CN102388137A

CN102388137A - 新型溶血磷脂酰基转移酶

Info

Publication number: CN102388137A
Application number: CN2010800159450A
Authority: CN
Inventors: 落合美佐
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2030-03-25
Also published as: EP2676554A2; EP2412804A4; KR101742933B1; US20150011786A1; AU2010228217A1; KR101692016B1; US9315835B2; RU2011143144A; EP2676554B1; EP2412804A1; CA3004441C; RU2534559C2; EP2676554A3; CA2755387A1; DK2676554T3; DK2412804T3; BRPI1009810A2; JP5539961B2; CN102388137B; JPWO2010110375A1

Abstract

本发明提供新型溶血磷脂酰基转移酶。本发明的上述课题通过本发明的序列号1及6的碱基序列以及序列号2及7的氨基酸序列来解决。

Description

新型溶血磷脂酰基转移酶

技术领域

本发明涉及新型溶血磷脂酰基转移酶。

背景技术

高不饱和脂肪酸的生物合成

脂肪酸是构成磷脂质、三酰基甘油等脂质的重要成分，含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为高不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已报道了各种生理活性(非专利文献1)。

虽然期待该高不饱和脂肪酸在各种领域中的应用，其中也包括了在动物体内不能合成的物质。因此，开发出了通过培养各种微生物来获得高不饱和脂肪酸的方法。并且，也进行了用植物生产高不饱和脂肪酸的尝试。在这种情况下，已知高不饱和脂肪酸例如作为三酰基甘油等储存脂质的构成成分，可在微生物的菌体内或植物种子中积累。

花生四烯酸是高不饱和脂肪酸中的一种，其作为形成前列腺素、白三烯等的中间代谢物受到关注，已进行了大量将其应用于功能性食品、医药品的原料的尝试。进而因为花生四烯酸在母乳中含有，对婴儿的发育，特别是胎儿的身高、脑的发育很重要，所以作为婴儿发育的必要成分，从营养学的观点来看与DHA(二十二碳六烯酸)共同受到关注。

花生四烯酸用图1所示的路径进行生物合成。具体来说，由通过新型脂肪酸合成而生成的棕榈酸经过数次链延长反应和去饱和反应而生成花生四烯酸。已知在该路径中，链延长酶及Δ9去饱和酶对酰基辅酶A进行作用。此外，Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶对卵磷脂等磷脂质的酰基进行作用(非专利文献2)。因此，在花生四烯酸等的PUFA的生物合成中，酰基必须可在酰基辅酶A与磷脂质之间转移。并不限于PUFA的生物合成，将在生物合成磷脂质后仅改变脂肪酸称为磷脂质的“改制(remodeling)”，已知溶血磷脂酰基转移酶(以下记为“LPLAT”)参与了该反应(非专利文献3)。

三酰基甘油的生物合成

作为储存脂质的三酰基甘油在生物体内如下述方式合成。即：甘油-3-磷酸在甘油-3-磷酸酰基转移酶(以下有时记为“GPAT”)的作用下，1位(α位)的羟基发生酰化从而生成溶血磷脂酸(以下有时记为“LPA”)。LPA是仅具有1个酰基的溶血磷脂质，其被溶血磷脂酸酰基转移酶(以下有时记为“LPAAT”)酰化从而生成磷脂酸(以下有时记为“PA”)。该PA被磷脂酸磷酸酯酶脱磷酸化生成二酰基甘油，该二酰基甘油被二酰基甘油酰基转移酶(以下有时记为“DGAT”)酰化生成三酰基甘油。此外，已知酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(以下有时记为“ACAT”)、溶血卵磷脂酰基转移酶(以下有时记为“LPCAT”)等间接参与三酰基甘油的生物合成。

磷脂质的生物合成

如上所述在LPAAT的作用下由LPA生成的PA成为各种磷脂质生物合成的前体。例如由PA可以生物合成磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)等重要的磷脂质。PA不仅是这样生物合成脂质的中间体，而且是具有细胞增殖、血小板凝聚效果、平滑肌收缩效果、促进癌浸润效果等非常多的生物学、药理学的作用的脂质性细胞内及细胞间的介质。

溶血磷脂酰基转移酶

如上所述，认为LPLAT参与PUFA的生物合成。该LPLAT是具有将酰基导入溶血磷脂质上的活性的酶的总称，根据对于底物的特异性的不同，也就是说根据作为底物的溶血磷脂质的分子种类的不同，存在各种称呼的LPLAT。其中1个是以LPA为底物的参与三酰基甘油、磷脂质的合成的LPAAT。LPLAT所作用的溶血磷脂质中此外还包括溶血卵磷脂(LPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)等。因此，从各种酶所作用的磷脂质的分子种类的不同来看，称为LPAAT、LPCAT、溶血磷脂酰丝氨酸酰基转移酶(LPSAT)、溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶(LPIAT)等。有时各种酶对1种溶血磷脂质进行特异性作用，但有时也对多种特异性溶血磷脂质进行作用。例如在被称为LPAAT的LPLAT中，不仅对LPA，也包括对LPC、LPE等进行作用的酶。

根据序列特征对溶血磷脂酰基转移酶的分类

LPLAT被分类为甘油磷脂质酰基转移酶。从氨基酸序列的比对来看，认为该甘油磷脂质酰基转移酶分类为LPAAT家族、MBOAT(膜结合O-酰基转移酶)家族及DGAT2家族这3个组(非专利文献5)。属于LPAAT家族的酶的特征在于，共同具有膜结合区域，序列上有保守基序(LPAAT基序)。属于LPAAT家族的酶中包括LPAAT、GPAT等。MBOAT家族中所包含的酶的特征在于，共同具有膜结合区域。已知在MBOAT家族中，除LPLAT之外还包括DGAT、ACAT等。认为在动物等体内属于MBOAT家族的几种酶是负责对膜磷脂质生物合成来说非常重要的改制反应的酶。

关于LPLAT，已在细菌、酵母等单细胞生物至哺乳动物等高等生物的种类广泛的生物中进行了报道。在菌类的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为膜结合型的LPLAT基因，已知有SLC1(YDL052C)和SLC4(YOR175C)(有时称为“ALE1”或“LPT1”)(非专利文献5)。在动物体内存在有多种LPLAT同源物，已知有在一次(de novo)合成甘油三酯体系中负责对LPA作用从而生成PA的反应的酶、对磷脂质的改制发挥作用的酶(非专利文献6)。

在作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下有时记为“M.alpina”)中得到了4种LPLAT，这些均属于LPAAT家族(专利文献1～3)。但是尚未报道从M.alpina中得到了属于MBOAT家族的LPLAT。

现有技术文献

专利文献

专利文献1 国际公报WO2004/087902号

专利文献2 美国专利申请公开公报US2006/0094090号

专利文献3 国际公报WO2008/146745号

非专利文献

非专利文献1 Lipids，39，1147(2004)

非专利文献2 J.B.C.，278(37)，35115-35126，(2003)

非专利文献3 J.B.C.，276(29)，26745-26752，(2001)

非专利文献4 Proc.Nath，Aca，Sci.，105(8)，2830-2835，(2008)

非专利文献5 J.B.C.，282(42)，30845-30855，(2007)

非专利文献6 J.B.C.，284(1)，1-5，(2009)

非专利文献7 Trends Biochem.Sci.25，111-112，(2000)

非专利文献8 Journal of lipid reserach 2009 R80035 JLR200v1

发明内容

如上所述，在花生四烯酸等PUFA的生物合成中磷脂质的改制是必需的，认为LPLAT参与该反应。但是存在对于目前为止所知的LPAAT同源物，即使导入宿主并进行表达，也不能使总脂肪酸中的PUFA的比率充分提高的课题。因此，需要鉴定出导入宿主内进行表达时能够使宿主的总脂肪酸中的PUFA的比率充分提高的新型核酸及蛋白质。此外，需要鉴定出可生产出利用价值高、脂肪酸的含量高的油脂的核酸及蛋白质，利用这些核酸及蛋白质来开发可生产出有用脂肪酸或者可提高有用脂肪酸的含量的方法。

本发明的目的是提供以下蛋白质及核酸，即：通过在宿主细胞内表达，或对宿主的脂质代谢产生影响，或使目标脂肪酸的含量增加，从而可生产出有用的油脂的蛋白质及核酸

在花生四烯酸等PUFA的生物合成中，磷脂质的改制是必需的。脂质生产菌M.alpina虽然可大量蓄积花生四烯酸等有用的PUFA，但如在动物等体内报道的参与脂质改制的属于MBOAT家族的酰基转移酶仍未从M.alpina中得到。本发明者对这一点进行关注，为了解决上述课题进行了精心研究，从M.alpina中获得了编码属于MBOAT家族的酶的cDNA，进而将得到的cDNA导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞内以试验产生脂肪酸组合物，结果发现可生成与将含有编码从M.alpina中得到的已知LPAAT的核酸的载体导入的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物、特别是花生四烯酸比率高的脂肪酸组合物。由此本发明者成功地进行了与已知LPAAT不同的新型LPLAT相关的基因的克隆，于是完成了本发明。

即：本发明如下所述。

(1)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(e)中任一项所述的核酸，

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有80％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列。

(2)根据(1)所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(e)中的任一项，(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列；

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且含有编码具有溶血磷脂酰基转移酶活性的蛋白质的碱基序列。

(3)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(e)中任一项所述的核酸，

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有80％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性。

(4)根据(3)所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(e)中的任一项，

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性；

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且含有编码具有以下活性的蛋白质的碱基序列，即：能够使被含有所述核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的核酸，其特征在于，编码的蛋白质属于膜结合性O-酰基转移酶家族。

(6)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(d)中任一项所述的核酸，

(a)核酸，其含有序列号1或6所示的碱基序列或其部分序列，

(b)核酸，其含有编码由序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列，

(c)核酸，其含有序列号4或9所示的碱基序列或其部分序列，

(d)核酸，其含有序列号5或10所示的碱基序列或其部分序列。

(7)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酰基转移酶活性，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酰基转移酶活性。

(8)根据(7)所述的蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中的任一项，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酰基转移酶活性，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酰基转移酶活性。

(9)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有能够使被含有编码所述氨基酸序列的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有能够使被含有编码所述氨基酸序列的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性。

(10)根据(9)所述的蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中的任一项，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有能够使被含有编码所述氨基酸序列的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有能够使被含有编码所述氨基酸序列的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被所述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性。

(11)根据(7)～(10)中任一项所述的蛋白质，其特征在于，属于膜结合性O-酰基转移酶家族。

(12)一种蛋白质，其特征在于，由序列号2或7所示的氨基酸序列组成。

(13)一种重组载体，其特征在于，含有(1)～(6)中任一项所述的核酸。

(14)一种转化体，其特征在于，被(13)所述的重组载体转化。

(15)脂肪酸组合物，其为培养(14)所述的转化体而得到的脂肪酸组合物，其特征在于，该脂肪酸组合物中的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比培养作为非转化体的宿主而得到的脂肪酸组合物中的花生四烯酸的比率高。

(16)脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从培养(14)所述的转化体而得到的培养物中提取(15)所述的脂肪酸组合物。

(17)一种食品，其特征在于，含有(15)所述的脂肪酸组合物。

(18)一种方法，其特征在于，使用(13)所述的重组载体，使导入了该载体的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未导入该载体的宿主的脂肪酸组成中的比率提高。

(19)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(e)中任一项所述的核酸，

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的蛋白质的碱基序列，

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的蛋白质的碱基序列，

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有80％以上同一性的碱基序列，且含有编码参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的蛋白质的碱基序列，

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成、且参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的蛋白质的碱基序列，

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的蛋白质的碱基序列。

(20)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成，且参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化。

本发明的LPLAT，因为能够使花生四烯酸等有用的脂肪酸、储存脂质的生产能力提高，所以优选作为可提高微生物、植物中的高不饱和脂肪酸的生产率的酶。因此，因为能够提供具有所期望特性、效果的脂质，所以作为可应用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的酶而有用。

附图说明

图1为表示花生四烯酸的生物合成路径的模式图。此外，图1中PL表示磷脂质、CoA表示辅酶A(coenzyme A)、DS表示去饱和酶(脂肪酸去饱和酶)、GLELO表示脂肪酸链延长酶、18:0-表示硬脂酰基、18:1-表示油酰基、18:2-表示亚油酰基、18:3(n-6)-表示γ-亚麻酰基、DGLA-表示二高-γ-亚麻酰基、ARA-表示花生四烯酰基。

图2表示来自M.alpina1S-4株的LPLAT5的cDNA全长序列(序列号4)及由其导出的氨基酸序列(序列号2)。

图3表示来自M.alpina1S-4株的LPLAT6的cDNA全长序列(序列号9)及由其导出的氨基酸序列(序列号7)。

图4A为来自M.alpina1S-4株的LPLAT5的基因组序列(序列号5)与ORF的序列(序列号1)的序列比对图。

图4B为来自M.alpina1S-4株的LPLAT5的基因组序列(序列号5)与ORF的序列(序列号1)的序列比对图。

图4C为来自M.alpina1S-4株的LPLAT5的基因组序列(序列号5)与ORF的序列(序列号1)的序列比对图。

图5A为来自M.alpina1S-4株的LPLAT6的基因组序列(序列号10)与ORF的序列(序列号6)的序列比对图。

图5B为来自M.alpina1S-4株的LPLAT6的基因组序列(序列号10)与ORF的序列(序列号6)的序列比对图。

图5C为来自M.alpina1S-4株的LPLAT6的基因组序列(序列号10)与ORF的序列(序列号6)的序列比对图。

图6为表示在M.alpina中抑制LPLAT6或Δ5脂肪酸去饱和酶表达时菌体内高不饱和脂肪酸组成比的坐标图。图6中GLA表示γ-亚麻酸，DGLA表示二高γ-亚麻酸，ARA表示花生四烯酸。

图7为表示在M.alpina中抑制LPLAT6或Δ5脂肪酸去饱和酶表达时三酰基甘油组分中的高不饱和脂肪酸组成比的坐标图。图7中GLA表示γ-亚麻酸，DGLA表示二高γ-亚麻酸，ARA表示花生四烯酸。

图8为表示在M.alpina中抑制LPLAT6或Δ5脂肪酸去饱和酶表达时磷脂质组分中的高不饱和脂肪酸组成比的坐标图。图8中GLA表示γ-亚麻酸，DGLA表示二高γ-亚麻酸，ARA表示花生四烯酸。

具体实施方式

本发明涉及来自森田属(Mortierella)的新型溶血磷脂酰基转移酶(“LPLAT”)，其特征在于，在花生四烯酸的生物合成过程中，使酰基在酰基辅酶A与磷脂质之间转移。本发明的蛋白质可对溶血磷脂质产生作用。酰基供体通常为酰基辅酶A，但并不限于此。

以下对本发明的实施方式进行具体说明。

本发明的编码溶血磷脂酰基转移酶的核酸

被本发明的核酸编码的溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)，作为其典型例子，包括LPLAT5及6。LPLAT5及6如以下实施例中的说明，可在宿主中产生具有如下特征的组成的脂肪酸组合物，即：与使公知的来自M.alpina的LPAAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物不同、花生四烯酸的比率高的特征。因此，本发明的LPLAT，优选与公知的来自M.alpina的LPAAT相比花生四烯酸产生效率极高。

本发明的编码LPLAT5及LPLAT6的核酸的cDNA、CDS、ORF及氨基酸序列的对应关系已整理并记载于以下表1中。

表1

也就是说，作为本发明的与LPLAT5相关的序列，可例举作为表示LPLAT5的ORF区域的序列的序列号1、作为LPLAT5的氨基酸序列的序列号2、作为表示LPLAT5的CDS区域的序列的序列号3、作为其cDNA的碱基序列的序列号4及作为其基因组序列的序列号5。其中，作为LPLAT5的cDNA序列的序列号4的第161-1693位的碱基序列相当于CDS(序列号3)，第161-1690位的碱基序列相当于ORF(序列号1)。图2中记载LPLAT5的cDNA序列与推定氨基酸序列。LPLAT5的基因组序列(序列号5)含有2个内含子，外显子区域为序列号5的第1-314位、第461-587位、第668-1759位碱基序列的区域。

同样，作为本发明的与LPLAT6相关的序列，可例举作为表示LPLAT6的ORF区域的序列的序列号6，作为LPLAT6的氨基酸序列的序列号7，作为表示LPLAT6的CDS区域的序列的序列号8、作为其cDNA的碱基序列的序列号9及作为其基因组序列的序列号10。其中，作为LPLAT6的cDNA序列的序列号9的第38-1759位的碱基序列相当于CDS(序列号8)，第38-1756位的碱基序列相当于ORF(序列号6)。图3中记载LPLAT6的cDNA序列与推定氨基酸序列。LPLAT6的基因组序列(序列号10)含有1个内含子，外显子为序列号10的第1-1095位及第1318-1944位的碱基序列的区域。

本发明的核酸除单链及双链的DNA之外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制备。DNA中，例如可例举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及这些DNA的组合物、DNA和RNA的杂交体，但并不限于此。

作为本发明核酸的优选实施方式，可例举(a)含有序列号1或6所示的碱基序列的核酸、(b)含有编码由序列号2或7所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸、(c)含有序列号4或9所示的碱基序列的核酸或(d)含有序列号5或10所示的碱基序列的核酸等。

为了获得上述碱基序列，也可以从具有LPLAT活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知的具有LPLAT活性的蛋白质有高同一性的蛋白质的碱基序列。作为具有LPLAT活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可例举M.alpina，但并不限于此。

进行EST分析时，首先构建cDNA文库。关于cDNA文库的构建方法，可参考《MolecularCloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》(美国冷泉港出版社(2001))。并且也可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举以下方法。即：将作为脂质生产菌的M.alpina的适当菌株接种到适当的培养基中，预培养适当时间。在主培养中适时提取培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从得到的总RNA中纯化poly(A)+RNA。并且可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列使用按照可决定载体上插入部分的碱基序列的方式设计的引物来决定，可得到EST。例如用ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(ZAP-cDNA GigapackIII金克隆试剂盒)(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。

相对于在GenBank中注册的氨基酸序列，利用BLASTX对本发明序列号1及6进行同源性分析时，由序列号1推定的氨基酸序列显示与来自真菌类的LPLAT同源物有同源性，由序列号6推定的氨基酸序列显示与来自动物的LPLAT同源物有同源性。用ClustalW来求出与各序列的ORF同一性最高的序列相关的碱基序列的同一性及氨基酸序列的同一性时，与序列号1的E-value(E-值)最低、即同一性最高的是来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的溶血磷脂酰基转移酶同源物(GI：161085648)，ORF的碱基序列的同一性为43.2％，氨基酸序列的同一性为33.3％。同样与序列号6同一性最高的是来自爪蟾(Xenopus laevis)的推定蛋白质(GI：56788919)，ORF的碱基序列的同一性为41.2％、氨基酸序列的同一性为28.6％。

LPLAT5与LPLAT6之间的同一性，ORF的碱基序列为40.0％，氨基酸序列为19.1％。

本发明还包括与含有上述序列号1或6所示的碱基序列(有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2或7所示的氨基酸序列(有时记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。具有“同等功能”是指本发明的碱基序列所编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质，具有如下活性：“溶血磷脂酰基转移酶活性(LPLAT活性)”、“能够使被含有编码本发明的蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被上述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性(以下有时称为“可提高花生四烯酸的比率的活性”)”、及/或“参与选自由18:1-CoA向18:1-PL转化、由18:3(n n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化、及由DGLA-CoA向DGLA-PL转化中的1种以上的转化的活性(以下有时称为“参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”)”。意味着优选具有与LPLAT5及/或6同样的活性。

本发明的“溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)活性”是指可使酰基在酰基辅酶A与溶血磷脂质之间转移的活性。“溶血磷脂质”是指从磷脂质中去掉1个酰基后的脂质。在本说明书中，溶血磷脂质无特别限定，包括溶血磷脂酸(LPA)、溶血卵磷脂(LPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)等。

本发明的LPLAT可以对1种溶血磷脂质进行特异性作用，也可以对多种特异性溶血磷脂质进行作用。

本发明的LPLAT活性可使用公知的方法测定，例如可例举J.B.C.，282(47)，34288-34298(2007)中记载的方法。

本发明的“可提高花生四烯酸的比率的活性”，如上所述是指能够使被含有本发明的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被上述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性，具体来说是指如下活性，即：能够使被包含含有本发明的碱基序列的核酸或含有编码由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸的重组载体转化的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未被上述载体转化的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的活性。该活性的测定可使用公知的方法，例如可例举如下方法，即：将上述本发明的碱基序列等插入表达载体pYE22m后，通过导入Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因、Δ5脂肪酸去饱和酶基因并进行表达，使以可产生花生四烯酸的方式而育种的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主进行转化，对于通过培养得到的转化体而回收的菌体，用以下实施例中记载的方法进行脂肪酸分析的方法等。

本发明的“参与花生四烯酸的生物合成路径”的活性，是指参与由18:1-CoA向18:1-PL转化、由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化、及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的活性。优选该活性是指参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA转化、及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL转化的活性。在此，18:1表示油酰基，18:3(n-6)表示γ-亚麻酰基，DGLA表示二高γ-亚麻酰基，PL表示磷脂质，CoA表示辅酶A。因此，例如DGLA-CoA意味着含有二高γ-亚麻酰基的酰基辅酶A，DGLA-PL意味着含有二高γ-亚麻酰基的磷脂质。参与花生四烯酸的生物合成路径的活性的确认，可通过确认各种由起始底物向生成底物的转化来进行。或者，可通过在被含有编码本发明蛋白质的核酸的重组载体转化的宿主或细胞中使本发明蛋白质进行过表达，或者在具有生产花生四烯酸能力的细胞中抑制该蛋白质表达来确认。例如可例举以下方法，即：用以下实施例中记载的方法，对于使本发明蛋白质过表达的宿主或细胞内的脂肪酸组成、或抑制了本发明蛋白质的表达的宿主或细胞内的脂肪酸组成进行分析，从该脂肪酸组成的变化来确认上述由各种起始底物向生成底物的转化。

进而优选本发明的碱基序列等为含有编码以下蛋白质的碱基序列的核酸，即：具有LPLAT活性、可提高上述花生四烯酸的比率的活性、及/或参与上述花生四烯酸的生物合成路径的活性的蛋白质。

进而特别优选被本发明的核酸编码的溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)，是LPLAT中的属于膜结合性O-酰基转移酶(MBOAT)家族的酶。

“MBOAT家族”为属于PFAM的注册号PF03062的蛋白质的家族，是指甘油磷脂质酰基转移酶的氨基酸序列中具有膜贯通区域的酶群。PFAM(http://pfam.sanger.ac.uk/)是由蛋白质家族的比对而得到的Profile(轮廓)数据库，由Sanger Institute提供。各Profile(轮廓)由类似序列组成，通过隐马尔可夫模型分析。除作为对象的蛋白质的名称外，还可使用关键词、编码该蛋白质的核酸序列、该蛋白质的氨基酸序列、注册号等信息来检索所期望的属于哪种蛋白质家族。根据使用编码本发明得到的LPLAT的核酸序列或LPLAT的氨基酸序列的检索，证明该蛋白质属于注册号PF03062的MBOAT家族。进而，属于MBOAT家族的酶中共同存在作为活性中心的保守的组氨酸残基，例如在LPLAT5中氨基酸序列中的第317位组氨酸残基相当于其活性中心，在LPLAT6中氨基酸序列中的第456位组氨酸残基相当于其活性中心。

此外，MBOAT家族与LPAAT家族不同，不含LPAAT基序。LPAAT基序是指专利文献3中记载的LPAAT蛋白质的氨基酸序列中4个位置存在的保守基序“HXXXXD(HX4D)”。例如在专利文献3中记载的来自作为脂质生产菌的M.alpina的LPAAT3中，专利文献3中的序列号2的氨基酸残基115-120相当于LPAAT基序，在LPAAT4中序列号4的氨基酸残基115-120相当于LPAAT基序。但是本发明的LPLAT蛋白质没有这样的基序。

在M.alpina中目前为至已检测出4种LPLAT(专利文献1～3)，但属于MBOAT家族的LPLAT酶仍未发现。因此，本发明的LPLAT特别优选属于MBOAT家族的LPLAT，为含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。

作为具有与上述本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举含有以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列的核酸。此外，在以下例举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”意味着上述“LPLAT活性、可提高花生四烯酸的比率的活性、及/或参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”。

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。“本发明的上述活性”如上所述。

具体来说，其为编码由如下氨基酸序列组成的蛋白质且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，即在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～400个、1～200个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、更优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸发生缺失、取代及/或附加后的氨基酸序列。在此，氨基酸序列发生了缺失、取代及/或附加，意味着在同一序列中的任意位置且在1个或多个氨基酸序列中的位置上有1或多个氨基酸残基的缺失、取代及/或附加。该缺失、取代及/或附加中的2种以上可同时发生，该缺失、取代及/或附加的数量通常来说越小越好。

其中，取代优选为保守取代，保守取代是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原来序列的结构相关的特征，可以为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构，或者不破坏赋予原来序列特征的其它种类的二级结构，可以为任何取代。

保守取代通常用生物学体系合成、化学肽合成来导入，优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也含有肽模仿物、氨基酸序列中没有被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。

以下将氨基酸残基按照可取代的残基进行分类例示，但可取代的氨基酸残基并不限定于以下记载的氨基酸残基。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

非保守性取代时，上述种类中的某1种成分可以与其他种类的成分交换，此时为了保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982))。

此外，非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。

在本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩略语均遵照IUPAC-IUB委员会的生物化学命名法的规定，或者基于例如《Immunology--A Synthesis(免疫合成)》(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren监修，Sinauer Associates，马萨诸塞州，桑德兰(Sunderland)(1991))等记载的本领域惯用的缩略语。此外，对于氨基酸，如果有光学异构体时，如无特别标示，均表示L体。

D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、以及其它非惯用的氨基酸也可作为构成本发明的蛋白质的要素。

此外，本说明书中使用的蛋白质的表示方法，根据标准用法及本领域惯用的表示方法，左方为氨基末端方向，右方为羧基末端方向。同样，在通常情况下如无特别说明，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方为5’方向。

如果是本领域技术人员，使用本领域公知的技术，可设计并构建本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如通过将认为对本发明的蛋白质的生物学活性不太重要的区域作为靶区，可鉴定出不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而可改变其结构的蛋白质分子中适当的区域。并且还可鉴定出在类似蛋白质间保留的分子残基及区域。进而，在认为对本发明的蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性、且对蛋白质的多肽结构不产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。

只要是本领域技术人员，通过鉴定对本发明的蛋白质生物学活性或结构重要的与相同蛋白质的肽类似的肽残基，比较这2个肽的氨基酸残基，即可预测与本发明的蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，也就是说，可进行结构-功能研究。进一步通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，还可选择保持本发明蛋白质的生物学活性的突变体。此外，如果是本领域技术人员，也可对本蛋白质的突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。并且从获得的分析结果中，也可预测与蛋白质的三维结构相关的氨基酸残基的比对。预测在蛋白质表面上存在的氨基酸残基，有参与和其他分子的重要相互作用的可能性，如果是本领域技术人员，可根据上述分析结果，构建使预测在这种蛋白质表面上存在的氨基酸残基不变化的突变体。进而如果是本领域技术人员，还可构建在构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基中仅有一个氨基酸残基发生取代的突变体。将这种突变体通过公知的分析方法进行筛选，可收集各种突变体的信息。通过这样，对于取代了某种特定氨基酸残基的突变体的生物学活性与本发明的蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现这种生物学活性时、或者产生抑制本蛋白质的生物学活性的不适当活性时的情况进行比较，可评价构成本发明的蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，根据这种从天常实验中收集的信息，通过单独应用或与其他突变组合，即可容易地分析作为本发明蛋白质的突变体所不期望的氨基酸取代。

如上所述，由在序列号2或7表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，可根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.(分子克隆，实验室手册，第三版)》(美国冷泉港出版社(2001))、《CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学的现行条例)》(John Wiley & Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6)等记载的定点诱变法等方法进行制备。这种氨基酸发生了缺失、取代或附加等突变的突变体的构建，例如可通过Kunkel(昆克尔)法、缺口双链体(Gapped duplex)法等公知的方法，使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒，例如QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(QuikChange^TM位点定向诱变试剂盒)(Stratagene公司制)、GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(GeneTailor^TM位点定向诱变系统)(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(TaKaRa位点定向诱变系统)(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TaKaRa Bio公司制)等进行。

此外，作为在蛋白质的氨基酸序列中，在保持其活性的同时导入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，除上述定点诱变之外，还可例举用突变源处理基因的方法、以及使基因选择性断裂从而将被选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。

本发明的核酸，优选为含有编码由在序列号2或7中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。本发明的蛋白质中的氨基酸的突变或修饰的数量、或者突变或修饰的位点，只要可保持本发明的上述活性则无限制。本发明的上述活性的测定方法如上所述。

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。“本发明的上述活性”如上所述。

上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段构建探针，使用该探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern(萨瑟恩)印迹法(用创建人Southern命名的进行基因组DNA特定序列定位的通用方法)等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。

对于杂交法的详细操作步骤，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rded.(分子克隆，实验室手册，第三版)》(美国冷泉港出版社(2001)；特别是6-7部分)、《Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行条例)》(John Wiley & Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4部分)、《DNA Cloning 1：Core Techniques，APractical Approach 2nd ed.(DNA克隆1：核心技术，实践方法)》(牛津大学(1995)；杂交条件特别是2.10部分)等。

杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件来决定。在本说明书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。

具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可例举1×SSC～6×SSC、42℃～55℃的条件，更优选1×SSC～3×SSC、45℃～50℃的条件，最优选2×SSC、50℃的条件。杂交溶液中例如含有约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5至15℃的温度。作为洗涤条件，可例举0.5×SSC～6×SSC、40℃～60℃。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05％～0.2％SDS、优选约0.1％SDS。

作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如作为杂交条件，可例举0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选0.2×SSC、63℃的条件。作为洗涤条件，可例举0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选0.2×SSC、60～65℃。

特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可例举：在5×SSC、1％SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)及50％甲酰胺中在42℃的条件下，进行预杂交后，添加探针，在42℃保温过夜形成杂交体，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行3次20分钟的洗涤的条件。但并不限于此条件。

此外，还可使用探针内不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒，具体可例举使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏诊断公司)、ECL直接标识&检测系统(ECL direct labeling &detection system)(Amersham公司制)的杂交等。

作为本发明所含有的核酸，可优选例举含有与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有80％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸含有与序列号1或6所示的核酸序列至少有80％以上同一性的碱基序列，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列，“本发明的上述活性”如上所述。

可例举：含有优选与序列号1或6所示的碱基序列至少有80％、更优选为85％、进一步优选为90％(例如92％以上、更进一步优选为95％以上、进一步优选为97％、98％或99％)同一性的碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，优选使用计算机程序通过比较2个核酸的序列信息来决定，作为序列比对的计算机程序，例如可例举可从美国国立医学图书馆网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html上利用的BLASTN程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：version 2.2.7版、或WU-BLAST2.0计算法等。对于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http://blast.wustl.edu记载的参数值。

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。“本发明的上述活性”如上所述。

具体来说，可例举与序列号2或7所示的氨基酸序列有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％、进一步优选为95％以上、更进一步优选为97％(例如98％、进而99％)以上同一性的氨基酸序列等。

本发明的核酸，优选含有编码与由序列号2或7所组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。进一步优选含有编码与由序列号2或7所组成的氨基酸序列有98％以上同一性的氨基酸序列组成蛋白质、且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。

2个氨基酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来决定，此外，可使用计算机程序来决定同一性％，作为这种计算机程序，例如可例举BLAST、FASTA(Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))、及ClustalW等。特别是BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)作了记载，所以可从美国国立生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站公开获得。(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等)。此外，也可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(天立软件)、Vector NTI(Infomax)等程序来决定。

使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，因为也可以显示序列中特定的短区域的匹配，所以即使使用的序列的全长序列间没有显著性的关系，但在这种区域，也可检测出特定的序列同一性非常高的区域。并且，BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数，还可使用下述：(A)包括用于将具有低组成复杂性的查询序列的片段(也可参照由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)决定；Wootton及Federhen，1996“序列数据库组成偏向性区域的分析(Analysis of compositionallybiased regions in sequence databases)”Methods Enzymol.，266：544-71)、或短周期内部重复序列组成的片段(Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序决定)屏蔽的过滤器，以及(B)用于报告相对于数据库序列的一致性的统计学显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然性发现的一致性期望概率；因某种一致性引起的统计学显著误差大于E-score阈值时，不报告该一致性。

(e)核酸，其与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

“本发明的上述活性”及杂交条件如上所述。

本发明的核酸还包括含有由在序列号1或6所组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加后的碱基序列、且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。具体来说，也可使用含有如下碱基序列、且含有编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸，即在序列号1或6所示的碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～1500个、1～1000个、1～500个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基发生缺失、取代及/或附加后的碱基序列。在此，碱基序列发生了缺失、取代及/或附加，意味着在同一序列中的任意位置且1个或多个碱基序列中的位置上有1或多个碱基的缺失、取代及/或附加。该缺失、取代及/或附加中的2种以上可同时发生，该缺失、取代及/或附加的数量通常来说越小越好。

作为本发明的核酸的优选实施方式，还包括以下(a)～(d)中任一项记载的核酸。

(a)含有序列号1或6所示的碱基序列或其部分序列的核酸，

(b)含有编码由序列号2或7所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列的核酸，

(c)含有序列号4或9所示的碱基序列或其部分序列的核酸。

(d)含有序列号5或10所示的碱基序列或其部分序列的核酸。

关于(a)含有序列号1或6所示的碱基序列的核酸，(b)含有编码由序列号2或7所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸、(c)含有序列号4或9所示的碱基序列的核酸，如上所述。上述序列的部分序列，包括上述碱基序列中含有的ORF、CDS、具有生物学活性的区域、作为以下记载的引物而使用的区域、可成为探针的区域，可以来自天然，也可以由人工合成。

此外，本发明的核酸，优选为编码属于膜结合性O-酰基转移酶家族的蛋白质的核酸。“膜结合性O-酰基转移酶家族”如上所述。

本发明的核酸中还包括以下核酸。

(1)(a)含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，

(b)与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸，

(c)含有与序列号1或6所组成的碱基序列有80％以上同一性的碱基序列的核酸，

(d)含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸，

(e)与由编码序列号2或7所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸，以及

(2)根据(1)所述的核酸，其为以下(a)～(e)中的任一项核酸，

(a)核酸，其含有编码由在序列号2或7所示的氨基酸序列中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，

(b)核酸，其与由序列号1或6所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，

(c)核酸，其含有与序列号1或6所组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列，

(d)核酸，其含有编码由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，

(e)核酸，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交。

本发明的溶血磷脂酰基转移酶蛋白质

本发明蛋白质的特征在于，具有“溶血磷脂酰基转移酶活性(LPLAT活性)”、“可提高花生四烯酸的比率的活性”及/或“参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”。本发明的蛋白质可以为来自天然的蛋白质，也可以为人工制备的蛋白质。

本发明的蛋白质优选为由序列号2或7所示的氨基酸序列组成的LPLAT5及LPLAT6。进而LPLAT5及LPLAT6的突变体即满足具有“溶血磷脂酰基转移酶活性(LPLAT活性)”、“可提高花生四烯酸的比率的活性”及/或“参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”的条件的突变体也包含在本发明中。

“溶血磷脂酰基转移酶活性(LPLAT活性)”、“可提高花生四烯酸的比率的活性”及“参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”，如上述“本发明的编码溶血磷脂酰基转移酶的核酸”项中的说明。此外，以下“本发明的上述活性”意味着上述“LPLAT活性、可提高花生四烯酸的比率的活性及/或参与花生四烯酸的生物合成路径的活性”。

作为本发明的蛋白质，包括以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质，

(a)蛋白质，其由在序列号2或7中1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性，

(b)蛋白质，其由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性。

关于“1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列”、“同一性为80％以上”的定义，如上述“本发明的编码溶血磷脂酰基转移酶的核酸”项中的说明。

本发明的蛋白质还包括：被含有序列号1或6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或者在序列号2或7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等通过多种修饰而发生突变的蛋白质，或者氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质，与其它蛋白质形成的融合蛋白质，且为具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的蛋白质也可以为人工制备的蛋白质，此时，可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。此外，还可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein TechnologyInstruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。

进而，本发明的蛋白质优选为属于膜结合性O-酰基转移酶家族的蛋白质。“膜结合性O-酰基转移酶家族”的定义等，如上述“本发明的编码溶血磷脂酰基转移酶的核酸”项中的说明。

此外，本发明的蛋白质还包括以下蛋白质。

(1)(a)由在序列号2或7中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，

(b)由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，

(2)上述(1)所述的蛋白质，其为以下(a)或(b)中的任一项，

(a)由在序列号2或7中1～50个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成的蛋白质，

(b)由与序列号2或7所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明的核酸的克隆

本发明的编码LPLAT蛋白质的核酸，例如可通过使用适当的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。此外，可通过使用适当的引物通过PCR反应进行扩增，再连接于适当的载体上来进行克隆。进而也可亚克隆到其它载体上。

例如可以使用pBlue-Script(商标)SK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。此外，通过PCR反应进行扩增时，引物可使用上述序列号1或6等所示的碱基序列中的任意部分，例如以下实施例1中例举的引物。接着使上述引物及耐热性DNA聚合酶等与从M.alpina菌体中制备的cDNA发生作用从而进行PCR反应。上述方法，根据《Molecular Cloning，ALaboratory Manual 3rd ed.(分子克隆，实验室手册，第三版)》(美国冷泉港出版社(2001))”等，只要是本领域技术人员即可容易地进行。

将获得的PCR产物进行纯化时可使用公知的方法。例如有使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kits)(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GEHealthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，将DNA片段从琼脂糖凝胶中切出，可通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel extraction Kits)(QIAGEN)、冷冻&挤压(Freeze&Squeeze)法等进行纯化。

已克隆的核酸的碱基序列可用碱基序列测序仪来决定。

本发明的表达用载体构建及转化体的制作

本发明还提供含有编码本发明的LPLAT蛋白质的核酸的重组载体。本发明还进一步提供被上述重组载体转化的转化体。

这种重组载体及转化体可通过以下方法获得。即：将含有编码本发明的LPLAT蛋白质的核酸的质粒用限制性内切酶进行酶切。作为使用的限制性内切酶，例如可例举EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于这些。此外，也可通过T4聚合酶处理进行末端平滑化。酶切后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳来进行纯化。通过用公知的方法将该DNA片段整合到表达用载体内，可获得LPLAT蛋白质表达用载体。将该表达载体导入宿主内制作转化体，供给目标蛋白质的表达。

此时，表达载体及宿主，只要能够表达目标蛋白质，没有特别限定，例如作为宿主，可例举真菌、细菌、植物、动物或其细胞等。作为真菌，可例举作为脂质生产菌的M.alpina)等丝状真菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母等。此外，作为细菌，可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。进而作为植物，可例举油菜子、大豆、棉花、红花、亚麻等油粮植物等。

作为脂质生产菌，例如可使用MYCOTAXON，Vol.XLIV，NO.2，pp.257-265(1992)所记载的菌株，具体来说可例举：属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被孢霉(M.elongate)IFO8570、M.exigua(小型被孢霉)IFO8571、M.hygrophila(湿地被孢霉)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpine)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或者深黄被孢霉(M.isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、M.nana(那那被孢霉)IFO8190、拉曼被孢霉(M.ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(M.vinacea)CBS236.82等属于小毛霉(Micromucor)亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选M.alpina。

将真菌类作为宿主使用时，优选本发明的核酸为可在宿主中自主复制、或者可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选为含有启动子、终止子的组成。使用M.alpina作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要能够在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1(组蛋白H4.1)基因启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF(翻译延伸因子)基因启动子等来自M.alpina的启动子。

作为向M.alpina等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法(particle delivery)以及向核内直接显微注射DNA等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养的选择培养基上生长发育的菌株，可获得转化体。此外，转化时使用抗药性标记基因时，在含有该药剂的选择性培养基上进行培养，可获得显示抗药性的细胞菌落。

使用酵母作为宿主时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。此外，也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。此外，作为适合于本发明的宿主，可例举酿酒酵母EH13-15株(trp1、MATα)等，但并不限于这些。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、GAL1启动子、GAL10启动子等来自酵母的启动子。

作为向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举乙酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或复数)的包裹、以及在核内直接显微注射DNA等。

使用大肠杆菌等细菌作为宿主时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。

本发明的脂肪酸组合物的制造方法

本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即从培养上述转化体得到的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。具体来说可用以下方法制造。但是关于本制造方法，并不限于该方法，也可使用通常公知的其它方法进行。

用于培养使本发明的蛋白质表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主增殖时所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如将酵母转化从而使LPLAT5及6表达时，可使用SC-Trp、Leu、Ura培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。

培养条件，只要适合宿主增殖，且为可使生成的酶保持稳定的适当条件，可以为任何条件，具体来说，可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以在同一条件下培养(一步培养)，也可以使用2个以上不同的培养条件即所谓的二步培养或三步培养，进行大量培养时，优选培养效率好的二步培养等。

本发明的脂肪酸组合物

本发明还提供上述脂肪酸组合物，其为本发明的LPLAT蛋白质所表达的细胞中的1种或1种以上的脂肪酸的聚合体的脂肪酸组合物，其特征在于，该脂肪酸组合物中的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比培养非转化体的宿主而得到的脂肪酸组合物中的花生四烯酸比率高。优选为培养本发明的LPLAT5及6表达的转化体而得到的脂肪酸组合物。在以下实施例中，在花生四烯酸生产酵母中用LPLAT5及6转化时，花生四烯酸的比率与作为对照的脂肪酸组合物中的花生四烯酸的比率相比，至少升高1.5倍。

脂肪酸可以为游离脂肪酸，也可以为三甘油酯、磷脂质等。

作为本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻油酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9)、或者有时简单表示为8:1)、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12)或者有时简单表示为18:2)、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(有时表示为18:3(6，9，12)、GLA或18:3(n-6))、亚麻油酸(Stearidonic acid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(有时表示为20:3(8，11，14)或DGLA)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(有时表示为20:4(5，8，11，14)或ALA)、二十碳四烯酸(8，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(7，10，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值)。

本发明的脂肪酸组合物，只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合，可以为由任何数量任何种类的脂肪酸组成的组合物。

在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法得到的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当时间，进而通过离心分离将菌体分离，回收溶剂，这样重复数次。然后使用适当的方法使脂质干燥固化，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。从该试样中取出适当量，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后用气相色谱法进行分析。

此外，培养被含有本发明的核酸的重组载体转化的转化体而得到的脂肪酸组合物中的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比公知的LPLAT脂肪酸组合物的花生四烯酸比率高。这是因为本发明的LPLAT能够提高酰基由酰基辅酶A向磷脂质转移、或者由磷脂质向CoA转移时所必需的脂肪酸的转换率。具体来说，如以下实施例所记载，可例举在花生四烯酸生产酵母(S.cerevisiae)中表达作为本发明的优选实施方式的LPLAT5及LPLAT6时，由该LPLAT5及LPLAT6表达的酵母所产生的脂肪酸组合物中的花生四烯酸的比率高。此时发现，LPLAT5参与由18:1-CoA向18:1-PL的转化、由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化以及由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化，LPLAT6参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化及由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化。

此外，如下述实施例中所记载，发现在M.alpina中LPLAT6参与由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化及由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化。

因此，本发明还提供以下方法，即：使用重组载体，使导入该载体的宿主的脂肪酸组成中的花生四烯酸的比率比未导入该载体的宿主的脂肪酸组成中的比率提高的方法。

含有本发明的脂肪酸组合物的食品等

此外，本发明提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物可根据常法在例如含有油脂的食品、工业原料(化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中使用。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊剂等医药制剂的形态、或者在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合有本发明的脂肪酸组合物的自然流体食物、半消化态营养食物、及成份营养食物、健康饮料、经肠营养剂等加工形态。

进而，作为本发明的食品例，可例举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体、及液体及其混合物，是可摄取食用的物质的总称。

营养辅助食品是指强化了特定的营养成分的食品，保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥身体的调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途食品含义相同。幼儿用食品是指供给小于约6岁的孩子用的食品，老人用食品是指处理成与无处理的食品相比容易消化及吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给小于约1岁的孩子用的配方乳，早产儿用配方乳是指供给早产儿从出生到出生后约6个月为止所用的配方乳。

作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)；中华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味料、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、天式点心)、豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。

编码本发明的LPLAT蛋白质的核酸或使用LPLAT蛋白质的菌株的评价·选择方法

本发明还提供使用本发明的编码LPLAT蛋白质的核酸或LPLAT蛋白质，进行评价、选择脂质生产菌的方法。具体如下所示。

(1)评价方法

作为本发明的一个实施方式，可例举使用本发明的编码LPLAT蛋白质的核酸或LPLAT蛋白质，进行评价脂质生产菌的方法。作为本发明的上述评价方法，首先例举使用根据本发明的碱基序列而设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。这种评价方法的通常方法是公知的，例如在国际专利申请手册WO01/040514号、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。

首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用赫里福德(Hereford)法、乙酸钾法等任何公知的方法(例如参照Methods in Yeast Genetics，美国冷泉港实验室出版社，p130(1990))。

根据本发明的碱基序列，优选根据序列号1或6设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明的碱基序列的任意部分，并且可使用公知的方法进行其设计。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000碱基为宜。

使用上述构建的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明的碱基序列的特异性序列。本发明的碱基序列的特异性序列的检测可采用公知的方法进行。例如，用含有本发明的碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，例如通过PCR法等来扩增被测菌株的核酸，可以测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。

适合本发明方法的PCR法的反应条件，没有特别限定。将得到的反应生成物的扩增产物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可以测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明的碱基序列的特异区域的核酸分子的大小，可以预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，可以进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。此外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。

此外，作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号1或6等本发明的碱基序列所编码的LPLAT蛋白质的表达量，也可以评价被测菌株的本发明的上述活性。此外，ALPLAT蛋白质的表达量，可以通过在适当的条件下培养被测菌株，对LPLAT蛋白质的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过免疫印迹法(Westernblotting)法进行(Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行条例)，John Wiley & Sons 1994-2003)。

(2)选择方法

作为本发明的其他实施方式，可例举使用本发明的编码LPLAT蛋白质的核酸或LPLAT蛋白质来选择脂质生产菌的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号1或6等本发明的碱基序列所编码的LPLAT蛋白质的表达量，选择目标表达量的菌株，可以选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，通过比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可以选择出期望的菌株。具体来说，例如将标准菌株和被测菌株在适当的条件下培养，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比较，被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，可以选择具有期望活性的菌株。对于期望的活性，如上所述可例举测定LPLAT蛋白质的表达量的方法。

此外，作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可以选择具有期望活性的被测菌株。对于期望的活性，如上所述，可例举测定LPLAT蛋白质的表达量的方法。

作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸的表达受到抑制的菌株、实施了突变处理的菌株、发生了自然突变的菌株等，但并不限于这些。作为突变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法、EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等(如参照大鸠泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p 67-75、学会出版センタ一)，但不限于这些。

此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株而使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体来说，标准菌株、被测菌株可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。以下，根据实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限于实施例。

实施例

〔实施例1〕

M.alpina的基因组分析

将M.alpina1S-4株接种于100ml的GY2:1培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物p H6.0)中，在28℃振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。

使用Roche454GS FLX Standard来决定上述基因组DNA的碱基序列。此时，将片段文库的碱基序列决定按2栏进行，Mate-pair文库的碱基序列决定按3栏进行。通过将得到的碱基序列拼接，可得到300个超级重叠群(Super Contig)。

cDNA文库的构建

将M.alpina1S-4株接种于100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母提取物、pH6.0)中，在28℃预培养3天。在10L培养槽(AbleCo.，东京)内加入5L培养基(1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adekanol(商品名称，日语原名：アデカノ一ル)、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0)，将预培养物全部接种，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2及3天分别加入相当于2％、2％及1.5％的葡萄糖。在培养的第1、2、3、6及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/CsCl法制备总RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(Oligotex-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒)(TaKaRa Bio)，从总RNA中纯化poly(A)⁺RNA。使用ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(ZAP-cDNA GigapackIII金克隆试剂盒)(STRATAGENE)来构建各阶段cDNA文库。

来自S.cerevisiae的SLC4同源物的检索

将由编码S.cerevisiae的MBOAT家族(PFAMPFO3062)的LPLAT的SLC4(YOR175c)导出的氨基酸序列相对于M.alpina1S-4的基因组碱基序列进行tblastn分析的结果，命中含有序列号5和序列号10所示的序列的超级重叠群(Super contig)。

探针的构建

为了克隆与序列号5和序列号10对应的cDNA，构建以下引物(表2)。

表2

以cDNA文库为模板，利用上述引物中的MaLPAAT5-1F和MaLPAAT5-3R、MaLPAAT6-2F和MaLPAAT5-3R的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR反应。将得到的DNA片段用TOPO-TAcloning kit(TOPO-TA克隆试剂盒)(INVITROGEN)进行克隆，将含有序列号4的第195位至第931位的碱基序列的质粒作为pCR-LPLAT5-P，将含有序列号9的第766位至第1414位的碱基序列的质粒作为pCR-LPLAT6-P。接着，以这些质粒作分别为模板，利用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了ExTaq(TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(罗氏诊断公司)代替添加的dNTP混合物，构建将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记过的探针。使用该探针来筛选cDNA文库。

杂交条件如下所示。

缓冲液：5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；

温度：42℃(一夜)；

洗涤条件：在0.2×SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)，20分钟×3次；

使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏诊断公司)来进行检测。利用体内切割从经过筛选获得的噬菌体克隆中切出质粒，得到各质粒DNA。在用LPLAT5探针1筛选得到的质粒中将插入长度最长的质粒作为pB-LPLAT5，在用LPLAT6探针1筛选得到的质粒中将插入长度最长的质粒作为pB-LPLAT6。质粒pB-LPLAT5的插入序列即LPLAT5的cDNA的碱基序列为序列号4，质粒pB-LPLAT6的插入序列即LPLAT6的cDNA的碱基序列为序列号9。

序列分析

在作为LPLAT5的cDNA序列的序列号4中含有由第161位至第1693位的碱基序列组成的CDS(序列号3)，含有由第161位至第1690位的碱基序列组成的ORF(序列号1)。图2中记载了LPLAT5的cDNA序列与推定氨基酸序列。

另一方面，在作为LPLAT6的cDNA序列的序列号9中，含有由第38位至第1759位的碱基序列组成的CDS(序列号8)，含有由第38位至第1756位的碱基序列组成的ORF(序列号6)。图3中记载了LPLAT6的cDNA序列与推定氨基酸序列。

相对于在GENEBANK中注册的氨基酸序列，使用BLASTX对序列号1及序列号6进行同源性分析。由序列号1推定的氨基酸序列显示与来自真菌类的LPLAT同源物有同源性，由序列号6推定的氨基酸序列显示与来自动物的LPLAT同源物有同源性。与各序列的E-value(E-值)最低、即同一性最高的氨基酸序列如下所述。将与各序列的ORF同一性最高的序列相关的碱基序列的同一性及氨基酸序列的同一性用clustalW求出，以下一并记载。

序列号1与来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的溶血磷脂酰基转移酶同源物(GI：161085648)，ORF的碱基序列为43.2％的同一性，氨基酸序列为33.3％的同一性。另一方面序列号6与来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的推定蛋白质(GI：56788919)，ORF的碱基序列为41.2％的同一性，氨基酸序列为28.6％的同一性。此外，LPLAT5与LPLAT6之间的同一性，ORF的碱基序列为40.0％，氨基酸序列为19.1％。

含有LPLAT5的CDS(序列号3)及含有LPLAT6的CDS(序列号8)的基因组序列分别记载于序列号5及序列号10中。序列号5含有2个内含子，外显子为1-314、461-587、668-1759。此外，序列号10含有1个内含子，外显子为1-1095、1318-1944。图4为LPLAT5的基因组序列与ORF序列的比对图，图5为LPLAT6的基因组序列与ORF的比对图。

〔实施例2〕

酵母表达用载体的构建

为了使LPLAT5及LPLAT6在酵母中表达，构建了以下载体。

以pBLPLAT5为模板，利用

引物Eco-MaLPLAT5-F(序列号15)

GAATTCATGCTAAACTCATTCTTCGGGGACGC和

引物Xho-MaLPLAT5-R(序列号16)：

CTCGAGTTACAGCGTCTTGATTTTAACTGCAGC，

通过ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR反应。

对于得到的DNA片段，使用TOPO-TAcloningKit(TOPO-TA克隆试剂盒)(INVITROGEN)进行TA-克隆，确认插入部分的碱基序列，将含有正确的碱基序列的质粒作为pCR-LPLAT5。将用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切该质粒得到的约1.6k的DNA片段插入酵母表达用载体pYE22m(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)的EcoRI-SalI位点，构建质粒pYE-MALPLAT5。

另一方面，用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切pBLPLAT6，将得到的1.9kb的DNA片段插入酵母表达载体pYE22m的EcoRI-KpnI位点，构建质粒pYE-LPLAT6。

在花生四烯酸生产酵母内的表达

(1)花生四烯酸生产酵母的育种

为了育种花生四烯酸生产酿酒酵母(S.cerevisiae)，构建以下质粒。

首先，将从M.alpina 1S-4株中制备的cDNA作为模板，利用Δ12-f和Δ12-r、Δ6-f和Δ6-r、GLELO-f和GLELO-r或Δ5-f和Δ5-r这样的引物组合，使用ExTaq进行PCR，扩增M.alpina 1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因以及Δ5脂肪酸去饱和酶基因。

Δ12-f：TCTAGAATGGCACCTCCCAACACTATTG(序列号17)

Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号18)

Δ6-f：TCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAG(序列号19)

Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号20)

GLELO-f：TCTAGAATGGAGTCGATTGCGCAATTCC(序列号21)

GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号22)

Δ5-f：TCTAGAATGGGTGCGGACACAGGAAAAACC(序列号23)

Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号24)

通过TOPO-TA-cloning Kit(TOPO-TA克隆试剂盒)将这些克隆。确认碱基序列，将含有这些碱基序列的克隆分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(含有序列号25的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS(含有序列号26的碱基序列)、pCR-MAGLELO(含有序列号27的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(含有序列号28的碱基序列)。

另一方面，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276号公报)后获得的约1.2kb的DNA片段，插入用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切载体pUC18后进行末端平滑化并通过自我连接作用而得到的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5’端的克隆作为pUC-URA3。

并且，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切YEp13得到的约2.2kb的DNA片段插入载体pUC18的SalI位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5’端的克隆作为pUC-LEU2。

接着，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS后进行末端平滑化后再用限制性内切酶XbaI酶切而得到的约1.2kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)后进行末端平滑化后再用限制性内切酶SpeI酶切而得到的约6.6kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS后进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切而得到约1.6kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12后进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约8kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将其用限制性内切酶PvuII部分酶切而得到的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，得到质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。

此外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO而得到的约0.95kbp的DNA片段，与用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC-LEU(STRATAGENE)而得到的约7.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS后进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约1.3kbp的DNA片段，与用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO后进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约8.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将其用限制性内切酶PvuII酶切而得到的约3.2kb片段插入pUC-LEU2的SmaI位点，得到质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。将S.cerevisiae YPH499株(STRATAGENE)通过质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化。转化株选择在SC-Leu，Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上生长发育的菌株。将这样获得的菌株中的任意一株作为ARA3-1株。该株通过在含有半乳糖的培养基上培养，由GAL1/10启动子使Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因、Δ5脂肪酸去饱和酶基因表达，因此可生产花生四烯酸。

(2)花生四烯酸生产酵母的转化

分别用质粒pYE22m、pYE-MALPLAT5、pYE-MALPLAT6转化ARA3-1株。转化株选择在SC-Trp、Leu、Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上生长发育的菌株。

从各质粒导入株中选择任意3株用于以下的培养。在以下的表3-8中，对照是指用质粒pYE22m转化的菌株，LPLAT5是指用质粒pYE-MALPLAT5转化的菌株，LPLAT6是指用质粒pYE-MALPLAT6转化的菌株。

(3)在无脂肪酸添加的培养基上的培养

将上述转化株在SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中在30℃振荡培养1天，取其中1ml在SG-Trp、Leu、Ura(每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o aminoacids)(DIFCO)为6.7g、半乳糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g)液体培养基10ml中在15℃振荡培养6天，收集菌体并水洗后，进行冷冻干燥，对菌体进行脂肪酸分析。

结果如表3所示。

表3 使各基因表达的酵母菌体的脂肪酸组成(％)

-在无脂肪酸添加的培养基上的培养-

进而根据表3的结果，求出在花生四烯酸生物合成路径中某种脂肪酸是否转化为下一级脂肪酸。例如在求18:2→18:3(n-6)的转化率时，

转化率＝(18:3(n-6)+DGLA+ARA)/(18:2+18:3(n-6)+DGLA+ARA)x 100

结果如表4所示。

表4 花生四烯酸生物合成路径中脂肪酸的转化率(％)

-在无脂肪酸添加的培养基上的培养-

如表3及表4所示，花生四烯酸在总脂肪酸中占有的比率与对照相比，LPLAT5表达株升高了1.5倍，LPLAT6表达株升高了2.3倍。此外，从花生四烯酸生物生物合成路径中的脂肪酸的转化率来看，在LPLAT5表达株中18:1→18:2、18:3(n-6)→DGLA、DGLA→ARA的转化率升高，在LPLAT6表达株中DGLA→ARA的转化率显著升高。如图1所示，在这些转化中，酰基由酰基辅酶A向磷脂质的转移或者由磷脂质向CoA的转移是必需的，表明LPLAT5及LPLAT6参与了这些转移。

(4)在添加亚油酸的培养基中的培养

将上述转化株在SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中在30℃振荡培养1天，取其中1ml接种于含有5mg/ml亚油酸及0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的SG-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中，在15℃振荡培养6天。收集菌体并水洗后，进行冷冻干燥，对菌体进行脂肪酸分析。结果如表5所示。

表5 使各基因表达的酵母菌体的脂肪酸组成(％)

-在添加亚油酸的培养基中的培养-

进而根据表5的结果，求出在花生四烯酸生物合成路径中某种脂肪酸是否转化为下一级脂肪酸。结果如表6所示。

表6 在花生四烯酸生物合成路径中脂肪酸的转化率(％)

如表5所示，花生四烯酸在总脂肪酸中占有的比率与对照相比，LPLAT5表达株升高了2倍，LPLAT6表达株升高了3.5倍。此外，LPLAT5表达株中添加了亚油酸的比率与对照相比升高。从花生四烯酸生物合成路径中脂肪酸的转化率来看(表6)，LPLAT5表达株和LPLAT6表达株中18:3(n-6)→DGLA、DGLA→ARA的转化率均升高，特别是LPLAT6表达株中显著升高。

(5)在添加γ-亚麻酸的培养基中的培养

将上述转化株在SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中在30℃振荡培养1天，取其中1ml接种于含有5mg/ml γ-亚麻酸及0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的SG-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中，在15℃振荡培养6天。收集菌体并水洗后，进行冷冻干燥，对菌体进行脂肪酸分析。结果如表7所示。

表7 使各基因表达的酵母菌体的脂肪酸组成(％)

-在添加γ-亚麻酸的培养基中的培养-

进而，如表7所示，求出在花生四烯酸生物合成路径中某种脂肪酸是否转化为下一级脂肪酸。(表8)。

表8 花生四烯酸生物合成路径中由γ-亚麻酸向下游脂肪酸的转化率(％)

-在添加γ-亚麻酸的培养基中的培养-

如表7所示，LPLAT5表达株中添加的γ-亚麻酸在总脂肪酸中占有的比率升高。但是其下游生成物的二高γ-亚麻酸、花生四烯酸的比率却未升高(表8)。另一方面，LPLAT6表达株中花生四烯酸在总脂肪酸中占有的比率与对照相比升高2.8倍，DGLA→ARA的转化率显著升高(表8)。

如上所述，LPLAT5及LPLAT6可提高酰基由酰基辅酶A向磷脂质转移、或者由磷脂质向CoA转移时所必需的脂肪酸的转化率。表明LPLAT5参与了由18:1-CoA向18:1-PL的转化、由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化及由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化。另一方面，LPLAT6参与了由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化及由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化。

〔实施例3〕LPLAT6在M.alpina中的功能分析

被孢酶表达载体的构建

作为接头，合成以下寡核苷酸。

A-1：GATCCGGCGCGCCGCGGCCGCTCTAGAGTCGACGGCGCGCCA(序列号29)

A-2：AGCTTGGCGCGCCGTCGACTCTAGAGCGGCCGCGGCGCGCCG(序列号30)

使A-1和A-2退火并与用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒pUC18后的产物连接，构建pUC18-R。

以从M.alpina 1S-4株中制备的基因组DNA或质粒作为模板，利用以下的引物组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)通过PCR来扩增各种DNA片段，使用TOPO-TAcloning Kit(TOPO-TA克隆试剂盒)(Invitrogen)进行克隆。

具体来说，以基因组DNA作为模板，

利用引物URA5g-F1：GTCGACCATGACAAGTTTGC(序列号31)和

引物URA5g-R1：GTCGACTGGAAGACGAGCACG(序列号32)

的组合，扩增含有URA5基因的基因组DNA约2kbp，

利用引物GAPDHp-F1：GTCGACGATCACGTCGGGTGATGAGTTG(序列号33)和

引物GAPDHp-R1：TCTAGAGATGTTGAATGTGTGGTGTGTG(序列号34)

的组合，扩增GAPDH启动子约0.9kbp，

利用引物GAPDHt-F1：GCGGCCGCTAAGAAAAGGGAGTGAATCGC(序列号35)和

引物GAPDHt-R1：GGATCCGGCGCGCCGATCCATGCACGGGTCCTTCTC(序列号36)

的组合，扩增GAPDH终止子约0.5kbp。

此外，以质粒pB-LPLAT6作为模板，

利用引物XbaI-LPLAT6-F1：TCTAGAATGGAGGCACTCTTGCACCAGG(序列号37)和引物

NotI-LPLAT6-R1：GCGGCCGCTTACTCAGTCTTGACAGACTTG(序列号38)

的组合，扩增LPLAT6基因CDS约1.6kbp，

利用引物EcoRV-LPLAT6-F2：GATATCGGGTAAAGCCTTCCTGGAACG(序列号39)和引物

XbaI-LPLAT6-R2：TCTAGATTACTCAGTCTTGACAGACTTGGATCG(序列号40)

的组合，扩增LPLAT6基因CDS 3’端约0.7kbp，

进而以质粒pCR-MAΔ5DS作为模板，

利用引物XbaI-Δ5DS-F1：TCTAGAATGGGTGCGGACACAGGAAAAAC(序列号41)和

引物NotI-Δ5DS-R1：GCGGCCGCTTACTCTTCCTTGGGACGAAG(序列号42)

的组合，扩增Δ5脂肪酸去饱和酶基因CDS约1.3kbp，

利用引物NdeI-Δ5DS-R2：TCTAGATTACTCTTCCTTGGGACGAAG(序列号43)和

引物XbaI-Δ5DS-F2：CATATGCATCCAGGACATCAACATCTTG(序列号44)

的组合，扩增Δ5脂肪酸去饱和酶基因CDS 3’端约0.5kbp。

在质粒pUC18-R的限制性内切酶EcoRI、NotI位点，插入用相同限制性内切酶从GAPDH终止子中切出的片段，构建质粒pUC-GAPDHt。接着用限制性内切酶XbaI和SalI将质粒pUC-GAPDHt切断，插入用相同限制性内切酶从GAPDH启动子中切出的片段，构建质粒pUC-GAPDHpt。用限制性内切酶SalI将质粒pUC-GAPDHpt切断，插入用相同限制性内切酶从含有URA5基因的基因组DNA中切出的片段。确认插入方向，将URA5基因的方向与载体的限制性内切酶位点EcoRI→HindIII方向相同而插入的质粒作为质粒pDUraRSC。

用限制性内切酶XbaI和NotI将质粒pDUraRSC切断，插入用相同限制性内切酶从LPLAT6基因CDS中切出的DNA片段，作为质粒pDUraRSC-LPLAT6。将用限制性内切酶EcoRV和XbaI将质粒pDUraRSC-LPLAT6切断而得到的约7kbp的DNA片段与用相同限制性内切酶从LPLAT6基因CDS 3’端约0.7kbp中切出的DNA片段连接，构建质粒pDUraRSC-LPLAT6-RNAi。

Δ5DS表达抑制(RNAi)载体的构建

用限制性内切酶XbaI和NotI将质粒pDUraRSC切断，插入用相同限制性内切酶从Δ5脂肪酸去饱和酶基因CDS中切出的DNA片段，构建质粒pDUraRSC-Δ5DS。将用限制性内切酶EcoRI和NdeI将质粒pDUraRSC-Δ5DS切断而得到的约1.2kbp的DNA片段与用限制性内切酶XbaI和EcoRI切断而得到的约5.5kbp的DNA片段以及用限制性内切酶NdeI和XbaI从Δ5脂肪酸去饱和酶基因CDS 3’端约0.5kbp中切出的产物连接，构建质粒pDUraRSC-Δ5DS-RNAi。

M.alpina转化株的获得

使用质粒pDUraRSC-LPLAT6-RNAi或质粒pDUraRSC-Δ5DS-RNAi，利用M.alpina，将根据专利文献(WO2005/019437“脂质生产菌的育种方法”)中记载的方法而诱导的尿嘧啶缺陷型株Δura-3作为宿主，利用粒子轰击法进行转化。选择转化株时，使用SC琼脂培养基[无氨基酸酵母氮源(不含硫酸胺)(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids andAmmonium Sulfate](Difco)0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％)。

M.alpina转化株的评价

将通过各质粒转化而得到的约50株分别接种于GY培养基(葡萄糖2％、酵母提取物1％、pH6.0)4ml中，在28℃振荡培养4天。培养结束后，通过过滤回收菌体，进行冷冻干燥。取出干燥菌体的一部分(约10-20mg左右)，通过盐酸甲醇法将菌体内的脂肪酸衍生为甲基酯后，用己烷提取，将己烷馏去后用气相色谱法进行分析，分析脂肪酸组成。在用各质粒转化的株中，分别选择二高γ-亚麻酸的组成比超过花生四烯酸的组成比的菌株、LPLAT6-D#6(用质粒pDUraRSC-LPLAT6-RNAi转化)和Δ5DS-D#45(用质粒pDUraRSC-Δ5DS-RNAi转化)。

将这些中的2株和对照(野生株M.alpina 1S-4株)在GY培养基4ml中在28℃振荡培养4天。培养结束后，通过过滤回收菌体，进行冷冻干燥。取出干燥菌体的一部分(约10-20mg左右)，用物理方法磨细。添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，一边不断搅拌，一边在70℃保持1小时后，通过离心分离回收上清。在剩余的菌体内进一步添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，一边不断搅拌，一边在70℃保持1小时后，通过离心分离将上清与前面的上清一并回收。通过高速真空离心浓缩装置，使脂质干燥固化，溶解于5ml的氯仿中。从其中取1ml与上述同样进行干燥固化，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲基酯，进行脂肪酸分析。另一方面，将溶解于氯仿的液体取2ml，与上述同样进行干燥固化，溶解于少量的氯仿中，全部量供给以下的薄层色谱法。即在硅胶60薄板(Merck)、展开溶剂己烷∶二乙基醚∶乙酸70∶30∶1的条件下进行薄层色谱法，分离脂质。用0.015％樱草素、80％丙酮水溶液(樱草素溶液)喷雾，通过照射UV使可视化，对三酰基甘油(TG)组分及磷脂质(PL)组分用铅笔作标记，将硅胶分别刮下并收集于试管内。通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲基酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。即加入二氯甲烷1ml、10％盐酸甲醇2ml，在50℃反应3小时，将脂肪酸衍生为甲基酯。接着添加己烷4ml、水1ml，剧烈搅拌后进行离心分离，取出上层。用高速真空馏去溶剂，溶解于乙腈中供给气相色谱法，进行脂肪酸分析。结果如图6-8所示。

图6表示用氯仿∶甲醇(2∶1)提取的全部脂质中的高不饱和脂肪酸的组成比。在对照中花生四烯酸多，但在LPLAT6-D#6株和Δ5DS-D#45株中，由于抑制了由二高γ-亚麻酸向花生四烯酸的转化，所以二高γ-亚麻酸和花生四烯酸的比率为同等程度。图7表示占菌体内脂质的大部分的三酰基甘油中的高不饱和脂肪酸组成比。菌体内全部脂质相同，与对照相比，LPLAT6-D#6株和Δ5DS-D#45株中二高γ-亚麻酸的组成比增高。另一方面，图8所示的磷脂质组分中，LPLAT6-D#6株和Δ5DS-D#45株的脂肪酸组成大不相同。即Δ5DS-D#45株中二高γ-亚麻酸的比率高，而LPLAT6-D#6株中虽然不及对照，但花生四烯酸的比率高，进而与对照、Δ5DS-D#45株相比，γ-亚麻酸的比率也增高。

M.alpina内的花生四烯酸的生物合成路径推定为图1所示。由上述实验也显然表明Δ5脂肪酸去饱和酶对DGLA-PL作用，生成花生四烯酸。另一方面，在LPLAT6表达抑制株中蓄积了18:3(n-6)-PL。此外，TG组分的DGLA比率升高，但PL组分中未发现DGLA比率显著升高。由此表明，LPLAT6在M.alpina内负责由18:3(n-6)-PL向18:3(n-6)-CoA的转化和由DGLA-CoA向DGLA-PL的转化。

[序列表自由文字]

序列号11：引物

序列号12：引物

序列号13：引物

序列号14：引物

序列号15：引物

序列号16：引物

序列号17：引物

序列号18：引物

序列号19：引物

序列号20：引物

序列号21：引物

序列号22：引物

序列号23：引物

序列号24：引物

序列号29：接头A-1

序列号30：接头A-2

序列号31：引物URA5g-F1

序列号32：引物URA5g-R1

序列号33：引物GAPDHp-F1

序列号34：引物GAPDHp-R1

序列号35：引物GAPDHt-F1

序列号36：引物GAPDHt-R1

序列号37：引物XbaI-LPLAT6-F1

序列号38：引物NotI-LPLAT6-R1

序列号39：引物EcoRV-LPLAT6-F2

序列号40：引物XbaI-LPLAT6-R2

序列号41：引物XbaI-Δ5DS-F1

序列号42：引物NotI-Δ5DS-R1

序列号43：引物NdeI-Δ5DS-F1

序列号44：引物XbaI-Δ5DS-R1