CN102329844B - 提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵酶解法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵酶解法，包括：(1)将大豆进行预处理；(2)将微生物菌种接入液体发酵培养基中发酵产酶；(3)发酵培养液离心，取上清液与水混合；接入豆粉酶解；(4)离心得乳状液，水解液和残渣；乳状液破乳，获得游离油；(5)调节水解液pH值，离心，清洗沉淀后再离心，将沉淀用水溶解后调pH值，干燥，得大豆分离蛋白。本发明对微生物发酵酶解提取大豆油和蛋白的各工艺参数进行全面而系统的研究，在确定最佳发酵产酶培养基和培养条件的基础上，以总油和总蛋白提取率，兼顾游离油三者为考察指标，确定酶解豆粉条件及破乳条件，使原料中的总油提取率达到90％以上，总蛋白得率达到90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆油脂和蛋白的提取方法，尤其涉及一种挤压膨化预处理后的大豆经微生物发酵液酶解同时提取油脂和蛋白的方法，属于大豆油脂的提取领域。
背景技术
目前大豆油制取工艺有两种，一种是溶剂浸出法，另一种是机械压榨法。这两种方法各存在以下的优缺点：溶剂浸出法的优点是出油率较高，但该方法溶剂易残留，对人体有较大伤害，而且湿粕在高温脱溶过程中蛋白变性严重，有机溶剂的使用增加了工艺的繁琐性，设备投资大，能耗大，生产安全性差，给环境造成污染等缺陷。压榨法制油工艺所得的油、饼质量差，且豆粕中残油率高(5％～7％，干基)，粕中蛋白变性严重以致只能用作肥料，造成大量优质植物蛋白浪费。
未经精炼的植物油中所含的维生素E可以防止胡萝卜素、肾上腺素、性激素及维生素A、D、K的氧化破坏。但是，溶剂浸出与机械压榨所得的大豆油经过碱炼、脱酸等多道精炼工序使维生素E氧化，在精炼油中，维生素E已荡然无存，虽不易腐败，但只能供给能量，没有其他营养价值。在上世纪50年代国外就有学者把生物技术(酶)应用于油脂提取以探求更科学、健康、安全的提取方法。到上世纪90年代，水酶法提油技术引起国内外学者的关注。
水酶法提取技术是利用酶水解油料同时得到油和蛋白最理想的方法，其工艺操作安全、设备简单、污染少，所得大豆油无溶剂残留且无需精炼即可食用，油中有益成分破坏少，营养价值高，蛋白变性程度低。但是水酶法提取技术也是难度较大的工艺方法，特别是低含油量的油料(最典型的是大豆)具有得油率较低的特点以及酶解后蛋白与油脂所形成的乳状液难以破乳分离等技术难题。1973-1977年意大利科学家Montedoro，G和Petruccioli，G对酶法提取橄榄油进行相关的研究。1983年美国Fullbook用酶从西瓜籽中制取营养性的可溶性水解蛋白时，发现随着水解的进行，部分油被释放出来。随后他用酶从菜籽与大豆中提取油与蛋白质，取得了预期的效果。1995年Dominguez等对酶处理后的大豆用正己烷浸提大豆油脂进行相关研究。1995年Ranalli，A，和Costantini，N利用当时已有的技术和研究成果进一步研究了引入蛋白水解酶对橄榄油提取率的影响。2001年Y.B.Che Man和Suhardiyono等用Alcalase蛋白酶成功的提取了米糠油，通过响应面分析方法发现酶的添加量对米糠油和蛋白的提取率影响最大，而酶解温度和酶解时间对其影响不显著，其优化后的最高提油率为79％、蛋白提取率为68％。
中国对水酶法提油的技术研究相对国外较晚。1992年无锡轻工大学首次对酶法从全脂豆粉中同时制取大豆油和蛋白的工艺进行研究。该工艺原料没有进行预处理，且在提取油脂过程中经过两次酶解，由于当时生物酶技术的限制，所以只采用了碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行水解，不仅工艺复杂，而且油脂提取率仅能达到65％左右。2000年浙江大学何国庆教授对水酶有机溶剂提取大豆油进行研究，得到了最佳酶的选择以及最佳酶解工艺条件和萃取条件，大豆油提取率达到84％左右，但由于当时技术的限制，这些方法并没有摆脱有机溶剂的使用。
在植物油料中，油脂存在于油料细胞内，并通常与其他大分子(蛋白质和碳水化合物)结合在一起，构成脂多糖、脂蛋白等复合体。水酶法提油工艺是在机械破碎的基础上，利用酶进一步破坏细胞，分解脂蛋白、脂多糖等，使油从非油相中释放出来，从而同时得到蛋白与油脂。
由于碱性蛋白酶对蛋白的水解能力最强，破坏程度最大，因而大多数水酶法都采用单一的碱性蛋白酶提取油脂与蛋白，还没有人用多种蛋白酶系提取油与蛋白取得较好的效果。
公开号CN101401658A的发明专利公开了一种水酶法从花生中提取油与水解蛋白的中试方法，它以花生为原料，用单一的碱性蛋白酶——Alcalase碱性内切蛋白酶进行酶解。公开号CN101602979A的发明专利公开了一种水酶法从大豆中提取油与蛋白的方法，该方法采用单一的Alcalase碱性内切蛋白酶从大豆中提取油与蛋白。
以上两项专利采用的Alcalase碱性内切蛋白酶仅能从蛋白肽链内部水解蛋白，共同的缺点是生产的蛋白具有较明显的苦味，限制了其应用。此外，上述专利中所用的商品纯酶在水解过程中为了保持酶良好的活性和适宜的pH作用条件，需不断向豆粉中滴加碱液以保持恒定的pH值，但这样所产生的后果便是终产品蛋白中含有大量的盐，增加了水洗工艺的工作量(需除盐)。另外，现在商品酶的价格较高，而且酶的活性易受外界环境影响，这样就给交通运输和贮藏提出了较高的要求，因此用纯商品酶提取大豆中的油和蛋白，使生产成本增加。
公开号为CN101401658A的发明专利乳状液经冷冻解冻破乳后得到破乳油，优化后的工艺为：冷冻解冻的最适宜条件是-16℃冻结15h，35℃解冻2h，3500rp m离心20min，此时乳状液中油回收率达到92.16％。公开号CN101602979的发明专利并未对所产乳状液的破乳工艺进行阐述，只笼统提到“经破乳处理”。
现有的水酶法提油技术都不同程度的存在着破乳工艺难度大、游离油得率较低的问题，直接影响着大豆中油脂的实际回收得率(破乳率越低，大豆中油的实际得率就越低)，从而间接增加成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵酶解法，该方法将微生物在适宜的发酵培养条件下产酶，然后用含有多种酶系的发酵液水解大豆粉同时提取油和蛋白，该方法具有条件温和、油中无溶剂残留、所得蛋白性能优良、设备简单、操作安全、污染少成本低、所得蛋白无苦味等优点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵酶解法，包括以下步骤：(1)将大豆进行预处理；(2)将活化后的微生物菌种接入到液体发酵培养基中进行发酵产酶；(3)将发酵培养液离心，得到上清液，将上清液与水混合得到混合液；将预处理粉碎后的大豆粉接入到混合液中进行酶解；(4)酶解完全后，离心得到乳状液，水解液和残渣；将乳状液破乳，获得游离油；(5)调节水解液pH值，离心，用水清洗沉淀后再离心，将沉淀用水溶解后调节pH值，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白；其中，按重量百分比计，步骤(2)中所述的液体发酵培养基的组成为：0.1-0.9％低温脱脂豆粕，1.0-2.0％葡萄糖，0.01-0.09％KH2PO4，0.3-1％吐温80，pH值7-10.5。
为了达到更好的提取效果，优选的，步骤(2)中所述的液体发酵培养基的组成为：按重量百分比计，0.3-0.7％低温脱脂豆粕，1.3-1.7％葡萄糖，0.03-0.07％KH2PO4，0.3-1％吐温80，pH值为7-10.5；更优选的，所述的液体发酵培养基的组成为：0.57％低温脱脂豆粕、1.48％葡萄糖、0.05％KH2PO4、0.5％Toween 80，pH值9。
步骤(2)中所述的微生物菌种优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)菌种。
步骤(2)中所述的发酵条件优选为：按体积比计，将4-7％微生物种子液接入液体发酵培养基中(其中，优选的，液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5)，33-39℃下120-200r/min振荡培养30-54小时；优选的，34-38℃下150-170r/min振荡培养32-50小时；更优选的35℃下160r/min振荡培养42小时。
本发明中枯草芽孢杆菌在优化后的培养基和发酵条件下发酵所产碱性蛋白酶活达到了3300u/ml以上，比未优化前的872u/ml高出3倍多，且成本低廉，更易实现工业化。
本发明还通过大量的试验对微生物发酵所产粗酶水解大豆提取油和蛋白的各工艺参数进行了测试，结果发现，优化后的工艺条件对于大豆油和蛋白的提取均带来了良好的效果，具体如下：
优选的，步骤(1)中所述的大豆预处理可以为：磨碎、超声波处理或挤压膨化；优选为挤压膨化，其中，所述的挤压膨化优选的工艺条件为：物料含水率为13％-17wt％，挤压膨化机套筒温度为85-110℃，螺杆转速95-115r/min。
步骤(3)中将发酵培养液在4℃条件下以5000转恒温离心20分钟，将上清液与水混合，在碱性酶活为2000-3000u/g全脂豆粉，中性蛋白酶活力为1500-2000u/g全脂豆粉的条件下，接入膨化全脂豆粉进行酶解；优选的，其中膨化全脂豆粉为过70-120目筛的膨化全脂豆粉。
步骤(3)中所述的酶解温度优选为50-60℃，更优选为55℃；所述的酶解时间优选为6-10小时，更优选为6小时。
步骤(3)中全脂豆粉与混合液的重量比例优选为1∶6-10，更优选为1∶7；
步骤(3)中优选将酶解液的pH值调整为8-11，更优选为10。
优选的，步骤(4)中将所得到的残渣进行如下处理：将残渣用水洗后离心分别得到乳化层、水洗液和残渣；合并乳状液与乳化层，破乳，获得游离油。
步骤(4)中优选将乳状液在以下条件下进行破乳：在40-65℃的温度下将乳状液pH调至3-5，作用30-60min；更优选的，在50℃的温度下将乳状液pH调至4或4.5，作用30min后，在3000～5000r/min，离心15～30min。
步骤(5)中调节水解液pH值至4.5，离心后沉淀用水清洗，再次离心，将沉淀用水溶解后调节pH值至7，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。
本发明以成本低廉的低温豆粕为发酵培养基主要成分，在培养基成分尽可能简单、易操作的前提下，以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，在优化后的发酵条件下产酶，从而获得较高酶活。本发明用发酵所产的多酶体系在水解全脂豆粉同时提取油和蛋白，相对于商品酶价格贵、难保存，活力易受外界影响等缺陷具有独特的优势，成本也更低。
本发明方法减少了酶解过程中加碱量，有效降低了工艺操作工作量。纯商品酶水解大豆粉提取油和蛋白时需往水解液中滴加碱液，使pH值恒定在某一特定值以保持所添加酶处于最适宜作用的酸碱范围。本发明微生物发酵所产发酵液中含有多种蛋白酶(包括碱性和中性蛋白酶)，因此酶解时无需向水解液中滴加碱液以保持恒定的pH值，而是随着pH值的变化不断到达不同酶的活性作用位点，这样就大大降低了碱的使用、减少了盐的生成，从而相应减少了后期制取分离蛋白时水洗去盐的工作量。显然本发明微生物发酵所产粗酶水解大豆粉提取油与蛋白要比单一的酶作用更具有优势。
本发明首次采用酸法破乳，其效果良好，操作简单且成本低廉。本发明利用蛋白在等电点附近溶解度最低的原理，通过加酸使乳状液的pH值调至4.5处左右，乳状液中的大部分蛋白沉淀下来，从而使乳状液中包裹的油释放出来。本发明酸法破乳效果良好，破乳率达到了100％，较其它破乳工艺操作简单，生产成本较低，容易实现工业化生产。
本发明方法油的提取率更高且所得蛋白品质优良。本发明所采用的微生物菌种枯草芽孢杆菌在发酵过程中，不仅产碱性蛋白酶还产中性蛋白酶等，与单一的商品纯酶水解大豆粉提油和蛋白相比，这种多种酶系协同作用不仅能使油和蛋白更彻底的提取出来，而且所得蛋白苦味程度较轻，感官性能更好，提高了蛋白的利用性，因此本发明方法比商品纯酶水解豆粉提油和蛋白更具有优势。
总之，本发明对微生物发酵产酶和所产酶液水解豆粉提取油和蛋白的各工艺参数进行全面而系统的研究，在确定最佳发酵产酶培养基和培养条件的基础上，以总油、总蛋白提取率，兼顾游离油得率三者为考察指标，确定酶解豆粉条件及破乳条件，使原料中的总油提取率达到90％以上，总蛋白得率达到90％以上。
附图说明
图1酶活力测定标准曲线。
图2不同碳源对枯草芽孢杆菌发酵产酶的影响。
图3发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶活的影响。
图4不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶活的影响。
图5不同豆粕浓度对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶活的影响。
图6不同浓度的KH2PO4对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶活的影响。
图7各因素对考察指标的降维分析图。
图8Y＝f(x1，x2)的响应曲面图。
图9初始pH对菌体所产碱性蛋白酶活的影响。
图10发酵温度对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶活力的影响。
图11不同酶解时间的总油、总蛋白、游离油提取率。
图12不同料液比的总油、总蛋白、游离油提取率。
图13不同酶解温度时的总油、总蛋白、游离油提取率。
图14不同酶解初始pH时的总油、总蛋白、游离油提取率。
图15发酵液水解大豆粉后各相中的油含量。
图16发酵液水解大豆粉后各相中的蛋白含量。
图17本发明方法的工艺流程图。
图18本发明方法的试验流程图。
图19本发明方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1液体发酵培养基的组成及发酵条件优化实验
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自于中国工业微生物菌种保藏中心(ATCC20524)。
1.1.2试剂
牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、酪氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、氯化钠以上试剂均为分析纯；Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.9适宜测定碱性蛋白酶活，pH 7.2适宜测定中性蛋白酶活)。
1.1.3原料
低温脱脂豆粕：购自哈尔滨高科生物技术公司。
1.1.4培养基
斜面保藏培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，pH 7.5，121℃灭菌20min。
种子培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，pH7.4，121℃灭菌20min。
1.2试验方法
根据现有的研究结果显示，碱性蛋白酶对蛋白水解能力最强，最有利于使包裹在蛋白里面的油脂释放，因此本试验优化过程的指标以碱性蛋白酶活力为考察指标。
1.2.1试验流程
如图18所示。
1.2.2碱性蛋白酶活力的测定
发酵液在4℃条件下，5000r/min离心20min取上清液，采用SB/T 10317-1999 Folin酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为：在50℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位，以u/mL表示。
1.2.3原料预处理
将低温脱脂豆粕粉碎成豆粉，过100目筛子。
1.2.4菌种活化
取1～2环斜面保存菌种接入种子培养基中，其中种子培养基体积：种子瓶体积＝1∶5，37℃下160r/min振荡培养20～24h，使菌体浓度达到108cfu/ml。
1.2.5发酵培养基成分的确定
因为豆粕中含有丰富的维生素、无机盐、生长因子，因此只需添加碳源和少许无机盐，以补充菌种的生长代谢需要。根据先前的预实验，无机盐本发明选择KH2PO4，而何种碳源与豆粕搭配才能提高菌种所产酶活，需对各种碳源进行选择。以碱性蛋白酶活为考察指标作如下设计：
碳源的确定：不同碳源对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响：碳源分别为蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉，添加量为1wt％；在37℃条件下，2wt％豆粕，0.5％wtToween 80，接种量为5wt％，pH9，在液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵48h。
1.2.6发酵产酶的动态研究
将活化菌种接入上述发酵培养基中后，37℃下160r/min，每隔6小时测一次酶活，振荡培养60小时。
1.2.7发酵培养基的优化
1.2.7.1不同豆粕浓度对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响：豆粕浓度分别为0，0.25wt％，0.5wt％，0.75wt％，1wt％，1.25wt％时，在37℃条件下，葡萄糖浓度为1wt％，KH2PO4的浓度为0.075wt％，Toween 80的浓度为0.5wt％，接种量为5wt％、pH9，在液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵42h。
1.2.7.2不同碳源浓度对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响：当葡萄糖浓度分别为0.5wt％，1wt％，1.5wt％，2wt％，2.5wt％时，37℃条件下，豆粕浓度为0.75wt％，KH2PO4的浓度为0.075wt％，Toween 80浓度为0.5wt％，接种量为5wt％、pH9，在液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵42h。
1.2.7.3不同无机盐浓度对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响：当KH2PO4浓度分别为0，0.025wt％，0.05wt％，0.075wt％，0.1wt％，0.125wt％时，在37℃的条件下，豆粕浓度为0.75wt％，葡萄糖浓度为1wt％，Toween 80浓度为0.5wt％，接种量为5wt％、pH9，在液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵42h。
1.2.7.4响应面实验设计
在单因素研究的基础上，选取葡萄糖含量x1、豆粕浓度x2、KH2PO4浓度x3为自变量，以碱性蛋白酶活Y为响应值，根据中心组合设计原理设计响应面分析实验，表1为因素水平编码表。
表1因素水平编码表
1.2.8发酵条件的确定
测试培养基初始pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0时，在37℃的条件下，接种量为5％、液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵42h的碱性蛋白酶活；
当发酵温度分别为31℃、33℃，35℃，37℃、39℃、41℃时，测试在接种量为5％、pH9，液体发酵培养基体积∶发酵瓶体积＝1∶5条件下发酵42h的碱性蛋白酶活。
2结果与分析
2.1酶活力测定标准曲线的制作
所得标准曲线如图1所示
y＝0.1184x+0.02246
R2＝0.9993
酪氨酸标准曲线的回归方程为：
y＝0.01184x+0.02246 R2＝0.9993 公式(1)
在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸微克数(即为K值)：K＝83。按公式(2)计算蛋白酶酶活。
蛋白酶活力X＝K×A×4/10×N×1/V＝33A×N/V 公式(2)
式中：A-平行实验的平均吸光度
K-吸光常数
4-离心管中反应液总体积(mL)
10-反应时间10min
N-稀释倍数
V-取酶液体积(mL)
2.2发酵培养基成分的确定
豆粕是大豆提油后的副产物，蛋白质含量丰富，在43～48％左右，并且还含有少量的糖、无机盐、维生素和某些生长因子，因而菌种可在以豆粕为氮源的培养基中生长良好。本发明以低温脱脂豆粕为发酵培养基的唯一氮源，一方面豆粕相对于其他化学试剂，成本较低，易工业化生产；另一方面豆粕中的大豆蛋白可被产生的酶类水解成大豆多肽，提高蛋白质生物效价，有利于吸收利用。
2.3不同碳源产酶情况
碳源是供给菌种生命活动所需能量的重要来源，不同的碳源影响着产物的生产能力。枯草芽孢杆菌发酵产酶实验选择的碳源为蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖。由图2可知，以葡萄糖作为碳源时，产酶量最高，这是由于葡萄糖在所有碳源中可直接被微生物利用，合成自身的能量，无需在身体内进行分解或降解成机体可利用的碳源，因此微生物能迅速利用葡萄糖进行生长代谢及酶的合成。
2.4发酵产酶曲线
图3显示随着发酵时间的延长，枯草芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶活力先增加后降低。在0-12h之前几乎不产酶活，发酵24h后酶活急剧升高，42h时，碱性蛋白酶活力达到高峰，为872u/ml。42h后，酶活开始下降。因此确定42h为最佳的发酵产酶时间。
2.5培养基中各成分浓度的确定
先前研究已发现培养基中的碳源、氮源和无机盐的浓度对发酵产酶量有显著影响。因此，在本阶段将葡萄糖(碳源)、KH2PO4、豆粕粉(氮源)三个因子作为考虑的变量，以碱性蛋白酶活为响应值，采用响应面法优化各成分浓度。培养基中各组分不同浓度时的碱性蛋白酶活见图4～6。
从图4中可看出在葡萄糖浓度为1％～2wt％之间，枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶活最高，而浓度在小于1％和大于2％范围内，产酶量减少。这是因为葡萄糖是一种速效碳源，菌体由种子液接种到发酵液中时，需要迅速获得大量碳源以维持继续生长势头，从而大量产酶，因此在一定范围内的高浓度葡萄糖有利于酶产量的提高；但过高的葡萄糖浓度(＞2％)反而会降低酶产量，原因是在发酵过程中过多的葡萄糖会加速菌体呼吸，使培养基中的溶解氧降低，不利于发酵产酶。因此，葡萄糖优化范围选定为：1～2wt％之间。
豆粕的浓度对蛋白酶产量具有举足轻重的作用。为获得最高的酶产量，豆粕浓度也必须保证在一个合适的范围内。氮源过多，菌体生长过于旺盛，导致pH偏高和溶氧不足，不利于酶的积累；氮源不足，影响菌体生长繁殖，菌体易衰老自溶，从而影响酶产量。从图5可知，豆粕浓度优化范围选定在0.1～0.9wt％之间；从图6可知，KH2PO4的浓度对产酶量有着重要的影响。在KH2PO4浓度为0.01～0.09wt％范围内，有最大酶活，所以优化范围选定为此区间。
2.6响应面优化培养基成分实验
2.6.1响应面实验安排及实验结果
本实验应用响应面方法进行过程优化，响应面实验方案及结果见表2。实验号1-14为析因实验，15-20为6个中心试验，用以估计实验误差。
表2响应面实验方案及结果
2.6.2响应面实验结果分析
通过统计分析软件SAS9.1进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：
Y1＝3117.064+54.85492x1+164.981x2-12.48111x3-204.1298x1x1-269.875x1x2-285.4471x2x2-575.1844x3x3
回归分析与方差分析结果见表3，响应面寻优见表4，降维分析见图7，交互相影响显著的响应面见图8。
表3回归与方差分析结果
注：经分析，总回归的相关性系数(R2)为93.77％，决定系数(R2Adj)为88.16％
方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著(p＜0.001)，失拟项不显著(p＞0.05)，并且该模型R2＝93.77％，R2 Adj＝88.16％，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：x2＞x1＞x3，即低温脱脂豆粕浓度＞葡萄糖浓度＞KH2PO4浓度。交互相对响应值的影响为，葡萄糖浓度和低温脱脂豆粕浓度交互影响对酶活的影响显著，而低温脱脂豆粕浓度与KH2PO4浓度交互影响和葡萄糖浓度与KH2PO4浓度交互影响对酶活的影响不显著。
由图7可以看出各因素对考察指标碱性蛋白酶活大小的影响规律。
应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果，响应面有最优值为3141.974±85.89281u/ml，由表4可知当低温脱脂豆粕浓度为0.57wt％，，葡萄糖浓度为1.48wt％，KH2PO4浓度0.05wt％时，响应值(碱性蛋白酶活)有最优值3141.974±85.89281u/ml。
表4响应面寻优结果
2.6.3验证实验与对比试验
在响应面分析法求得的最佳条件下，即低温脱脂豆粕浓度为0.57％，，葡萄糖浓度为1.48％，KH2PO4浓度0.05％时进行3次平行实验，所得酶活的均值为3108.6u/ml，酶活预测值为3141.974±85.89281u/ml，说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好，比未优化前的酶活(872u/ml)提高了2倍多。
2.6.4发酵条件的确定
培养基初始pH和发酵温度直接影响菌体的生长和蛋白酶类的产量，从图9中可看到在初始pH为9时有最大酶活。
温度对微生物的生长有重要影响，温度过低，菌种生产迟缓，不易产酶；温度过高，其生长周期变短，菌株过早老化，也不利于产酶。从图10可知随着发酵温度的升高，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力增强，在34-38℃范围内酶活较高，35℃时碱性蛋白酶活达到最高值3351.3u/ml，比条件未优选前(3108.6u/ml)高了200u/ml。
2.6.5对最优发酵条件下所产发酵液的中性蛋白酶活进行测定，结果显示为2068.5u/ml，这个结果在后期的分离纯化实验中再次得到验证——分离出来两种有活力的酶，经测定分别为中性和碱性蛋白酶。
3实验结论
在发酵条件一定的前提下，以枯草芽孢杆菌为发酵剂，以碱性蛋白酶活为考察指标，分析了培养基中不同碳源的酶活，发现在相同条件下，葡萄糖产碱性蛋白酶活最高，其次为蔗糖。
利用响应面法，以碱性蛋白酶活为响应值，对发酵培养基中的三个主要成分——葡萄糖、豆粕、KH2PO4的浓度进行三因素五水平实验分析，发现在培养基组成为：1.48wt％葡萄糖、0.57wt％豆粕、0.05wt％KH2PO4、0.5wt％Toween 80、pH9时，碱性蛋白酶活有最高值，预测值为3141.974±85.89281u/ml，验证实验的酶活为3108u/ml，比未优化前的酶活(872u/ml)提高了2倍多。
在优化后的培养基中，枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶适宜的发酵条件为pH9，35℃，发酵42小时，此时碱性酶活达到3351.3u/ml，比条件未优选前(3108.6u/ml)高了200u/ml，此时中性蛋白酶活性为2068.5u/ml。
实验例2酶解条件及破乳条件的工艺优化实验
1材料与方法
1.1实验材料
原料：挤压膨化后的大豆。
1.2挤压膨化：物料含水率为13％-17wt％，挤压膨化机套筒温度为85～110℃，螺杆转速95-115r/min。
1.3粉碎：将膨化物料粉碎，过70～120目筛子。
1.4实验方法
1.4.1工艺流程
如图19所示。
1.4.2测试方法：
蛋白含量的测定：凯氏定氮法
乳中油脂含量的测定：哥特-罗紫法
残渣中的油脂含量：索氏抽提法
1.4.3测试公式
1.4.4发酵液水解膨化大豆粉提取油脂工艺条件的确定
将在优化后的培养基和发酵条件下枯草芽孢杆菌所产发酵液在4℃下，5000r/min恒温离心20分钟，取一定体积的上清液，加入磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配成0.2mol/L相应pH值的粗酶缓冲溶液(即发酵上清液)，在碱性蛋白酶活(2000～3000)U/mL，中性蛋白酶活(1500～2000)U/mL时接入膨化全脂豆粉水解，以总油、总蛋白提取率和游离油得率为考察指标，对酶解过程中的条件参数进行优选。
1.4.4.1酶解时间的确定：在pH9、全脂豆粉浓度10％、酶解温度50℃的条件下，分别酶解2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，测定总油、游离油和总蛋白提取率。
1.4.4.2酶解料液比的确定：在pH9、酶解温度50℃，酶解6小时的条件下，分别测定全脂豆粉：酶解混合液(上清液和水的混合液)，即：料液比(质量比)分别为1∶4；1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10时的总油、游离油和总蛋白提取率。
1.4.4.3酶解温度的确定：在pH9、料液比1∶7、酶解6小时的条件下，酶解温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时的总油、游离油和总蛋白提取率。
1.4.4.4酶解最佳pH的确定：在温度55℃，料液比1∶7，酶解6小时的条件下，酶解起始pH分别为6、7、8、9、10、11时的总油、游离油和总蛋白提取率。
1.4.5发酵液酶解大豆粉后固液各相的分离及重量测定
将酶解后的全脂豆粉溶液以5000r/min离心20分钟后，分为三个部分，最上层为乳状层部分(包括游离油和乳状液)，中间为水解液，底部为酶解后的残渣。将乳状液与水解液分别收集。
1.4.6破乳工艺
用小烧杯称取乳状液15克，用HCl将其pH值分别调至pH9，pH8，pH7，pH6，pH5，pH4.5，pH4，pH3后，分别置于30℃、40℃、50℃、65℃、80℃水浴锅内恒温作用30min后，以3000r/min离心15min，测游离油得率，每个条件下做3个平行样。
1.4.7蛋白回收
将粗酶水解豆粉后的水解液pH调至4.5后，水解液中溶解的大部分蛋白沉淀下来，3000～5000r/min离心15min，收集沉淀，用水清洗沉淀后，再次在相同条件下离心，所得沉淀中加入清水，并将pH调至7，沉淀溶解后，喷雾干燥或冷冻干燥，制得分离蛋白粉。
1.4.8纯酶水解全脂豆粉
采用Alcalase碱性蛋白酶，在料水比1∶7，55℃条件下，加酶量2％，pH 9时，酶解膨化豆粉4h后，5000r/min离心20min，测总油和总蛋白提取率，其水解液中的蛋白按1.4.7进行回收并制取蛋白粉。
1.4.9水解蛋白苦味值的评定
蛋白苦味值的评定按如下方法进行测评：
以0mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L、32mg/L浓度的盐酸奎宁溶液分别定义为无味、微苦、中度苦、苦、很苦的标准对蛋白液进行评分，感官评定小组由5人组成。评定员用蒸馏水漱口之后，取浓度10mg/mL经发酵液和纯酶Alcalase水解豆粉提取的蛋白溶液适量置于口中片刻后吐出，漱口后取与之苦味程度相近的标准液品尝，如两苦味相近，则可将待评液定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准液再试，直至苦味相同。结果取5人的平均值。
1.4.10水解蛋白的氨基酸组成测定
用氨基酸自动分析仪对经粗酶(发酵上清液)和纯Alcalase酶提取的大豆蛋白干粉中总氨基酸和游离态氨基酸含量分别测定。
多肽态结构氨基酸含量的计算：以所测总氨基酸含量减去游离态氨基酸含量即为样品蛋白粉中多肽态结构氨基酸含量。
2实验结果
2.1酶解不同时间总油、总蛋白和游离油提取率的变化
图11显示，在酶解时间小于6h时，油与蛋白的提取率随时间的增长，提取率不断增加，但当酶解时间达到6h时，总油、游离油与总蛋白提取率都达到了最高值，其后随着酶解时间的延长，油与蛋白提取率都趋于平稳，增加不再明显。随着酶解的进行，底物不断的分解，酶解一定时间后，积累的产物达到一定浓度后，反过来抑制了酶与底物的结合，从而表现为酶活降低，底物不再分解。
2.2料液比对酶解的总油、总蛋白和游离油提取率的影响
图12显示，当料液比在1∶6-10范围内时，总油、游离油与蛋白有较大提取率，这是由于豆粉浓度太大或太小都不利于大豆蛋白的分解，若料液比太小发酵液利用率不高，造成资源浪费，成本升高；若底物浓度过大，抑制了酶活，则豆粉不能完全酶解，油与蛋白提取率都不高，根据实验结果，最佳的料液比定为1∶7。
2.3酶解温度对总油与总蛋白提取率的影响
从图13中可以看出，当酶解温度在55℃时，总油、总蛋白、游离油得率有最高值，分别达到了93％，88.7％，22.5％；因此确定55℃为酶解的最适宜温度。
2.4酶解pH对总油与总蛋白提取率的影响
从图14中可以看到，当发酵液起始pH10时总蛋白、总油与游离油得率有最高值，分别达到了90.4％，94.5％和24％，而通常所用的商品酶的酶解最佳pH值大都在9，这是因为商品酶在酶解过程中不断向水解液中滴加碱液以使pH保持在9附近，使酶有最大酶活，而我们此实验中微生物发酵产生的酶液是一个多种酶系的复合体，不仅含有碱性蛋白酶，还有中性蛋白酶，因此无需用碱去控制酶解液保持恒定的pH值，而是随着体系pH值不断地下降，而到达不同蛋白酶系的适宜作用位点。但也可看出在pH6～10范围内，起始pH越高，发酵液中的酶系能够较长时间处于其有效作用的酸度范围之内，因此蛋白与油提取率也趋于越高。兼顾蛋白与油两项指标，本发明选择酶解最适宜的pH值为10。经过酶解各条件的优选后，总油提取率达到了94.5％，游离油提取率为24％，总蛋白提取率达到90％以上。
2.5酶解后各相中的油脂含量
图15显示了酶解离心后各相中油脂分布情况，优化后的酶解提油工艺，残渣中剩余5.5％的油脂，生产出游离油24％，乳状液中的含油量占原料中总油质量的59％。
2.6破乳
乳状液在不同温度不同酸度时的破乳效果见表5。
表5不同酸度条件下的破乳效果
表5显示，在相同酸度条件下，随着温度的升高其破乳率相应增加；在温度一定的前提下，乳状液的pH值越接近于4～4.5附近，乳状液的破乳率越高。这是因为在pH4.5左右，乳状液中的蛋白接近于等电点，此时蛋白的溶解度最低，因此乳状液中大部分蛋白沉淀下来，破坏了油水体系的乳化性，从而使蛋白包裹的油脂释放出来，实现较好的破乳效果。同时也可以看到当加热温度在50℃和65℃时乳状液在各酸度范围内的破乳率相似，加酸破乳在此区间内随温度的上升，破乳率增加不明显。80℃时，乳状液在各酸度条件下的破乳率都非常高，即使是在pH9这样偏离于等电点处的破乳率也达到了90％，这是由于加热温度过高使游离油得率升高，而不是加酸的作用，过高的温度虽然有利于破乳率的提升，但也会使成本增加。结合成本和游离油回收情况，确认在50℃时将乳状液的pH值调节至4～4.5处破乳较适宜工业化采用。结合2.5的结果，在50℃时将乳状液的pH值调节至4～4.5处破乳后，本实验可从原料大豆中回收到原料豆中82％的油，残渣中残留为5.5％左右的油，其余的油脂则以游离油的状态存在于水解液中。
酸法破乳工艺简单，易操作，成本低，易实现工业化生产，说明本发明提取大豆油脂的工艺是切实可行的。
2.7回收蛋白
图16显示原料中89％的蛋白都分布在水解液中，因此需将水解液中的蛋白进行回收，制取大豆分离蛋白。
2.8商品Alcalase碱性蛋白酶水解豆粉的总油和总蛋白提取率
从表6中可知利用商品Alcalase碱性蛋白酶提取大豆油脂，总油提取率为90.2％，总蛋白提取率为90.6％，比本发明发酵液水解豆粉总油得率低4.3％，而总蛋白提取率则稍高0.2％。因此可看出本发明油的提取更彻底，比商品酶提油更加具有优势。
表6Alcalase酶解全脂大豆的总油与总蛋白提取率
2.9商品Alcalase酶解和微生物发酵液水解大豆粉所得分离蛋白的感官评价
通过对样品液的品尝，评定组成员5人一致认为采用本发明微生物发酵所产酶液水解大豆粉所得到的蛋白呈微苦味，而Alcalase蛋白酶水解所得大豆蛋白则具有明显的苦味。
通常商品纯酶水解的大豆蛋白风味较差，具有明显的苦味，限制了其在工业上的应用。其原因是在水解过程中形成了苦味肽，而大部分苦味肽的苦味是由其中的疏水性氨基酸引起的。在完整的大豆蛋白分子中，大部分疏水性侧链藏在内部，它们接触不到味蕾，感觉不到苦味。当蛋白质水解时，肽链含有的疏水性氨基酸侧链充分暴露出来，可接触到味蕾，感觉到苦味。
目前已知枯草芽孢杆菌可产数十种酶，在本发明中枯草芽孢杆菌所产的发酵液中已经证实同时含有碱性蛋白酶和中性蛋白酶，除此之外枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中还应产生了其他种类的酶，在这样一个多酶体系中的发酵液中，蛋白经水解后形态和空间结构都发生了变化，其氨基酸含量、肽链组成成分的改变都直接影响着水解蛋白的感官指标，从而影响其作为食品关键组分的应用。
发酵所产粗酶液水解蛋白和Alcalase酶水解蛋白的氨基酸组成如表7所示。
表7水解蛋白的相对氨基酸组成(％)
注：表中*代表具有较强苦味的疏水性氨基酸
从氨基酸组成上看，具有较强苦味的四种疏水氨基酸——缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，它们在粗酶水解蛋白中以游离态存在的占总蛋白含量的1.742％，以多肽形式存在的占总氨基酸的18.42％，稍低于纯酶水解蛋白的疏水氨基酸多肽含量(20.66％)，由于游离态的疏水性氨基酸是不苦的，具有苦味的是肽链末端的疏水性氨基酸，因此通过发酵所得酶液水解豆粉提取的蛋白比纯酶提取的苦味程度轻。
Claims (15)
1.一种提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵酶解法，包括以下步骤：（1）将大豆进行预处理；（2）将活化后的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）菌种接入到液体发酵培养基中进行发酵产酶；（3）将发酵培养液离心，得到上清液；上清液与水混合得到混合液；将预处理粉碎后的大豆粉接入到混合液中进行酶解；所述的酶解温度为50-60℃；所述的酶解时间为6-10小时；（4）酶解完全后，离心得到乳状液，水解液和残渣；将乳状液在以下条件下进行破乳获得游离油：在50℃的温度下将乳状液pH调至4或4.5,作用30分钟，在3000-5000r/min转速下离心15-30min；（5）调节水解液pH值，离心，清洗沉淀后再离心，将沉淀用水溶解后调节pH值，干燥，获得大豆分离蛋白；其中，按重量百分比计，步骤（2）中所述的液体发酵培养基的组成为：0.1-0.9%低温脱脂豆粕，1.0-2.0%葡萄糖，0.01-0.09%KH2PO4，0.3-1%吐温80；pH值为7-10.5。
2.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于，步骤（2）所述的液体发酵培养基的组成为：按重量百分比计，0.3-0.7%低温脱脂豆粕，1.3-1.7%葡萄糖，0.03-0.07%KH2PO4，0.3-1%吐温80，pH值为7-10.5。
3.按照权利要求2所述的微生物发酵酶解法，其特征在于，步骤（2）所述的液体发酵培养基的组成为：0.57%低温脱脂豆粕，1.48%葡萄糖，0.05%KH2PO4，0.5%吐温80；pH值为9。
4.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于，步骤（1）中所述的大豆预处理方式为：磨碎、超声波处理或挤压膨化。
5.按照权利要求4所述的微生物发酵酶解法，其特征在于，步骤（1）中所述的大豆预处理方式为挤压膨化；所述挤压膨化在以下条件下进行：物料含水率为13%-17%，挤压膨化机套筒温度为85-110℃，螺杆转速95-115r/min。
6.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（2）中所述的发酵条件为：按体积比计，将4-7%枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）种子液接入到液体发酵培养基中，其中，液体发酵培养基与发酵瓶的体积比为1:5，33-39℃下120-200r/min振荡培养30-54小时。
7.按照权利要求6所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：将4-7%枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）种子液接入到液体发酵培养基中，在34-38℃下150-170r/min振荡培养32-50小时。
8.按照权利要求7所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：将4-7%枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）种子液接入到液体发酵培养基中，在35℃下160r/min振荡培养42小时。
9.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中,预处理粉碎后的大豆粉为全脂豆粉，将发酵培养液在4℃条件下以5000转恒温离心20分钟，将上清液与水混合，在碱性酶活为2000-3000u/g全脂豆粉，中性蛋白酶活力为1500-2000u/g全脂豆粉的条件下，接入膨化全脂豆粉进行酶解；其中膨化全脂豆粉为过70-120目筛的膨化全脂豆粉。
10.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中所述的酶解温度为55℃；所述的酶解时间为6小时。
11.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中，预处理粉碎后的大豆粉为全脂豆粉，全脂豆粉与混合液的重量比例为1：6-10。
12.按照权利要求11所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中全脂豆粉与混合液的重量比例为为1：7。
13.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中将酶解液的pH值调至为8-11。
14.按照权利要求13所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（3）中将酶解液的pH值调至为10。
15.按照权利要求1所述的微生物发酵酶解法，其特征在于：步骤（4）中将所得到的残渣进行如下处理：将残渣用水洗后离心分别得到乳化层、水洗液和残渣；合并乳状液与乳化层，破乳，获得游离油；步骤（5）中调节水解液pH值至4.5，离心后沉淀用水清洗，再次离心，将沉淀用水溶解后调节pH值至7，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。
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