 DF（嗜热培养物）的制品的大豆蛋白联合发酵3小时导致较低量的造成大豆异味的化合物和类似量的造成正面风味印象的组分。相比之下，用嗜温和嗜热培养物的混合物长时间发酵8和24小时导致异味化合物减少，但也导致正面香味化合物的含量降低。

通过仅用嗜热微生物发酵，由于产生例如二乙酰基和乙醛，获得相当强的乳品特征。在发酵中联合使用嗜温和嗜热微生物（根据本发明，在例如以实施例1中的比率使用时）产生比仅用嗜热微生物时低的二乙酰基和乙醛量，但也除去异味。在短发酵时间（例如3小时）后，由于二乙酰基和乙醛的较高含量，乳品特征相当突出，而在8小时后，味道特征的乳味强度较低。通过调节例如嗜温和嗜热微生物之间的比率和发酵时间，可以将味道状况调节至所需味道状况，即淡味或乳味或两者之间。

D：感官

在3小时发酵时间后，对于用培养物的组合接种的大豆基料观察到比仅用嗜热链球菌接种的大豆基料高的酸奶味强度。在8小时发酵后，用培养物的组合接种的大豆基料的酸奶味似乎被察觉到不如仅用嗜热链球菌接种的大豆基料强。感官描述与上述挥发物数据相符。

实施例2

嗜热链球菌和旧金山乳杆菌的组合

A：原材料

B：发酵

通过在MRS肉汤中在30℃下培养整夜，制备旧金山乳杆菌ATCC27651（免费供应）的预培养物。在Peptone Physiological盐溶液中洗涤细胞并浓缩两倍。

将A下制成的大豆基料加热至30℃并用旧金山乳杆菌的1%浓缩细胞制品接种。

如此获得的含有旧金山乳杆菌的大豆蛋白制品在5分钟内用YF-L01 DF进一步接种并在30℃下培养多达24小时。YF-L01 DF（来自Chr Hansen, Denmark的嗜热链球菌培养物）以冷冻丸粒形式提供并以0.02%计量加入所述大豆基料中。

在用单一培养物或用两种培养物的组合接种后，以规则时间间隔测量大豆基料的pH。在接种后(t=0)，在3和8小时后通过在MRS琼脂上平板接种适当稀释物和在30℃下培养2天（为了量化乳杆菌），测定培养物的活菌计数（每毫升的集落形成单位，Cfu/ml）。通过在含有0.5%葡萄糖的M17琼脂上平板接种样品和在37℃下培养2天，量化链球菌（表2.1和2.2）。

表2.1用旧金山乳杆菌和YF-L01发酵的大豆基料的活菌计数。

接种

Cfu/ml MRS

Cfu/ml M17

培养物1/嗜温

培养物2/嗜热

0h

3h

8h

0h

3h

8h

无

&

YF-L01 DF

1.97E+07

6.55E+07

7.80E+07

旧金山乳杆菌

&

YF-L01 DF

1.02E+07

3.70E+08

1.33E+09

1.97E+07

5.15E+08

1.51E+09

表2.2 用旧金山乳杆菌和YF-L01发酵的大豆基料的酸化

。

大豆基料用培养物以旧金山乳杆菌以大约1x10⁷ Cfu/ml和嗜热链球菌以大约2x10⁷ Cfu/ml接种，在旧金山乳杆菌和嗜热链球菌的组合中造成1:2比率。

pH测量表明，YF-L01独自在少于3小时内将大豆基料酸化至pH 6.0且产物在30℃下24小时后具有大约4.5的pH。混合嗜温和嗜热培养物也在3小时内实现酸化至pH 6.0且产物在24小时中具有大约4.5的pH。嗜热培养物的活菌计数（在M17琼脂上的嗜热链球菌）在8小时内提高大约4倍。在与旧金山乳杆菌组合时，发现在24小时后嗜热链球菌增加大约75倍。

在3、8或24小时发酵后收获的300毫升产品通过在水浴中在85℃下培养30分钟来巴氏杀菌，随后评测挥发物和气味。

C：挥发物

对用旧金山乳杆菌和YF-L01的组合培养物发酵的样品的等分试样和仅用YF-L01发酵的样品的等分试样施以SPME，接着GC-MS分析。发现在用组合培养物发酵的过程中，都被确定为造成异味的戊醛、己醛、庚醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和2-庚酮的峰面积如表2.3中所示显著降低。

表2.3 用旧金山乳杆菌和YF-L01发酵的大豆产品中的大豆异味。

	与仅用YF-L01发酵相比8小时后的峰面积降低（%）	与仅用YF-L01发酵相比24小时后的峰面积降低（%）
			(E,E)-2,4-癸二烯醛	57%	38%
(E,E)-2,4-庚二烯醛	49%	55%
			(E)-2-己烯醛	37%	31%
(E)-2-壬烯醛	6%	41%
			庚醛	13%	8%
2-庚酮	29%	66%
			己醛	16%	21%
壬醛	0%	42%
			戊醛	24%	38%

分析进一步表明，在用旧金山乳杆菌和YF-L01的组合发酵的过程中，二乙酰基和乙醛的浓度（通过PTR-MS量化）如表2.4中所示改变。

表2.4 用旧金山乳杆菌和YF-L01发酵的大豆产品中的乳味。

	在8小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的降低	在24小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的降低
			二乙酰基	33%	96%
乙醛	1.5 ppm	1.7 ppm

因此，挥发物分析表明，含有旧金山乳杆菌（嗜温培养物）和嗜热链球菌YF-L01 DF（嗜热培养物）的制品的大豆蛋白联合发酵8和24小时导致较低量的造成大豆异味的化合物，但也导致正面香味化合物的含量降低。

D：感官

在8小时发酵后，用培养物的组合接种的大豆基料的酸奶味似乎被察觉到不如仅用嗜热链球菌接种的大豆基料强。感官描述与上述挥发物数据相符。

实施例3

嗜热链球菌和乳酸乳球菌的组合

A：原材料

B：发酵

YF-L01 DF（来自Chr Hansen, Denmark的嗜热链球菌培养物）和FD-0013（复合乳酸乳球菌培养物，可购自Chr Hansen, Denmark）以冷冻丸粒形式提供并在各自的5分钟内就这样以0.02%（重量）计量加入在A下制成的大豆基料（已加热至30℃）中，并在 30℃下培养多达24小时。

在用单一培养物或用培养物的组合接种后，以规则时间间隔测量大豆基料的pH。在接种后(t=0)通过在含有0.5%葡萄糖的M17琼脂上平板接种适当稀释物和在37℃下培养2天以量化Lactococci和/或链球菌，测定培养物的活菌计数（每毫升的集落形成单位，Cfu/ml）。（表3.1和3.2）。

表3.1 用乳酸乳球菌和YF-L01发酵的大豆基料的活菌计数。

接种			Cfu/ml M17
				培养物1/嗜温		培养物2/嗜热	0h
无	&	YF-L01 DF	1.97E+07
				FD-0013	&	YF-L01 DF	3.10E+07

表3.2 用乳酸乳球菌和YF-L01发酵的大豆基料的酸化

。

大豆基料用培养物以乳酸乳球菌大约1x10⁷ Cfu/ml和嗜热链球菌大约2x10⁷ Cfu/ml接种，在组合发酵中造成大约1:2比率。

pH测量表明，嗜热培养物独自在少于3小时内将大豆基料酸化至pH 6.0且产物在30℃下24小时后具有大约4.5的pH。混合嗜温和嗜热培养物也在3小时内实现酸化至pH 6.0且产物在24小时中具有大约4.5的pH。

C：挥发物

对用乳酸乳球菌和YF-L01的组合培养物发酵的样品的等分试样和仅用YF-L01发酵的样品的等分试样施以SPME，接着GC-MS分析。发现在用组合培养物发酵的过程中，都被确定为造成异味的戊醛、己醛、庚醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和2-庚酮的峰面积如表3.3中所示显著降低。

表3.3 用乳酸乳球菌和YF-L01发酵的大豆产品中的大豆异味

	与仅用YF-L01发酵相比3小时后的峰面积改变*（%）	与仅用YF-L01发酵相比8小时后的峰面积改变*（%）	与仅用YF-L01发酵相比24小时后的峰面积改变*（%）
				(E,E)-2,4-癸二烯醛	39%	-44%	-23%
(E,E)-2,4-庚二烯醛	41%	-33%	-26%
				(E)-2-己烯醛	-20%	-28%	-22%
(E)-2-壬烯醛	-6%	-16%	0%
				庚醛	6%	-59%	-46%
2-庚酮	6%	-10%	-2%
				己醛	-7%	-42%	-50%
壬醛	-17%	17%	-65%
				戊醛	5%	-45%	-24%

^* 负数是指峰面积降低，正数是提高。

分析进一步表明，在用乳酸乳球菌和YF-L01的组合发酵的过程中，二乙酰基和乙醛的浓度（通过PTR-MS量化）如表3.4中所示改变。

表3.4 用乳酸乳球菌和YF-L01发酵的大豆产品中的乳味

	在3小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的改变*	在8小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的改变*	在24小时发酵后，与仅用YF-L01发酵相比，峰面积（%）或ppm的改变*
				二乙酰基	52%	10%	-28%
乙醛	0.5 ppm	0.4 ppm	0.5 ppm

^* 负数是指峰面积降低，正数是提高。

因此，挥发物分析表明，与仅用嗜热生物体发酵相比，含有乳酸乳球菌（嗜温培养物）和嗜热链球菌YF-L01 DF（嗜热培养物）的制品的大豆蛋白联合发酵3小时和8小时导致较低量的许多大豆异味和类似或甚至更高量的造成正面乳味印象的组分。相比而言，用嗜温和嗜热培养物的混合物长时间发酵24小时导致异味化合物减少，但也导致正面香味化合物的含量降低。

D：感官

在3小时和8小时发酵时间后，对于用培养物的组合接种的大豆基料观察到比仅用嗜热链球菌接种的大豆基料高的酸奶味强度。感官描述与上述挥发物数据相符。

实施例4

德氏乳杆菌和短乳杆菌的组合

A：原材料

B：发酵

通过在MRS肉汤中在30℃下培养整夜，制备短乳杆菌Lb20（CBS122084，依据布达佩斯条约保藏在Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands）的预培养物。通过在水中洗涤和再悬浮细胞，获得其两倍浓缩培养物，并测量其OD₆₀₀。通过离心浓缩细胞和以更小体积再悬浮，获得具有8倍高的OD₆₀₀的细胞悬浮液。通过在MRS肉汤中在37℃下培养整夜，制备德氏乳杆菌乳亚种Lb05-14（CBS109270，依据布达佩斯条约保藏在Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands）的预培养物。将细胞浓缩或用水稀释至短乳杆菌 Lb20的相同OD₆₀₀。通过细胞离心和以更小体积再悬浮，获得具有50倍高的OD₆₀₀的细胞悬浮液。

将A下制成的大豆基料用如此获得的短乳杆菌Lb20的1%浓缩细胞制品接种。如此获得的含有Lb20的大豆蛋白制品在5分钟内用Lb05-14的1%浓缩细胞制品进一步接种。

类似地，通过用具有8倍OD600的1% Lb20和1% Lb05-14接种大豆基料，制造培养物的组合。通过用具有50倍OD600的1% Lb20和1% Lb05-14接种大豆基料，制造另一培养物组合。

作为对照物，仅用2% Lb20接种一个大豆蛋白样品（与上述A下相同的浓度）。通过仅用2% Lb05-14接种，制备第二对照物。

在仅用Lb20或仅用Lb05-14或用德氏乳杆菌Lb05-14和短乳杆菌Lb20的不同组合接种后，以规则时间间隔测量大豆基料的pH。在接种后(t=0)、在5和24小时后通过在MRS琼脂上平板接种适当稀释物和在45℃下培养2小时和随后在43℃下培养3-4天（为了量化德氏乳杆菌），测量培养物的活菌计数（每毫升的集落形成单位，Cfu/ml）。通过在含有1 mg/l万古霉素的MRS琼脂上平板接种样品和在30℃下培养3-4天，量化短乳杆菌。（表 4.1和4.2）。

表4.1 用短乳杆菌和德氏乳杆菌发酵的大豆基料的活菌计数

。

表4.2 用短乳杆菌和德氏乳杆菌发酵的大豆基料的酸化

。

在第一组合中用短乳杆菌以大约1.4x10⁷ Cfu/ml和德氏乳杆菌以大约2.1x10⁷ Cfu/ml接种大豆基料。因此，对于短乳杆菌和德氏乳杆菌的组合，组合培养物的比率为1:1.5。对于第二组合，用短乳杆菌以大约1.1x10⁸ Cfu/ml和德氏乳杆菌以大约2.1x10⁷ Cfu/ml接种大豆基料。因此，组合培养物的比率为4.5:1。在第三组合中，用短乳杆菌以大约1.4x10⁷ Cfu/ml和德氏乳杆菌以大约4.2x10⁸ Cfu/ml接种大豆基料。因此，组合培养物的比率为1:30。

pH测量表明，单独的Lb20和单独的Lb05-14在大约6小时内将大豆基料酸化至pH 6.0且产物在30℃下24小时后具有大约5.7的pH。Lb20和Lb05-14的混合培养物在4小时内实现酸化至pH 6.0且产物在24小时后具有大约4.0的pH。嗜热培养物的活菌计数（在MRS琼脂上的德氏乳杆菌）在单一培养物中经5小时略微提高并在混合培养物中经24小时提高至1.5至5倍高的水平。嗜温培养物（在MRS Vm琼脂上的短乳杆菌）的活菌计数在单一培养物中经24小时提高5.5倍并在组合培养物中提高6至30倍。在24小时发酵后收获的500毫升产品通过在水浴中在85℃下培养30分钟来巴氏杀菌，随后评测气味。

C：感官

在24小时发酵时间后，对于用培养物的组合接种的大豆基料观察到比仅用德氏乳杆菌或仅用短乳杆菌接种的大豆基料高的乳味/酸奶味强度，在1:1比率下获得最高强度。在仅用德氏乳杆菌、仅用短乳杆菌和用德氏乳杆菌:短乳杆菌的比率为1:1的组合接种的样品中，豆味特征明显较低。

在这种所选范围内的最佳比率因此是德氏乳杆菌和短乳杆菌之间1:1比率，豆味显著降低并产生乳品特征。

PCT

1	下面作出的指示涉及说明书中下列地方提到的保藏的微生物或其它生物材料：
			1-1	页	13
1-2	行	18-26
			1-3	保藏物的鉴定
1-3-1	保藏机构名	CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
			1-3-2	保藏机构地址	Uppsalalaan 8, NL-3584 CT Utrecht, The Netherlands / P. O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, The Netherlands
1-3-3	保藏日期	2001年1月26日（26.01.2001）
			1-3-4	保藏号	CBS 109270
1-5	指示的指定国	所有指定国
			2	下面作出的指示涉及说明书中下列地方提到的保藏的微生物或其它生物材料：
2-1	页	13
			2-2	行	18-26
2-3	保藏物的鉴定
			2-3-1	保藏机构名	CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
2-3-2	保藏机构地址	Uppsalalaan 8, NL-3584 CT Utrecht, The Netherlands / P. O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, The Netherlands
			2-3-3	保藏日期	2007年11月22日（22.11.2007）
2-3-4	保藏号	CBS 122084
			2-5	指示的指定国	所有指定国

仅供受理局使用

0-4	此表格已随国际申请接收（是或否）	是
			0-4-1	授权官员	Krista Delimon

仅供国际局使用

0-5	此表格已由国际局接收
			0-5-1	授权官员

Claims

1.改变含大豆蛋白的底物的风味的方法，所述方法包括下列步骤：

- 用选自嗜温乳酸菌（LAB）的细菌以10⁵至10⁹ Cfu/ml底物的量接种所述含大豆蛋白的液体，该嗜温乳酸菌选自乳酸乳球菌（包括乳亚种、乳脂亚种和二乙酰乳酸变种）、短乳杆菌、发酵乳杆菌、清酒乳杆菌、旧金山乳杆菌、假肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，和用嗜热乳酸菌（LAB）以10⁵至10⁹ Cfu/ml底物的量接种所述含大豆蛋白的液体，

- 和其中：

o 同时进行用所述嗜温LAB和嗜热LAB接种，或

其中嗜温LAB的细菌和嗜热LAB的细菌以10:1至1:100，优选1:1至1:40的嗜温LAB与嗜热LAB的Cfu比例接种。

2.根据权利要求1的方法，其中嗜热LAB选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌。

3.根据权利要求1或2的方法，其中嗜温培养物是具有25至37℃的最适生长温度的培养物。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其中嗜热培养物是具有高于40℃和低于50℃，优选40-46℃，更优选41-45℃的最适生长温度的培养物。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其中被接种的灭菌或巴氏杀菌的含水液体包含1至10重量%，优选1至8重量%的量的大豆蛋白。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其中被接种的灭菌或巴氏杀菌的含水液体包含0.1至10重量%，优选0.2至5重量%的量的碳水化合物。

7.根据前述权利要求任一项的方法，其中该碳水化合物包含单糖和/或二糖。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其中在发酵之前、之中或之后添加总共少于该发酵产品的6重量%的二糖。

9.根据前述权利要求任一项的方法，其中在25至40℃的温度下进行发酵。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其中在发酵过程中发生风味化合物浓度的下列变化：

· 正己醛浓度降低至少40%，优选至少50%；

11.根据前述权利要求任一项的方法，其中在发酵过程中，(E)-2-己烯醛浓度降低至少20%，优选至少30%。

12.根据前述权利要求任一项的方法，其中该方法包括进一步的步骤，该步骤包括将如此发酵的含水组合物灭菌或巴氏杀菌。

13.根据前述权利要求任一项的方法，包括将该发酵产品灌装到容器中，随后密封该灌装容器，其中在灌装到容器中之前向该发酵产品中加入食用酸以将pH调节至小于4.5，且任选在灌装到容器中之前、之中或之后不对该发酵产品施以灭菌或巴氏杀菌。

14.根据权利要求13的方法，其中在发酵达到产物抑制防止乳酸菌进一步产生乳酸的程度之前，向所述发酵产品中加入所述食用酸。

15.根据前述权利要求任一项的方法，其中由选自大豆分离物、大豆浓缩物、大豆粉及其组合的大豆蛋白源制备含有0.5-15重量%的溶解大豆蛋白的含水液体，所述大豆蛋白源衍生自表现出小于15 kU/mg，更优选小于10 kU/mg的脂肪氧合酶活性的大豆。

16.根据前述权利要求任一项的方法，其中该底物是液体，且所得产品是饮料。