CN102432620B

CN102432620B - 一种白藜芦醇四聚体化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102432620B
Application number: CN2011102665082A
Authority: CN
Inventors: 戈惠明; 陈玉胜; 孔令东; 丁晓琴
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: CN102432620A

Abstract

本发明涉及一种白藜芦醇四聚体化合物及其制备方法，所述的制备方法包括（1）将具翼龙脑香的细枝部分经过醇提制备浸膏、（2）干法上样、（3）利用流动相洗脱液进行洗脱和（4）凝胶柱层析，本发明还涉及一种白藜芦醇四聚体化合物在预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或在保健食品中的应用。本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物在其提取和纯化过程中，未用反相柱和半制备柱，使得其工艺简单、得率高；此外，与针对痛风和高尿酸血症的发明相比，本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物为单体化合物，作为一个天然的降尿酸剂，药效成分明确，降尿酸作用显著，可以作为质量标准，方便可靠，为其临床应用提供了科学依据。

Description

一种白藜芦醇四聚体化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种白藜芦醇四聚体化合物（Vaticaffinol）及其制备方法，以及白藜芦醇四聚体化合物（Vaticaffinol）在预防和治疗高尿酸血症和痛风中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

白藜芦醇 ( resveratrol, 简称Res ) 是非黄酮类的多酚化合物,日本人Tokaoka 1940年首次从毛叶藜芦 ( Veratrum grangiflorum) 的根部分离得到。1963年Nonomura等提出白藜芦醇是某些草药治疗炎症、脂类代谢紊乱和心血管疾病等的有效成分。随着对白藜芦醇的深入研究，显示白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎等作用, 可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。

白藜芦醇有二聚体、三聚体和四聚体形式，白藜芦醇四聚体化合物及其药理功效已有所报道。如，从龙脑香科植物Vatica rassak 的茎皮中分离得到的白藜芦醇四聚体Vaticanol-C能够强力诱导癌细胞凋亡[ Ito T, Akao Y, Yi H, et al.(2003) Antitumor effect of resveratrol oligomers against human cancer cell lines and the molecular mechanism of apoptosis induced by vaticanol C. Carcinogenesis 24:1489–1497]。Vaticanol-C还能通过活化PPARα和 PPARβ/δ来抑制心血管疾病发生发展（Tomoko Tsukamoto, Rieko Nakata, Emi Tamura, et al. Vaticanol C, a resveratrol tetramer, activates PPARα and PPARβ/δ in vitro and in vivo. Nutrition & Metabolism 2010, 7:46）；从北部非洲的葡萄酒中首次分离得到的白藜芦醇四聚体Hopeaphenol 具有显著的抗菌、抗炎、抗真菌及对HIV病毒的抑制效应(HABIBA AMIRA GUEBAILIA, KLEOPATRA CHIRA, TRISTAN RICHARD, et al. Hopeaphenol: The First Resveratrol Tetramer in Wines from North Africa. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9559??9564)， Hopeaphenol 还可用于预防和治疗神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、高胆固醇血症和肥胖症（中国医学科学院药物研究所.作为肝X受体调节剂的化合物：中国,200810102538.8[P].2009-09-30）； Vaficaffinol 是由斯里兰卡人 M. Uvais S. Sultanbawa等，于1980年首次从龙脑香科濒危植物版纳青梅(Vatica guangxiensis)中分离到的一种白藜芦醇四聚体[M. Uvais S. Sultanbawa, Sivaguanasundram Surendrakumar, and Mohamed I. M. WAZEER, Novel Resveratrol Tetramer, Vaticaffinol, from Vatica affinis Thw. (Dipterocarpaceae), J.C.S. CHEM. COMM., 1981,1204~1206], 但本专利从具翼龙脑香（Dipterocarpus alatus Roxb）中分离到该化合物乃属初次，且其具有预防或治疗高尿酸血症和痛风之功效从未报道。

痛风是由于嘌呤类物质代谢紊乱，尿酸产生过多或排泄减少，血清尿酸浓度持续增高导致尿酸盐结晶沉淀软组织所致的一组代谢性疾病。其临床表现为反复发作的关节炎，痛风石形成和关节畸形，严重者可导致关节活动障碍，累及肾脏时可引起慢性间质炎和尿酸性肾石病。尿酸水平升高是痛风的生化基础，无症状性高尿酸血症是痛风发生的前期状态，痛风必伴有高尿酸血症。近年来，痛风和高尿酸血症的发病率呈上升趋势，发病年龄呈现低龄化，给社会带来巨大的负担，并与高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志。痛风症状以反复下肢关节红肿热痛为主，在中医辨证上多属湿热病范畴。其病机或因先天禀赋不足，或因后天饮食不节，脏腑功能失调，分清别浊失常，于是湿、热、瘀、浊诸病随之产生。

目前对痛风和高尿酸血症的治疗主要有阻止内源性嘌呤合成的药物（如别嘌呤醇）及促尿酸排泄（丙磺舒、苯溴马龙）的药物，而天然产物白藜芦醇四聚体（Vaticaffinol）用于预防或治疗高尿酸血症和痛风尚未报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白藜芦醇四聚体化合物及其制备方法，以及提供一种白藜芦醇四聚体化合物在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品组合物中的应用。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：

一种白藜芦醇四聚体化合物，其特征在于，所述的白藜芦醇四聚体化合物具有如式（I）所述的结构式：

（I）。

一种权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）醇制备浸膏：将具翼龙脑香的细枝部分粉碎、过40～80目筛，然后用浓度为95-50%的乙醇连续浸泡具翼龙脑香的细枝粉末，并进行提取，提取的次数为3～5次，每次的时间为12～24小时；过滤收集提取后的提取液，经旋转蒸发仪蒸干，即得浸膏；

（2）干法上样：将步骤（1）制备的浸膏通过有机溶剂溶解，然后用200～300目硅胶与其混匀，硅胶与浸膏的干重比为1～2∶1，室温下自然风干后上硅胶柱，硅胶柱中的硅胶颗粒为300～400目，且硅胶柱中的硅胶与浸膏的干重比为10～12∶1；

（3）利用流动相洗脱液进行洗脱：利用氯仿-甲醇溶剂系统进行洗脱，所述的氯仿甲醇溶剂系统中氯仿与甲醇的体积比分别具有100∶0、100∶5、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100和0∶100多个极性段，洗脱液每300~500ml收集一瓶，且每一极性段洗脱至无色；

（4）凝胶柱层析：根据步骤（3）所述的氯仿与甲醇的体积比为100:20极性段的各组分的薄层色谱图，合并具有相同荧光点的组分，然后将后流出的若干瓶具有相同荧光点的组分合并后上凝胶柱细分，以甲醇为流动相，然后再根据各组分的薄层色谱图，合并有相同荧光点的馏分，将后流出的若干瓶有相同荧光点的馏分合并，室温下置通风橱内抽干溶剂即得固体白藜芦醇四聚体。

I其中，步骤（4）中所述的凝胶柱中的填料为葡聚糖LH-20。

具有式（I）结构的白藜芦醇四聚体化合物在预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或者保健食品中的应用。

本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物，配以常用的药用辅料（如：赋形剂、助溶剂、控释剂等），制成各种剂型包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂，用于制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品。

本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊剂、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。

本发明的有益效果是：本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物在其提取和纯化过程中，未用反相柱和半制备柱，使得其工艺简单、得率高；此外，与针对痛风和高尿酸血症的发明相比，本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物为单体化合物，作为一个天然的降尿酸剂，药效成分明确，降尿酸作用显著，可以作为质量标准，方便可靠，为其临床应用提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物的¹H NMR图；

图2为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物的LCMS图；

图3为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响结果图；

图4为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠尿液尿酸水平的影响结果图；

图5为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肝脏XOD活性的影响结果图；

图6为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肾脏URAT1蛋白水平影响结果图；

图7为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肾脏URAT1 mRNA水平影响结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

为了更好地理解本发明的实质，下面用白藜芦醇四聚体化合物Vaticaffinol的提取分离、药理实验及结果来说明其在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或保健食品中的应用。

白藜芦醇四聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）醇提制备浸膏：将具翼龙脑香的细枝部分粉碎、过40～80目筛，然后用浓度为95-50%的乙醇连续浸泡具翼龙脑香的细枝粉末，并进行提取，提取的次数为3～5次，每次的时间为12～24小时；过滤收集提取后的提取液，经旋转蒸发仪蒸干，即得浸膏；

（2）干法上样：将步骤（1）制备的浸膏通过有机溶剂溶解，所述的有机溶剂为氯仿和甲醇，所述的氯仿和甲醇的体积比为1:1，然后用200~300目硅胶与其混匀，硅胶与浸膏的干重比为1～2∶1，室温下自然风干后上硅胶柱，硅胶柱中的硅胶颗粒为300～400目，且硅胶柱中的硅胶与浸膏的干重比为10～12∶1；

（4）凝胶柱层析：根据步骤（3）所述的氯仿与甲醇的体积比为100:20极性段的各组分的薄层色谱图，合并具有相同荧光点的组分，然后将后流出的8瓶（57~64）具有相同荧光点的组分合并后上凝胶柱细分，凝胶柱中的填料为葡聚糖LH-20，以甲醇为流动相，利用注射青霉素瓶收集，然后再根据各组分的薄层色谱图，合并有相同荧光点的馏分，然后将后流出的16瓶（57~64 - 30~45）有相同荧光点的组分合并，室温下置通风橱内抽干溶剂即得固体白藜芦醇四聚体Vaticaffinol。

利用上述方法制备的白藜芦醇四聚体化合物具有如式（I）所述的结构式：

（I）。

上述的具有式（I）结构的白藜芦醇四聚体化合物在预防或治疗高尿酸血症和痛风药物或者保健食品中的应用。

白藜芦醇四聚体化合物（Vaticaffinol）对高尿酸血症和正常小鼠的血清和尿液尿酸水平、肝脏XOD活性及肾脏尿酸重吸收转运子m-URAT1 mRNA和蛋白表达的影响：

氧嗪酸钾盐是一种尿酸酶抑制剂，可诱导抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，造成高尿酸血症动物模型，国际上普遍用其评价药物的抗高尿酸血症和痛风作用。本发明亦采用高尿酸血症模型动物验证药物的降尿酸疗效，疗效结果可靠，效果显著。

1、实验动物：昆明种小鼠，体重20±2g，雄性。

2、药物配制：白藜芦醇四聚体化合物(Vaticaffinol)和别嘌呤醇分别分散溶于生理盐水中，用于灌胃给药，给药剂量分别为40mg/kg和5mg/kg。

3、实验材料：Trizol Reagment ( Invigen )、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC、M-MLV反转录酶、PCR试剂盒、RIPA裂解液、尿酸试剂盒。

4、实验仪器：高速冷冻离心机、高速匀浆机、Bio-radio-rad垂直电泳槽、MBI-PCR仪、水平电泳槽。

5、实验模型：高尿酸血症模型

6、模型的建立：动物适应环境一周后，灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg，对照给予等体积生理盐水，造模周期7天。

7、给药：造模期间同时给药，在给予氧嗪酸钾盐造模/生理盐水对照1h后，分别灌胃给予白藜芦醇四聚体Vaticaffinol 40mg/kg，别嘌呤醇（AP）5mg/kg，对照组给予生理盐水。

8、小鼠处死及组织的保存：小鼠灌胃给予白藜芦醇四聚体/生理盐水后1h处死，取血、尿液，冰台上分离肝脏、肾脏组织，组织经液氮冷冻后保存于-80℃，待测。

9、蛋白质印迹（Western-blotting）：提取小鼠肾脏组织蛋白，提取蛋白经10～12%的SDS-PAGE胶电泳分离后，PVDF转膜，封闭液封闭1～2小时后加入mURAT1抗体（根据NCBI数据库mURAT1蛋白序列制备，使用浓度为1:4000），4℃孵育过夜，二抗（1:4000）室温摇床孵育1小时，TMB显色，扫描后进行灰度值分析。

10、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：肾组织0.1g加入1ml的Trizol Reagent (Invittrogen).按照试剂盒的要求提取RNA，RNA逆转录到cDNA模板，根据NCBI数据库mURAT1基因设计引物，进行mURAT1目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后UV成像，对灰度值进行灰度分析。

11、实验结果：

（1）、白藜芦醇四聚体化合物Vaticaffinol的结构鉴定：

图1为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物的¹H NMR图（300MHz，Acetone-d₆，TMS），图2为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物的LCMS图。据图2分析可知：该化合物的分子量为906，分子式为C₅₆H₄₂O₁₂，再根据图1，结合文献 [M. Uvais S. Sultanbawa, Sivaguanasundram Surendrakumar, and Mohamed I. M. WAZEER, Novel Resveratrol Tetramer, Vaticaffinol, from Vatica affinis Thw. (Dipterocarpaceae), J.C.S. CHEM. COMM., 1981,1204~1206]，可确定该化合物的结构式为式[I]：

（I）。

（2）、图3为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响结果图，如图3所示：⁺P < 0.05, ⁺⁺P < 0.01, ⁺⁺⁺P < 0.001 与空白组比较；^*P < 0.05, ^**P < 0.01,^***P < 0.001 与模型组比较。

（3）、图4为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠尿液尿酸水平的影响结果图，如图4所示： ⁺P < 0.05, ⁺⁺P < 0.01, ⁺⁺⁺P < 0.001 与空白组比较； ^*P < 0.05,^**P < 0.01,^***P < 0.001 与模型组比较。

（4）、图5为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肝脏XOD活性的影响结果图，如图5所示：⁺P < 0.05, ⁺⁺P < 0.01, ⁺⁺⁺P < 0.001 与空白组比较； ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 与模型组比较。

（5）、图6为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肾脏URAT1蛋白水平影响结果图，如图6所示：⁺P < 0.05, ⁺⁺P < 0.01, ⁺⁺⁺P < 0.001 与空白组比较； ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 与模型组比较。

（6）、图7为本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物对高尿酸血症小鼠肾脏URAT1 mRNA水平影响结果图，如图7所示： ⁺P < 0.05, ⁺⁺P < 0.01, ⁺⁺⁺P < 0.001 与空白组比较； ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 与模型组比较。

在上述的图6和图7中，分组试验所涉及到的各字母的含义分别为： C：正常对照组，M：模型组，AP：别嘌呤醇组，R：Vaticaffinol组。

本发明所述的白藜芦醇四聚体化合物（Vaticaffinol）对高尿酸血症表现为降尿酸作用，表明该化合物可用于制备预防或治疗高尿酸血症和痛风的药物或保健食品。

所述的具有降尿酸药效的白藜芦醇四聚体化合物（Vaticaffinol）对小鼠高尿酸血症模型表现出降尿酸作用。

由以上结果可知：白藜芦醇四聚体化合物Vaticaffinol可显著降低高尿酸血症模型下动物血清尿酸水平，显著提高尿液尿酸水平，而对正常动物血清及尿液尿酸水平均无显著影响，这表明化合物Vaticaffinol可安全有效地治疗和预防高尿酸血症和痛风。化合物Vaticaffinol能显著抑制模型小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）的活性及肾脏m-URAT1 mRNA和蛋白表达，表明化合物Vaticaffinol的降尿酸作用与其抑制肝脏XOD活性和肾脏尿酸重吸收转运子m-URAT1 mRNA和蛋白表达有关，以降低高尿酸血症动物尿酸合成和增加排泄，达到降尿酸作用

上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种白藜芦醇四聚体化合物的制备方法，所述的白藜芦醇四聚体化合物具有如式（I）所述的结构式：

Figure 2011102665082100001DEST_PATH_IMAGE002

（I），

其特征在于，包括以下步骤：

（1）醇提制备浸膏：将具翼龙脑香的细枝部分粉碎、过40～80目筛，然后用浓度为95～50%的乙醇连续浸泡具翼龙脑香的细枝粉末，并进行提取，提取的次数为3～5次，每次的时间为12～24小时；过滤收集提取后的提取液，经旋转蒸发仪蒸干，即得浸膏；

（2）干法上样：将步骤（1）制备的浸膏通过有机溶剂溶解，然后用200~300目硅胶与其混匀，硅胶与浸膏的干重比为1～2∶1，室温下自然风干后上硅胶柱，硅胶柱中的硅胶颗粒为300～400目，且硅胶柱中的硅胶与浸膏的干重比为10～12∶1；

（4）凝胶柱层析：根据步骤（3）所述的氯仿与甲醇的体积比为100:20极性段的各组分的薄层色谱图，合并先流出的具有相同荧光点的组分，然后将后流出的若干瓶具有相同荧光点的组分合并后上凝胶柱细分，以甲醇为流动相，然后再根据各组分的薄层色谱图，合并有相同荧光点的馏分，将后流出的若干瓶有相同荧光点的馏分合并，室温下置通风橱内抽干溶剂即得固体白藜芦醇四聚体。

2.根据权利要求1所述的白藜芦醇四聚体化合物的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的凝胶柱中的填料为葡聚糖LH-20。

3.一种权利要求1所述的具有式（I）结构的白藜芦醇四聚体化合物在制备预防或治疗高尿酸血症和痛风药物中的应用。