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CN102333871B - 包含两个选择标记的表达载体系统 - Google Patents

包含两个选择标记的表达载体系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达载体或至少两个表达载体的组合，其至少包含(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中选择标记(sm I)和(sm II)参与叶酸代谢。也提供了合适的宿主细胞、选择方法和用于以高产率产生多肽的方法。

Description

包含两个选择标记的表达载体系统
发明领域
本发明涉及适用于选择表达目的产物的宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞的新选择系统。所述选择系统基于使用至少两种选择标记(sm I和sm II)，其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记影响。本发明提供了合适的表达载体、宿主细胞以及用于选择以高产率表达目的产物的宿主细胞的方法。此外，本发明涉及以高产率有效地产生多肽的方法。
发明背景
大量地克隆和表达目的产物例如重组肽和蛋白质的能力变得越来越重要。纯化高水平的蛋白质的能力在人类制药和生物技术领域中是重要的，例如用于产生蛋白质药物，以及在基础研究背景中，例如用于结晶蛋白质，以允许测定它们的三维结构。用其他方法很难大量获得的蛋白质可以在宿主细胞中过量表达并随后进行分离和纯化。
用于产生重组蛋白质的表达系统的选择取决于多种因素，包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学活性，以及在生产治疗性蛋白质中的监管问题和经济考虑。哺乳动物细胞优于其他表达系统例如细菌或酵母的主要优点是实现正确的蛋白质折叠、复杂的N联糖基化和真正的O联糖基化、以及广谱的其他翻译后修饰的能力。由于所述优点，真核细胞且特别是哺乳动物细胞是目前选择用于产生复杂的治疗性蛋白质例如单克隆抗体的表达系统。
获得高表达宿主细胞(也称为高生产者)的最常见方法以产生用于表达目的产物的合适表达载体作为第一步。该表达载体驱动编码目的产物的多核苷酸在宿主细胞中表达，并提供至少一种用于产生重组细胞系的选择标记。哺乳动物表达载体的主要元件通常包括能增强转录活性的组成型或诱导型启动子；通常包括Kozak序列的优化的mRNA加工和翻译信号、翻译终止密码子、mRNA切割和多腺苷酸化信号、转录终止子以及用于制备稳定细胞系和用于基因扩增的选择标记；此外，表达载体还可以提供用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记。
近年来，研发的焦点集中于用于在宿主中且特别是在哺乳动物细胞中基因表达的改良载体的设计。尽管有许多可用的载体，但以高产率在哺乳动物细胞中增强地产生多肽/蛋白质仍具有挑战性。
一种已经建立的用于获得以高产率表达目的产物的高产细胞系的方法是宿主细胞的稳定转染。然而，稳定整合到基因组中是偶发事件，并且只有一小部分的稳定转染细胞是高生产者。
为了获得以高产率表达目的产物的宿主细胞，选择标记和选择系统广泛地用于基因工程、重组DNA技术和重组产物的产生中。各个系统还用于产生和鉴定稳定转染的克隆。使用各个选择标记和选择系统的主要目的是引入选择基因，在暴露于选择性生长条件时其允许鉴定能高水平产生重组目的产物的细胞。可以将例如缺乏酶，如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系与含有编码这些选择标记酶的基因的表达载体及试剂例如抑制DHFR的氨甲蝶呤(MTX)和抑制GS的蛋氨酸亚砜酰亚胺(methionine sulfoxamine)(MSX)结合使用，通过基因扩增例如实现增加的产物表达产率。还可以将各个选择标记的更敏感突变形式与野生型细胞结合使用。使用含有在强启动子控制下的重组基因和编码选择标记例如DHFR或GS的基因的表达载体，首先分别获得了DHFR+(正)或GS+(正)转染子，然后通过在浓度逐渐增加的MTX或MSX中培养转染子来实现基因扩增。提供此种选择性压力的目的是分离表达选择标记并因此以高产率表达目的产物的细胞。
因此，高度严格的选择系统对于从转染的群体中富集高产细胞至关重要。选择系统的严格性越高，选择处理后低生产者的数目越低，并且找到非常稀少的超高产克隆的机会越高。
本发明的目的是提供用于选择以高产率产生目的产物的宿主细胞的严格选择系统，以及合适的表达载体和宿主细胞。
发明概述
本发明涉及用于选择以高产率表达目的产物的宿主细胞的选择系统，并涉及各产物特别是多肽的产生。
根据一个实施方案，本发明涉及表达载体或者至少两个表达载体的组合，其至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；
(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；
(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中选择标记(sm I)和(sm II)都参与叶酸代谢。
本发明进一步涉及宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞，其至少包含
(a)编码目的产物的引入多核苷酸；
(b)编码第一选择标记(sm I)的引入多核苷酸；
(c)编码第二选择标记(sm II)的引入多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同；
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中选择标记(sm I)和(sm II)都参与叶酸代谢。
此外，提供了用于选择至少一个能表达目的产物的宿主细胞的方法，其包括
(a)提供多个宿主细胞，其至少包含
(i)编码目的产物的引入多核苷酸；
(ii)编码第一选择标记(sm I)的引入多核苷酸；
(iii)编码第二选择标记(sm II)的引入多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同；
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中选择标记(sm I)和(sm II)都参与叶酸代谢；
(b)在选择选择标记(sm I)和(sm II)的生长条件下培养所述多个宿主细胞，因此获得表达目的产物的宿主细胞。
也提供了可以在根据本发明的选择方法中使用的选择性培养基，其包含限制浓度的叶酸和叶酸拮抗物(antifolate)。“选择性培养基”是用于选择宿主细胞的细胞培养基。
本发明也涉及用于产生目的产物的方法，包括在允许目的产物表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞或根据本发明的教导选择的宿主细胞。
本发明也涉及与第二选择标记(sm II)组合的第一选择标记(sm I)的用途，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同。选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到用于选择表达目的产物的真核宿主细胞的、特别是哺乳动物宿主细胞的另一选择标记的活性影响。选择标记(sm I)和(sm II)优选地参与相同的或一致的对于细胞成活或细胞增殖必需的代谢过程或者途径。优选地，选择标记(sm I)和(sm II)参与叶酸代谢。
使用两个选择标记(sm I)和(sm II)的本发明的策略导致了非常严格的选择条件，其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中两个选择标记(sm I)和(sm II)都参与相同的对细胞成活或细胞增殖必需的代谢途径。这将在本文根据优选的实施方案进行解释，其中两个选择标记(sm I)和(sm II)都参与叶酸代谢。叶酸代谢是必需的代谢途径，其对于细胞存活和细胞生长是关键的。由于选择标记(sm I)或(sm II)的活性影响另一选择标记的活性，并且两个选择标记都参与叶酸代谢，所以在选择性培养条件下，只有当两个选择标记(sm I)和(sm II)都足量表达并因此在受体宿主细胞中高产量表达时，叶酸代谢才发挥功能。因此，明显增加了对宿主细胞的选择压力。
在一个优选的实施方案中也解释了选择标记(sm II)的活性是怎样至少部分地受到选择标记(sm I)的活性影响的，选择标记(sm I)是或者包含将叶酸掺入到宿主细胞中的转运多肽。选择标记(sm II)是催化多肽，其加工作为底物的由选择标记(sm I)掺入的叶酸或者获自或产生自所述输入的叶酸的后续产物。各个催化多肽的优选实例是DHFR。认为在该实施方案中，如果叶酸转运蛋白(sm I)将足量的叶酸掺入到了宿主细胞中，那么第二选择标记(sm II)将以更高的效率或更高的周转率运行。不被理论所束缚，认为作为第一选择标记(sm I)的叶酸转运蛋白的强烈表达允许宿主细胞从培养基中输入更多的叶酸到细胞中，并因此允许宿主细胞耐受培养基中更低浓度的叶酸。叶酸转运蛋白(sm I)的强烈表达导致催化多肽(sm II)的足够底物(或者所述底物的前体)输入到宿主细胞中并因此对于催化多肽(sm II)是可利用的。因此，催化多肽(sm II)的活性受到叶酸转运蛋白(sm I)的活性影响，因为催化多肽(sm II)的活性取决于由叶酸转运蛋白(sm I)输入到宿主细胞中的叶酸的足够量。因此，在宿主细胞强烈地表达第一选择标记(sm I)并因此输入足够量的叶酸到细胞中以维持叶酸代谢的情况下，即使培养基中叶酸的浓度非常低也可以维持/增强细胞成活。由于叶酸转运蛋白(sm I)的活性，增加了催化多肽(sm II)的底物的可获得性。选择性培养基可以包含催化多肽(sm II)的抑制物，例如其实际底物的竞争物。强烈表达催化多肽(sm II)的细胞耐受更高浓度的所述抑制物，特别是在高底物浓度的情况下，所述浓度至少部分依赖于用作为第一选择标记(sm I)的叶酸转运蛋白的活性。如果选择标记(sm I)和(sm II)二者都强烈表达，那么在选择性培养条件下，选择标记(sm I)和(sm II)的活性/功能的偶联具有显著地增加宿主细胞的成活和/或生长速率的作用。无论选择性培养条件如何，宿主细胞存活/增殖都可以足够地维持叶酸代谢以允许细胞存活和生长。
根据本发明的表达系统的独特设计提供了非常严格的选择系统，以允许从转染的宿主细胞群体中富集高产细胞。根据本发明的选择系统的这种高度严格性降低了选择后群体中低生产者的数目，并增加了找到非常稀少的超高产克隆的机会。这增加了细胞群体存活选择的生产性(productivity)。实施例显示，用根据本发明的选择系统获得的宿主细胞以高产率产生了目的产物。也增加了单个生产者克隆的平均生产性。因此，根据本发明的选择系统用较低的筛查努力，增加了找到高生产者克隆的机会。
上面的假设反映了对潜在机制的现行理解，但是，然而并非是有约束力的，因为在使用都参与叶酸代谢的选择标记(sm I)和(sm II)时，对于在选择压力中观察到的依赖性/增加可能存在其他解释。此外，正如在详细说明中也描述的那样，本发明的一般原理也可应用于其他代谢过程或途径以及其他选择标记(sm I)和(sm II)。然而，重要的是，选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且特别地依赖于另一选择标记的活性，以增加选择压力。因此，对本领域技术人员而言，本申请的其他目的、特征、优势和方面从以下描述和所附权利要求将是显而易见的。然而，应当理解，以下的说明、所附权利要求和具体的实施例，尽管指出了本申请的优选的实施方案，但仅以说明的方式给出。对本领域技术人员而言，所公开的发明的精神和范围内的多种改变和修改将从对以下的阅读变得显而易见。
发明详述
根据本发明的一个方面，提供了表达载体或至少两个表达载体的组合，其至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；
(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；
(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响。
“选择标记”(sm)，其由引入的多核苷酸表达，允许在合适的选择性培养条件下选择表达所述选择标记的宿主细胞。选择标记优选地是生物分子，特别是多肽。下文详细描述了合适的选择标记。
根据本发明的“载体”是能携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸。载体像分子运载体那样发挥作用，将核酸的片段、各个多核苷酸递送到宿主细胞中。它可以包含至少一种包含调节序列的表达盒，用于正确地表达掺入其中的多核苷酸。待引入到细胞中的多核苷酸(例如编码目的产物或选择标记的多核苷酸)可以插入到载体的表达盒中以从其表达。根据本发明的载体可以以环状或线性(线性化)形式存在，并且也包括载体片段。术语“载体”也包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。
“多核苷酸”是通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，且取决于上下文，其指DNA以及RNA。术语“多核苷酸”并不包含任一大小限制，并且也包括包含修饰，特别是包含修饰的核苷酸的多核苷酸。
“引入的多核苷酸”指例如通过使用重组技术如转染，引入到宿主细胞中的多核苷酸。宿主细胞可以含有或者可以不含有与引入的多核苷酸对应的、分别相同的内源多核苷酸。引入可以例如通过转染可以整合到宿主细胞的基因组中(稳定转染)的合适载体来实现。将在下文详细描述允许引入多核苷酸到宿主细胞中的合适载体。在引入的多核苷酸没有插入到基因组中的情况下，引入核苷酸可能在后期例如当细胞进行有丝分裂的时候丢失(瞬时转染)。合适的载体也可以在没有整合到基因组中的情况下在宿主细胞中保留，例如通过附加型复制。然而，现有技术中还已知用于将多核苷酸引入宿主细胞中的其他技术，这将在下文进一步的详细描述。
“目的产物”指在所述宿主细胞中表达的产物。目的产物可以是例如多肽或多核苷酸，例如RNA。优选地，目的产物是多肽，特别是免疫球蛋白分子。实例描述如下。
“多肽”指包含通过肽键连接到一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包括任一长度的多肽，包括蛋白质(例如，具有50个以上的氨基酸)和肽(例如，具有2-49个氨基酸)。多肽包括任一活性或生物活性的蛋白质和/或肽。下文描述了合适的实例。
“选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响”的特性具体地指一种选择标记的活性至少在某种程度上直接地或间接地受到和/或依赖于另一选择标记的各个功能的活性影响(并且任选地，反之亦然)。在本文中，“活性”特别地描述提供、促进和/或增加对选择压力的抗性的选择标记的任一功能和作用，并且包括但不限于选择标记的催化活性、周转率、动力学反应速率和/或运输速率。选择标记(sm I)和(sm II)的依赖性/相互作用可以在选择性培养条件下显著地增加对宿主细胞的选择压力。优选地，选择标记(sm I)和选择标记(sm II)参与对细胞成活或增殖必需的相同或一致代谢过程或途径。下文详细描述了选择标记(sm I)和(sm II)以及代谢过程和途径的合适实例。
随后，我们描述了根据本发明的表达载体或表达载体的组合的实施方案和优点。根据需要，我们描述了这些优点以及将所述表达载体用在选择表达目的产物的宿主细胞中。
根据本发明的教导，在选择两种选择标记的培养条件下，选择标记(sm I)或(sm II)的活性受到并因此至少部分依赖于另一选择标记的活性影响。由于选择标记(sm I)和(sm II)的这种相互作用，增加了对宿主细胞的选择压力。由于其独特的设计，提供了非常严格选择系统，以允许从转染的宿主细胞群体中富集高产细胞。根据本发明的这个高度严格的选择系统降低了选择后群体中低生产者的数目，并增加了找到非常稀少的超高产克隆的机会。
根据一个优选的实施方案，选择标记(sm I)和(sm II)都参与相同的代谢过程，优选地是对细胞成活和/或增殖必需的代谢过程；例如核酸或多肽的合成。因此，当将表达载体或至少两个表达载体的组合引入到受体宿主细胞中时，所述选择标记(sm I)和(sm II)的活性/存在与选择性培养条件一起影响/攻击了受体宿主细胞的相同代谢过程。因此，选择标记(sm I)和(sm II)的活性在所述代谢过程内相互影响，由此增加了对宿主细胞的选择压力。无论选择性培养条件如何，在选择性培养条件下，宿主细胞存活/增殖可以足够地维持所述代谢过程以允许细胞存活和生长。如果所述宿主细胞表达两个选择标记(sm I)和(sm II)，并因此以高产率表达引入的表达载体，那么将促进存活/生长。由此，选择以高产率表达目的产物的宿主细胞。
“代谢过程”特别地描述宿主细胞中的过程，其对细胞成活和/或细胞增殖是必需的。代谢过程的例子是核酸合成或多肽合成。“代谢途径”特别地指代谢过程的亚类，并描述了在细胞内发生的已定义的一系列化学反应。在每一途径中，通过化学反应修饰了主要的化学物。代谢途径的经典例子是核苷酸合成(属于核酸合成的代谢过程)，特别是嘌呤或嘧啶生物合成，或者氨基酸的合成(属于多肽合成的代谢过程)。存在几种水平的代谢途径，其也通常是相互依赖并因此连接的。因此，应当理解，这些术语并非功能上作为单独的代谢途径，并且代谢过程也常常是重叠的。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)参与的代谢过程或途径选自
a)核酸合成和/或多肽合成，
b)核苷酸合成和/或氨基酸合成，和
c)叶酸代谢。
提及的代谢过程/途径对于维持宿主细胞的细胞成活和/或宿主细胞的增殖是重要的。因此，对于根据本发明的选择系统，它们是合适的作用点。因此，这些代谢途径是非常适用于挑选作为选择标记(sm I)和选择标记(sm II)的在其中参与的合适选择标记，并允许选择表达所述标记的宿主细胞的合适选择条件。参与各个代谢途径的合适选择标记以及合适的宿主细胞和合适的选择条件在现有技术中是已知的，并描述如下，并因此可以与本发明一起使用。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)是真核选择标记。“真核选择标记”允许选择包含分别表达所述选择标记的真核宿主细胞。所述真核选择标记可以是代谢选择标记，并因此该标记参与细胞的代谢过程或途径，例如核酸或多肽合成。
此外，第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)可以是可扩增的选择标记。可扩增的选择标记允许选择含有载体的宿主细胞并促进基因扩增。各可扩增选择标记的实例在现有技术中是已知的，例如DHFR和GS。
第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)可以是催化多肽或转运蛋白多肽。存在许多合适的各选择标记可以与本发明一起使用，并且将在下文详细说明。
根据一个实施方案，第二选择标记(sm II)是加工底物的催化多肽，其中
(a)底物，其是通过第一选择标记(sm I)掺入到宿主细胞中的化合物或者获自所述掺入的化合物的后续产物和/或
(b)通过第一选择标记(sm I)的活性获得的底物或其前体。
因此，用作为选择标记(sm II)的所述催化多肽可以通过第一选择标记(sm I)的活性加工输入到宿主细胞中的底物。它也可以加工由第一选择标记(sm I)的活性产生的底物。例如通过第一选择标记(sm I)掺入到宿主细胞中的所述化合物也可以是由第二选择标记(sm II)加工的实际底物的前体。因此，催化多肽(sm II)也可以加工这样的底物，所述底物是获自通过第一选择标记(sm I)的活性掺入到宿主细胞中的化合物的后续产物。在选择标记(sm I)是催化多肽而不是转运蛋白多肽的情况下也同样适用。
不被理论所束缚，假设在该实施方案中，在选择两个标记的培养条件下，第二选择标记(sm II)的活性强烈地依赖于第一选择标记(sm I)的活性。第二选择标记(sm II)的底物的存在和/或量至少在一定程度上依赖于选择标记(sm I)的正确表达/活性。第一选择标记(sm I)的强烈过量表达导致第二选择标记(sm II)的底物的更高可获得性。底物的更高可获得性增加了第二选择标记的活性(例如周转率)。然而，如果选择标记(sm I)没有足量表达，那么将没有或很少产生选择标记(sm II)的底物，它的活性也相应的降低。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)是负责引入/掺入来自培养基的化合物到宿主细胞中的转运蛋白多肽，所述化合物是第二选择标记(sm II)的底物或底物的前体。优选地，所述化合物对于细胞成活和/或增殖是必需的。认为在该实施方案中，如果第一选择标记(sm I)掺入了足量的所述化合物到宿主细胞中，那么第二选择标记(sm II)将以更高的效率或周转率运行。不被理论所束缚，认为第一选择标记(sm I)的强烈过量表达使得宿主细胞从培养基中输入了更多的所述化合物到细胞中，并因此使得宿主细胞能耐受培养基中更低浓度的所述化合物。这也导致在宿主细胞中所述化合物和因此的第二选择标记(sm II)的底物(或者所述底物的前体)的更高可获得性。在第一选择标记(sm I)是催化多肽的情况下，也适用同样的原理，其中所述催化多肽产生被第二选择标记(sm II)加工的/使用的底物或底物的前体。该假设反映了对潜在机制的现行理解，但是，然而并非是有约束力的，因为对于在选择压力中观察到的依赖性/增加可以存在其他解释。
选择标记(sm I)或(sm II)的活性影响另一选择标记的活性，并且两者都靶向相同的或一致的代谢过程或途径，例如核苷酸合成或叶酸代谢，因此，在选择性培养条件下将更有效地发挥功能，条件是两个选择标记都足量表达，并因此在宿主细胞中以高产率表达。这导致了高度严格的选择条件。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)在第二选择标记(sm II)的上游起作用。这意味着，例如在相同的或一致的代谢途径内，第一选择标记(sm I)可能例如在所述途径的开始其作用，并且第二选择标记(sm II)在选择标记(sm I)的下游起作用。
根据一个优选的实施方案，第一选择标记(sm I)是或者包含转运蛋白多肽。“转运蛋白多肽”特别地是介导化合物从一个区室到另一个区室，特别是从培养基到宿主细胞中的转运的多肽。合适的转运蛋白多肽的实例包括受体多肽、通道蛋白(channels)和运载体。
作为转运蛋白多肽，所述选择标记(sm I)优选地将化合物输入到宿主细胞中，所述化合物涉及宿主细胞的细胞成活或增殖和/或对宿主细胞的细胞成活或增殖是必需的。因此，细胞成活或增殖至少部分依赖于将所述化合物输入到宿主细胞中。与转运蛋白多肽(sm I)组合使用的第二选择标记(sm II)优选的是参与依赖于第一选择标记(sm I)的转运蛋白活性的/受第一选择标记(sm I)的转运蛋白活性的影响的代谢途径或过程的酶，因为它使用例如输入的化合物或其后续产物。在该实施方案中，所述第二选择标记(sm II)的活性和特别地周转率至少部分依赖于转运蛋白多肽(sm I)的活性，所述转运蛋白多肽(sm I)输入所述化合物到宿主细胞中。该实施方案可以与选择性培养基组合使用，所述选择性培养基包含限制浓度的通过转运蛋白多肽(sm I)输入到宿主细胞中的所述化合物。
“限制浓度”指所述化合物在选择性培养基中的浓度，其为宿主细胞提供选择压力。因此，在选择性培养基中并不大量包含所述化合物，从而为宿主细胞提供选择压力。因此，选择性培养基可以例如除去了所述化合物，分别地可以含有低量的通过转运蛋白多肽(sm I)掺入/运输到细胞中的所述化合物。
因此，在宿主细胞过量表达第一选择标记(sm I)的情况下，细胞成活是维持的/增加的，并因此输入了足够量的所述化合物到细胞中，以维持一致的代谢途径，即使所述化合物在培养基中的浓度非常低。如果转运蛋白多肽(sm I)的表达和因此的活性是增加的，那么第二选择标记(sm II)的底物的可获得性也是增加的。当第二选择标记(sm II)是催化多肽时，选择性培养基可以包含所述第二选择标记(sm II)的抑制物，例如第二选择标记(sm II)的实际底物的竞争物。强烈过量表达第二选择标记(sm II)的细胞耐受更高浓度的所述抑制物，特别是在高底物浓度的情况下(其至少部分依赖于选择标记(sm I)的的活性)。如果两个选择标记(sm I)和(sm II)都强烈表达，那么这具有在选择性条件下宿主细胞的成活会显著增加的效果。从而，目的产物的表达速率是增加的。因此，选择标记(sm I)和(sm II)的活性/功能的偶联导致了非常严格的选择条件，其允许选择高的和也超高表达的细胞克隆。同样的原理也适用于在第一选择标记(sm I)是参与第二选择标记(sm II)的底物产生/生成的酶的情况(参见上文)。
根据一个优选的实施方案，第一选择标记(sm I)和第二选择标记(sm II)都参与叶酸代谢。根据本发明的叶酸可以例如是氧化叶酸(即维生素Bc(folic acid))或还原叶酸或者它们的衍生物。一般而言，叶酸可以用于本发明内，只要宿主细胞，特别是哺乳动物细胞能吸收此种叶酸。氧化叶酸，即维生素Bc，以及维生素Bc的还原衍生物，称为还原叶酸或四氢叶酸(THF)，是一组B-9维生素，其在真核细胞，特别是哺乳动物细胞中，是用于生物合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸的必需辅因子和/或辅酶。THF辅因子对于DNA复制和因此的细胞增殖是特别关键的。具体而言，THF辅因子在涉及从头生物合成嘌呤和胸苷酸、氨基酸的一系列互相联系的代谢途径以及甲基代谢包括DNA的CpG岛甲基化中作用为一碳单位的供体。具体而言，THF辅因子包括10-甲酰基-THF(10-CHO-THF)，在涉及嘌呤的从头生物合成的两个关键从头甲酰基转移酶反应中提供一碳单位。氧化叶酸的优选实例是维生素Bc。还原叶酸的优选实例是5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸和5，10--亚甲基-四氢叶酸。
与合成其自身叶酸的大多数原核生物、植物和真菌相反，哺乳动物和其他真核物种缺乏THF辅因子生物合成，并因此必须从外源来源，通常是从培养基获得它们。目前已知三种独立的运输系统在哺乳动物细胞中介导叶酸和叶酸拮抗物的摄取：
a)还原叶酸辅因子的主要细胞运输系统是还原叶酸运载体(RFC)。RFC(也已知为溶质载体蛋白家族19成员1，SLC19A1)是普遍表达的作用为双向易化运载体的～85kDa膜糖蛋白，其通过交换有机磷酸例如已知积累到非常高的胞内水平的腺嘌呤核苷酸以及一磷酸硫胺素和硫胺素焦磷酸来介导还原叶酸的上向运输。RFC显示出对包括甲酰四氢叶酸在内的THF辅因子高的亲和力(5-甲酰-THF；Kt＝1μM)，但却仅拥有对氧化叶酸维生素Bc非常差的运输亲和力(Kt＝200-400μM)。
b)叶酸摄取的另一途径是最近已经克隆的质子偶联的叶酸转运蛋白(PCFT，也已知为SLC46A)。PCFT显示出独立于RFC的表达，在酸性pH(5.5)功能最佳，并介导了氧化叶酸(例如维生素Bc)和THF辅因子(即还原叶酸)二者以及包括MTX的多种亲水性叶酸拮抗物的流入。在酸性pH(5.5)显示出叶酸和叶酸拮抗物的最佳运输，但在生理性pH(7.4)没有功能的PCFT在小肠上部吸收叶酸和叶酸拮抗物二者中具有关键作用。
c)第三种运输途径涉及叶酸受体(FR)。FR是由三种不同的基因FRα、FRβ、FRγ编码的高亲和力叶酸结合糖蛋白。FRα也已知为成人叶酸结合蛋白或FDP，作为叶酸受体1或FOLR(在小鼠中为folbp1)，以及作为卵巢癌相关抗原或MOv18。FRβ也已知为FOLR2(胎的)和FBP/PL-1(胎盘)。FRγ也已知为FOLR3和FR-G(由M.D.Salaza和M.Ratnam，Cancer Metastasis Rev.200726(1)，第141-52页综述)。已经很好表征的成熟FR是具有～70-80％氨基酸同一性的同源蛋白质并含有229至236个氨基酸以及两个至三个N糖基化位点。FRα和FRβ是膜结合的，特别是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面糖蛋白，而FRγ缺乏GPI锚且是分泌蛋白质。FRα和FRβ对维生素Bc(Kd＝0.1-1nM)、5，10-二去氮四氢叶酸(DDATHF；洛美曲索；使用[3H]维生素Bc作为底物Ki＝0.4-1.3nM)和BGC945(其是仅通过FRα而非通过还原叶酸运载体特异运输的基于环戊二烯并[g]喹唑啉(cyclopenta[g]quinazoline)的胸苷酸合酶抑制物)(Kd＝1nM)显示出高亲和力，但是对MTX显示出远低得多的亲和力(Kd＞100nM)。叶酸和叶酸拮抗物的FR依赖的摄取通过受体介导的胞吞作用的经典机制进行。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)是转运蛋白多肽，其从培养基中将至少一种叶酸输入到宿主细胞中。一般而言，叶酸在本发明中是有用的，只要宿主细胞，特别是哺乳动物细胞能通过第一选择标记(sm I)吸收此种叶酸。
根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)是或者包含还原叶酸运载体(RFC)、或者其功能性变体或片段。RFC是普遍表达的膜糖蛋白，其用作为摄取还原叶酸例如5-甲基-THF和5-甲酰-THF到细胞中的主要转运蛋白。然而，RFC对氧化叶酸、维生素Bc显示出非常低的亲和力。因此，缺少RFC的表达或者已经从基因组中删除了RFC基因座的细胞可以用作为在还原叶酸例如5-甲酰-THF从生长培养基中逐渐除去的条件下转染选择标记基因RFC(作为(sm I))的受者，从而强迫细胞表达增加水平的这种叶酸转运蛋白。
根据一个优选的实施方案，所述实施方案也在实施例部分进行了详细的描述，第一选择标记(sm I)是或者包含叶酸转运蛋白多肽，且优选地是功能性叶酸受体。使用叶酸受体或其功能性变体或片段相对于使用RFC选择系统具有几个优点。它不是必需使用其中已经通过靶向敲除或者功能突变敲除或失活了内源FR基因座的细胞。此外，RFC对维生素Bc具有差的运输亲和力，并因此在用于选择的培养基中不能使用这种氧化叶酸。然而，维生素Bc可以通过叶酸受体进行加工。此外，基于叶酸受体的选择系统是单向叶酸摄取系统，其中RFC是双向叶酸转运蛋白，其显示出同等能力的叶酸输入和输出。因此，使用叶酸受体具有几个重要的优点。然而，它也可以用于与RFC组合作为选择标记。
通过根据本发明的表达载体或至少两个表达载体的组合，可以将各个叶酸受体引入到意图产生目的产物的真核细胞中。在引入编码叶酸受体作为第一选择标记(sm I)的多核苷酸，以及编码目的产物(如多肽)的多核苷酸和编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸后，将细胞培养于含有限制浓度的叶酸的选择性培养基中。叶酸在培养基中的浓度越低，所应用的选择条件就越严格。优选地，当第一选择标记(sm I)是或者包含叶酸受体时，第二选择标记(sm II)是加工底物的催化多肽，所述底物是叶酸和/或获自叶酸的后续产物。因此，过量表达引入的叶酸受体的细胞可以摄取足够量的叶酸以维持细胞生长、DNA复制和因此细胞增殖。由于第二选择标记(sm II)的活性依赖于第一选择标记(sm I)的活性/受到第一选择标记(sm I)的活性(在此处为叶酸受体的转运蛋白活性(参见上文))的影响的事实，该效果得到了进一步的增强。这具有只有那些强烈过量表达引入的选择性标记(sm I)和(sm II)并因此过量表达目的产物的细胞才存活的效果。虽然这构成了一个可能的实施方案，但是这种方法要求依赖于选择的实施方案没有事先缺失内源叶酸受体(FR)基因。
通过使用根据本发明的表达载体引入到真核宿主细胞中的叶酸受体可以源自任一物种，只要它在本发明中是有功能的，即与所使用的真核细胞兼容。优选地，使用衍生自哺乳动物物种的叶酸受体，例如源自啮齿类动物，或者，最优选地，人叶酸受体。
总而言之，引入到真核宿主细胞中并用作为选择标记的叶酸转运蛋白，特别是叶酸受体可以是与宿主细胞的内源叶酸受体同源的或异源的。如果它是同源的，那么它是衍生自与宿主细胞相同的物种，并可以，例如，是与宿主细胞的内源叶酸受体相同的。如果它是异源的，那么它是衍生自非宿主细胞的另一物种，并可以因此不同于宿主细胞的内源叶酸受体。一般地，用作为选择标记的引入叶酸转运蛋白，优选地叶酸受体是与宿主细胞异源的。例如，人衍生的叶酸受体可以用作为啮齿类动物宿主细胞例如CHO细胞的选择标记。
根据一个实施方案，叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体。所述受体可以是能单向的输入或摄取叶酸或其衍生物到真核细胞中的功能性膜结合受体。膜结合叶酸受体可以衍生自上文所述的任一物种。
用作为第一选择标记(sm I)的功能性膜结合叶酸受体可以选自叶酸受体α、叶酸受体β、叶酸受体γ、具有或包含SEQ.ID.NO.1、2或3的氨基酸序列的叶酸受体，以及前述的功能性变体。优选地，它是人叶酸受体α或其功能性变体。
功能性变体包含以生理性方式起作用，即能通过宿主细胞(特别是真核细胞且优选地是哺乳动物宿主细胞)摄取叶酸并通过细胞的叶酸代谢有助于细胞成活的叶酸受体的衍生物。例如，叶酸受体的变体形式可以包含一个或多个氨基酸突变，如一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或添加。所述术语也包括这样的变体，所述变体是包含各个叶酸受体的融合蛋白。
优选地，叶酸受体是人叶酸受体α、人叶酸受体β或它们的功能性变体。最优选的是具有或包含以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1，单字母密码，以从氨基末端到羧基末端的方向显示)的人叶酸受体α：
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS
另一个优选的实施方案涉及具有或包含以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2，单字母密码子，以从氨基末端到羧基末端的方向显示)的人叶酸受体β：
MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG
在一个备选的实施方案中，用作为第一选择标记(sm I)的叶酸受体并非是天然膜结合的。可以改变此种非膜结合受体以变成膜结合的。例如可以提供膜锚定和/或将所述叶酸受体表达为包含非膜结合叶酸受体和另一多肽的跨膜区的融合蛋白。同样地，可以使用对于本领域技术人员可以容易地获得的其他变体。在这方面，优选的实例是基于可溶性叶酸受体γ，优选地人类可溶性叶酸受体γ。在一个其最优选的实施方案中，人类可溶性叶酸受体γ具有/包含以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.3，单字母密码，以从氨基末端到羧基末端的方向显示)：
MDMAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPRSARARTDLLNVCMNAKHHKTQPSPEDELYGQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQVNQSWRKERILNVPLCKEDCERWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTFESYFPTPAALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAAAMNAGAPSRGIIDS
所述受体可以是突变的或者另外地基因改变的、衍生的或者修饰的，以形成在本发明的上下文中能叶酸摄取的功能性膜结合叶酸受体。
从上文可以看出，选择标记(sm I)和/或(sm II)可以是或者可以包含参与核酸合成和/或叶酸代谢的催化多肽。根据一个实施方案，第一选择标记(sm I)是或者包含掺入参与核酸合成和/或对核酸合成必需的化合物到宿主细胞中的转运蛋白，并且第二选择标记(sm II)是参与核酸合成例如核苷酸产生的催化多肽。优选地，第二选择标记(sm II)是催化多肽，优选地是参与核酸合成，特别是叶酸代谢的酶。如果第一选择标记(sm I)运输叶酸到宿主细胞中并且例如是叶酸受体，那么这是特别有用的。
在核酸合成过程中，第一个酶，甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶(GARTF)参与嘌呤的咪唑环的形成，然而由5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸转甲酰基酶(AICARTF)介导的更下游的反应产生了嘌呤中间产物肌苷5′-一磷酸(IMP)。后者用作为AMP和GMP的受调节的生物合成的关键前体。此外，5，10-亚甲基-THF(5，10-CH2-THF)是另一重要的THF辅酶，其作为胸苷酸合酶(TS)的关键辅因子发挥作用。TS使用5，10-亚甲基-THF(5，10-CH2-THF)从dUMP催化形成胸苷一磷酸(dTMP)，从而提供二氢叶酸。二氢叶酸还原酶(DHFR)催化二氢叶酸(DHF)的NADP依赖的还原生成四氢叶酸(THF)。然后将THF互变成分别在嘌呤和胸苷酸的从头合成中使用的10-甲酰-THF和5，10-亚甲基-THF。该反应由丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)催化。DHF因此是胸苷酸合酶(TS)的催化活性的副产物，其在5，10-亚甲基-THF依赖的反应中催化dUMP转变成dTMP。因此，对于对嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成所必需的THF辅因子的再循环而言，DHFR是关键的，所述嘌呤和嘧啶核苷酸对DNA复制是必需的。
在某种程度上叶酸依赖的所述酶是对DNA复制必需的嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的从头生物合成的关键介导物，并适合作为第一选择标记(sm I)和/或(sm II)，因为它们参与相同的代谢过程，即核酸合成。
根据一个实施方案，第二选择标记(sm II)加工的底物是叶酸、叶酸的衍生物和/或通过加工叶酸能获得的产物例如DHF或THF或者前述的功能性变体或衍生物。各个底物对于核酸的产生都是重要的。优选地，所述第二选择标记(sm II)是或包含二氢叶酸还原酶(DHFR)或者在下游发挥作用/分别与DHFR组合的酶，例如TS和SHMT。如果选择标记(sm I)是叶酸转运蛋白，那么该实施方案是特别适合的。
几种合适的DHFR酶和因此的基因是现有技术中已知的，其可以与本发明结合使用。DHFR可以是野生型DHFR或者其功能性变体或衍生物。术语“变体”或“衍生物”包括相对于各个DHFR酶的氨基酸序列，具有一个或多个氨基酸序列交换(例如缺失、替换或添加)的DHFR酶、包含DHFR酶或其功能性片段的融合蛋白和已经被修饰以提供额外结构和/或功能的DHFR酶，以及前述的功能性片段，所述功能性片段仍具有DHFR酶的至少一种功能。例如可以用作为选择标记(sm II)的DHFR酶比野生型DHFR酶和/或由表达DHFR酶的宿主细胞内源表达的DHFR酶对叶酸拮抗物例如MTX更加敏感或更加不敏感。DHFR酶可以源自任一物种，只要它在本发明中是有功能的，即与所使用的真核细胞兼容。例如对MTX具有主要抗性的突变型小鼠DHFR已经广泛地用作为显性选择标记，其明显地增加了转染细胞中高水平MTX抗性的获得。优选地，用作为选择标记的DHFR酶比在DHFR+(阳性)宿主细胞中内源表达的DHFR酶对DHFR抑制剂例如MTX更不敏感。
根据一个实施方案，其内含子或片段位于DHFR基因的可读框的3’端。这对构建体的表达率/扩增率具有积极的作用。在DHFR表达盒中使用的内含子产生了更小的、非功能性DHFR基因变体(Grillari等人，2001，J.Biotechnol.87，59-65)。从而更降低了DHFR基因的表达水平并因此可以进一步增加选择系统的严格性。因此，宿主细胞可以包含编码DHFR酶的引入多核苷酸，所述多核苷酸包含位于DHFR编码序列的3’的内含子。在EP0724639中描述了使用内含子来降低DHFR基因的表达水平的备选方法，并且也可以使用。
根据一个优选的实施方案，第一选择标记(sm I)是维生素Bc受体并且第二选择标记是比野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达的DHFR酶对MTX更不敏感的DHFR变体。所述DHFR变体也优选地包含如上所述的内含子。特别优选与DHFR+(阳性)细胞组合的各标记的组合。
可以使用如本文中所述的表达载体和/或至少两个表达载体的组合来实施本发明的教导。编码目的产物的多核苷酸或者用于掺入各个多核苷酸的插入位点、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸和任选地其他载体元件例如其他选择标记可以位于相同的或者分别的表达载体上。
例如，使用包含至少上述所有决定性元件即编码目的产物(或者用于掺入各个多核苷酸的插入位点)的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸的表达载体具有仅需要将一种表达载体引入到宿主细胞中的优点。此外，特别是在建立稳定表达系时，因为所有元件都整合到基因组中，所以通过宿主细胞同等地或者至少以类似的速率表达所有元件的机会越高。
然而，将至少两种或三种表达载体的组合用于转染也是可能的，并且也在本发明的范围内，其中各个多核苷酸位于不同的表达载体上。然后将所述表达载体的组合转染入宿主细胞中。当使用至少两个表达载体的组合时，优选地使用其中至少一个编码目的产物的多核苷酸(或者用于引入目的多核苷酸的插入位点)和至少一个选择标记(sm I)或(sm II)都排列在相同的表达载体上的设置。这特别是当使用表达载体的组合以建立稳定表达细胞系、以确保紧密偶联选择标记(sm I)和/或(sm II)的表达以表达目的产物的时候。另一选择标记(sm I)或(sm II)可以位于所述表达载体组合的分别的表达载体上。因此，包含另一选择标记(sm I)或(sm II)的所述分别的表达载体可以包含编码目的产物的其他多核苷酸。可以例如将各个设置用于表达免疫球蛋白分子。然而，位于分别的并因此单独的表达载体上的所有多核苷酸(编码目的产物(sm I)和(sm II))也在本发明的教导内。
根据一个实施方案，根据本发明的表达载体包含用于插入编码目的产物的多核苷酸但还没有含有编码目的产物的多核苷酸的插入位点。可以将各个“空”表达载体用于插入编码想要的目的产物的多核苷酸，从而获得可以掺入到宿主细胞中的现成可用的表达载体，以表达目的产物。可以通过使用合适的克隆方法，例如通过使用限制性酶以插入编码目的产物的多核苷酸来实现掺入。为此，表达载体可以例如包含例如可以在所有阅读框中使用的多克隆位点(MCS)的表达载体。各个多克隆位点作为插入位点的实例可以位于表达盒内。由于通过插入编码想要的目的产物的多核苷酸，可以将表达载体容易地用于预定的用途，因此，各个“空”表达载体提供了用于表达不同的目的产物的有用工具。
表达载体或者至少两个表达载体的组合可以额外地包含其他载体元件。例如可以提供编码其他目的产物的至少一个其他多核苷酸。该实施方案特别适用于表达免疫球蛋白分子。可能有用的其他一般载体元件是现有技术中已知的并且包括但不限于复制起点、其他选择标记、用于在不同宿主细胞或体外表达中表达的启动子。
根据本发明的表达载体或至少两个表达载体的组合可以包含编码免疫球蛋白分子的重链的至少一个功能性片段的至少一个多核苷酸和编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一个功能性片段的至少一个多核苷酸。在使用至少两个表达载体的组合的情况下，所述多核苷酸可以位于相同的或不同的表达载体上。使用至少两个表达载体的组合也在本发明的范围内，其中一个表达载体至少包含编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一个功能性片段的至少一个多核苷酸和/或编码所述免疫球蛋白分子的重链的一个多核苷酸，并且所述组合的另一表达载体至少包含编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸和编码所述免疫球蛋白分子的轻链的至少一个功能性片段的至少一个多核苷酸和/或编码所述免疫球蛋白分子的重链的多核苷酸。在实施例中也描述了各个设置。所述多核苷酸在宿主细胞中的表达后，将获得功能性免疫球蛋白分子。如也在下文所述，编码免疫球蛋白分子的重链的至少一个功能性片段的多核苷酸和编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一个功能性片段的多核苷酸可以包含在相同的表达盒或者在不同的表达盒中。
根据本发明的表达载体或至少两个表达载体的组合可以额外地包含编码一个或多个其他选择标记的一个或多个其他多核苷酸。所述其他标记可以参与与选择标记(sm I)和(sm II)一样的或一致的代谢过程或途径。在本发明的一个实施方案中，使用本发明的系统与一个或多个不同的选择系统(例如抗生素抗性选择系统如neo/G418)一起的共选择可以应用于进一步改善性能。除允许选择真核宿主细胞的其他真核选择标记外，也可以使用原核选择标记。“原核选择标记”是在合适的选择条件下，允许在原核宿主细胞中选择的选择标记。各个原核选择标记的实例是提供对抗生素例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素的抗性的标记。
用于表达目的产物的载体通常含有适用于驱动转录的转录控制元件例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录中止或终止信号作为表达盒的元件。如果想要的产物是蛋白质，那么优选地将合适的翻译控制元件包括在载体中，例如产生适用于募集核糖体的5’帽结构的5’非翻译区和终止密码子以终止翻译过程。特别地，用作为选择标记基因的多核苷酸以及编码目的产物的多核苷酸可以在存在合适启动子的转录元件的控制下转录。得到的选择标记基因的转录物和目的产物的转录物具有有助于相当高水平的蛋白质表达(即翻译)和正确翻译终止的功能性翻译元件。能正确驱动掺入的多核苷酸表达的功能性表达单位，在本文中也称为“表达盒”。在表达盒中优选地包含编码目的产物的多核苷酸和编码选择标记(sm I)和(sm II)的多核苷酸。几种实施方案都是适合的，例如可以在不同的表达盒中包含每一所述多核苷酸。然而，在一个表达盒中包含至少两个分别的多核苷酸也在本发明的范围内。
因此，根据本发明的表达载体或表达载体的组合可以包含至少一个启动子和/或启动子/增强子元件作为表达盒的元件。尽管这两个控制元件之间的物理界限并非总是清楚的，但是术语“启动子”通常指核酸分子上与RNA聚合酶和/或任一相关的因子结合并起始转录的位点。增强子在时间上和空间上加强启动子活性。许多启动子在多种细胞类型中都是转录活跃的。可以将启动子分为两类，组成型发挥作用的启动子和受到诱导或去抑制调节的启动子。二者都适用于与本发明的教导结合。用于在哺乳动物细胞中高水平生产蛋白质的启动子在多种细胞类型中应当是强的并优选地是活跃的。
在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于，腺病毒主要晚期启动子、人类巨细胞病毒即时早期启动子、SV40和劳斯肉瘤病毒启动子和鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子、EF1a。当启动子和/或增强子是获自CMV和/或SV40时，本发明的表达载体可以取得较好的结果。转录启动子可以选自SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和β肌动蛋白启动子。
一个优选的实施方案涉及根据本发明的表达载体，其中编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸在独特的转录启动子的控制下。总而言之，在宿主细胞，特别是真核宿主细胞中，能促进必需多核苷酸的表达的，特别是转录的启动子都是合适的。驱动从多核苷酸表达的独特转录启动子可以是相同的或者不同的。
根据一个实施方案，将更强的启动子和/或增强子用于驱动编码目的产物的多核苷酸的表达，而不是用于驱动编码第一选择标记(sm I)和/或(sm II)的多核苷酸的表达。这种安排具有目的产物产生的转录物比选择标记更多的作用。目的产物的产生比选择标记的产生要占优势是有利的，因为单个细胞产生异源产物的能力并非是无限的，并因此应当集中于目的产物。此外，选择过程仅发生在建立表达细胞系的开始阶段，所述表达细胞系然后稳定地产生目的产物。因此，集中细胞资源以表达/生产目的产物是有利的。此外，使用比表达目的多肽所使用的启动子稍弱的表达选择标记(sm I)和/或(sm II)的启动子进一步增强了选择压力。
根据一个实施方案，驱动编码目的产物的多核苷酸的表达的启动子是CMV启动子，且驱动编码选择标记(sm I)和/或(sm II)的多核苷酸的表达的启动子是SV40启动子。CMV启动子是已知的可用于哺乳动物表达的最强的启动子之一，并导致了非常好的表达率。认为会比SV40启动子产生显著更多的转录物。
根据另一实施方案，编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸在相同的转录启动子的控制下。上文描述了合适的启动子。在该实施方案中，从在所述转录启动子控制下的各个表达盒获得了一个长转录物。根据一个实施方案，至少一个IRES元件功能性位于编码选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸之间。因此，它确保了从所述转录物中获得分离的翻译产物。
表达载体或至少两个表达载体的组合可以包含合适的转录终止位点作为表达盒的元件。由于从上游启动子通过第二转录单位持续地转录可以抑制下游启动子的功能，这种现象称为启动子封堵或转录干扰。在原核生物和真核生物中都已经描述了这种事件。在两个转录单位之间正确放置转录终止信号可以防止启动子封堵。已经较好的表征了转录终止位点，并且它们在表达载体中的掺入已经显示出对基因表达具有多种有利作用。
优选地，使用的宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物宿主细胞。大多数真核新生mRNA在3’端具有在复合物加工期间添加的聚腺苷酸尾巴，所述复合物加工涉及初级转录物的切割和偶联的聚腺苷酸化反应。聚腺苷酸尾巴对于mRNA稳定性和可转移性是有利的。因此，根据本发明的载体的表达盒通常包含聚腺苷酸化位点。在哺乳动物表达载体中存在几种可以使用的有效聚腺苷酸信号，包括衍生自牛生长激素(bgh)、小鼠β珠蛋白、SV40早期转录单位和单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因的那些聚腺苷酸信号。然而，也已知合成的聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等人，1989，Genes Dev.3，(7)：1019-1025)。聚腺苷酸化位点可以选自SV40聚腺苷酸位点，例如SV40晚期和早期聚腺苷酸位点(参见例如质粒pSV2-DHFR，描述于Subramani等人，1981，Mol.Cell.Biol.854-864)、合成的聚腺苷酸位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等人，1989，Genes Dev.3，(7)：1019-1025)和bgh聚腺苷酸位点(牛生长激素)。
此外，包含编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸的表达盒可以包含至少一个内含子。当将真核细胞，特别是哺乳动物宿主细胞用于表达时，该实施方案是特别合适的。大多数来自高等真核生物的基因都含有在RNA加工期间被除去的内含子。各个构建体在转基因系统中比缺少内含子的同一构建体更有效地表达。通常，内含子位于可读框的5’端，但也可以位于3’端。因此，可以在表达盒中包含内含子以增加表达率。所述内含子可以位于启动子和或启动子/增强子元件与待表达的核苷酸的可读框的5’端之间。在现有技术中已知的几种合适的内含子可以与本发明结合使用。
根据一个实施方案，在用于表达目的产物的表达盒中所使用的内含子是合成内含子例如SIS或RK内含子。RK内含子是强合成内含子，其优选地位于目的基因的ATG起始密码子之前。RK内含子是由CMV启动子的供体剪接位点和小鼠IgG重链可变区的受体剪接位点组成的内含子(参见例如Eaton等人，1986，Biochemistry 25，8343-8347，Neuberger等人，1983，EMBO J.2(8)，1373-1378；它可以获自pRK-5载体(BDPharMingen))。
可以将根据本发明的表达载体或载体组合以其环状形式转染入宿主细胞中。由于内切核酸酶和外切核酸酶的活性，在细胞核内，超螺旋载体分子通常将转变成线性分子。然而，在转染前线性化表达载体通常改善稳定转染的效率。如果在转染前表达载体是线性化的，那么也可以控制作为线性化的点。因此，根据本发明的一个实施方案，表达载体或至少两个表达载体的组合包含至少一个预定义的限制位点，其可以用于在转染前线性化载体。有才智地放置所述线性化限制位点是有利的，因为所述限制位点决定了载体打开/线性化的部位，并因此决定了当构建体整合到真核细胞，特别是哺乳动物细胞的基因组时，表达盒的顺序/排列。在将载体用作为预定的标准表达载体例如作为表达几种不同的产物/多肽的工具的情况下，有利的是提供包含具有低切割频率的酶的多个识别位点的线性化限制位点。挑选的用于线性化的限制性酶应当优选地并不在目的产物的表达盒、选择标记或其他载体骨架序列内切割，以确保对于载体的正确线性化，酶仅切割一次。通过提供包含用于具有低切割频率的限制性酶的多个限制位点的线性化限制位点，使用者可以从提供的选择中挑选用于线性化的合适限制性酶，以安全地避免编码目的产物的核苷酸内的限制位点。然而，如上所述，可以突变其他限制位点或者进行部分限制性酶切消化。根据一个实施方案，线性化时的线性化位点是如此排列的，编码真核可扩增选择标记的多核苷酸位于编码目的产物的多核苷酸的5’。这种排列对于基因扩增是有利的。在额外地使用了原核选择标记的情况下，编码所述标记的多核苷酸位于编码目的产物的多核苷酸的3’。这具有原核选择标记基因在3’并因此在线性化载体核酸的“哺乳动物”部分“之外”的作用。这种排列是有利的，因为原核基因可能对真核表达且特别是哺乳动物表达并非是有利的，因为原核序列在哺乳动物细胞中可能导致增加的甲基化或其他沉默作用。
表达载体可以包含其他元件以允许根据本发明的选择方法与现有技术中已知的其他选择系统组合。在现有技术中已知的一个已建立的选择方法是基于使用流式细胞术，特别是荧光激活细胞分选术(FACS)。应用流式细胞术的选择方法具有可以快速地筛选大量细胞的优点。在一个特别用于鉴定高产细胞克隆的选择方法中，将一部分目的产物例如抗体表达为膜结合的融合多肽。因此，一部分产物作为融合多肽展示于细胞表面上。由于产生的融合多肽的量与整体表达率有关，因此，可以通过基于展示在细胞表面上的融合多肽的量的流式细胞术来选择宿主细胞。这允许快速地选择高产宿主细胞。已经发现，根据本发明的选择系统可以有利地与基于使用流式细胞术的各个选择方法组合。为了允许使用FACS的有效选择，优选地使用用于表达目的产物的特定表达盒。因此，根据一个实施方案，根据本发明的表达载体或至少两个表达载体的组合包含用于表达编码目的产物的多核苷酸的表达盒，其设计为一部分表达的目的产物包含跨膜锚。存在几种实现该结果的选择。
根据一个实施方案，所述表达盒至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸，
(b)在编码目的产物的多核苷酸的下游的至少一个终止密码子，和
(c)在终止密码子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的其他多核苷酸。
表达盒的这种设计具有通过翻译连读过程(终止密码子是“遗漏的”)，将一部分目的产物产生为包含膜锚的融合多肽的作用。结果，这种融合多肽展示在细胞表面上，并且可以通过流式细胞术，优选地通过FACS选择展示高水平的膜锚定融合多肽的细胞。因此，选择了具有高表达率的宿主细胞。这种基于终止密码子的技术的详细描述和优选实施方案描述于WO2005/073375和PCT/EP2009/006246中。其在本公开中引用。
根据一个备选的实施方案，所述表达盒至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸，
(b)包含5’剪接供体位点和3’剪接受体位点并包含框内翻译终止密码子和多腺苷酸化信号的内含子和
(c)在所述内含子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的多核苷酸。
表达盒的这种设计具有通过转录和转录物加工从表达盒中获得至少两个不同的成熟mRNA(mRNA-POI)和(mRNA-POI-ANCHOR)的作用。mRNA-POI的翻译产生了目的产物。mRNA-POI-ANCHOR的翻译产生了包含目的产物和膜锚的融合多肽。结果，这种融合多肽也展示在细胞表面上，并且可以通过流式细胞术，优选地FACS选择展示高水平的膜锚定融合多肽的细胞。因此，选择了具有高表达率的宿主细胞。这种基于内含子的技术的详细和优选实施方案描述于WO2007/131774中。其在本公开中引用。
根据一个优选的实施方案，其特别地用于表达作为目的产物的抗体，膜锚是免疫球蛋白跨膜锚。免疫球蛋白跨膜锚的其他合适膜锚和优选的实施方案描述于WO2007/131774、WO2005/073375和PCT/EP2009/006246中。
也提供了宿主细胞，其至少包含
(a)编码目的产物的引入多核苷酸；
(b)编码第一选择标记(sm I)的引入多核苷酸；
(c)编码第二选择标记(sm II)的引入多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同；
其中，选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记影响。
根据一个实施方案，如在上文和权利要求中所详细描述，宿主细胞包含表达载体或至少两个表达载体的组合。我们引用了上面的公开。
此外，宿主细胞可以具有至少一个以下特征：
宿主细胞优选的是真核宿主细胞。所述真核细胞，优选地选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞和植物细胞可以对叶酸是原养型的(即此类细胞可以独立自主地合成对于它们的细胞成活，即细胞生长和增殖必需的它们自己的叶酸)。本发明特别包括对叶酸是或成为营养缺陷型的此类真菌和植物细胞。这可以例如由于遗传操纵，即细胞现在不能合成足够量的对它们的细胞成活所必需的叶酸。例如，此类真菌或植物细胞例如通过合适的代谢途径内源地生物合成叶酸的能力可以例如通过合适靶基因的基因破坏或基因沉默、或者关键酶的抑制等失活。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞优选地选自啮齿类动物细胞、人类细胞和猴细胞。特别优选的是啮齿类动物细胞，其优选地选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。最特别优选的啮齿类动物细胞是CHO细胞。也优选的是人类细胞，其优选地选自HEK293细胞，MCF-7细胞、PerC6细胞和HeLa细胞。其他优选的是猴细胞，其优选地选自COS-1、COS-7细胞和Vero细胞。
宿主细胞和掺入的选择标记(sm I)和(sm II)应当是兼容的，这意味着所挑选的宿主细胞和选择标记(sm I)和(sm II)的组合允许在选择性培养条件下选择表达各个标记的宿主细胞。选择标记(sm I)和(sm II)的表达应当在选择性培养条件下提供选择性优势。因此，优选地挑选在选择性生长条件下易于通过选择标记(sm I)和(sm II)选择的宿主细胞。例如，在将某些酶用作为选择标记(sm I)和/或(sm II)的情况下，宿主细胞可以不表达内源的各个酶或者可以至少表达非足够量的或者非足够活性的所述酶，以在缺少编码选择标记(sm I)和(sm II)的异源多核苷酸充分表达的情况下，在选择性培养条件下允许细胞正常的运行/生长。因此，如果宿主细胞以足以在选择性生长条件存活的产量表达引入的选择标记和因此编码目的产物的多核苷酸，那么宿主细胞可以以足够的速率仅存活/增殖。合适的宿主细胞的选择/设计取决于所挑选的选择标记(sm I)和(sm II)。合适的宿主细胞是现有技术中已知的或者可以通过研发合适的细胞系例如通过基因工程(例如诱变、基因敲除；基因沉默等)产生。这些原理是现有技术中熟知的并因此不需在此处详细解释。
例如，在没有核苷酸的培养基中，可以将缺少DHFR基因的宿主细胞(例如CHO细胞)(例如，通过靶向的基因组缺失，也称为DHFR-宿主细胞)用作为用于转染DHFR基因作为选择标记基因的受体。然而，如果使用了合适的选择性培养基，那么当进行DHFR选择时，也可以使用内源表达DHFR的宿主细胞(DHFR+(正)宿主细胞)。在这种情况下，优选地将DHFR酶用作为选择标记(sm II)，其比由DHFR+(正)宿主细胞表达的内源DHFR酶对MTX更不敏感。在用异源多核苷酸，例如根据本发明的包含DHFR基因例如作为第二选择标记(sm II)的表达载体转染后，可以使细胞经历浓度逐渐增加的DHFR的抑制物。一个实例是叶酸拮抗物例如MTX，其是有效的DHFR抑制物(Kd＝1pM)。在培养基中叶酸拮抗物例如MTX的存在迫使细胞为了存活而产生增加水平的DHFR。经过多轮的选择，选择标记DHFR频繁地经历显著的基因扩增以实现细胞存活。现有技术必须使用相当高的叶酸拮抗物/MTX浓度以实现充分的基因扩增和因此目的产物的产生的增加。由于叶酸拮抗物是有毒的并可能改变宿主细胞，这是不利的。组合参与相同的或一致的代谢途径(优选地叶酸代谢)的两个选择标记(sm I和sm II)的本发明的新方法具有已经在低抑制物(例如MTX)水平时，选择严格性显著增加的优点。因此，相对于提供非常严格的选择条件的现有技术的方法，本发明的教导需要较少的抑制物和因此的毒性剂。
上文详细描述了用于选择标记(sm I)和(sm II)以及它们的组合的合适实例；我们引用以上公开。
编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸可以被稳定引入到所述宿主细胞中。对于建立表达细胞系和特别对于目的产物的大规模的和因此的工业生产，稳定地引入各个转染是有利的。
编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸可以位于包含在所述宿主细胞中相同的或分别的表达载体上。上文描述了有关这些实施方案的细节；我们引用以上的公开。
根据一个实施方案，所使用的宿主细胞的细胞成活力或增殖率可以依赖于通过第一选择标记(sm I)掺入到宿主细胞中的化合物(例如叶酸)的摄取。如上所述，第一选择标记(sm I)可以编码能将化合物输入到所述宿主中的转运蛋白多肽。根据上文详细描述的一个实施方案，第一选择标记(sm I)至少将一种叶酸输入到了宿主细胞中，并优选地，如上所述，其是叶酸受体。当使用DHFR作为第二选择标记(sm II)时，该实施方案特别有效。根据一个优选的实施方案，第一选择标记(sm I)是维生素Bc受体，且第二选择标记是比野生型DHFR酶对MTX更不敏感的DHFR变体。各个标记组合特别优选地与DHFR+(正)细胞组合。在这种情况下，优选地将DHFR酶用作为选择标记(sm II)，其比由DHFR+(正)宿主细胞表达的内源DHFR酶对MTX更不敏感。细节描述于上文和下文。
根据一个实施方案，宿主细胞缺乏至少一种内源功能性膜结合叶酸受体的完全活性。可以通过选择/筛选方法或者通过例如为了产生敲除细胞系的基因工程技术获得各个细胞系。因此，也提供了宿主细胞，其中内源单向功能性叶酸运输系统，例如包含至少一个内源功能性膜结合叶酸受体的内源单向功能性叶酸运输系统是缺乏完全活性的，即是减弱的。此种减弱可以例如通过所讨论的内源叶酸运输系统，例如内源的功能性膜结合叶酸受体的任一类型诱变，例如通过点突变、基因破坏等提供。减弱可以是部分的或者完全的。在后者的情况下，根据本发明的真核细胞并不包含内源功能性单向功能性叶酸运输系统，例如内源的功能性膜结合叶酸受体。
根据一个实施方案，除了例如通过上述表达载体引入到所述宿主细胞中的异源功能性膜结合叶酸受体外，根据本发明的宿主细胞还包含至少一个内源功能性单向功能性叶酸运输系统，特别是一个或多个内源功能性膜结合叶酸受体。本发明的优点是，即使存在此种内源单向功能性叶酸运输系统，即其中保留了此种内源系统的情况下，仍可以使用本文所述的选择系统。由于在非选择性条件下使用用于目的产物的后续产生的各个宿主细胞，所以如果保留了内源系统且因此是有功能的，这将更易于操作。
因此，进一步优选的实施方案涉及本发明的宿主细胞，其包含至少一个内源单向功能性叶酸运输系统，其中此种内源单向功能性叶酸运输系统优选地包含至少一个内源功能性膜结合叶酸受体。在一个其优选的实施方案中，内源功能性膜结合叶酸受体选自叶酸受体α和叶酸受体β。
其他合适的组合是选择与作为第二选择标记(sm II)的突变DHFR组合的作为第一选择标记(sm I)的叶酸受体的方案，所述突变DHFR比在DHFR+(正)宿主细胞中内源表达的DHFR酶对DHFR抑制物例如MTX更不敏感。所述宿主细胞也可以是上文所述的RFC+(正)细胞。
也提供了用于产生如上所述的宿主细胞的方法，包括至少引入下述多核苷酸到所述宿主细胞中的步骤
(a)编码目的产物的多核苷酸；
(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；
(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同；
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响。
在现有技术中已知存在几种合适的方法用于将多核苷酸和表达载体引入到宿主细胞，包括真核宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞中。各个方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂转染、生物射弹和多聚体介导的基因转染。除常规的基于随机整合的方法外，也可以使用重组介导的方法以将编码目的产物的核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸转移到宿主细胞基因组中。此类重组方法可以包括使用位点特异的重组酶如Cre、Flp或ΦC31(参见例如Oumard等人，Cytotechnology(2006)50：93-108)，其可以介导转基因的定向插入。备选地，可以将同源重组的机制用于插入所述多核苷酸(综述于Sorrell等人，Biotechnology Advances 23(2005)431-469中)。基于重组的基因插入允许最小化包含在转移/引入到宿主细胞的异源核酸中的元件的数目。例如，可以使用已经提供了启动子和聚腺苷酸位点(外源的或内源的)的插入基因座，从而仅需要将剩下的元件(例如编码目的产物的多核苷酸、编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸和/或编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸)转移/转染到宿主细胞。上文详细描述了根据本发明的合适的表达载体或表达载体的组合以及合适的宿主细胞的实施方案；我们引用上面的公开。
上文详细描述了编码合适的选择标记(sm I)和(sm II)的多核苷酸以及它们的组合；我们引用上面的公开。根据一个实施方案，将根据本发明的表达载体或表达载体的组合引入到宿主细胞中。在上文和权利要求中详细描述了表达载体和表达载体的组合。
也提供了用于选择能表达目的产物的至少一种宿主细胞的方法，包括
(a)提供了多个宿主细胞，至少包含
(i)编码目的产物的引入多核苷酸；
(ii)编码第一选择标记(sm I)的引入多核苷酸；
(iii)编码第二选择标记(sm II)的引入多核苷酸；所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同；
其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响。
(b)在用于选择标记(sm I)和(sm II)选择的条件下培养所述多个宿主细胞，从而获得表达目的产物的宿主细胞。
如本文中所用，术语“挑选”或“选择”，特别指使用选择标记和选择性培养条件选择并因此获得已经掺入了根据本发明的载体或载体组合的宿主细胞的方法。因此，可以从转染的宿主细胞群体中分离和/或富集成功转染的宿主细胞。
与已经成功掺入了根据本发明的载体或载体组合的宿主细胞比较，没有成功掺入根据本发明的载体或载体组合的宿主细胞优选地在选择性培养条件下死亡或者是生长受损的。在选择期间，可以从转染宿主细胞的群体中将已经成功掺入了根据本发明的载体或载体组合的宿主细胞富集为库。在选择期间，也可以从转染的宿主细胞群体中分离个别的宿主细胞(例如通过克隆选择)。为了获得成功转染的宿主细胞的选择方法的合适实施方案(例如通过FACS分选术或有限稀释)是现有技术中熟知的并因此不需详细描述。
上文详细描述了特别针对选择标记(sm I)和(sm II)以及它们的组合的合适宿主细胞和特定实施方案。我们涉及上面的公开。
取决于所使用的宿主细胞和因此挑选的选择标记(sm I)和(sm II)，可以修改生长条件以对宿主细胞发挥选择压力。例如选择性培养基可以包含对挑选作为选择标记(sm I)和/或(sm II)的催化多肽的合适抑制物。当将DHFR用作为选择标记(sm II)时，例如可以使用叶酸拮抗物例如MTX以抑制DHFR的活性。取决于在培养基中所使用的所述抑制物的浓度(其也可以是逐渐增加的)，增加选择条件的严格性。此外，为了保持选择压力，培养基中不应当包含允许绕过选择标记(sm I)和/或(sm II)的足够量的代谢物。例如如果将DHFR用作为选择标记(sm II)，那么有利的是选择性培养基不包含有关的核苷酸。总而言之，应当控制，例如避免干扰所述选择策略的代谢物。
此外，在第一选择标记(sm I)是转运蛋白多肽的情况下，选择性培养基应当包含限制浓度的由第一选择标记(sm I)输入的对细胞生长必需的所述化合物，例如在第一选择标记(sm I)运输叶酸到宿主细胞中的情况下，所述化合物为叶酸。挑选此类选择性条件的原理在现有技术中是已知的，且也可以实验确定，并因此不需详细描述。在本文中也描述了特别适合用于快速培养悬浮细胞的叶酸和叶酸拮抗物的合适浓度。
可以同时应用用于选择标记(sm I)和(sm II)的选择条件。当使用最佳条件时，这增加了选择性压力并允许通过节约一个选择步骤加快选择过程。这缩短了用于获得合适的细胞系的时间。例如对于叶酸受体/DHFR选择标记组合，可以使用包含降低量的叶酸和包含DHFR的抑制物的生长培养基。合适的抑制物是叶酸拮抗物例如MTX。
在使用除(sm I)和(sm II)外还有其他选择标记的情况下，可以在应用选择标记(sm I)和/或(sm II)的选择条件之前(例如在预选择步骤中)或同时应用所述选择标记的选择条件。例如在将新霉素磷酸转移酶基因(neo)用作为其他选择标记的情况下，可以先将细胞培养在例如含有G418的培养基中，以选择已经掺入了根据本发明的表达载体或至少两个表达载体的组合的细胞。第一培养基也可以是已经对选择标记(sm I)或(sm II)的至少之一有选择性的。然后，应用选择标记(sm I)和/或(sm II)的选择条件。这种方法特别地用于选择标记(sm I)和/或(sm II)之一是可扩增的选择标记的情况。
如上所述，优选地，(sm I)是叶酸转运蛋白，特别是叶酸受体，并因此，本发明的一个实施方案是基于叶酸在细胞培养基中的有限可获得性。该系统将是可广泛应用的，并特别对于细胞成活依赖于叶酸摄取的真核细胞。该实施方案可以用于加快宿主细胞，特别是真核细胞，例如哺乳动物细胞克隆的选择、筛选和建立，所述细胞克隆优选地稳定表达高水平的重组产物。甚至，并且与其他已知的选择系统相反，对于例如由突变或敲除内源基因提供的修饰细胞，不存在必需的需求(尽管这有时是可行的)。因为例如FRα显示出对FA如RFC对甲酰四氢叶酸(Kt＝1μM)更高的亲和力(KD＝0.1nM)，并通过单向途径将维生素Bc运输到细胞中，所以，本发明特别地通过逐渐从生长培养基中除去叶酸(例如维生素Bc)，提供了将FRα和其他叶酸受体用作显著改进的显性代谢选择标记。这种基于叶酸的选择是极好的策略，其非常适用于在培养的哺乳动物细胞中快速地、稳定地且高水平地过量表达靶蛋白质。
由于靶向一种代谢途径的选择条件的加性效应/协同作用，使用两个在某种程度上相互依赖的，优选地参与共同的或一致的代谢过程或途径的选择标记(sm I)和(sm II)的本发明的策略具有获得非常高的严格性的优点。因此，显著增加了选择存活的细胞群体的生产性。实例显示，在选择方法后获得的宿主细胞以高产率产生目的产物。也增加了单个宿主细胞的平均生产性。因此，提高了以更低的筛选努力找到高生产者克隆的可能性。因此，根据本发明的选择系统要优于在现有技术中使用的选择系统。特别对于使用叶酸受体和DHFR酶作为选择标记(sm I)和(sm II)的优选组合，将获得与单独使用各个选择标记比较，具有更高生产性的宿主细胞。因此，由于选择条件的更高严格性，优化了选择方法。
根据本发明的选择方法也可以比现有技术中已知的常规选择策略更快和更有效地进行，因为，如果使用了最佳的细胞培养条件，可以在一个选择步骤中进行选择标记(sm I)和(sm II)的选择。
该方法可以额外地包括步骤：
(c)选择至少一个以想要的产率表达目的产物的宿主细胞。
可以将作为本发明的严格筛选/选择方法的结果获得的细胞一般地分离，并可以从原始细胞群体的非选择细胞中富集。可以将它们分离并培养为单个细胞。然而，也可以使用富集的细胞群体。也可以将获得的细胞用于一次或多次额外的选择轮次，任选地用于额外的定性或定量分析，或者可以用于例如研发用于蛋白质生产的细胞系。根据一个实施方案，可以将如上所述选择的生产宿主细胞的富集群体直接用作为用于以好的产率产生目的多肽的群体。
优选地，选择稳定表达目的产物的宿主细胞。上文详细描述了稳定转染/表达的优点。我们涉及上面的公开。
在一个用于选择的方法的最优选的实施方案中，多个宿主细胞包含根据本发明即如在本文中所公开的宿主细胞。我们涉及以上详细公开，特别涉及合适的选择标记(sm I)和(sm II)以及它们的组合。
上文详细描述了特别与宿主细胞和表达载体、表达载体的各个组合有关的其他优选的实施方案。我们涉及上面的公开。
优选地，第一选择标记(sm I)是能将叶酸运输入宿主细胞的转运蛋白/受体。根据本发明的选择系统的该实施方案并不需要在转染前基因组缺失或减弱内源叶酸受体α、β或γ基因，并因此可应用于任一受体细胞，即使当存在一些内源叶酸受体基因表达时(参见上文)。其关键的优点是基于叶酸受体α转染后，细胞可以暴露于从生长培养基中突然并严重丧失叶酸(例如维生素Bc)的事实。结果，只有表达显著量的叶酸受体α选择标记的转染细胞可以运输足够的叶酸以维持DNA复制和细胞增殖。这发生在不存在内源叶酸受体α基因的表达有任何显著升高的情况下。此外，由于通过增加表达叶酸摄取的备选途径，包括增加表达内源RFC，减轻了选择压力，所以根据本发明的选择系统的该实施方案并不会经历选择严格性的丢失。这种重要的优点归因于尽管叶酸受体α对于维生素Bc具有显著的亲和力(Kd＝0.1nM)，但RFC对维生素Bc显示出非常差的亲和力(Km＝0.2-0.4mM)的事实。
当(sm II)是DHFR或者核酸合成途径或特别是叶酸代谢的另一种酶时，选择性培养基额外地含有各个酶的抑制物，例如叶酸拮抗物例如MTX，以提供选择条件。
在至少一个选择步骤中使用的选择性培养基可以包含一种或多种类型的叶酸。宿主细胞能吸收并加工以限制浓度包含于选择性培养基中的叶酸。宿主细胞不会加工的叶酸和特别地叶酸的衍生物不会有助于选择压力并因此不会有助于限制浓度。选择性培养基可以具有一种或多种以下特征：
(a)它包含限制浓度的叶酸，优选地以约500nM或更低、约250nM或更低、约150nM或更低、约100nM或更低、约75nM或更低、约50nM或更低、约25nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低或者直到约2.5nM的浓度，并且其中所述叶酸优选地是维生素Bc；和/或
(b)它包含以约500nM或更低、约250nM或更低、约150nM或更低、约100nM或更低、约75nM或更低且优选地约50nM或更低的维生素Bc；和/或
(c)它包含DHFR抑制物；和/或
(d)它包含叶酸拮抗物；和/或
(e)它包含以约500nM或更低、约350nM或更低、约200nM或更低，优选地约150nM或更低的浓度的叶酸拮抗物；和/或
(f)它包含MTX作为叶酸拮抗物；和/或
(g)它包含以约350nM或更低、约200nM或更低，优选地约150nM或更低的浓度的MTX；和/或
(h)它包含维生素Bc，其浓度多达100nM，优选地多达50nM，和等摩尔浓度直到20倍的叶酸拮抗物。
叶酸和特别地维生素Bc的优选浓度选自：
(a)约500nM-100pM；
(b)约250nM-1nM；优选地约250nM-2.5nM或者约250nM-5或10nM；
(c)约150nM-1nM；优选地约150nM-2.5nM或者约150nM-5或10nM；
(d)约100nM-1nM；优选地约100nM-2.5nM或者约100nM-5或10nM；
(e)约75nM-1nM；优选地约75nM-2.5nM或者约75nM-5或10nM；
(f)约50nM-1nM；优选地约50nM-2.5nM或者约50nM-5或10nM；
(g)约50nM-12.5nM；和
(h)约25nM-2.5nM或者约25nM-5nM。
叶酸拮抗物和特别地MTX的优选浓度选自：
(a)约500nM-5nM；
(b)约350nM-5nM；
(c)约200nM-5nM；
(d)约100nM-10nM；
(e)约50nM-10nM；和
(f)约50nM。
上述的叶酸和叶酸拮抗物的优选浓度和浓度范围可以相互组合。在一个实施方案中，使用与10nM-100nM的叶酸拮抗物浓度组合的约12.5nM-50nM的叶酸浓度。如所述，优选地将维生素Bc用作为叶酸，并将MTX作为叶酸拮抗物。
此外，也发现，使用的叶酸和叶酸拮抗物浓度可以相互影响。因此，除叶酸和叶酸拮抗物的绝对浓度外，比率也可以成为用于提供合适选择条件的因素。叶酸拮抗物(优选地MTX)的浓度可以多达叶酸(优选地维生素Bc)浓度的约20倍。叶酸拮抗物(优选地MTX)浓度可以是叶酸(优选地维生素Bc)浓度的约10倍。优选地，选择性培养基包含以1∶10至10∶1的浓度比率，优选地以1∶5至5∶1的浓度比率的叶酸和叶酸拮抗物。如果使用大致等摩尔浓度的叶酸和叶酸拮抗物，那么可以得到非常好的结果。如实施例所示，这些比率提供了非常合适的选择培养条件以获得高产宿主细胞。上述选择性培养基也有助于本发明的单个元件，因为本发明也提供了适用于选择根据本发明方法的宿主细胞的各个选择性培养基。
上述浓度特别适用于快速培养悬浮细胞，所述悬浮细胞是用于商业生产细胞系的优选表型。然而，不同的细胞系可能具有不同的维生素Bc消耗特性。此外，限制浓度可以依据所使用的叶酸、各个叶酸拮抗物而变化。因此，叶酸，特别是维生素Bc和叶酸拮抗物，特别是MTX，以及合适的维生素Bc与MTX的比率可以依据所挑选的宿主细胞和叶酸、各个叶酸拮抗物而不同。然而，技术人员可以容易地实验确定合适浓度。
根据一个实施方案，在转染和/或选择前，将宿主细胞预培养于无叶酸培养基或包含限制浓度的叶酸的培养基中。上文描述了叶酸的合适限制浓度。优选地，用于预培养宿主细胞的所述培养基包含叶酸，特别是50nM或更低浓度的维生素Bc。
如上所述，可以将根据本发明的选择方法与现有技术中已知的基于流式细胞术的选择方法组合。因此，根据一个实施方案，在根据本发明的方法选择宿主细胞后，进行涉及流式细胞术的选择步骤，以选择以高产率表达目的产物的宿主细胞。为此，优选地将至少一部分目的产物表达为在宿主细胞的细胞表面展示的膜锚定融合多肽。基于展示的融合多肽的量，可以使用流式细胞术，优选地使用FACS选择以高产率表达目的产物的宿主细胞。
根据一个优选的实施方案，目的多核苷酸因此表达自
a)表达盒，其至少包含
aa)编码目的产物的多核苷酸，
bb)在编码目的产物的多核苷酸的下游的至少一个终止密码子，和
cc)在终止密码子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的多核苷酸；
或
b)表达盒，其至少包含
aa)编码目的产物的多核苷酸，
bb)包含5’剪接供体位点和3’剪接受体位点并包含框内翻译终止密码子和多腺苷酸化信号的内含子和
cc)在所述内含子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的多核苷酸。
上文描述了有关这些表达盒的设计的细节。其引用各个公开。对于选择，培养宿主细胞以允许目的产物的表达，从而将至少一部分目的产物表达为包含膜锚的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主细胞的表面，并且其中至少一个宿主细胞是基于展示在细胞表面上的融合多肽的量选择的。如上所讨论，优选地使用流式细胞仪，特别地FACS选择宿主细胞。如在实施例中所示，根据本发明的选择方法与基于各个流式细胞术的选择方法的组合是非常有利的，并且鉴定了具有非常高的表达率的宿主细胞。
根据一个实施方案，本发明也提供了包含限制浓度的叶酸和叶酸拮抗物的选择性培养基。如上所述，宿主细胞能摄取并加工以限制浓度包含在选择性培养基中的叶酸。宿主细胞不会加工的叶酸和特别地叶酸的衍生物不会有助于选择压力并因此不会有助于限制浓度。对于与本发明所述的选择方法结合使用的选择性培养基，特别地对于包含在培养基和优选的实施方案中的叶酸和叶酸拮抗物的浓度，所述选择性培养基优选地具有一个或多个上述特征。上文也详细描述了所述优点。其涉及也在此处应用的以上公开。所述选择培养基可以与本发明的选择系统结合使用。
也提供了用于产生目的产物的方法，包括根据本发明培养宿主细胞和/或根据本发明的教导在允许表达目的产物的条件下选择宿主细胞的步骤。
使用根据本发明的宿主细胞用于产生目的产物，特别地多肽具有可以以非常高的产率产生目的产物的优点。当将根据本发明的选择方法进行选择用于表达的合适宿主细胞的时候，这是特别有利的。因此，本发明提供了用于产生目的多肽的改进方法。上文描述了合适的宿主细胞；我们涉及上面的公开。
可以通过破坏宿主细胞获得表达的目的产物。也可以将多肽表达，例如分泌到培养基中，并可以从中获得多肽。各个方法的组合也是可以的。因此，可以以高产率有效地产生和获得/分离产物，特别地多肽。也可以将获得的产物进行进一步的加工步骤例如纯化和/或修饰步骤以产生所需质量的目的产物。根据一个实施方案，在无血清条件下培养所述宿主细胞。
用于产生目的产物的方法可以包括至少一个以下步骤：
-从所述细胞培养基和/或从所述宿主细胞中分离目的产物；和/或
-加工分离的目的产物。
通过本领域已知的方法，可以回收、进一步纯化、分离和/或修饰根据本发明产生的目的产物，例如多肽。例如，可以通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、抽提或沉淀，从营养培养基中回收产物。可以通过本领域已知的多种方法，包括但不限于层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、色谱聚焦层析和大小排阻层析)、电泳方法(例如制备型等点聚焦电泳)、差异溶解(例如硫酸铵沉淀)或者提取进行纯化。
目的产物可以是能通过转录、翻译或者表达编码所述多核苷酸的基因信息的任一其他事件产生的任一生物产物。在这方面，产物可以是表达产物。目的产物可以选自多肽和核酸，特别地RNA。产物可以是药学的或治疗的活性化合物、或者是用于测定法中的研究工具等。在一个特别优选的实施方案中，产物是多肽，优选地，药学的或治疗的活性多肽、或者是用于诊断或其他测定法中的研究工具等。因此，多肽并不限于任一具体的蛋白质或蛋白质组，但相反，可以是期望的由本文所述的方法选择和/或表达的任一大小、功能或来源的任一蛋白质。因此，可以表达产生几种不同的目的多肽。术语多肽指包含通过肽键连接在一起的氨基酸的多聚体的分子。多肽包括任一长度的多肽，包括蛋白质(例如具有50个以上的氨基酸)和肽(例如2-49个氨基酸)。多肽包括任一活性或生物活性的蛋白质和/或肽，包括例如生物活性多肽例如酶促蛋白质或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体蛋白质或肽、转运蛋白质或肽、杀菌的和/或内毒素结合的蛋白质、结构蛋白质或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。所述多肽可以选自肽激素、白细胞介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白，特别地抗体或功能性抗体片段或者它们的变体。在一个最优选的实施方案中，多肽是免疫球蛋白分子或抗体、或者它们的功能性变体，例如嵌合的、或者部分或完全人源化的抗体。此种抗体可以是诊断性抗体、或者药学的或治疗的活性抗体。
如在上文和权利要求中所定义，也提供了通过根据本发明的方法获得的产物。所述产物优选地是多肽，特别地免疫球蛋白分子或其功能性片段。
本发明的其他方面涉及与第二选择标记(sm II)组合的第一选择标记(sm I)的用途，用于选择能表达目的产物的宿主细胞，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响。
第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)可以至少具有以下特征之一：
(a)第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)参与的代谢过程或途径选自
(aa)核酸合成和/或多肽合成；
(ab)核苷酸合成和/或氨基酸合成；和
(ac)叶酸代谢；和/或
(b)第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)是催化多肽或转运蛋白多肽；和/或
(c)第二选择标记(sm II)是催化多肽，其加工
(ca)底物，所述底物是由第一选择标记(sm I)输入到宿主细胞中的化合物或者获自所述掺入的化合物的后续产物和/或
(cb)通过第一选择标记(sm I)的活性产生的底物或者其前体；和/或
(d)第一选择标记(sm I)在第二选择标记(sm II)的上游发挥作用；和/或
(e)第一选择标记(sm I)是或包含将参与细胞成活和/或增殖和/或对于细胞成活和/或增殖必需的化合物输入到宿主细胞的转运蛋白多肽；和/或
(f)第一选择标记(sm I)将至少一种叶酸运输/掺入到宿主细胞中；和/或
(g)第一选择标记(sm I)是或包含功能性膜结合叶酸受体；和/或
(h)第二选择标记(sm II)是加工底物的催化多肽，所述底物是叶酸和/或获自叶酸的后续产物；和/或
(i)第一选择标记(sm I)是功能性膜结合叶酸受体，其是或包含具有一个或多个以下特征的叶酸受体：
(ia)叶酸受体选自叶酸受体α、叶酸受体β、叶酸受体γ和前述的功能性变体，和/或
(ib)叶酸受体是人叶酸受体或其功能性变体，和/或
(ic)叶酸受体是人叶酸受体α或其功能性变体，和/或
(id)叶酸受体是具有或包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.1、2或3的叶酸受体或者前述的功能性变体；和/或
(j)选择标记(sm I)和/或(sm II)是或者包含参与核酸合成和/或叶酸代谢的催化多肽，优选地DHFR，或者其功能性变体或片段；和/或
(k)第一选择标记(sm I)是或者包含将参与和/或对核酸合成必须的化合物掺入到宿主细胞的转运蛋白多肽，和第二选择标记(sm II)是参与核酸合成的催化多肽；和/或
(I)第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)是真核选择标记；和/或
(m)第一选择标记(sm I)和/或第二选择标记(sm II)是可扩增的选择标记。
上文描述了这些实施方案的细节、组合和优点。我们涉及上面的公开。特别优选的是叶酸转运蛋白例如叶酸受体与DHFR或者其功能性变体或衍生物的组合。
在本文中提及的文本和文件的全部内容在此处引用作为参考，并因此成为本公开的一部分。
以下实施例用于说明本发明，并非以任一方式限制其范围。具体而言，实施例涉及本发明的优选实施方案。
实施例
一般而言，合适的材料，例如试剂，对技术人员是熟悉的、商业可得到的并可以根据厂商说明书使用。实施例根据所描述的说明执行。
1.实施例1-选择
使用具有相同目的蛋白质(单克隆抗体)但不同选择标记组合的同一表达盒的载体在CHO细胞中进行共转染实验。该实验显示，在细胞培养基中，MTX和限制维生素Bc浓度的组合选择允许产生高过量表达的目的产物，此处为免疫球蛋白分子的细胞群体，并且与仅使用DHFR或叶酸受体α(FoIR)作为代谢选择标记的策略比较，这些群体的生产性更高。
1.1.材料和方法
1.1.1.载体构建
VECTOR I含有DHFR(用于dhfr+(正)细胞系的突变体)表达盒。所述质粒载体(VECTOR I)适用于在真核细胞，特别地CHO细胞中表达，包含：
(i)包含编码重链的多核苷酸的表达盒和编码IgG1型分泌的重组人抗体的轻链的表达盒。重组抗体的表达在CMV启动子和标准的(SV40)多腺苷酸化信号的控制下；
(ii)包含编码DHFR(具有对MTX较低敏感性的突变形式)作为选择标记基因(sm II)的多核苷酸的独特表达盒。DHFR的表达在SV40启动子和标准的(SV40)多腺苷酸化信号的控制下。
质粒载体(VECTOR II)包含代替DHFR的人类维生素Bc受体α作为第一选择标记(sm I)。因此，两种载体都含有G418抗性基因(neo)，但不同的其他标记，即DHFR或人叶酸受体α。VECTOR I和VECTOR II包含以下主要元件：
  VECTOR I的元件   VECTOR II的元件
  CMV启动子/增强子   CMV启动子/增强子
  RK-内含子   RK-内含子
  编码抗体轻链的多核苷酸   编码抗体轻链的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点   SV40聚腺苷酸位点
  CMV启动子/增强子   CMV启动子/增强子
  RK-内含子   RK-内含子
  编码抗体重链的多核苷酸   编码抗体重链的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点   SV40聚腺苷酸位点
  SV40增强子/启动子   SV40增强子/启动子
  新霉素抗性基因   新霉素抗性基因
  合成的聚腺苷酸位点   合成的聚腺苷酸位点
  氨苄青霉素抗性基因   氨苄青霉素抗性基因
  SV40启动子   SV40启动子
  编码DHFR(突变体)的多核苷酸   huFolR
  SV40内含子片段
  SV40聚腺苷酸位点   SV40聚腺苷酸位点
1.1.2.CHO细胞的转染和选择
在摇瓶中，使用悬浮生长的CHO细胞在常规培养基中实施细胞培养、转染和筛选。为了降低宿主细胞中胞内维生素Bc储备并防止维生素Bc从预培养的培养基共转移到选择性培养基中，在转染和选择前，将细胞传代到无维生素Bc的培养基或具有降低的维生素Bc含量(例如50nM)的培养基中。
通过电穿孔用VECTOR I和VECTOR II共转染细胞。取决于细胞成活，在转染后24-48小时，通过将含G418和10nM维生素Bc的选择性培养基加入细胞来开始第一选择步骤。当细胞恢复到80％以上的成活时，通过将细胞传代到含100nM MTX和10nM维生素Bc的无G418培养基中来应用第二选择步骤。如果细胞在更严格的条件下没有恢复，那么维生素Bc浓度可以增加到20nM并随后到100nM。可以观察到那些没有生长但是增加了成活的库。将细胞转移到含11.3μM维生素Bc且无MTX的培养基中。在该转移后，将开始生长的共转染细胞群体扩大用于进一步分析。
1.1.3.库生产性的确定
在第一次和最终选择步骤后，在含11.3μM维生素Bc、无G418和MTX的培养基中，通过过度生长的摇瓶分批培养物分析选择的细胞群的生产性。
将分批培养物接种于具有50ml工作体积的摇瓶125中，并在摇动箱(未加湿的)中以150转/分钟和10％CO2培养。当开始测定时，细胞的成活必须＞90％。接种的细胞密度大约为2x105个细胞/mL。在第13天进行滴度测定。在开始培养后13天，通过A蛋白HPLC测定细胞培养上清中的抗体滴度。
1.2.结果
为了显示使用DHFR和FolR作为选择标记的选择策略的有效性，进行了编码DHFR(VECTOR I)和FolR(VECTOR II)以及同一单克隆抗体的载体的共转染。两种载体都含有G418抗性基因(参见上文)。
1.2.1.第一选择步骤
首先，通过添加G418和降低至10nM浓度的维生素Bc选择已转染的细胞群体。这种最初的预选择步骤有助于在第二选择步骤中应用更严格的选择条件前，杀死未转染的细胞并平行地迫使细胞消耗其胞内的维生素Bc储备。在这些第一选择条件下，通常恢复了所有的转染细胞群体，并且如材料和方法中所述来进行生产性评估。在摇瓶分批培养物中分析在含G418和10nM维生素Bc的培养基中选择的转染细胞。在培养第13天，获取培养基的样品并通过A蛋白HPLC分析抗体含量。表1总结了在各个实例中获得的生产性结果。
  载体   VECTOR I(dhfr)和VECTOR II(FolR)
  库编号   mg/L
  1   53
  2   42
  3   62
  4   66
  5   47
表1：在无MTX的第一次选择步骤后细胞群体的生产性
所有细胞群体都产生抗体。用与DHFR载体(VECTOR I)组合的FolR载体(VECTOR II)转染的细胞比常规的现有技术方法(例如仅DHFR)以更高的平均生产性对选择应答。在培养基中限制的维生素Bc含量促进了过量表达FolR的细胞的生长。
1.2.2.第二选择步骤
为了增加选择严格性，下一个步骤将除去G418但将100nM MTX加入到培养基中并保持维生素Bc浓度为10nM。在这些条件下，所有转染群体细胞的成活都急剧地下降并维持在较低的水平。此外，通常检测不到细胞生长。通过首先将维生素Bc含量增加到20nM并然后到100nM，可以降低选择压力。为了推动用于生产性评估的选择群体的生长，可以将恢复的活细胞转移到没有MTX并具有11.3μM维生素Bc的培养基中。分开地维持来自双转染的一个已经部分恢复的库并且在含100nM维生素Bc的培养基中，同时合并每一载体组合的其他库以增加细胞密度并从而增加存活的机会。进一步扩大快速生长的双转染细胞并分析生产性。表2显示了结果：
  载体   VECTOR I(dhfr)和VECTOR II(FolR)
  库编号   mg/L
  1   1110
  2-5   524
表2：第二次选择步骤后细胞群体的生产性
通过添加100nM MTX和逐渐增加的维生素Bc浓度，进一步选择G418和10nM维生素Bc选择的细胞群体。最后，将细胞转移到无MTX并含11.3μM维生素Bc的培养基中，并在摇瓶分批培养物中分析恢复的群。在培养的第13天，获取培养基的样品并通过A蛋白HPLC分析抗体含量。
在该选择过程后，双转染的细胞群体的生产性令人惊奇的高。与第一选择步骤比较，在库1达到1g/L的情况下，抗体滴度增加了大约20倍，并且在合并库2-5的情况下，增加了大约10倍。此外，与使用例如与G418组合的仅DHFR作为选择标记的更加强优化的选择方法比较，双选择后，发现用根据本发明的载体组合的生产性更高。使用DHFR/G418组合用于相同的抗体的先前实验产生了相对较低的混合滴度(pool titer)。
因此，使用DHFR和FolR作为选择标记的组合选择产生了高度过量表达目的蛋白质的细胞。该组合也要优于现有技术中的选择系统(例如DHFR/G418)。
2.实施例2：选择条件的优化
2.1.转染、选择和克隆特征
2.1.1.转染和选择
对于选择条件的优化，在两个顺序的选择步骤中测试了维生素Bc和MTX浓度的其他组合。首先，在含0.8g/L G418的培养基中，将浓度为12.5nM、25nM、50nM和11.3μM(参照)的维生素Bc浓度与2.5nM、5nM或10nM MTX或者没有MTX组合。在第二选择步骤中，将在这些条件下恢复的细胞群体转移至含有与第一选择步骤相同的维生素Bc浓度但10倍更高的MTX浓度的无G418培养基中。根据DHFR选择标准方法，将参照细胞转移至含500nM MTX的培养基中。
2.1.2.克隆和克隆表征
对通过以每孔0.5个细胞的密度有限稀释接种在96孔板中的细胞进行克隆。随后，将细胞首先扩大到24孔板，并然后到摇瓶中用于生产性筛选。
使用不同的形式，在分批和补料分批实验中分析克隆的生产性。通过将细胞接种于摇动的24孔板中，在24孔板分批测定法中进行初步筛选。在开始培养后10天，通过定量A蛋白-HPLC测定细胞培养上清中的抗体滴度。随后在摇瓶模型中以分批和补料分批模式分析最高产的克隆。将在含11.3μM维生素Bc的培养基中的分批培养物以100mL或50mL的工作体积接种到摇瓶(500mL或250mL容积)中，并以150转/分钟、36.5℃和10％CO2培养于摇动箱(未加湿的)中。当开始测定时，细胞的成活应＞90％。接种的细胞密度是2x105个细胞/mL。抗体滴度、细胞数目和成活可以在定义的培养时间点测定。使用相同的条件，但具有4x105个细胞/mL的起始细胞密度，并在活细胞密度在7x106个细胞/mL以上时开始定时的添加补料，进行补料分批实验。通过培养细胞一直到19周来评价克隆稳定性，同时，大约每两周使用摇瓶分批模型进行生产性测量。
2.2.结果
2.2.1.第一选择步骤
在第一选择步骤中以与从2.5nM至10nM的MTX浓度组合的从12.5nM至50nM的维生素Bc浓度选择转染的细胞。作为参照，也测试了11.3μM维生素Bc(FA)。在第一选择步骤后获得的生产性总结于表3中。
Figure BDA0000086458330000491
表3：在以维生素Bc和MTX浓度的不同组合的第一选择步骤后细胞的生产性。所有数值都是mg/L。
发现在以10nM MTX的选择后，获得了最高的产率。用VETCOR I和VECTOR II共转染的细胞生产了数量惊人的大量产物(多达887mg/L)。这显著地多于仅用DHFR转染的细胞的生产性(仅dhfr参照)。
2.2.2.第二选择步骤
通过将细胞转移到无G418的培养基、保持第一选择步骤的维生素Bc浓度但增加MTX浓度10倍，将第二选择步骤应用于恢复的群体。分析了在这些条件下恢复的细胞群体的生产性。结果总结于表4中。
Figure BDA0000086458330000492
Figure BDA0000086458330000501
表4：以维生素Bc和MTX浓度的不同组合在第二选择步骤后细胞的生产性。所有数值都是mg/L。
令人惊奇地，发现在合适的选择条件下，与仅用VECTOR I转染的细胞比较，用VETCOR I和VECTOR II和因此根据本发明的组合转染的细胞具有更高的生产性(多达1.5g/L)。这显示，DHFR和FolR的组合作为选择标记提供了高度增加的选择严格性。因此，本发明提供了超越现有技术的巨大改进。
2.2.3.克隆生产性的比较
选择后，通过从共转染的库中有限稀释克隆来产生克隆。将在24孔板筛选中鉴定的最高产克隆进一步扩大至摇瓶。在过度生长的摇瓶分批测定法中分析生产性，并与在先前的实验中用分别的载体获得的最高克隆的结果比较。
Figure BDA0000086458330000502
表5：来自有限稀释克隆化的前5株克隆在摇瓶分批模型中的生产性。所有数值为在培养第13-15天时抗体的g/L。
通过共转染含有dhfr和folR作为选择标记的载体，并通过在有限的维生素Bc浓度力MTX下选择转染细胞获得最高产的克隆。
2.2.4.克隆生产稳定性的分析
从解冻小管开始，直到19周期间测定前10株dhfr/folR共转染的且已选择的克隆的克隆生产稳定性，并在解冻后第5周进行第一次生产性评估。在以50nM维生素Bc和50nM MTX的选择条件下培养细胞。用含11.3μM维生素Bc的培养基进行生产性测定。
  克隆   第5周   第8周   第12周   第15周   第17周   第19周
  6A8   1070   1230   1040   924   980   987
  7F2   1090   1140   1120   971   975   1060
  7F7   1120   1240   1140   904   917   937
  9C4   1110   1200   1030   769   560   573
  9G12   1150   1240   1140   938   775   538
  9H9   1100   1150   1130   969   1000   1040
  10D3   1140   1130   1090   1020   1040   1090
  10G10   1060   1180   1080   987   1080   1080
  10H5   1100   1240   1170   1050   1140   1190
  10H8   1050   1120   1140   1050   1020   1170
表6：来自有限稀释克隆化的前10株克隆在摇瓶分批模型中的克隆生产稳定性。所有数值为在培养第13-15天时抗体的mg/L。
分析的10个克隆中的8个克隆显示出在19周期间的高生产稳定性，并且全部十株克隆都显示出在12周期间的足够稳定性。
3.实施例3-使用组合载体和FACS分选术的选择
3.1.载体构建
产生了在一个骨架上含有选择标记DHFR和FolR的VECTOR III，其也允许使用FACS分选术的进一步选择。所述VECTOR III包含用于表达抗体重链的表达盒，其包含“遗漏的”终止密码子和免疫球蛋白跨膜锚。如在上面的说明书中所述，表达盒的这种设计具有(由于翻译的连读过程)将一部分抗体产生为锚定在宿主细胞的细胞表面的融合蛋白的作用。VECTOR III包含以下主要元件：
  VECTOR III的元件
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体轻链的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体重链的多核苷酸
  终止密码子(遗漏的)
  编码包括胞质结构域的免疫球蛋白跨膜锚的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  SV40增强子/启动子
  编码huFolR的多核苷酸
  合成的聚腺苷酸位点
  氨苄青霉素抗性基因
  SV40启动子
  编码DHFR(突变体)的多核苷酸
  SV40内含子片段
  SV40聚腺苷酸位点
将这种DHFR/FolR-FACS载体(VECTOR III)与DHFR-FACS参照载体比较，所述DHFR-FACS参照载体含有neo基因作为第二选择标记(VECTOR IV)。VECTOR IV包含以下主要元件：
  VECTOR IV的元件
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体轻链的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体重链的多核苷酸
  终止密码子(遗漏的)
  编码包括胞质结构域的免疫球蛋白跨膜锚的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  SV40增强子/启动子
  新霉素抗性基因
  合成的聚腺苷酸位点
  氨苄青霉素抗性基因
  SV40启动子
  编码DHFR(突变体)的多核苷酸
  SV40内含子片段
  SV40聚腺苷酸位点
此外，对于使用两种表达载体和FACS分选术的共转染实验，产生的VECTOR V不包含DHFR基因，但包含neo基因和huFolR。VECTOR V包含以下主要元件：
  VECTOR V的元件
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体轻链的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  CMV启动子/增强子
  RK-内含子
  编码抗体重链的多核苷酸
  终止密码子(遗漏的)
  编码包括胞质结构域的免疫球蛋白跨膜锚的多核苷酸
  SV40聚腺苷酸位点
  SV40增强子/启动子
  新霉素抗性基因
  合成的聚腺苷酸位点
  氨苄青霉素抗性基因
  SV40启动子
  huFolR
  SV40聚腺苷酸位点
3.2.选择、克隆和克隆表征
将用组合VECTOR III转染的细胞在含12.5nM维生素Bc和5nMMTX的培养基中选择。将用参照质粒转染的细胞在含12.5nM维生素Bc、5nM MTX和0.8g/L G418的培养基中选择。在第二选择步骤中，将FACS富集周期后应用的MTX浓度增加至50nM，而将维生素Bc浓度保持恒定并除去G418。在摇瓶分批培养中筛选恢复的细胞群体(库)的生产性。
细胞的FACS分析、富集和克隆化
细胞的标记：将每个转染库中的2x10E7个细胞离心并用5mL的冷PBS洗涤，并重悬于1mL的冷PBS中。加入合适量的FITC标记的抗IgG抗体(供给物)到细胞中，并在冰上暗处温育30分钟。随后，将细胞用5mL PBS室温洗涤两次、重悬在1mL PBS中、过滤并分散到FACS管中用于分析、分选和克隆化。用装配了Automatic Cell Deposition Unit(ACDU)的FACSAria(Becton Dickinson)，使用FACSDiva软件进行细胞分选。将调整到488nm的低功率气冷固态激光器(
Figure BDA0000086458330000541
SapphireTM solide state)用于激发与第二抗体结合的荧光染料。通过530/30BP滤光片在E检测器上测量相对FITC荧光强度。门控(gated)5％的最高FITC荧光细胞并进行批量分选或者以单个细胞分选入96孔板。
通过有限稀释来自FACS富集的库或者通过FACS克隆化来自富集的或非富集的库产生克隆。
抗体产生和克隆稳定性的测定
使用不同的形式，在分批和补料分批实验中分析克隆的生产性。通过将细胞接种于摇动的24孔板中，在24孔板分批测定法中进行初步筛选。在开始培养后10天，通过定量A蛋白-HPLC测定细胞培养上清中的抗体滴度。随后在摇瓶模型中以分批和补料分批模式分析最高产的克隆。将在含11.3μM维生素Bc的培养基中的分批培养物以100mL或50mL的工作体积接种到摇瓶(500mL或250mL容积)中，并以150转/分钟、36.5℃和10％CO2培养于摇动箱(未加湿的)中。当开始测定时，细胞的成活应＞90％。接种的细胞密度是2x105个细胞/mL。抗体滴度、细胞数目和成活可以在定义的培养时间点测定。使用相同的条件，但以4x105个细胞/mL的起始细胞密度，并在活细胞密度超过7x106个细胞/mL时开始定时的添加补料，来进行补料分批实验。通过培养细胞一直到19周来评价克隆稳定性，同时，大约每两周使用摇瓶分批模型进行生产性测量。
3.3.结果
如上所述产生并选择了用DHFR/FolR组合载体(VECTOR III)转染的5个细胞群体和用参照载体(VECTOR IV)转染的3个细胞群体。恢复的细胞库在摇瓶分批培养物中的生产性总结于表5中。
Figure BDA0000086458330000551
表7：在一次选择步骤后，用DHFR/FolR组合载体或DHFR/Neo载体(参照)转染的细胞的生产性。所有数植为mg/L。
使用DHFR/FolR组合载体(VECTOR III)在仅一次选择步骤后，产生了令人惊奇的良好生产性。
通过应用FACS富集周期和用10倍增加的MTX浓度进一步处理库。也获得了非常高的库生产性，从而组合载体与共转染方法的作用一样好(参见表8)。
Figure BDA0000086458330000561
表8：摇瓶分批模型：在第二选择步骤后FACS富集的库(50nMMTX)。所有数值为mg/L。
通过有限稀释来自FACS富集的库产生克隆，并扩大到24孔板用于最初的筛选。将最好的生产者进一步扩大到摇瓶。在摇瓶分批培养物中分析生产性，并与在先前的实验中用通过FACS克隆化的dhfr参照载体获得的最高克隆的结果比较。
用组合VECTOR III转染的克隆在摇瓶分批模型中的生产性显著地高于用仅包含DHFR基因的参照VECTOR IV转染的克隆的生产性(参见表9)。
Figure BDA0000086458330000562
表9：摇瓶分批模型：参照dhfr载体(VECTOR IV)和组合载体(VECTOR III)的最高5个克隆。所有数值为g/L。
通过解冻冷藏的小管并在摇瓶分批模型中监测生产性来进一步分析用VECTOR III转染的克隆的克隆生产稳定性。监测从解冻后5周至解冻后19周的生产性，并与冷藏前的生产性比较。将克隆在选择条件下培养，而在具有高维生素Bc含量(11.3μM)的培养基中进行摇瓶分批培养。
表10：克隆生产稳定性的分析
12个分析的克隆中仅一个克隆在19周期间显示出超过25％的生产性丢失，全部其他克隆都显示出高生产稳定性。
IV.实施例4-用转染的CHO细胞大规模产生多肽
可以在例如波生物反应器、玻璃生物反应器或不锈钢生物反应器中进行多肽的大规模产生。为此目的，通常从单个冷冻小瓶，例如来自主细胞库(Master Cell Bank)的小瓶起始扩大细胞。解冻细胞并通过几个步骤扩大。用适量细胞接种不同规模的生物反应器。可以通过向生物反应器中加入补料溶液和添加剂来提高细胞密度。使细胞在延长的时间保持高成活。在大规模条件下，反应器中的产物浓度为几百毫克每升到多达几克每升。可以通过标准层析方法进行纯化，其可以包括亲和、离子交换、疏水相互作用或大小排阻层析步骤。生物反应器的大小在最终规模中可以高达几千升体积(也参见例如F.Wurm，Nature Biotechnology Vol.22，11，2004，1393-1398)。
Figure IDA0000086458390000011
Figure IDA0000086458390000021
Figure IDA0000086458390000041
Figure IDA0000086458390000051
Figure IDA0000086458390000061

Claims (20)

1.表达载体或至少两个表达载体的组合，其至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；
(b)编码第一选择标记的多核苷酸；
(c)编码第二选择标记的多核苷酸，所述第二选择标记与第一选择标记不同，
其中所述第一或第二选择标记的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记参与叶酸代谢并且其中所述第一选择标记是叶酸转运蛋白并且所述第二选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）。
2.根据权利要求1所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记是叶酸受体和所述第二选择标记是DHFR酶，所述DHFR酶比野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达的DHFR酶对MTX更不敏感。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记是人叶酸受体。
4.根据权利要求1或2所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记是由SEQ.ID.NO.1、2或3的氨基酸序列组成的叶酸受体。
5.根据权利要求1或2所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述编码目的产物的多核苷酸包含于表达盒中，所述表达盒至少包含
(a)编码目的产物的多核苷酸，
(b)在编码目的产物的多核苷酸的下游的至少一个终止密码子，和
(c)在终止密码子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的多核苷酸。
6.宿主细胞，其至少包含
(a)编码目的产物的引入多核苷酸；
(b)编码第一选择标记的引入多核苷酸；
(c)编码第二选择标记的引入多核苷酸，所述第二选择标记与第一选择标记不同，
其中所述第一或第二选择标记的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记参与叶酸代谢并且其中所述第一选择标记是叶酸转运蛋白并且所述第二选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其具有一个或多个以下特征：
a)已经将根据权利要求1至5中至少一项所述的表达载体或至少两个表达载体的组合引入到所述宿主细胞中；
b)宿主细胞是CHO细胞；和／或
c)宿主细胞是DHFR+（正）细胞，并且所述第一选择标记是叶酸受体和所述第二选择标记是DHFR酶，所述DHFR酶比野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达的DHFR酶对MTX更不敏感。
8.权利要求7的宿主细胞，其中b)中的宿主细胞是DHFR+（正）细胞。
9.用于产生根据权利要求6或7所述的宿主细胞的方法，其包括至少将以下多核苷酸引入到所述宿主细胞中的步骤
(a)编码目的产物的多核苷酸；
(b)编码第一选择标记的多核苷酸；
(c)编码第二选择标记的多核苷酸，所述第二选择标记与第一选择标记不同，
其中所述第一或第二选择标记的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记参与叶酸代谢并且其中所述第一选择标记是叶酸转运蛋白并且所述第二选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将根据权利要求1至5中至少一项所述的表达载体或表达载体的组合引入到宿主细胞中。
11.用于选择能表达目的产物的至少一个宿主细胞的方法，其包括
(a)提供多个宿主细胞，其至少包含
(i)编码目的产物的引入多核苷酸；
(ii)编码第一选择标记的引入多核苷酸；
(iii)编码第二选择标记的引入多核苷酸，所述第二选择标记与第一选择标记不同，
其中所述第一或第二选择标记的活性至少部分地依赖于另一选择标记的活性，并且其中所述选择标记参与叶酸代谢并且其中所述第一选择标记是叶酸转运蛋白并且所述第二选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）；
(b)在对第一和第二选择标记选择的条件下培养所述多个宿主细胞，从而获得表达目的产物的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其额外地包括步骤
(c)选择至少一个表达目的产物的宿主细胞。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其具有一个或多个以下特征：
a)所述多个宿主细胞包含根据权利要求6或7所述的宿主细胞；
b)将选择性培养基用于至少一个选择步骤，所述选择性培养基包含叶酸和叶酸拮抗物，其中所述叶酸是限制浓度的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中将选择性培养基用于至少一个选择步骤，所述选择性培养基包含叶酸和叶酸拮抗物，其中所述叶酸是限制浓度的，并且其中所述选择性培养基包含500nM或更低浓度的叶酸，和其中所述选择性培养基包含500nM或更低的浓度的叶酸拮抗物。
15.权利要求14的方法，其中所述选择性培养基包含200nM或更低的浓度的叶酸拮抗物。
16.权利要求14或15的方法，其中所述选择性培养基包含100nM或更低浓度的叶酸。
17.用于产生目的产物的方法，其包括在允许表达目的产物的条件下培养
(a)根据权利要求6或7的宿主细胞和/或
(b)根据权利要求11至16中至少一项选择的宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其包含至少一个以下步骤：
(a)分离来自所述细胞培养基和/或来自所述宿主细胞的目的产物；和/或
(b)加工分离的目的产物。
19.选择性培养基的用途，用于根据权利要求11至16中一项或多项所述的方法中，所述选择性培养基包含500nM或更低的浓度的叶酸拮抗物和500nM或更低的限制浓度的叶酸。
20.第一选择标记和第二选择标记组合用于选择能够表达目的产物的宿主细胞的用途，所述第二选择标记不同于所述第一选择标记，其中所述第一或第二选择标记的活性至少部分地受到另一选择标记活性的影响，并且其中所述第一选择标记是叶酸转运蛋白并且所述第二选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）。
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