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CN102448287A - 用于促进植物的次生细胞壁形成的方法 - Google Patents

用于促进植物的次生细胞壁形成的方法 Download PDF

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CN102448287A CN2010800239474A CN201080023947A CN102448287A CN 102448287 A CN102448287 A CN 102448287A CN 2010800239474 A CN2010800239474 A CN 2010800239474A CN 201080023947 A CN201080023947 A CN 201080023947A CN 102448287 A CN102448287 A CN 102448287A
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佐藤茂
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Abstract

提供的是用于增加植物的次生细胞壁厚度的方法。通过使用使用管状分子分化（TED）相关蛋白质或其C末端片段用于增加植物的次生细胞壁厚度的方法，其包括：构建转基因（Tg）植物，所述转基因植物以可表达方式包含编码一种或多种蛋白质的DNA，所述蛋白质选自TED6与TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段与TED7的C末端片段的组合，并且在所述植物内表达所述DNA；Tg植物；及其后代、细胞、组织或种子。

Description

用于促进植物的次生细胞壁形成的方法
技术领域
本发明涉及具有促进植物的木纤维次生细胞壁形成的功能的蛋白质，编码该蛋白质的DNA及其用途。
背景技术
人类长久以来已在各种工业领域中使用木质生物质(woody biomass)例如树干、根、叶和枝，所述工业领域包括造纸、建筑、饲料生产、燃料生产等。其中利用木质生物质的工业考虑到全球环境问题的改善而再次得到认识，因为它们使得能够在未来使用可持续性使用资源。因此，此类工业预期是再循环导向的工业，其利用碳源代替目前的化石资源。因此，为了稳定和可持续地保证木质生物质，主要针对桉属（Eucalyptus）、金合欢属（Acacia）等的快速生长树的造林工业在全世界得到促进。
木质生物质由植物茎的次生木质部中存在的导管细胞和木纤维细胞组成。这些细胞特征均在于在细胞内的次生细胞壁形成，所述次生细胞壁由纤维素、半纤维素和木质素组成。占大多数次生木质部的木纤维细胞用作工业领域中的木质生物质（非专利文献1）。木纤维细胞的次生细胞壁的量（厚度程度）是非常重要的，因为它影响生物质的量或木纤维的物理性质。
近年来，使用木质生物质的生物能生产和生物精炼已变得越来越普及，这是众所周知的。考虑到生产力的改善和成本降低，增厚次生细胞壁以增加生物质的量是非常有益的。此外，当木质生物质视为用于常规造纸的原料时，考虑到用于绒毛纸（bulky paper）等的生产力的改善和成本降低，增厚次生细胞壁以增加生物质的量是非常有利的，对于所述绒毛纸等需要具有厚次生细胞壁和高Runkel比（次生细胞壁与腔比）水平的木纤维。
与造林计划的未来发展一致，促进作为木质生物质主要来源的木纤维细胞的次生细胞壁形成，以改变生物质（纤维素、半纤维素和木质素）的量，并且改变木纤维的形态（例如Runkel比）。因此，可以预期未来用于能量应用或作为工业原料的扩展用途。因此，用于促进木纤维细胞的次生细胞壁形成的方法的开发对于实现在全球规模上木质生物质的更高效和有效生产是非常重要的。
用于促进次生细胞壁形成的几种方法迄今已变得已知（专利文献1 – 5和非专利文献2 - 5）。然而，它们不能投入实际使用，因为其中许多涉及促进除木纤维外的植物细胞的次生细胞壁形成，并且该促进作用引起的细胞和次生细胞壁的量是极低的。进一步地，尽管存在用于促进木纤维细胞的次生细胞壁形成的技术，但它们不能在实际上使用，因为观察到不利影响例如矮化。如上所述，难以使用目前已知的技术促进木纤维细胞的次生细胞壁形成。
本发明人已发现其表达在导管细胞形成后被特异性诱导的许多基因（非专利文献6）。由本发明人发现的基因群包括未知功能的许多基因，并且这些基因考虑为在导管形成中起一些作用。导管细胞和木纤维细胞彼此高度类似，因为2种细胞都在细胞内形成次生细胞壁，并且它们都被称为源于管胞。因此，考虑这些基因的功能分析可以使得能够不仅对于导管细胞、还对于木纤维细胞控制次生细胞壁形成。然而，不存在此类技术或发现。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1] 日本专利号4068152
[专利文献2] 日本专利公开（特表）号2003-509009 A
[专利文献3] 日本专利公开（特开）号2006-246852 A
[专利文献4] 日本专利公开（特表）号2006-526990 A
[专利文献5] 日本专利公开（特开）号2008-178422 A。
[非专利文献]
[非专利文献1]Evert，RF. Esau’s Plant Anatomy，Meristems，Cells，and Tissues of the Plant Body：their Structure，Function，and Development. 3rd ed. New Jersey：John Wiley &Sons，Inc.
[非专利文献2] Kubo等人，2005 Genes & Dev. 19:1855-1860
[非专利文献3] Goicoechea等人，2005 The Plant Journal 43:553-567
[非专利文献4] Mitsuda等人，2005 The Plant Cell 17:2993-3006
[非专利文献5] Zhong等人，2006 The Plant Cell 18:3158-3170
[非专利文献6] Demura，T.和Fukuda，H. 2007 Trends in Plant Sci. 12:64-70。
发明概述
本发明解决的课题
本发明已考虑到上述情况来实现。本发明的目的是提供使用为未知功能的基因的TED6和TED7的方法，和其中次生细胞壁形成得到促进的植物。
用于解决课题的方法
本发明人已预测为植物的管状分子分化（tracheary element differentiation，TED）相关蛋白质的TED6或TED7可能涉及植物次生细胞壁的纤维素合成和模式形成。然而，他们已揭示单独的此类蛋白质不具有这种功能。进一步深入研究的结果是，他们已完成了具有下述特征的本发明。
简言之，本发明具有下述特征。
在第一个方面，本发明提供了使用TED相关蛋白质或其C末端片段用于增加植物的次生细胞壁厚度的方法，其包括：产生转基因植物，所述转基因植物以可表达方式（即，从而可以表达基因）包含编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合；并且引起该DNA在该植物内的表达。
在上述方面的一个实施方案中，上述TED6或TED7的C末端片段由下述组成：缺乏在TED6或TED7的成熟氨基酸序列中从N末端到跨膜结构域的序列的氨基酸序列，或在缺乏所述序列的氨基酸序列的N末端侧和/或C末端侧上包含一个或数个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列。
此处，“几个”指示10或更少的整数；即2 – 10的整数。
在第二个方面，本发明提供了转基因植物或其后代植物，其特征在于它以可表达方式包含编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自如上所述TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合，并且与野生型植物比较次生细胞壁的厚度增加。
在第三个方面，本发明进一步提供了衍生自上述转基因植物或其后代植物的细胞或组织。
在第四个方面，本发明进一步提供了上述转基因植物或其后代植物的种子。
日本专利申请号2009-086922的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容引入本文作为参考，所述日本专利申请是本申请的优先权文件。
发明效果
本发明的方法使得能够促进植物的木纤维细胞中的次生细胞壁形成，并且从而增加次生细胞壁的厚度。次生细胞壁的增厚是有利的，因为它可以导致增加量的生物质。
附图简述
图1显示Ze TED6、Ze TED7及其C末端片段的超表达对百日菊（Zinnia elegans）细胞的次生细胞壁形成的作用。垂直轴指示具有可见次生细胞壁的细胞百分率（％）。图1A显示全长Ze TED6和Ze TED6的C末端片段（SEQ ID NO:1的27Leu-95Ala）的超表达。图1B显示全长Ze TED7-1和Ze TED7-1的C末端片段（SEQ ID NO：2的209Trp-300Gly）的超表达。图1C显示Ze TED6和Ze TED7的共超表达。进一步地，在图1中，GUS（β-葡糖醛酸酶）指示其中GUS而不是Ze TED6、Ze TED7或其C末端片段超表达的植物对照。
图2-1显示：百日菊TED6和TED7（即Ze TED6和Ze TED7）的氨基酸序列以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）、毛果杨（Populus trichocarpa）和水稻（Oryza sativa）同源物的氨基酸序列的比对（图2A）；显示根据邻接法使用MEGA4（Molecular Evolutionary Genetics Analysis软件版本4.0；Tamura，K.等人，（2007）Mol. Biol. Envol. 24：1596-1599）的保守区比较的树状图（图2B）；和用于图2B中的制备的氨基酸序列的相对保守C末端区（图2C）。在图2A中，粗体字母指示跨膜结构域，并且下划线指示实施例中使用的克隆Z1943和Z16653的氨基酸序列。Os08g0108300包含2个重复的C末端结构域（图2A）。图2B显示分开的Os08g0108300的2个保守重复的C末端结构域。
图2-2显示：百日菊TED6和TED7（即Ze TED6和Ze TED7）的氨基酸序列以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）、毛果杨（Populus trichocarpa）和水稻（Oryza sativa）同源物的氨基酸序列比对（图2A）；显示根据邻接法使用MEGA4（Molecular Evolutionary Genetics Analysis软件版本4.0；Tamura，K.等人，（2007）Mol. Biol. Envol. 24：1596-1599）的保守区比较的树状图（图2B）；和用于图2B中的制备的氨基酸序列的相对保守C末端区（图2C）。在图2A中，粗体字母指示跨膜结构域，并且下划线指示实施例中使用的克隆Z1943和Z16653的氨基酸序列。Os08g0108300包含2个重复的C末端结构域（图2A）。图2B显示分开的Os08g0108300的2个保守重复的C末端结构域。
图3显示在拟南芥的根中At TED6和At TED7基因的瞬时RNAi分析的结果。图3A显示在瞬时诱导的RNAi的条件下At TED6和At TED7基因的表达。对应于At TED6、At TED7以及其两者的反向重复序列在糖皮质激素介导的诱导系统的控制下在转基因拟南芥植物中瞬时表达。总RNAs在补充有10 μM地塞米松的生长培养基上温育5小时后从1周大的拟南芥幼苗中提取。所有RT-PCR样品在相同条件下制备，除了对于At TED6采用25个PCR循环，并且对于At TED7和泛素采用30个PCR循环外。图3B – 图3E显示At TED6和At TED7基因的RNAi系的表型。三（3）周大的转基因拟南芥植物在补充有10 μM地塞米松的生长培养基上温育5天，从而使得使用糖皮质激素介导的诱导系统表达反向重复序列。在温育过程中，检查在更缓慢发育的根中RNAi对导管形成的作用。在图3B中，条(bar)指示50 μm。图3B显示野生型Col-0。图3C显示At TED7 RNAi系，显示为梯纹的线性延长的后生木质部导管。图3D显示At TED6-TED7嵌合体RNAi系，并且具体显示在线性延长的后生木质部导管的缺失。图3E显示YFP RNAi系，并且具体显示具有大凹陷的后生木质部导管分子。此处，“YFP”指示黄色荧光蛋白质。
用于执行本发明的实施方案
（编码TED6和TED7蛋白质的DNA）
TED6和TED7都是与管状分子例如植物的导管分化相关的I型膜蛋白质。这些蛋白质在植物细胞中同时超表达时导致导管细胞或木纤维细胞的次生细胞壁形成的促进。
在许多植物物种中，TED6和TED7具有特征性结构，其从N末端侧由富含脯氨酸（Pro）的结构域、单次跨膜（TM）结构域和C末端结构域组成。富含脯氨酸的结构域是细胞外结构域，而C末端结构域是细胞质结构域。一般而言，众所周知在植物细胞外蛋白质中，富含脯氨酸的序列是富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGPs）特有的。特别地，TED7假定为HRGP，尽管Ze TED7缺乏在HRGP家族中一般观察到的重复序列。
图2显示包括百日菊、拟南芥、毛果杨和水稻的示例性植物的TED6和TED7的氨基酸序列比对（图2A），和上述氨基酸序列中相对保守的C末端区的氨基酸序列（图2C）。尽管在来自不同物种的植物的TED蛋白质间的序列同一性低，但应当理解，基于它们具有上述特征性结构域结构的事实，上述示例性蛋白质属于管状分子分化相关的蛋白质家族。
衍生自这些植物的TED6和TED7的氨基酸序列在序列表中以下述SEQ ID NOS列出。
百日菊TED6、TED7-1和TED7-2：SEQ ID NO：1（AB377514）、SEQ ID NO：2（AB377515）和SEQ ID NO：3（AB377516）
拟南芥TED6和TED7：SEQ ID NO：4（Atlg43790）和SEQ ID NO：5（At5g48920）
毛果杨TED6和TED7：SEQ ID NO：6（eugene3. 00020671）和SEQ ID NO：7（eugene3．00070382）、SEQ ID NO：8（fgenesh1_pg．C_LG_V000008）（此处，SEQ ID NOS：7和8的序列属于TED7。）
水稻TED：SEQ ID NO：9（Os08g0108300）（（注）SEQ ID NO：10（Os08g0108300_1st：TERKAEVHNL SGHVHVHKAT ESGPSGAKAT VLSIDEDLKF QEVAG）和SEQ ID NO：11（Os08g0108300_2nd：AENKAELINV TEHIHVDEKI VSGPQGQKIE ILSEDEDIRF EEEGR）（此处，SEQ ID NOS：10和11的序列是通过分开SEQ ID NO：9的序列中的重复结构域制备的部分序列））
进一步地，跨膜区和C末端结构域的氨基酸序列的氨基酸残基位置（图2A）、以及这些氨基酸序列中相对保守的C末端区（图2C）可以基于SEQ ID NOS：1-11的氨基酸序列和图2中列出的序列进行确定。
关于可以在本发明中使用的TED6、TED7及其C末端片段，突变可以引入野生型氨基酸序列内，只要TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段或TED7的C末端片段促进导管细胞或木纤维细胞的次生细胞壁形成的能力未丧失。此类突变型TED6和TED7与野生型氨基酸序列具有70％或更多或80％或更多、优选90％或更多或95％或更多、且进一步优选98％或更多或99％或更多同一性。氨基酸突变是例如1个或多个（优选几个）氨基酸的缺失、置换或添加。置换希望是保守氨基酸置换。术语“保守氨基酸置换”指关于例如就结构、电学、极性或疏水性而言具有相似特性的氨基酸的置换。此类特性还可以例如基于氨基酸侧链的相似性进行分类。具有碱性侧链的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有酸性侧链的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。具有不荷电极性侧链的氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等。具有疏水性侧链的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。具有分支侧链的氨基酸包括苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。具有芳香族侧链的氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和组氨酸。
如上所述编码TED6、TED7及其C末端片段的DNAs还可以包含一个或多个突变。此类突变的例子包括基于遗传密码的简并性的突变（即沉默突变）、剪接突变、由于多态性的突变。进一步地，上述突变型DNA的例子还包括包含能够在严格条件下与野生型DNA杂交的核苷酸序列的突变体。在这种情况下，以TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、或TED7的C末端片段的形式，由此类DNA编码的突变型蛋白质应具有促进导管细胞或木纤维细胞的次生细胞壁形成的能力。此类能力可以等价于或高于野生型蛋白质的能力，或可以次于野生型蛋白质的能力。编码突变型TED6和突变型TED7的DNAs与野生型成熟的核苷酸序列具有70％或更多或80％或更多、优选90％或更多或95％或更多、且更优选98％或更多或99％或更多同一性。
此处，严格条件的例子包括包含在约42℃ - 55℃用2 - 6 × SSC杂交和在50℃ - 65℃用0.1 - 1 × SSC和0.1％- 0.2％SDS的一轮或数轮洗涤的条件。此类条件可以取决于模板核酸的GC含量、离子强度、温度等而改变，并且从而它们不限于上述特定条件。此处，1 × SSC由在pH 7.0的0.15 M NaCl和0.015 M柠檬酸钠组成。一般而言，这样测定严格条件，使得温度比在指定离子强度和pH下特定序列的解链温度（Tm）低约5℃。此处，术语“Tm”指与模板序列互补的探针的50％以平衡状态与模板序列杂交的温度。
例如，定点诱变、使用PCR的诱变等可以优选作为用于人工引入突变的技术采用（Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，John Wiley & Sons）。
如本文使用的，术语“同一性”意指例如当2个氨基酸序列或核苷酸序列含或不含缺口的引入比对时，等同氨基酸或核苷酸数目与观察到的氨基酸或核苷酸总数目的比（％）。
进一步地，同源序列搜索或同源性搜索可以使用已知算法例如BLAST（例如BLASTN、BLASTP和BLASTX）或FASTA执行。
来自除上文示例那些外的植物的TED6和TED7蛋白质的氨基酸序列和编码此类蛋白质的DNAs的核苷酸序列可以通过访问在其下对公众开放植物基因组的网站而获得，例如NCBI（U.S.A.）、EBI（Europe）、KAOS（Kazusa DNA Research Institute）、IRGSP（International Rice Genome Sequencing Project）、GrainGenes（U.S.A.）、PGDIC（U.S.A.）、ForestGEN（Forestry and Forest Products Research Institute）。
根据本发明，特别地，TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合在促进导管细胞或木纤维细胞的次生细胞壁形成中具有重要功能。
此处，通过在植物或植物细胞内基本上同时表达编码TED6和TED7的DNAs随后翻译成蛋白质，可以实现“TED6和TED7的组合”。在这种情况下，对于DNAs的表达，2个DNAs可以以可表达方式掺入分开的载体内，或2个DNAs可以以可表达方式串联掺入相同载体内。
进一步地，在“TED6的C末端片段”或“TED7的C末端片段”中的“C末端片段”可以由TED6或TED7蛋白质的细胞质侧上的C末端结构域（即，具有缺乏在成熟氨基酸序列中从N末端到跨膜结构域的序列的氨基酸序列的结构域）组成。可替代地，C末端片段可以具有在C末端结构域的氨基酸序列中在N末端侧和/或C末端侧上具有一个或数个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列。在后面一种情况下，例如，来自侧接C末端结构域的跨膜区的约1 – 3个氨基酸残基可以加入C末端片段的N末端侧上。可替代地，例如在C末端侧上的序列的一部分（例如10个或更少的氨基酸残基）可以从C末端结构域的氨基酸序列中缺失。通常，希望本发明中的上述C末端片段包含如图2C中所示在植物中相对保守的氨基酸序列，并且具有促进导管细胞或木纤维细胞的次生细胞壁形成的能力。编码此类C末端片段的DNA可以通过执行聚合酶链反应（PCR）获得，其使用编码TED6或TED7蛋白质的DNA作为模板，和基于在编码C末端结构域的核苷酸序列中待扩增的序列制备的5’和3’引物（其可以任选包含在跨膜区的C末端侧上的1 – 3个氨基酸残基）。随后，将如此制备的DNA掺入合适载体内。
关于PCR法和对其的条件，采用通常技术，其由在PCR缓冲液中以及在热稳定的DNA聚合酶（例如，Taq聚合酶）、有义引物、反义引物、dNTPs（N=A、T、G、C）和模板DNA的存在下的扩增循环组成，所述扩增循环包括变性（例如，94℃，20秒 – 5分钟）、退火（例如，55℃，30秒 - 1分钟）和延伸（例如，72℃，30秒 - 10分钟）的约20 – 40个循环。具体技术例如在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，John Wiley & Sons中描述。扩增产物可以使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离且纯化。
附带提及地，在下文实施例中使用的百日菊TED6和TED7-1的C末端片段的氨基酸序列分别是范围从SEQ ID NO：1中的27Leu到95Ala的序列和范围从SEQ ID NO：2中的209Trp到300Gly的序列。
此外，如在“TED6和TED7的组合”的情况下，通过在植物或植物细胞内基本上同时表达编码TED6蛋白质的C末端片段的DNAs和编码TED7蛋白质的C末端片段的DNA随后翻译成蛋白质，可以实现“TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合”。在这种情况下，对于DNAs的表达，2个DNAs可以以可表达方式掺入分开的载体内，或2个DNAs可以以可表达方式串联掺入相同载体内。
上述DNAs和包含其的载体可以例如通过基因工程技术产生。作为基因工程技术，例如，可以采用Sambrook等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，John Wiley & Sons等中描述的技术。
简言之，例如，编码TED6或TED7的DNA可以使用基于已知序列制备的引物通过PCR从植物组织衍生的cDNA文库扩增。例如通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA，并且随后将DNA以可表达方式插入合适的表达载体内。
载体的例子包括双元载体和其他载体。双元载体包含土壤杆菌属（Agrobacterium）T-DNA的2个约25-bp边界序列，右边界（RB）和左边界（LB），在其间插入外源DNA。双元载体的例子包括pBI载体（例如pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBI221（Clontech））、pGA482、pGAH和pBIG。其他载体的例子包括中间质粒，例如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200和包含GATEWAY盒的pH35GS（Kubo等人，2005，Genes & Dev. 19：1855-1860）。将启动子连接到外源DNA的5'末端。启动子的例子包括花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、胭脂碱合酶基因启动子、玉米泛素启动子、章鱼碱合酶基因启动子和稻肌动蛋白启动子。进一步地，将终止子（例如胭脂碱合酶基因终止子）插入外源DNA的3'末端。将转化细胞选择所需的选择标记进一步插入载体内。选择标记的例子包括药物抗性基因，例如卡那霉素抗性基因（NPTII）、潮霉素抗性基因（htp）和双丙氨磷抗性基因（bar）。
（转基因植物的产生）
用于将因而构建的载体引入植物内的转化方法的例子是使用土壤杆菌属的方法。载体还可以使用其他方法引入，例如基因枪、电穿孔、病毒载体、花序浸渍法( floral dip method)、叶盘法。植物转化技术和组织培养技术例如在Isao Shimamoto and Kiyotaka Okada（supervisors），Shokubutsu Saibou Kougaku Series 15，Model Shokubutsu No Jikken Protocol，Idengakuteki Shuhou Kara Genome Kaiseki Made（Plant Cell Technology Series 15，Model Plant Experimental Protocols，From Genetic Techniques to Genome Analysis），2001，Shujunsha中描述。
根据使用双元载体-土壤杆菌属系统的方法，制备植物细胞、愈伤组织或植物组织切片，并且随后用土壤杆菌属感染，以便将编码本发明的蛋白质的DNA引入植物细胞内。在转化后，苯酚化合物（乙酰丁香酮）可以加入培养基中。特别地，在单子叶植物的情况下，细胞可以进行有效转化。进一步地，作为土壤杆菌属，可以使用根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株（例如C58、LBA4404、EHA101、EHA105和C58C1RifR）。
转化培养基是固体培养基。例如，植物培养基例如MS培养基、B5培养基、DKN培养基或Linsmaier & Skoog培养基用作基础培养基。可以向培养基中加入1％- 5％糖例如麦芽糖、蔗糖、葡萄糖或山梨糖醇，以及0.2％- 1％多糖固化剂例如琼脂、琼脂糖、Gelrite或吉兰糖胶。酪蛋白氨基酸，脱落酸，生长素或细胞分裂素例如激动素(kinetin)，2,4-D，吲哚乙酸或吲哚丁酸，抗生素例如卡那霉素、潮霉素或羧苄青霉素，乙酰丁香酮等可以加入培养基中。对于培养基优选的pH范围为5 – 6，例如pH 5.5 - 5.8。进一步地，诱导转录激活的物质例如类固醇激素（例如糖皮质激素、地塞米松、雌激素或其衍生物）可以在转化后加入培养基中。
特别地，通过在约25℃在黑暗中培养约4天制备土壤杆菌属悬浮液。将植物愈伤组织或组织（例如叶片、根、茎切片或生长点）浸入细菌悬浮液中数分钟，去除水分，并且随后将生成物置于固体培养基上用于共培养。愈伤组织是植物细胞的团块，其可以使用愈伤组织诱导培养基由植物组织切片、完全成熟的种子等进行诱导。转化的愈伤组织或组织切片基于选择标记进行选择。在愈伤组织的情况下，随后使用再分化培养基可以引起它们再分化成不定枝。同时，在植物切片的情况下，愈伤组织可以由植物切片诱导，并且随后诱导且引起再分化成不定枝，或可以由植物切片制备原生质体，并且随后在愈伤组织培养后引起其再分化成不定枝。将如此获得的不定枝在生根后移植到土壤内，从而使得它们再生成植物。
进一步地，当使用花序浸渍法时，例如如由Clough和Bent等人（Plant J. 16，735-743（1998））描述执行该方法，例如如下：通过在约25℃在黑暗中培养约4天制备土壤杆菌属悬浮液，将已生长直至未成熟的花芽发育的待转化的植物宿主的花芽浸入细菌悬浮液中10秒，并且随后用罩保持静置过夜以保持湿度；第二天去除罩，允许植物生长并且随后收获种子；通过将收获的种子种植到补充有合适选择标记例如抗生素的固体培养基上，可以选择转化个体；将如此选择的个体移植到土壤内且允许生长，从而使得可以获得转基因植物的下一代种子。
通过使转基因植物与野生型植物杂交，可以产生具有与转基因植物类似的新表型的后代植物。
通过上述方法产生的转基因植物或其后代植物特征在于它们以可表达方式包含编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合，并且与野生型植物比较次生细胞壁的厚度增加。
因此，本发明进一步不仅提供了此类转基因植物或其后代植物，还提供了来自它们的细胞或组织或种子。
本发明的主题植物的例子包括但不限于植物例如双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和树。特别有用的植物的例子包括作为生物质资源重要的木本植物和草本植物，例如桉属、白杨、甘蔗、稻和早熟禾亚科（Pooideae）。
（TED6和TED7的次生细胞壁形成-促进功能）
本发明人已假定在使用拟南芥的研究过程中，TED6和TED7可能涉及导管的次生细胞壁合成（T. Demura，“Regulatory Mechanisms Underlying Xylogenesis in Arabidopsis，as a Model for Wood Formation,” Abstracts in FUNCFIBER 2008 International Symposium on the Biology and Biotechnology of Wood，第12页（2008））。然而，已揭示单独的TED6或TED7实际上不具有促进次生细胞壁形成的功能。
本发明人已首次发现，使用RNA干扰（RNAi）方法，选自TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合的蛋白质具有如本文描述的促进导管细胞和木纤维细胞的次生细胞壁形成的能力。根据本发明的这些蛋白质、其C末端片段及其例子如上所述。
如通过细胞内定位的分析结果揭示的，TED6和TED7蛋白质主要存在于植物细胞的质膜中，并且还以一定程度存在于细胞壁中。在其中，TED7趋于以比TED6更高的水平保留在细胞壁中。这可能是由于TED7的富含脯氨酸的N末端结构域的相互作用。在结构上，TED6具有比TED7的那种短很多的富含脯氨酸的N末端结构域。因此，假定TED6不太可能保留在细胞壁中。关于TED6，使用拟南芥的实验结果揭示TED6与纤维素合酶CesA的IRX3亚单位结合。这是证实TED6与次生细胞壁-CesA复合物相互作用的证据。
实施例
本发明将通过下文实施例更详细地描述，这不应解释为限制本发明的范围。
[实施例1]
在百日菊属（百日菊）植物的管状分子中Ze TED6和Ze TED7基因的功能分析
基于Ze TED6和Ze TED7蛋白质的生物信息学分析（包括SOSUI、TMHMM和SignalP），这2种蛋白质都预测为“I型跨膜蛋白质”（具有细胞外或腔N末端和细胞质C末端的单次跨膜蛋白质）。上述蛋白质包含一般单次跨膜结构域样疏水区（分别代表Ze TED6蛋白质和Ze TED7蛋白质的的95个氨基酸中的23个和300个氨基酸中的23个氨基酸）。预测其C末端将定位于细胞质侧上。然而，关于这些蛋白质的潜在活性，尚未通过ProDom、PROSITE或Pfam预测功能结构域。仅富含Pro的区域已在Ze TED7蛋白质的N末端区域中得到鉴定。众所周知在细胞外植物蛋白质中，富含Pro的序列是富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGPs）。Ze TED7可能是HRGP，尽管它不具有在HRGP家族中一般观察到的任何重复的基序。
通过利用电穿孔将编码其C末端融合有YFP（黄色荧光蛋白质）的蛋白质的质粒引入百日菊叶肉内，经实验检查Ze TED6或Ze TED7的细胞内定位，所述蛋白质由CaMV 35S启动子驱动（Endo等人，（2008）Plant J. 53：864-875）。来自每种融合蛋白的荧光信号仅在细胞的外周区中检测到，指示蛋白质在质膜和/或细胞壁中的定位。利用质壁分离细胞，明确指示蛋白质主要定位于质膜中，并且还以一定程度定位于细胞壁中。Ze TED7-YFP融合蛋白以比Ze TED6-YFP融合蛋白更高的水平保留在细胞壁中。这可以通过Ze TED7蛋白质的富含Pro的N末端结构域和细胞壁之间的可能相互作用加以解释。
基于代表可见TE SCW的细胞数目，使用dsRNA介导的RNAi法，检查全长Ze TED6或Ze TED7蛋白质的超表达对TE SCW（次生细胞壁）形成的作用。此外，对于这些蛋白质的C末端结构域执行相似检查，从而评估上述细胞质结构域在SCW形成中的功能。结果是，当单独使用C末端结构域（并非全长蛋白质）时，发现轻微但显著的增加（与作为对照的超表达GUS比较增加几个百分点）。因此，使用低密度细胞培养物（0.5 × 105细胞/mL-1），以便观察到对SCW形成的正面作用。此类培养物通常导致在对照中低百分率的SCW形成（小于30％）。从而证实SCW形成的百分率随着使用C末端结构域的统计显著性增加（图1A和图1B）。类似地，全长Ze TED6蛋白质和全长Ze TED7蛋白质的同时超表达导致SCW形成的百分率增加（图1C），指示在TE的SCW形成中Ze TED6蛋白质和Ze TED7蛋白质之间的功能相互作用。
[实施例2]
在属于十字花科（Brassicaceae）（拟南芥属）的植物中At TED6和At TED7的功能分析
发现在拟南芥属中Ze TED6和Ze TED7基因的同源物分别为At1g43790（At TED6）和At5g48920（At TED7）。使用At TED6和At TED7的1 kb-和0.5 kb-上游序列检查At TED6和At TED7的启动子活性。GUS报道基因与这些上游序列连接。在不定枝中报道转基因的表达局限于经历关于2种基因的分化的导管分子，证实与Ze TED6和Ze TED7的功能同源性。将YFP报道基因与At TED6和At TED7的编码序列的N末端连接，并且随后基因在其自身启动子的控制下表达。At TED6信号和TED7-YFP信号仅在经历分化的原生木质部和后生木质部导管分子中生成的SCW下特别观察到。这些信号的不一致定位在某些情况下在后生木质部导管分子中观察到，尽管其生物学意义仍是未知的。
为了检查At TED6和At TED7的功能，产生具有CaMV 35S启动子已与之连接的At TED6或At TED7的全长、C末端或反向重复（RNAi）的转基因拟南芥属。然而，除了具有At TED7的反向重复的拟南芥属外，未观察到急剧的形态学改变。
转基因植物不能在发芽培养基上生长，但它们在愈伤组织诱导培养基上存活。这指示At TED7基因功能的组成性丧失导致在RNAi分析时不定枝的死亡。
为了进一步检查At TED6和At TED7的功能丧失，搜索关于插入突变体的SALK T-DNA数据库（http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress）。对于At TED6不能获得系，尽管对于At TED7可以获得T-DNA/转座子插入系（SALK_084115，SALK_089549和SM_2_30444）。在At TED7的编码区中未观察到插入，但在At TED7的5’或3’侧翼区中观察到插入。这些结果证实插入不导致At TED7的敲除突变体。
使用地塞米松（DEX）诱导型启动子（Aoyama和Chua（1997）Plant J. 11：605-612）代替At TED7的组成性RNAi。将诱导型启动子已与之连接的At TED6、At TED7、At TED6和At TED7的嵌合体、以及YFP（对照）的各自反向重复序列引入拟南芥属植物内。通过选择包含诱导性RNAi构建体且在非诱导条件下充分生长的植物选择转化株。可以获得At TED7 RNAi和At TED6-TED7嵌合体RNAi的少数转化株。将其考虑为是由于引起不定枝中的死亡的At TED7反向重复的其余“泄露”表达。在植物暴露于10 μM地塞米松5小时后选择的幼年植物系中，对于每种靶转录物经由RT-PCR检查诱导性RNAi的效率（图3A）。通过在补充有10 μM地塞米松的生长培养基上温育植物5天，对于3周大的拟南芥属植物执行诱导性RNAi（图3B – 图3F）。出乎意料地揭示DEX诱导性RNAi自身具有独特效应，包括在SCW上具有异常大的凹陷的根的后生木质部导管形成，以及在某些情况下根的原生木质部导管形成的抑制（图3E）。除上述独特效应外，在At TED7和At TED6-TED7嵌合体的诱导性RNAi系中引起在根的导管分子的SCW形成中的明确缺陷（图3B和图3C）。在这2个系中，形成具有罕见梯纹SCW的异常导管分子（图3C）而不是通常形成丛状或凹陷的SCW的后生木质部导管（图3B）。此外，At TED6-TED7嵌合体RNAi系显示在后生木质部中的不连续或缺陷导管（图3D）。At TED6-TED7嵌合体RNAi系的根的透射电子显微镜检查揭示，具有不完全的薄SCW的导管（这假定代表梯纹SCW）定位于后生木质部中，这与YFP RNAi对照不同。这些结果强烈指示At TED6和At TED7在导管分子的SCW形成中的牵涉。
[实施例3]
（dsRNA和质粒DNA）
对Zinnia EST克隆（Demura等人，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99：15794-15799）实施PCR，以制备在2个末端上包含T7和SP6启动子的片段。如由Endo等人（Plant J. 53：864-875，2008）描述的，纯化PCR产物且随后将其直接用作模板用于dsRNA的体外合成。使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech，http://www.clontech.com/），获得Ze TED6和Ze TED7基因（分别为克隆Z1943和Z16653）的全长cDNAs。将编码序列插入pH35GY（Kubo等人，2005，Genes Dev. 19：1855-1860）和pY35GS（Endo等人，2008，Plant J. 53：864-875）内，并且将所得到的构建体用于检查在Zinnia细胞内的蛋白质定位和超表达。将通过GUS插入pY35GS内构建的pY35GUS用作对照。将编码Ze TED6（SEQ ID NO：1）的27Leu - 95Ala的序列和编码Ze TED7（SEQ ID NO：2）的209Trp - 300Gly的序列插入pY35GS内。将At TED6和At TED7基因的起始密码子的5'上游序列（分别为1 kb和0.5 kb）用作启动子区。将片段插入pBGGUS（Kubo等人，2005（同上））内，并且随后检查其在拟南芥属植物中的启动子活性。将包含启动子区和ORF的基因组片段插入pHGY（这通过CaMV 35S启动子序列的缺失衍生自pH35GY）内。将FAD2（At3g12120）基因的第一个内含子用作全长At TED6 ORF、At TED7 ORF和At TED6-TED7嵌合体序列的反向重复序列的接头。将At TED7 ORF插入At TED6 ORF的PshA I位点，以便构建嵌合体。将反向重复插入pH35GS（Kubo等人，2005（同上））和/或pTA7002（Aoyama和Chua，1997，Plant J.11：605-612）内，以构建用于制备组成性瞬时RNAi系的载体。VND7 cDNA（Yamaguchi等人，2008，Plant J. 55：652-664）插入pER8（Zuo等人，2000，Plant J. 24：265-273）内，以构建用于制备异位TE诱导性系的载体。
（RT-PCR）
RNA如由Endo等人（2008（同上））描述的由2个独立系制备，并且随后用于cDNA合成。使用定位于At TED6和At TED7的5’-和3’-UTRs中的引物执行PCR。用于At TED6的引物是5’-AGA GCC TCA CAC ATC AAA CAC AAG-3’（SEQ ID NO：12）和5’-GGT AAC ATT ATG AAT GAA GAA AGC TC-3’（SEQ ID NO：13）；用于At TED7的引物是5’-AAC CAT TTA AGT ACA TAC ATA CTC CC-3’（SEQ ID NO：14）和5’-ATG ATT GTT TAC ATT TTG AGC CTT TTG-3’（SEQ ID NO：15）；用于肌动蛋白2（At3g18780）的引物是5’-CCG TTT TGA ATC TTC CTC AAT C-3’（SEQ ID NO：16）和5’-ATA CCG GTA CCA TTG TCA CAC A-3’（SEQ ID NO：17）；并且用于泛素（At5g57860）的引物是5’-TCC AAT GTG ATC CAA CAG AGA C-3’（SEQ ID NO：18）和5’-TTC AAA GTC AAA GCC ACA ACT G-3’（SEQ ID NO：19）。
此外，下述序列用于Ze TED7-1和Ze TED7-2的PCR扩增的引物。
5’-TTC CCT CAT TTT CCA CCG CCA TC-3’（SEQ ID NO：20）和5’-TGT TGT GGA ATG GTT GCT TGG AGA-3’（SEQ ID NO：21）
工业实用性
本发明促进植物中的导管细胞和木纤维细胞的次生细胞壁形成，并且从而增加次生细胞壁的厚度。本发明使得木本植物和草本植物中增加的纤维素含量成为可能，所述木本植物和草本植物是生物质资源并且因此具有高度的工业有用性。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请整体引入本文作为参考。
序列表单行本
SEQ ID NOS：12-21：引物
                         序列表
 
<110>  RIKEN
 
<120>  用于促进植物的次生细胞壁形成的方法
 
<130>  PH-4318-PCT
 
<150>  JP 2009-086922
<151>  2009-03-31
 
<160>  21   
 
<170>  PatentIn version 3.4
 
<210>  1
<211>  95
<212>  PRT
<213>  百日菊(Zinnia elegans)
 
<400>  1
 
Met Ala Thr Ile Phe Ile Val Phe Val Ser Phe Gly Cys Val Phe Val
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Gly Ile Ala Ala Phe Val Leu Cys Cys Leu Ile Lys Lys Trp Lys
            20                  25                  30         
 
 
Cys Ser Lys Ala Ile Glu Lys Asn Glu Met Val His Val Asp Gln His
        35                  40                  45             
 
 
Leu Gln Val His Glu Asn Ile Leu Gln Gly Pro Asn Gly Met Lys Thr
    50                  55                  60                 
 
 
Val Ala Ile Thr Val Asp Asp Asp Leu His Val His Asp Glu Glu Glu
65                  70                  75                  80 
 
 
Cys Val Lys Asn Glu Lys Leu Gly Thr Ala Ser Thr Ser Lys Ala
                85                  90                  95 
 
 
<210>  2
<211>  300
<212>  PRT
<213>  百日菊
 
<400>  2
 
Met Ala Ser Pro Leu Ser Gln Ser Val Phe Pro His Phe Pro Pro Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Pro Ala Ala Thr Pro Pro Pro Ala Pro Thr Thr Pro Ser Thr Pro
            20                  25                  30         
 
 
Pro Pro His Phe Ile Ser Pro Pro Pro His Ser Val Pro Pro Pro Ser
        35                  40                  45             
 
 
Pro Pro His Ser Val Pro Pro Pro Leu His Pro Val Pro Pro Pro Ser
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Pro His Pro Val Ser Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80 
 
 
Pro Pro His Pro Val Ser Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
                85                  90                  95     
 
 
Pro Pro His Pro Val Phe Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
            100                 105                 110        
 
 
Pro His Phe Val Pro Pro Pro Pro Asn Met Val Pro Pro Pro Ser Pro
        115                 120                 125            
 
 
Pro His Ala Asn Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Val Pro Pro
    130                 135                 140                
 
 
Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Ile Pro
145                 150                 155                 160
 
 
Pro Pro Ala His Ala Leu Ser Pro Pro Pro Pro His Ile Ile Pro Pro
                165                 170                 175    
 
 
Pro Pro Pro Ser Pro Ser Asn His Ser Thr Thr Ile Val Val Ile Phe
            180                 185                 190        
 
 
Val Ser Cys Gly Gly Val Phe Phe Leu Ala Phe Ala Met Ala Ala Leu
        195                 200                 205            
 
 
Trp Cys Phe Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Met Val Gln Lys Ala Glu
    210                 215                 220                
 
 
Asn Ile His Phe Asp Glu His Arg Lys Val Thr Glu Arg Ile Glu Gln
225                 230                 235                 240
 
 
Gly Pro His Gly Thr Glu Thr Ala Ile Leu Ser Val Glu Asp Asp Ile
                245                 250                 255    
 
 
His Ile Glu Glu Asp Ile Lys Lys Ser Glu Leu Glu Asn Phe Arg Lys
            260                 265                 270        
 
 
Gly Leu His Leu Asn Tyr Gly Asn Thr Tyr Asn Ile Asp Thr Gly Lys
        275                 280                 285            
 
 
Pro Ser Ser Ser Phe Gly His His Tyr Leu His Gly
    290                 295                 300
 
 
<210>  3
<211>  283
<212>  PRT
<213>  百日菊
 
<400>  3
 
Met Ala Ser His Leu Ser Gln Ser Leu Phe Pro His Phe Pro Pro Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Pro Ala Ala Thr Pro Pro Pro Ala Pro Thr Thr Pro Ser Thr Pro
            20                  25                  30         
 
 
Pro Pro His Phe Ile Ser Pro Pro Pro His Ser Val Pro Pro Pro Ser
        35                  40                  45             
 
 
Pro Pro His Ser Val Pro Pro Pro Leu His Pro Val Pro Pro Pro Leu
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Pro His Ser Val Pro Pro Pro Ser His Thr Val Pro Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80 
 
 
Pro Pro His Pro Val Ser Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
                85                  90                  95      
 
 
Pro Pro His Pro Val Ser Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
            100                 105                 110        
 
 
Pro Pro His His Val Ser Pro Pro Pro His Thr Val Pro Pro Pro Ser
        115                 120                 125            
 
 
Pro His Phe Val Pro Pro Pro Pro Asn Thr Val Pro Pro Pro Pro Ala
    130                 135                 140                
 
 
Pro His Phe Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Ile Ile Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
 
 
Pro Pro Ser Pro Ser Asn His Ser Thr Thr Ile Val Val Ile Phe Val
                165                 170                 175    
 
 
Ser Cys Gly Gly Val Phe Phe Leu Ala Phe Ala Met Ala Ala Leu Trp
            180                 185                 190        
 
 
Cys Phe Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Met Val Arg Lys Ala Glu Asn
        195                 200                 205            
 
 
Ile His Phe Asp Glu His Arg Lys Val Thr Glu Arg Ile Glu Gln Gly
    210                 215                 220                
 
 
Pro His Gly Thr Glu Thr Ala Ile Leu Ser Val Glu Asp Asp Ile His
225                 230                 235                 240
 
 
Ile Glu Glu Asp Ile Lys Lys Ser Glu Ile Glu Asp Phe Arg Lys Gly
                245                 250                 255    
 
 
Leu His Leu Asn Tyr Gly Asn Thr Tyr Asn Ile Asp Thr Gly Lys Pro
            260                 265                 270        
 
 
Ser Ser Ser Phe Gly His His Tyr Leu His Gly
        275                 280            
 
 
<210>  4
<211>  116
<212>  PRT
<213>  拟南芥(Arabidopsis thaliana)
 
<400>  4
 
Met Ala Ser Thr Asp Ser Val Tyr Arg Pro Thr Pro Thr Pro Asp His
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Thr Thr Val Val Val Val Val Phe Val Ser Leu Gly Cys Val Met
            20                  25                  30         
 
 
Phe Leu Ala Phe Leu Ala Phe Val Ile Trp Phe Leu Ile Lys Lys Arg
        35                  40                  45             
 
 
Ser Arg Lys His Arg Glu Arg Ser Glu Ala Val Arg Val Asp Glu His
    50                  55                  60                 
 
 
Phe Lys Met Lys Glu Ala Ile Val Glu Gly Pro Asn Gly Gln Lys Ser
65                  70                  75                  80 
 
 
Val Val Leu Ser Val Glu Asp Asp Val Lys Ile Glu Asp Ala Ile Lys
                85                  90                  95     
 
 
Arg Glu Glu Lys Asp Leu Lys Lys Asp Gly Gly Val Gly Ser Ser Val
            100                 105                 110        
 
 
Val Ser Arg Ser
        115    
 
 
<210>  5
<211>  205
<212>  PRT
<213>  拟南芥
 
<400>  5
 
Met Ala Ala Ser Val Glu Tyr Phe Pro Tyr Tyr Ser Pro Pro Ser His
1               5                   10                  15     
 
 
Gln His Pro Leu Pro Ser Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser His Ile Ser
            20                  25                  30         
 
 
Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ser Pro Pro His His Pro Pro Pro Pro His
        35                  40                  45             
 
 
Phe Ser Pro Pro His Gln Pro Pro Pro Ser Pro Tyr Pro His Pro His
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Pro Pro Pro Ser Pro Tyr Pro His Pro His Gln Pro Pro Pro Pro
65                  70                  75                  80 
 
 
Pro His Val Leu Pro Pro Pro Pro Pro Thr Pro Ala Pro Gly His His
                85                  90                  95     
 
 
Val Ile Ile Val Val Val Ile Ser Leu Gly Ser Leu Phe Phe Leu Ala
            100                 105                 110        
 
 
Phe Leu Ala Ala Ala Leu Phe Cys Tyr Leu Lys Lys Arg Arg Lys Ser
        115                 120                 125            
 
 
Ser Thr Lys Ala Glu Ile Ile Glu Phe Asp Glu His Leu Lys Val Gln
    130                 135                 140                
 
 
Glu Thr Ile Val Gln Gly Pro His Gly Glu Gln Thr Arg Val Val Met
145                 150                 155                 160
 
 
Leu Glu Glu Asp Ile His Leu Val Glu Asp Ile His Lys Thr Glu Lys
                165                 170                 175    
 
 
Leu Ser Arg Pro Ser His Leu Ser Ser Thr Gly Arg His Ala Ile Asp
            180                 185                 190        
 
 
Ile Ser Asp Pro Asn His His Phe Thr Glu Gln Lys Ser
        195                 200                 205
 
 
<210>  6
<211>  173
<212>  PRT
<213>  毛果杨(Populus trichocarpa)
 
<400>  6
 
Met Ala Ala Ser Asn Asn Leu Asp Phe Pro Tyr Ser Pro Pro Pro Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Ser His Ser Phe Gln Pro Pro Pro Ser Pro Pro His Val Arg Pro Pro
            20                  25                  30         
 
 
Pro Pro His Ile Arg Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Pro Ser
        35                  40                  45             
 
 
Pro Ser Asn Asn Thr Thr Val Ile Val Ile Val Phe Val Ser Phe Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Gly Leu Ile Phe Leu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Leu Cys Phe Phe Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Val Glu Glu Thr Asp Ile Val His Val
                85                  90                  95     
 
 
His Glu His Leu Lys Val Lys Glu Ala Ile Val Glu Gly Pro His Gly
            100                 105                 110        
 
 
Pro Lys Ala Val Val Leu Glu Ile Val Asp Asp Val His Ile Gly Glu
        115                 120                 125            
 
 
Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Val Gly Glu Gly Leu His Ala Lys Ala
    130                 135                 140                
 
 
Ile Glu Gly Asn Ala Gly Thr Val Asp Gln Leu Ala Ala Pro Ser Ser
145                 150                 155                 160
 
 
Ser Gly Ser Asn Asn His Ser Arg Leu Glu His Lys Ala
                165                 170            
 
 
<210>  7
<211>  210
<212>  PRT
<213>  毛果杨
 
<400>  7
 
Met Ala Pro Thr Asn Asn Tyr Asp Tyr Asn Phe Pro Tyr Phe Pro Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Pro Pro Pro His Asn Asn Pro Pro Ser Pro Pro Lys Val Ala Pro Pro
            20                  25                  30         
 
 
His Ser Ser Pro Ser Pro Pro Asn Val Ser Pro Pro His Asn Phe Pro
        35                  40                  45             
 
 
Pro Pro His Ile Thr Pro Pro Ser Pro Lys Val Pro Pro Pro Pro His
    50                  55                  60                 
 
 
His Pro Ile Thr Pro Pro Pro Thr His Pro Phe His Pro Pro Pro Pro
65                  70                  75                  80 
 
 
His His Ile Pro Pro Pro Pro His Val Ile Pro Pro Pro Pro Pro Thr
                85                  90                  95      
 
 
Pro Gly His His Ser Thr Val Ile Ile Val Val Phe Val Ser Leu Gly
            100                 105                 110        
 
 
Gly Leu Phe Phe Leu Ala Phe Leu Ser Val Ala Leu Cys Cys Phe Ile
        115                 120                 125             
 
 
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Val Gln Lys Thr Glu Ile Leu Glu Phe
    130                 135                 140                
 
 
Asp Glu His Thr Lys Val Gln Glu Ala Ile Val Pro Gly Pro His Gly
145                 150                 155                 160
 
 
Glu Lys Ile Thr Val Leu Asn Ile Glu Glu Asp Val His Leu Val Glu
                165                 170                 175    
 
 
Glu Ile Lys Lys Asn Glu Lys Leu Thr Glu Gly Ser His Ile Lys Ser
            180                 185                 190        
 
 
Ala His Asp Arg Pro Leu Tyr Ser Asp Ile Ala Thr Pro Ser Ser Gln
        195                 200                 205            
 
 
Tyr Asn
    210
 
 
<210>  8
<211>  273
<212>  PRT
<213>  毛果杨
 
<400>  8
 
Met Ala Pro Leu Asp Asn Tyr Asp Tyr Asn Phe Pro Tyr Phe Pro Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Pro Pro Pro His Asn Pro Pro Ser Pro Pro Lys Val Val Pro Pro His
            20                  25                  30         
 
 
Asn Tyr Pro Ser Pro Pro Lys Gly Ser Pro Pro His Asn Pro Pro Pro
        35                  40                  45             
 
 
Pro His Ile Ile Pro Ser Pro Pro Lys Val Val Pro Pro His Asn Tyr
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Ser Pro Pro Lys Gly Ser Pro Pro His Asn Pro Pro Pro Pro His
65                  70                  75                  80 
 
 
Ile Lys Pro Ser Pro Pro Lys Val Pro Pro Pro His His Pro Ile Thr
                85                  90                  95     
 
 
Pro Pro Ser Pro Phe Pro Val Pro Ala Thr Pro Pro Asn His Pro Phe
            100                 105                 110        
 
 
His Pro Pro Pro Pro His His Ile Pro Pro Pro Ser Pro Pro His Ile
        115                 120                 125             
 
 
Ile Pro Pro Ala Pro Ser His Val Ile Pro Pro Pro Pro Pro Thr Pro
    130                 135                 140                
 
 
Gly His His Ser Thr Val Ile Ile Val Val Phe Val Ser Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
 
 
Leu Phe Phe Leu Ala Phe Leu Ser Val Ala Leu Cys Cys Phe Ile Lys
                165                 170                 175    
 
 
Lys Lys Lys Lys Lys Thr Val Gln Lys Thr Glu Ile Leu Glu Phe Asp
            180                 185                 190        
 
 
Glu His Thr Lys Val Gln Glu Ala Ile Ile Pro Gly Pro His Gly Glu
        195                 200                 205            
 
 
Lys Ile Thr Val Leu Asn Ile Glu Glu Asp Val His Leu Val Glu Glu
    210                 215                 220                
 
 
Ile Lys Lys Asn Glu Lys Leu Ala Glu Gly Ser His Ile Lys Leu Ala
225                 230                 235                 240
 
 
His Asp His Pro Leu Asp Ser Asp Ile Ala Thr Ser Ser Ser Arg Ser
                245                 250                 255    
 
 
Asn Gln Gln His Leu Glu His Lys Val Gln His His Leu Glu His Lys
            260                 265                 270        
 
 
Val
   
 
 
<210>  9
<211>  342
<212>  PRT
<213>  水稻(Oryza sativa)
 
<400>  9
 
Met Thr Phe Asn Pro Gly Ser Pro Gly Phe Gly Phe Pro Phe Pro Phe
1               5                   10                  15     
 
 
Tyr Pro Pro Asn Pro Asn Pro Tyr Ala Pro Leu Asn Pro Asn Ala Pro
            20                  25                  30          
 
 
Lys Pro Pro Val Met Pro Pro Arg Pro Gln Ala Pro Pro Pro Pro Gln
        35                  40                  45             
 
 
Arg Phe Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ser Pro Pro
    50                  55                  60                  
 
 
Gly Arg Ala Pro Pro Pro Pro Gly Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ser Gln
65                  70                  75                  80 
 
 
Ala Pro Pro Pro Pro Arg Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ala Leu Pro Pro
                85                  90                  95     
 
 
Pro Pro Pro Arg Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ser Met Pro Pro Pro Pro
            100                 105                 110        
 
 
Pro Pro Arg Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ala Thr Pro Pro Pro Pro Pro
        115                 120                 125            
 
 
Arg Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ile Arg Pro Pro Pro Pro
    130                 135                 140                
 
 
Pro Thr Pro Arg Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Pro Ser His Pro Leu Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Pro Pro Pro Pro His Ile Ser Pro Pro Ala Pro Val Pro Pro Pro Pro
                165                 170                 175    
 
 
Ser Pro Pro Pro His Ile Val Ile Ile Val Val Phe Val Ser Phe Gly
            180                 185                 190        
 
 
Gly Leu Leu Leu Leu Ala Cys Leu Ala Ala Leu Phe Cys Trp His Lys
        195                 200                 205            
 
 
Lys Arg Arg Glu Thr Glu Arg Lys Ala Glu Val His Asn Leu Ser Gly
    210                 215                 220                
 
 
His Val His Val His Lys Ala Thr Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Lys
225                 230                 235                 240
 
 
Ala Thr Val Leu Ser Ile Asp Glu Asp Leu Lys Phe Gln Glu Val Ala
                245                 250                 255    
 
 
Gly Glu Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ser His His Thr Pro Trp
            260                 265                 270        
 
 
Ser Trp His Arg Arg Gln Gln Glu Gly Lys Ala Glu Asn Lys Ala Glu
        275                 280                 285            
 
 
Leu Ile Asn Val Thr Glu His Ile His Val Asp Glu Lys Ile Val Ser
    290                 295                 300                
 
 
Gly Pro Gln Gly Gln Lys Ile Glu Ile Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ile
305                 310                 315                 320
 
 
Arg Phe Glu Glu Glu Gly Arg Lys Glu Lys Gly Asp Gln Arg Ser Lys
                325                 330                 335    
 
 
Thr Arg Ile Thr Lys Thr
            340        
 
 
<210>  10
<211>  45
<212>  PRT
<213>  水稻
 
<400>  10
 
Thr Glu Arg Lys Ala Glu Val His Asn Leu Ser Gly His Val His Val
1               5                   10                  15     
 
 
His Lys Ala Thr Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Lys Ala Thr Val Leu
            20                  25                  30         
 
 
Ser Ile Asp Glu Asp Leu Lys Phe Gln Glu Val Ala Gly
        35                  40                  45 
 
 
<210>  11
<211>  45
<212>  PRT
<213>  水稻
 
<400>  11
 
Ala Glu Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asn Val Thr Glu His Ile His Val
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Glu Lys Ile Val Ser Gly Pro Gln Gly Gln Lys Ile Glu Ile Leu
            20                  25                  30         
 
 
Ser Glu Asp Glu Asp Ile Arg Phe Glu Glu Glu Gly Arg
        35                  40                  45 
 
 
<210>  12
<211>  24
<212>  DNA
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agagcctcac acatcaaaca caag                                            24
 
 
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<213>  人工的
 
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ggtaacatta tgaatgaaga aagctc                                          26
 
 
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aaccatttaa gtacatacat actccc                                          26
 
 
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atgattgttt acattttgag ccttttg                                         27
 
 
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tccaatgtga tccaacagag ac                                              22
 
 
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ttcaaagtca aagccacaac tg                                              22
 
 
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ttccctcatt ttccaccgcc atc                                             23
 
 
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tgttgtggaa tggttgcttg gaga                                            24

Claims (5)

1.使用管状分子分化（TED）相关蛋白质或其C末端片段用于增加植物的次生细胞壁厚度的方法，其包括：产生转基因植物，所述转基因植物以可表达方式包含编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合；并且引起所述DNA在所述植物内的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中所述TED6或TED7的C末端片段由下述组成：缺乏在所述TED6或TED7的成熟氨基酸序列中从N末端到跨膜结构域的序列的氨基酸序列，或在缺乏所述序列的氨基酸序列的N末端侧和/或C末端侧上包含一个或数个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列。
3.转基因植物或其后代植物，其特征在于：其以可表达方式包含编码蛋白质的DNA，所述蛋白质选自TED6和TED7的组合、TED6的C末端片段、TED7的C末端片段、以及TED6的C末端片段和TED7的C末端片段的组合；并且与野生型植物比较次生细胞壁的厚度增加。
4.细胞或组织，其衍生自根据权利要求3的转基因植物或其后代植物。
5.种子，其衍生自根据权利要求3的转基因植物或其后代植物。
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