CN102286601B - 一种发酵制备花生抗氧化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，包括以下步骤：低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水，超声波分散溶解，调节pH值，灭菌，冷却；接入菌种种子培养液，发酵培养；超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。以本发明制得的花生抗氧化肽产品具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用、铁还原力、钼还原力、铁离子螯合能力、铜离子螯合能力、抑制脂质体过氧化活性、抗亚油酸体系氧化作用、抗油脂过氧化能力等抗氧化活性，操作简便，反应条件温和，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，属于食品蛋白加工领域。
背景技术
随着自由基生命科学研究的不断进展，氧化应激损伤和抗氧化保护作用的研究受到了人们的日益关注。严重的氧化应激状态下，当活性氧的浓度超过细胞防御能力时，氧化损伤就可改变细胞的结构和功能，影响机体健康。同样，食品是一系列复杂的体系，过多的自由基存在也会严重影响体系的稳定性。现代食品工业的发展表明，通过添加具有抗氧化活性物质的方法可以增加食品体系的稳定性。随着营养学和生物技术的发展，人们发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类，由于其特殊的结构特点，食用安全性更高，抗氧化活性更为显著，亦可归属于抗氧化剂，作为人体内清除自由基的物质来源。
目前，酶解法制备抗氧化肽主要有两种工艺技术：蛋白酶酶解法和发酵法。蛋白酶酶解法反应条件温和，可得到一定分子量范围的抗氧化肽产品，现在主要使用的方法是蛋白酶酶解法，但由于酶的底物专一性和酶的空间构象的限制，使得蛋白酶酶解法只能利用分离蛋白作为底物，增加了操作成本。
发酵法利用微生物生长繁殖时能产生蛋白酶的原理，直接将微生物与原料混合一起进行发酵，省去了提取分离蛋白的步骤。此外，微生物除了产生蛋白酶外，还能产生纤维素酶、植酸酶等，可以分解细胞壁，有利于蛋白与蛋白酶的活性位点结合，提高水解效率，增加酶解产物的抗氧化活性，降低生产成本，但发酵法在动物血清蛋白抗氧化肽制备中有报道，在植物特别是花生抗氧化肽提取中仍未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种操作简便、反应条件温和，可连续化生产具有较好抗氧化活性的花生抗氧化肽的发酵制备方法。
花生蛋白质含量为25～36%，其生物价为58，蛋白质效价为1:7，含18种氨基酸，包括8种必需氨基酸，研究表明，蕴藏在花生蛋白质肽链中的一些短肽具有抗氧化活性。由于枯草芽孢杆菌能产蛋白酶，黑曲霉能产蛋白酶、纤维素酶和植酸酶，米曲霉能产蛋白酶和纤维素酶，本发明拟采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合菌种作为发酵菌种，通过固体发酵或液体发酵方法制备花生抗氧化肽，以提高酶解效率和抗氧化肽的抗氧化活性，为花生抗氧化肽的开发提供新途径。
为达到上述目的，本发明采用以下步骤：
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水，搅拌均匀，超声波分散溶解，调节pH值，灭菌，冷却；接入菌种种子培养液，发酵培养；超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。
具体来说，所述的方法如下：
（1）低变性脱脂花生蛋白粉中加入蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀，超声波分散溶解，调节pH值，灭菌，冷却；
（2）接入菌种种子培养液，固体发酵或液体发酵培养，得到发酵物；
（3）发酵物经超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。
优选地，步骤（1）所述的低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6.5ml/g原料（固体发酵），19.5ml/g原料（液体发酵），超声波分散溶解条件：超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为25℃，时间为15min，用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.5~7.5，高压灭菌锅内121℃灭菌15min。
优选地，步骤（2）所述的菌种种子培养液为枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合种子培养液，接入量为22.5%（固体发酵），6.5%（液体发酵），枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的菌龄分别为46h、70h和38h，混合种子培养液中它们的比例为枯草芽孢杆菌：黑曲霉：米曲霉=1.8:1.4:1.8，固体发酵条件为：温度31.5℃，培养箱中静置培养34h，液体发酵条件为：温度34.5℃，以65r/min转速，摇瓶振荡培养36h。
优选地，步骤（3）所述的发酵物经超声波辅助酶解的方法是：固体发酵物加入10~15ml/g原料的蒸馏水后超声波辅助酶解，而液体发酵物直接超声波辅助酶解，超声波辅助酶解的条件：超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为48.5℃，时间为22.5min，灭酶的条件为100℃恒温水浴中灭酶18min，离心条件为12℃，6500r/min转速离心12min。
本发明的有益效果在于：本发明制备的花生抗氧化肽产品具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用、铁还原力、钼还原力、铁离子螯合能力、铜离子螯合能力、抑制脂质体过氧化活性、抗亚油酸体系氧化作用、抗油脂过氧化能力等体外抗氧化活性，可以作为功能食品用于清除体内自由基、预防和辅助治疗现代文明病，也可以作为天然抗氧化剂用在食品的贮藏和保鲜中，延长食品货架期；发酵制备花生抗氧化肽的方法反应条件温和，环境友好，可大批量连续化生产，为花生抗氧化肽的开发提供了新的途径。
具体实施方式
实施例1
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6.5ml/g原料，玻璃棒搅拌均匀，以超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为25℃的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊状物，用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.86，在高压灭菌锅内，121℃灭菌15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌：黑曲霉：米曲霉=1.8:1.4:1.8比例混合的种子培养液，接入量为22.5%，在培养箱中，以温度31.5℃，静置固体发酵培养34h，得到固体发酵物；在固体发酵物中加入12.5ml/g原料的蒸馏水，在超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为48.5℃的条件下，超声波辅助酶解22.5min；在100℃恒温水浴中灭酶18min，冷却到室温，在12℃条件下，6500r/min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除羟自由基的IC50值为0.35mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为1.47mg/mL，清除DPPH自由基的IC50值为1.39mg/mL，对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC50值为0.53mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为4.14mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为1.26mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为1.71mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为1.48mg/mL，抑制脂质体过氧化活性的IC50值为1.82mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC50值为2.06mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC50值为2.13mg/mL。
实施例2
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6.5ml/g原料，玻璃棒搅拌均匀，以超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为25℃的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊状物，用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.62，在高压灭菌锅内，121℃灭菌15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌：黑曲霉：米曲霉=1.8:1.4:1.8比例混合的种子培养液，接入量为22.5%，在培养箱中，以温度31.5℃，静置固体发酵培养34h，得到固体发酵物；在固体发酵物中加入14.5ml/g原料的蒸馏水，在超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为48.5℃的条件下，超声波辅助酶解22.5min；在100℃恒温水浴中灭酶18min，冷却到室温，在12℃条件下，6500r/min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除羟自由基的IC50值为0.57mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.98mg/mL，清除DPPH自由基的IC50值为1.02mg/mL，对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC50值为0.42mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为2.46mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为0.99mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为1.24mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为1.11mg/mL，抑制脂质体过氧化活性的IC50值为1.43mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC50值为1.08mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC50值为1.29mg/mL。
实施例3
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水19.5ml/g原料，玻璃棒搅拌均匀，以超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为25℃的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉悬浮液，用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.28，在高压灭菌锅内，121℃灭菌15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌：黑曲霉：米曲霉=1.8:1.4:1.8比例混合的种子培养液，接入量为6.5%，在摇床中，以温度34.5℃，摇瓶液体发酵培养36h，得到液体发酵物；取液体发酵物，在超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为48.5℃的条件下，超声波辅助酶解22.5min；在100℃恒温水浴中灭酶18min，冷却到室温，在12℃条件下，6500r/min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除羟自由基的IC50值为0.17mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.49mg/mL，清除DPPH自由基的IC50值为0.61mg/mL，对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC50值为0.33mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为1.09mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为0.65mg/mL，铁离子螯合力的IC50值为0.58mg/mL，铜离子螯合力的IC50值为0.43mg/mL，抑制脂质体过氧化活性的IC50值为0.41mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC50值为0.75mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC50值为0.28mg/mL。
Claims (1)
1.一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，包括以下步骤：
（1）低变性脱脂花生蛋白粉中加入蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀，超声波分散溶解，调节pH值，灭菌，冷却；
（2）接入菌种种子培养液，固体发酵或液体发酵培养，得到发酵物；
（3）发酵物经超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽；
步骤（1）所述的低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水，6.5ml/g原料时固体发酵，19.5ml/g原料时液体发酵，超声波分散溶解条件：超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为25℃，时间为15min，用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.5~7.5，高压灭菌锅内121℃灭菌15min；
步骤（2）所述的菌种种子培养液为枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合种子培养液，接入量为22.5%时固体发酵，6.5%时液体发酵，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的菌龄分别为46h、70h和38h，混合种子培养液中它们的比例为枯草芽孢杆菌：黑曲霉：米曲霉=1.8:1.4:1.8，固体发酵条件为：温度31.5℃，培养箱中静置培养34h，液体发酵条件为：温度34.5℃，以65r/min转速，摇瓶振荡培养36h；
步骤（3）所述的发酵物经超声波辅助酶解的方法是：固体发酵物加入10~15ml/g原料的蒸馏水后超声波辅助酶解，而液体发酵物直接超声波辅助酶解，超声波辅助酶解的条件：超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为48.5℃，时间为22.5min，灭酶的条件为100℃恒温水浴中灭酶18min，离心条件为12℃，6500r/min转速离心12min。
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