CN102424863B - 一种增强型荧光定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测转基因植物及其产品的增强型荧光定量PCR方法。本发明所述方法灵敏度高，特异性强，操作简单，样本范围广，尤其适用于转基因植物的定量检测及定性检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测转基因植物及其产品的增强型荧光定量PCR方法。
背景技术
随着生命科技的不断进步，人类改变了植物常规育种的方法，通过基因工程的手段，将外源基因转入植物体内，从而培育出一批高产、抗逆性性强的转基因植物品种。自90年代起到2010年，全世界转基因植物的种植面积累计达10亿公顷。转基因作物已成规模。尽管如此，世界各国对转基植物的态度仍很谨慎，并出台了很多的政策法规，要求对转基因成分进行检测，并要求检测结果为阳性者需要标识。
目前，常用的检测方法有实时荧光PCR，普通凝胶PCR等检测方法。实时荧光PCR(RT-PCR)：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过检测到的荧光信号对未知模板进行分析的方法。然而这些检测方法都存在自身的不足，如对某些深加工产品及转基因含量较低的产品存在判定盲区，即无法对检测结果进行一次性判定。
这就需要开发高效、准确、更灵敏的转基因检测方法。这对于国家的进出口贸易、转基因安全性以及对于海关、商检、出入境检验检疫部门、食品加工部门来说都是至关紧要需要解决的一个问题。
发明内容
本发明针对现有技术无法检测的转基因植物DNA分子含量较低的样品或因深加工转基因产品造成DNA分子的严重破坏的样品以及应用荧光定量PCR检测方法无法判定阴性阳性的灰区的样品，提供一种增强型荧光定量PCR方法，其灵敏度、准确度更高，可广泛应用于转基因植物及其加工产品的检测。
本发明提供的一种检测转基因玉米品系BT11的增强型荧光定量PCR方法，将包含引物组0.5μM、探针0.5μM、模板1～100ng的总体积25μl的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：
50℃，2min；
95℃10min；
95℃15s，45℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；
95℃15s，60℃ 1min。
作为优选，检测目的基因为BT11结构特异基因cry1Ab与adh1-IVS6的边界序列，所述引物组中上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
更优选地，所述探针序列如SEQ ID No.3所示。所述探针可以利用本领域已知各种核酸标记方法使探针分子标记信标分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、体外转录、随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法。所述信标分子可以为选择合适荧光素；所述荧光素包括但不限于，Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红等。
本发明还提供一种检测转基因水稻品系TT51-1的增强型荧光定量PCR方法，将包含引物组0.5μM、探针0.25μM、模板1～100ng的总体积25μl的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：
50℃，2min；
95℃10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；
95℃ 15s，60℃ 1min。
作为优选，检测目的基因为TT51外源基因cry1Ab，所述引物组中上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示。
更优选地，所述探针序列如SEQ ID No.6所示。
本发明针对转基因玉米品系BT11、转基因水稻品系TT51-1筛选出适合的引物及探针，且对整个检测系统进行了优化，包括：引物探针浓度与配比的优化，通过选用不同引物浓度，及在相同引物浓度下不同的引物、探针浓度比得出结论：在相同引物及探针浓度比情况下，引物及探针浓度越高，实时PCR曲线的ΔRn值也就相对越高，同时CT值也呈现相应变化。当引物与探针的比例在2∶1的时候扩增曲线形状较好，重复性好，CT值更小。而改变退火温度对CT值和荧光值影响不大。而中间的循环数越多，则CT值越小而对荧光值影响不大。
通过对标准品进行梯度稀释，ERT-PCR内源基因和外源基因的扩增效率都达到要求，并且线性关系好，R2＞0.98。扩增效率在100％左右，说明ERT-PCR反应条件已达到优化。
通过ERT-PCR和RT-PCR比较发现，RT-PCR具有检测方法灵敏度高，其检测下限较普通RT-PCR高出10倍左右。ERT-PCR与RT-PCR采用相同的模板，ERT-PCR的CT值范围在12-30，而普通RT-PCR的CT值范围则位于22-39之间，而一般认为CT值在40左右就很难判定阴性或者阳性，从这个角度上分析，ERT-PCR提高了检测的灵敏度。另外，我们分别采用ERT-PCR以及RT-PCR分别对转基因种子(0.5％，1％，5％)进行定量定值结果符合要求，显示ERT-PCR检测结果比RT-PCR更接近真实值，说明ERT-PCR的准确性要比RT-PCR高。
综上，与目前转基因检测普遍使用的荧光定量PCR检测技术相比，本发明所述ERT-PCR具有检测方法灵敏度高，约为RT-PCR灵敏度的10倍。针对转基因含量较低或深加工的转基因产品造成的DNA分子的严重破坏，提取样品中含有大量PCR抑制剂以及由于目前所应用的荧光定量PCR检测方法无法判定阴性阳性的灰区的样品特别适合，并可在多种转基因品系的检测中应用，具有广泛的应用前景。
定义和一般术语
本发明将会把确定的具体化的内容详细列出。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
增强型荧光定量PCR(ERT-PCR)：对荧光定量PCR方法进行了改进，改进方面包括：退火温度、循环数等，而大大提高荧光定量PCR检测灵敏度和准确性的一种检测方法。
实时荧光PCR(RT-PCR)：实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过检测到的荧光信号对未知模板进行分析的方法。
灰区：当荧光定量PCR的CT值位于35-40之间将无法判定阴性及阳性，此区间称为灰区。
具体实施方式
本发明公开了一种检测转基因植物及其产品的增强型荧光定量PCR方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实验中所用试剂耗材：
材料：阳性转基因玉米种子BT11，阳性转基因水稻种子TT51-1，以上样品由香港海康生命科技有限公司提供。IRMM购买的NK603标准品(分别为0.1％、0.5％、1％、2％、5％)
转基因植物及深加工产品提取方法(In house)，购自海康生命科技有限公司；Taqman基因表达预混液(Master mix)，购自ABI公司。
实施例1：针对BT11的ERT-PCR条件优化-探针、引物浓度优化
材料：BT11 Genome；BT11SSIIB引物F，R(10μM)，SSIIB探针(10μM)；Specific引物F，R(10μM)，Specific探针(10μM)；
试剂：ABI 2×Master Mix，ddH2O
仪器：ABI 7500
检测目的基因为：BT11结构特异基因cry1Ab与adh1-IVS6的边界序列。引物探针序列如下：
方法与步骤：
a.实验设计
加样体系：
| 成分 | 储存浓度 | 单管加样体积(μL) |
| ddH2O | - | 9-A-B |
| 2×Master Mix | 2× | 10 |
| 引物-F/R | 10μM | A |
| 探针 | 10μM | B |
| 模板 | - | 1.0 |
| 总体积 | 25 |
其中A＝(20μL*引物浓度)/10μM
B＝(20μL*探针浓度)/10μM
模板：Genome浓度为110ng/μL
b.扩增条件：
50℃，2min；
95℃ 10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)；
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注释：60℃1min处收集荧光
通过引物浓度分别为0.2μM、0.3μM、0.5μM，引物：探针浓度为2∶1、1∶1、1∶2不同情况进行实时PCR，每个实验做2个重复。设立以水为模板的阴性对照(引物及探针比为1∶1)；模板为BT11转基因玉米种子采用Promega磁珠提取试剂盒提取基因组，浓度为11.2μg/mL。
实验结果显示，通过选用不同引物浓度，及在相同引物浓度下不用的引物、探针浓度比得出结论在相同引物及探针浓度比情况下，引物及探针浓度越高，实时PCR曲线的ΔRn值也就相对越高，同时CT值也呈现相应变化；当引物浓度达到0.5μM时，BT11的SSIIB基因以及Specific基因实时PCR曲线均较好，且ΔRn值均在1.5以上，鉴于实时PCR中探针与反应的特异性有一定关系，确定选用引物浓度为0.5μM，探针浓度为0.5μM作为最终的优化结果。
实施例2：针对BT11的ERT-PCR条件优化——循环数优化
材料：BT11Genome；BT11 SSIIB引物F，R(10μM)，SSIIB探针(10μM)；Specific 引物F，R(10μM)，Specific探针(10μM)同实施例1；
试剂：ABI 2×Master Mix，ddH2O
仪器：ABI 7500
方法与步骤：
a.实验设计：本次实验将选用两个不同的循环数条件，分别为5个循环数及10个循环数进行比较。
b.本实验选用引物∶探针＝1∶1，浓度分别为0.5μM
加样体系：
c.扩增条件：
1)50℃，2min；
95℃ 10min；
95℃ 5min，45℃ 30s，72℃ 1min(5cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注释：60℃ 1min处收集荧光
2)50℃，2min；
95℃ 10min；
95℃ 5min，45℃ 30s，72℃ 1min(10cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注释：60℃ 1min处收集荧光
分别对SSIIB组引物、Specific组引物进行循环数为5、10的ERT-PCR；每个实验做2个重复。模板为BT11转基因玉米种子采用Promega磁珠提取试剂盒提取基因组，浓度为11.2μg/mL，结果见下表。
不同循环数ERT-PCR CT值比较
| 样品名称 | CT(10cycles) | CT(5cycles) |
| specific-1 | 20.1174 | 24.2902 |
| specific-2 | 20.1461 | 24.3405 |
| SSIIB-1 | 19.7149 | 23.6693 |
| SSIIB-2 | 19.6259 | 23.7318 |
结论：通过循环数5cycles和10cycles的比较可得出结论，10cycles循环数下CT值较5Cycles循环数下的CT值小近4个循环，因此循环数为10的灵敏度较循环数为5的高。而这两种循环数下ΔRn值区别不大。
实施例3：用本发明所述方法检测转基因品系BT11特异基因
检测目的基因为：BT11结构特异基因cry1Ab与adh1-IVS6的边界序列。引物探针序列如下：
针对BT11的ERT-PCR的反应条件为：
50℃，2min；
95℃ 10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)；
95℃ 15s，60℃ 1min (40cycles)
针对BT11的ERT-PCR的反应体系见下表：
| 成分 | 终浓度 |
| ddH2O | |
| 2×Master Mix | 1× |
| 引物-F/R | 0.5μM |
| 探针 | 0.5μM |
| 模板 | 1～100ng |
| 总体积 | 25μL |
通过梯度稀释使用海康Food Ex及Food Ex plus植物基因组提取试剂盒提取的阳性基因组，进行梯度稀释(248ng，24.8ng，2.48ng，248pg，24.8pg)，建立标准曲线，扩增结果显示，本发明所述方法检测转基因玉米BT11特异基因序列的检测下限为24.8pg。而RT-PCR的检测下限仅为248pg。此结果说明：对于本发明所使用的ERT-PCR的检测转基因玉米BT11其检测下限要比使用RT-PCR高出10倍，说明ERT-PCR的检测方法更加灵敏。结果还显示：ERT-PCR结果的CT值较相同模板浓度RT-PCR的CT值小，而CT值位于35-40之间将无法判定阴性及阳性，此区间称为灰区。
实施例4：针对TT51-1(BT63)的ERT-PCR条件优化-探针、引物浓度优化
材料：BT63Genome；Specific引物F，R(10μM)，Specific探针(10μM)；
试剂：ABI 2×Master Mix，ddH2O
仪器：ABI 7500
检测目的基因为：TT51外源基因cry1Ab。引物探针序列如下：
实验设计
加样体系：
| 成分 | 储存浓度 | 单管加样体积(μL) |
| ddH2O | - | - |
| 2×Master Mix | - | 12.5 |
| 引物-F/R | 10μM | A |
| 探针 | 10μM | B |
| 模板 | - | 5.0 |
| 总体积 | 25 |
其中A＝(20μl*引物浓度)/10μM
B＝(20μl*探针浓度)/10μM
模板：Genome浓度为2ng/μL
扩增条件：
50℃，2min；
95℃ 10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)；
95℃ 15s，60℃ 1min
注：60℃1min处收集荧光
通过引物浓度分别为0.2μM、0.3μM、0.5μM，引物：探针浓度为2∶1、1∶1、1∶2不同情况进行实时PCR，每个实验做2个重复。设立以水为模板的阴性对照(引物及探针比为1∶1)；模板为BT63转基因水稻采用Promega磁珠提取试剂盒提取基因组，稀释后浓度为2ng/μL。
结果显示，当specific引物浓度为0.2μM时，探针浓度越高ΔR n值越高，当引物∶探针浓度为1∶2(引物浓度：0.2μM、探针浓度：0.4μM)时，Real time PCR曲线的ΔR n值达到2.6；而当引物∶探针浓度为2∶1(引物浓度：0.2μM、探针浓度：0.1μM)时，Real time PCR曲线的ΔRn值只达到0.7。引物与探针的浓度比对CT值的影响不大，当引物∶探针浓度＝2∶1时，CT值分别为：21.0，21.5；引物∶探针浓度＝1∶2时，CT值分别为：19.5，19.5。
当specific引物浓度为0.3μM时，探针浓度越高ΔRn值越高，当引物∶探针浓度＝1∶2(引物浓度：0.3μM、探针浓度：0.6μM)时，Real time PCR曲线的ΔR n值达到3.6左右；而当引物∶探针浓度＝2∶1(引物浓度：0.3μM、探针浓度：0.15μM)时，Real time PCR曲线的ΔRn值只达到1.4左右。引物与探针的浓度比对CT值的影响不大，当引物∶探针浓度＝2∶1时，CT值分别为：19.7，20.0；引物∶探针浓度＝1∶2时，CT值为：19.4，19.5。
当specific引物浓度为0.5μM时，探针浓度越高ΔRn值越高，当引物∶探针浓度＝1∶2(引物浓度：0.5μM、探针浓度：1μM)时，Real time PCR曲线的ΔR n值达到5.3左右；而当引物∶探针浓度＝2∶1(引物浓度：0.5μM、探针浓度：0.25μM)时，Real time PCR曲线的ΔRn值只达到2.3左右。引物与探针的浓度比对CT值的影响不大，当引物∶探针浓度＝2∶1时，CT值分别为：19.6、19.6；引物∶探针浓度＝1∶2时，CT值分别为：19.4、19.4。当引物浓度为0.5μM时，Real time PCR的ΔRn值以及CT值变化均较小。
通过选用不同引物浓度，及在相同引物浓度下不同的引物、探针浓度比得出结论：在相同引物及探针浓度比情况下，引物及探针浓度越高，Real timePCR曲线的ΔR n值也就相对越高，同时CT值也呈现相应变化；当引物浓度达到0.5μM时，BT63的Specific基因Real time PCR曲线均较好，且ΔRn值均在1.5以上，鉴于Real time PCR中探针与反应的特异性有一定关系以及从节约成本的角度考虑，本实验选用引物浓度为0.5μM，探针浓度为0.25μM作为最终的优化结果。
实施例5：针对TT51-1(BT63)的ERT-PCR条件优化——循环数优化
材料：BT63Genome；BT63Specific引物F，R(10μM)，Specific探针(10μM)；
试剂：ABI 2×Master Mix，ddH2O
仪器：ABI 7500
a.实验设计：本次实验将选用两个不同的循环数条件，分别为：5个循环数、10个循环数进行比较。
b.通过20100205日实验，本实验选用引物∶探针＝2∶1，浓度、探针分别为：0.5μM
加样体系：
A＝(20μl*引物浓度)/10μM
B＝(20μl*探针浓度)/10μM
模板：Genome浓度为2ng/μLc.扩增条件：
1)50℃，2min；
95℃ 10min；
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(5cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注：60℃1min处收集荧光
2)50℃，2min；
95℃ 10min；
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注：60℃1min处收集荧光
分别对引物进行循环数为5、10的ERT-PCR，设置NTC：以水为模板的阴性对照(引物及探针比为1∶1)；2个重复。模板为BT63转基因水稻采用Promega磁珠提取试剂盒提取基因组，稀释后浓度为2ng/μL，结果见下表。
不同循环数ERT-PCR CT值比较
| 样品名 | CT(10cycles) | CT(5cycles) |
| specific-1 | 19.5689 | 24.3398 |
| specific-2 | 19.6372 | 24.5139 |
通过循环数5cycles和10cycles的比较可得出结论，10cycles的CT值较5Cycles的CT值小3左右，因此循环数为10的灵敏度较循环数为5的高出23倍。而这两种循环数下ΔRn值区别不大。
实施例6：针对TT51-1(BT63)的ERT-PCR条件优化-温度优化
材料：BT63Genome；BT63Specific 引物F，R(10μM)，Specific探针(10μM)；
试剂：ABI 2×Master Mix，ddH2O
仪器：ABI 7500
方法与步骤：
a.实验设计：本次实验将选用两个不同的温度条件，分别为：45度、50度进行比较。
b.通过20100205日实验，本实验选用引物∶探针＝2∶1，浓度分别为0.5μM
加样体系：
A＝(20μL*引物浓度)/10μM
B＝(20μL*探针浓度)/10μM
模板：Genome浓度为2ng/μL
c.扩增条件：
1)50℃，2min；
95℃ 10min；
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注：60℃1min处收集荧光
2)50℃，2min；
95℃10min；
95℃ 15s，50℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
注：60℃1min处收集荧光
分别在温度为45℃、50℃时进行ERT-PCR，设置NTC：以水为模板的阴性对照(引物及探针比为1∶1)；2个重复。模板为BT63转基因水稻采用Promega磁珠提取试剂盒提取基因组，浓度为2ng/μL，结果见下表：
不同温度下ERT-PCR CT值比较
通过温度为50℃和45℃的比较可得出结论，50℃的CT值较45℃的CT值小0.2左右，差别不大。且这两种温度下ΔRn值区别也不大。
实施例7：用本发明所述方法检测转基因品系TT51-1特异基因
检测目的基因为：TT51外源基因cry1Ab。引物探针序列如下：
使用海康Food Ex及Food Ex plus植物基因组提取试剂盒提取的阳性基因组，配成如下25μL反应体系，进行PCR扩增反应：
针对TT51-1的ERT-PCR的反应条件为：
50℃，2min；
95℃10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)；
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
针对TT51-1的ERT-PCR的反应体系见下表。
| 成分 | 终浓度 |
| ddH2O | |
| 2×Master Mix | 1× |
| 引物-F/R | 0.5μM |
| 探针 | 0.25μM |
| 模板 | 1～100ng |
| 总体积 | 25μL |
通过梯度稀释使用海康Food Ex及Food Ex plus植物基因组提取试剂盒提取的阳性基因组，进行梯度稀释(625ng，125ng，25ng，5ng，1ng，200pg，40pg，8pg)，建立标准曲线，扩增曲线结果显示，转基因水稻TT51-1特异基因序列的检测下限为40pg。而RT-PCR 40pg时候的CT＞35。所以检测下限仅为200pg，不如ERT-PCR方法灵敏。从实验结果图中还可以看出，ERT-PCR结果的CT值较相同模板浓度RT-PCR的CT值小，而CT值位于35-40之间将无法判定阴性及阳性，此区间称为灰区。
实施例8：本发明所述方法检测的准确性
针对转基因玉米NK603的ERT-PCR的反应条件为：
50℃，2min；
95℃10min
95℃ 15s，45℃ 30s，72℃ 30s(10cycles)；
95℃ 15s，60℃ 1min(40cycles)
针对NK603的ERT-PCR的反应体系见下表。
NK603检测时采用北京海康公司检测用的引物探针，采用以上扩增体系，分别使用IRMM的标准品(分别为0.1％、0.5％、1％、2％、5％)建立标准曲线，对ABC三个盲样进行定值，以检测ERT-PCR的准确性，结果见下表。
结果显示，两组结果不存在显著性差异(P＞0.05)。但因为A1，B1，C1三组盲样(香港海康生命科技有限公司提供)的真值分别为0.5％，1％，5％，ERT-PCR检测结果比RT-PCR更接近真实值，说明ERT-PCR的准确性要比RT-PCR高。
综上所述：通过对标准品进行梯度稀释，ERT-PCR内源基因和外源基因的扩增效率都达到要求，并且线性关系好，R2＞0.98。扩增效率在100％左右，说明ERT-PCR反应条件已优化好，并可以应用于转基因植物及其产品的检测。
通过ERT-PCR和RT-PCR比较发现，ERT-PCR的检测下限较普通RT-PCR高出10倍左右。ERT-PCR与RT-PCR采用相同的模板，ERT-PCR的CT值范围在12-30，而普通RT-PCR的CT值范围则位于22-39之间，而一般认为CT值在40左右就很难判定阴性或者阳性，所以从这个角度上分析，ERT-PCR提高了检测的灵敏度。另外，我们分别采用ERT-PCR以及RT-PCR分别对转基因种子(0.5％，1％，5％)进行定量定值结果符合要求，且与RT-PCR定值结果不存在显著性差异。
上述结果显示，与目前转基因检测普遍使用的荧光定量PCR检测技术相比。ERT-PCR具有检测方法灵敏度高，约为RT-PCR灵敏度的10倍。针对转基因含量较低或深加工的转基因产品造成的DNA分子的严重破坏，提取的DNA含有大量PCR抑制剂以及由于目前所应用的荧光定量PCR检测方法无法判定阴性阳性的灰区的样品特别适合，并可在多种转基因品系的检测中应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种检测转基因玉米品系BT11的增强型荧光定量PCR方法，其特征在于，将包含引物组0.5μM、探针0.5μM、模板1-100ng的总体积25μl的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：
50°C，2min；
95°C 10min；
95°C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10个循环;
95°C 15s，60°C 1min，40个循环；
所述引物组中上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示；所述探针序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种检测转基因水稻品系TT51-1的增强型荧光定量PCR方法，其特征在于，将包含引物组0.5μM、探针0.25μM、模板100ng的总体积25μl的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：
50°C，2min；
95°C 10min
95°C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10个循环;
95°C 15s，60°C 1min，40个循环；
所述引物组中上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQID No.5所示；所述探针序列如SEQ ID No.6所示。
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