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CN102282165A - Gdnf剪接变体及其用途 - Google Patents

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CN102282165A CN2008801228304A CN200880122830A CN102282165A CN 102282165 A CN102282165 A CN 102282165A CN 2008801228304 A CN2008801228304 A CN 2008801228304A CN 200880122830 A CN200880122830 A CN 200880122830A CN 102282165 A CN102282165 A CN 102282165A
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arg
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莉娜·尼瓦莱塔
马特·萨尔马
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Abstract

本发明涉及神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白和基因，更具体来说，涉及GDNF蛋白的新的剪接变体，该剪接变体由新的剪接变体pre-(γ)pro-GDNF编码，其分泌受到生物学调控。

Description

GDNF剪接变体及其用途
技术领域
本发明涉及神经胶质细胞系来源的神经营养因子(Glial CellLine-Derived Neurotrophic Factor，GDNF)蛋白及其cDNA，更具体来说，涉及被称为(γ)pro-GDNF的GDNF蛋白的新剪接变体，该变体由新的mRNA剪接变体pre-(γ)pro-GDNF编码，并以神经元活性依赖性的方式分泌。本发明涉及(γ)pro-GDNF蛋白、其cDNA和它的部分的用途。
背景技术
GDNF是支持周围交感神经、副交感神经、肠神经和感觉神经的神经元以及中脑多巴胺神经元和运动神经元的发育和存活的神经营养因子。在帕金森氏症(PD)的多种动物模型中，GDNF可以预防神经毒素诱导的多巴胺神经元的死亡，并且促进轴突出芽最终导致功能的恢复。被称为pre-(α)pro-GDNF(先前称为GDNFα)和pre-(β)pro-GDNF(先前称为GDNFβ)的两种GDNF剪接变体已有描述(Suter-Crazzolara and Unsicker，Neuroreport，5：2486-2488(1994))。这些剪接变体是通过GDNF mRNA的不同剪接产生的。
多种分泌蛋白包括神经营养因子都是以前体、前-原-成熟蛋白的形式合成的。由ER信号肽构成的前区(pre region)在翻译过程中被信号肽酶剪掉，原-成熟蛋白在合成后立即被释放到ER腔中。成熟蛋白的蛋白水解切割可以发生在细胞内或胞外基质或者这两种情况都有。原-成熟蛋白还可以保持不被切割的状态，具有不同于切割好的成熟蛋白的功能。例如，神经细胞既分泌成熟的脑来源神经营养因子(BDNF)，也分泌原-BDNF。成熟BDNF与TrkB受体结合，诱导神经元存活、分化和突触调制，而原-BDNF与p75NTR和分拣蛋白(sortilin)受体结合，诱发细胞凋亡(参见Thomas and Davies，Curr.Biol，15：262-264(2005)；Teng et al，J.Neurosci.，25：5455-5463(2005)等综述)。
GDNF剪接变体含有氨基端信号序列(前区)和会被从成熟结构域切下的原序列(Lin et al.，Science，260：1130-1132(1993))(图1)。(β)pro-GDNF的原区(pro-region)比(α)pro-GDNF的原区少26个氨基酸(aa)(Trupp et al.，J.Cell Biol，130：137-148(1995))。这两种剪接变体产生的成熟GDNF蛋白非常可能是一样的。成熟GDNF由134个氨基酸(aa)组成，含有两个推测的N-糖基化位点和7个保守半胱氨酸，这些半胱氨酸与TGF-β蛋白家族的其他成员处于同样的相对间距(Lin et al.，Science，260：1130-1132(1993)；Eigenbrot and Gerber，Nat.Struct.Biol，4：435-438(1997)；Chang et al.，Endocri.Rev.，23：787-823(2002))(图1)。生物活性的成熟GDNF二聚体是通过单体中未配对的半胱氨酸之间的共价二硫键形成的(Eigenbrot and Gerber，Nat.Struct.Biol.4：435-438(1997))。
在科学文献中，GDNF mRNA和GDNF蛋白这两个名称已被用于全长pre-((α)pro-GDNF mRNA和(α)pro-GDNF蛋白被蛋白水解切割产生的成熟GDNF蛋白。对于成熟GDNF蛋白已有广泛深入的研究，在PubMed中GDNF有2500个以上的引用。GDNF的鉴定基于其提高神经突长度、细胞大小和多巴胺能神经元数量的能力，以及它们摄入培养基中多巴胺的高亲和力(Linet al.，Science，260：1130-1132(1993))。GDNF在PD动物模型中以及PD患者的治疗中，是保护黑质多巴胺能神经元抗毒素诱导的降解的有力因子(综述见Airaksinen and Saarma，Nat.Rev.Neurosci.3：383-394(2002)，和Bespalovand Saarma，Trends Pharmacol.Sci.28：68-74(2007))。此外，GDNF在治疗肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)、成瘾症、酗酒和抑郁症的动物模型中具有医疗作用(综述见Bohn，Exp.Neurol，190：263-275(2004)；Messer et al.，Neuron，26：247-257(2000)；He et al.，J.Neurosci.，25：619-628(2005)；Angelucci et al.，Int.J.Neuropsycho-pharmacol.，6：225-231(2003))。GDNF在神经系统之外也有重要作用。它是肾发育过程中的形态发生素，并且能够调节精原细胞的分化(综述见Sariola and Saarma，J.Cell Sci.116：3855-3862(2003))。
在例如美国专利6,362,319和欧洲专利0610254中公开了(α)pro-GDNF蛋白，截短形式的GDNF在美国专利6,184,200和欧洲专利0920448中有公开。已经利用成熟GDNF蛋白进行了治疗帕金森氏症的临床试验。临床前试验中得到的结果很有希望(Gill et al.，Nat.Med.，9：589-595(2003)；Slevinet al，J.Neurosurg.，102：401(2005))，但是I/II期临床试验的结果不令人满意。据报道帕金森氏症的症状没有统计学上显著的改善，并且存在着潜在的安全风险。因此，成熟GDNF蛋白的临床试验被全部终止(Lang et al.，Ann.Neurol，59：459-466(2006))。
pre-(β)pro-GDNF mRNA剪接变体由Suter-Crazzolara和Unsicker(Neuroreport，5：2486-2488)在1994年首次描述了存在于大鼠组织，由Matsushita等(Gene，203：149-157(1997))在1997年描述存在于小鼠组织，Grimm等(Hum.MoI.Genet.，12：1873-1886(1998))l998年报道存在于人组织。除了mRNA的表达数据，Trupp等(J.Cell Biol，130：137-148(1995))显示，pre-(β)pro-GDNF cDNA所编码的分泌的GDNF蛋白在E10鸡椎旁交感神经元中促进了强健存活、广泛的神经突生长并提高了细胞体的大小。
发明概述
本申请中描述的发明显示，除了以前知道的被称为pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF的GDNF mRNA剪接变体，还存在着第三个不同的剪接变体，称为pre-(γ)pro-GDNF(图3和4)。人pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF的开放读码框(ORFs)从外显子2开始，而pre-(γ)pro-GDNF剪接变体缺少整个外显子2的序列，而是在外显子1中含有替代的蛋白翻译起始密码子CTG(图2)。
pre-(γ)pro-GDNF mRNA所编码的(γ)pro-GDNF蛋白的前原区长度为47个氨基酸(aa)，比(α)pro-GDNF的前原区短30个aa(图1)。pre-(γ)pro-GDNF的前原区的26个C末端aa由外显子3编码，因此与pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF中的相应区域相同。(γ)pro-GDNF的前21个aa由外显子1编码，是该剪接变体特有的(图2)。由这三种GDNF剪接变体产生的成熟GDNF蛋白非常可能是一样的(图1)。
我们的结果显示(α)pro-GDNF、(β)pro-GDNF和(γ)pro-GDNF以原-GDNF蛋白和成熟蛋白的形式分泌，其中成熟蛋白是原-GDNF被蛋白水解切割产生的。(α)pro-GDNF和成熟GDNF的分泌是组成性的，而(β)pro-GDNF和(γ)pro-GDNF的分泌是神经元活性依赖性的，即受到神经元和神经生理刺激的调节。这使得(β)pro-GDNF和(γ)pro-GDNF以及它们的编码cDNAs比(α)pro-GDNF及其cDNA更有可能成为基因疗法治疗PD的治疗分子。
因此，本发明的主要对象是由人pre-(γ)pro-GDNF剪接变体编码的，包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的纯化和分离的人(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体。作为对比，我们也纯化和分离了由小鼠pre-(γ)pro-GDNF剪接变体编码的，包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的小鼠(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体。
发明的另一个对象是人(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的修饰，其中氨基端亮氨酸残基被甲硫氨酸残基代替。所述修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
发明的再一个对象是人pre-(γ)pro-GDNF的成熟多肽部分，包含SEQ IDNO：2中的氨基酸1到134，以及(γ)pro-序列，即SEQ ID NO：2中氨基酸-47到-1的序列部分，这部分具有调控功能但不含信号序列。
发明的一个对象是人(γ)ro-GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，以及修饰的前-原序列，这两个氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：21所示。SEQ ID NO：21中显示的具有调控功能的前-原序列的(γ)pro部分也包含在本发明中。
人(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的截短形式，即缺少成熟多肽部分中N末端的38个氨基酸(SEQ ID NO：24)，及其如上所述的Leu-Met修饰(SEQ IDNO：26)也是发明的对象。
人(γ)pro-GDNF剪接变体的V34M突变体(SEQ ID NO：27)及其如上所述的Leu-Met修饰(SEQ ID NO：29)也是发明的对象。
本发明的再一方面是纯化的、分离的和V38M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(β)pro-GDNF)，以及所述pre-(β)pro-GDNF的截短形式，该截短形式缺少成熟多肽部分N末端的38个氨基酸。这些蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：35所示。另外，pre-(β)pro-GDNF剪接变体及编码该变体的多核苷酸(如SEQ IDNO：51所示)在特别是利用基因疗法治疗神经系统疾病(neurological disorder)或神经退行性疾病(neurodegenerative disease)中的用途，也是发明的一个具体方面。
发明还涉及纯化的、分离的和V64M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(α)pro-GDNF)。其氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。
发明的另一些对象是编码以上指定形式的GDNF蛋白剪接变体的分离的多核苷酸。
特异结合(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的抗体构成本发明的再一对象。还提供了与(α)pro-GDNF、(β)pro-GDNF和/或(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的原部分特异结合的抗体。此外，还考虑了与pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区特异结合的抗体。
本发明的一个优选项提供了重组形式的人pre-(γ)pro-GDNF剪接变体编码的蛋白。
应当理解，可以从其他哺乳动物中获得同源pre-(γ)pro-GDNF分子及其编码序列。作为一个实例，提供了包含如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的小鼠(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体。
附图简述
图1是pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF mRNA编码的蛋白的结构示意图。为了清楚起见，包含了氨基端的信号序列(前区)，虽然它们在蛋白翻译过程中已被切除。图中显示了成熟分子中的氨基酸(以
Figure BPA00001167896000051
表示)，原区中的氨基酸(以
Figure BPA00001167896000052
表示)、前区中的氨基酸(以
Figure BPA00001167896000053
表示)的数量。在pre-(γ)pro-GDNF中，前原区以示。7个保守半胱氨酸的相对位置以黑色条带指示。GDNF中两个推测的N-糖基化位点标有箭头。
图2显示了pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF剪接变体的特点。在GDNF cDNA中，剪接变体的ORFs显示为
Figure BPA00001167896000055
未翻译的(UTR)区域显示为
Figure BPA00001167896000056
pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF的ORFs被分为外显子2和3，pre-(γ)pro-GDNF的分为外显子1和3。pre-(β)pro-GDNF剪接变体的外显子2的3’区缺少78bp。pre-(γ)pro-GDNF剪接变体的外显子1中含有替代的蛋白翻译起始密码子CTG，和一个独特的61bp的序列。成熟GDNF由外显子3编码，在全部三种剪接变体中很可能一样。
图3。通过RT-PCR分析的小鼠GDNF mRNA在肾组织中的表达。泳道1：胚胎第13天(E 13)肾组织；泳道2：E15肾组织；泳道3：E17肾组织；泳道4：产后第1天(P1)肾组织；泳道5：P5肾组织；泳道6：P6肾组织；泳道7：空泳道；泳道8：PCR阴性对照。pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF变体标有箭头。在样品E13-P1中检测到pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF变体。样品E13、E15和P1中检测到pre-(γ)pro-GDNF变体。
图4。通过RT-PCR分析的GDNF mRNA在成人脑组织中的表达。泳道1和2：成人脑组织；泳道3：PCR阳性对照；泳道4：阴性PCR对照。pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF变体标有箭头。
图5。小鼠(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF蛋白在CH0细胞中表达的分析。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，用小鼠抗GDNF抗体(3.3μg/样品)将GDNF免疫沉淀，利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。泳道1：转染了小鼠pre-(α)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道2：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3：未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物；泳道4：转染了小鼠pre-(α)pro-GDNF的细胞、培养基；泳道5：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的细胞、培养基；泳道6：未转染的细胞(阴性对照)、培养基。
图6。人(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF蛋白在CH0细胞中表达的分析。含有人pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)中的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。泳道1：转染了人pre-(α)pro-GDNF的细胞，细胞裂解物；泳道2：转染了人pre-(β)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3：未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物；泳道4：转染了人pre-(α)pro-GDNF的细胞、培养基；泳道5：转染了人pre-(β)pro-GDNF的细胞、培养基；泳道6：未转染的细胞(阴性对照)、培养基。
图7。小鼠(γ)pro-GDNF蛋白在BHK细胞中表达的分析。含有小鼠pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的pre-(γ)pro-GDNF cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的BHK细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μ质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，用小鼠抗GDNF抗体(3.3μg/样品)将GDNF免疫沉淀，利用15％变性SDS-PAGE胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。泳道1：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道2：转染了小鼠pre-(γ)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3：未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物。
图8A和8B。人(γ)pro-GDNF蛋白在BHK和COS-7细胞中表达的分析。含有人pre-(γ)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs(含有ATG或CTG作为蛋白翻译的起始密码子)克隆到pAAV-MCS(Stratagene)或pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的BHK细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集培养基(上清)，利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。图8A：泳道1：转染了含有人pre-(γ)pro-GDNF(翻译起始密码子为ATG)的pAAV-MCS的BHK细胞、培养基；泳道2：转染了含有人pre-(γ)pro-GDNF(带有翻译起始密码子CTG和终止密码子)的pEGFP-Nl的BHK细胞、培养基。图8B：泳道1：转染了含有人pre-(γ)pro-GDNF(翻译起始密码子为ATG)的pAAV-MCS的COS-7细胞、培养基；泳道2：未转染的COS-7细胞(阴性对照)、培养基。
图9A和9B。GDNF在分化PC-6.3细胞中的亚细胞定位的免疫荧光分析。含有人pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。PC-6.3细胞在转染前，在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)(DMEM)、5％HS(Gibco)、2.5％FCS和50ng/ml神经生长因子(NGF)的分化培养基中分化3天。转染后24小时，将细胞用4％PFA固定，或者先用50mM KCl和50μg/ml环己亚胺刺激2小时，使蛋白合成停止，然后用4％PFA固定。所有细胞用0.5％BSA(Sigma)封闭，并用0.1％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5％BSA中的一抗，即多克隆抗GDNF(Gene Way Biotech Inc.；1∶750稀释)和成熟高尔基体的单克隆抗GM130(Abeam；1∶100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。图9A：pre-(α)pro-GDNF(白色)或pre-(β)pro-GDNF(灰色)编码的蛋白在未被刺激的PC-6.3细胞中的亚细胞定位的定量。显示了蛋白在单独高尔基体中或者在囊泡+/-高尔基体中的百分比(n＝3)。*P＝0.0023.误差条显示SD。图9B：Q pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF编码的蛋白在分化PC-6.3细胞中的亚细胞定位的定量。显示了蛋白在单独高尔基体中、在囊泡+/-高尔基体中或者在单独囊泡中的百分比(n＝3)。细胞没有处理(oh)或者用50mM KCl和50μg/ml环己亚胺处理2小时(2h)。
图10。收集自分化PC-6.3细胞的细胞培养基中的小鼠GDNF Western印迹分析。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10％马血清(HS)、5％胎牛血清(FCS)和抗生素的DMEM中的PC-6.3细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基替换为含有5％HS和2.5％FCS、50mg/ml神经生长因子(NGF)和抗生素的DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的25mM KCl将PC-6.3细胞去极化5小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。在细胞培养基中，pro-GDNF、加工过的中间体pro-GDNF和成熟GDNF条带标有箭头。泳道1：转染了小鼠pre-(α)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道2：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道3：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道4：转染了小鼠pre-(β)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基。
图11。收集自分化PC-6.3细胞的细胞培养基中的人GDNF Western印迹分析。含有人pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。将生长在含有10％HS、5％FCS和抗生素的DMEM中的PC-6.3细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基替换为含有5％HS和2.5％FCS、50mg/ml NGF和抗生素的DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的50mM KCl将PC-6.3细胞去极化5小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗GDNF抗体(SantaCruz，1∶500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。泳道1：转染了人pre-(α)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道2：转染了人pre-(α)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道3：转染了人pre-(β)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基；泳道4：转染了人pre-(β)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基。
图12A和12B。通过ELISA分析确定PC-6.3细胞中的GDNF浓度。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。在pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中含有不带终止密码子的大鼠前-原-BDNF的表达构建体作为对照。将生长在含有10％HS、5％FCS和抗生素的DMEM中的PC-6.3细胞接种至24孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染0.8μg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有5％HS和2.5％FCS、50mg/ml NGF和抗生素的DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的50mM KCl将PC-6.3细胞去极化2小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用GDNF Emax ImmunoAssay System(Promega)分析GDNF，利用BDNF Emax ImmunoAssay System(Promega)分析BDNF。图12A：第1栏：转染了人pre-(α)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基；第2栏：转染了人pre-(α)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基；第3栏：转染了人pre-(β)pro-GDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基；第4栏：转染了人pre-(β)pro-GDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基，(n＝3).*，P＝0.092227。误差条表示SD。图12B：第1栏转染了大鼠前-原-BDNF的去极化的PC-6.3细胞、培养基；第2栏转染了大鼠前-原-BDNF的未去极化的PC-6.3细胞、培养基，(n＝3).*，P＝0.00307。误差条表示SD。
图13A和13B。321/pro-GDNF抗体识别CH0细胞中pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。含有人pre-(β)pro-GDNF、人pre-(γ)pro-GDNF的表达构建体(含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-GDNF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。由空的pEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至4孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染0.8μg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10％FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后24小时，用4％仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0.1％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5％BSA中的一抗，即抗GDNF原-结构域的多克隆321/pro-GDNF(1∶200稀释)和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1∶100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。图13A：在CHO细胞中过表达小鼠(α)pro-GDNF、人(β)pro-GDNF、人(γ)pro-GDNF和没有原区的人成熟GDNF，用321/pro-GDNF(红色)和抗GDNF(绿色)双重免疫荧光染色。将未转染的细胞染色作为对照。细胞核以蓝色显示。图13B：在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用321/pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。
图14A和14B。320/(α)pro-GDNF抗体识别CHO细胞中pre-(α)pro-GDNF的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。含有人pre-(γ)pro-GDNF的表达构建体(含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-GDNF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。由空的pEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染0.8μg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10％FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后24小时，用4％仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0.1％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5％BSA中的一抗，即抗(α)pro-GDNF原-结构域的多克隆320/(α)pro-GDNF(1∶200稀释)和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1∶100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。图14A：在CHO细胞中过表达小鼠(α)pro-GDNF、小鼠(β)pro-GDNF、人(γ)pro-GDNF和没有原区的人成熟GDNF，用320/(α)pro-GDNF(红色)和抗GDNF(绿色)双重免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图14B：在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用320/(α)pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。
图15A和15B。322/(β)pro-GDNF抗体识别CHO细胞中pre-(β)pro-GDNF的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。含有人pre-(γ)pro-GDNF的表达构建体(含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-GDNF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。由空的pEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染0.8μg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10％FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后24小时，用4％仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0.1％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5％BSA中的一抗，即抗(β)pro-GDNF原-结构域的多克隆322/(β)pro-GDNF(1∶200稀释)和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1∶100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。图15A：在CHO细胞中过表达小鼠(α)pro-GDNF、小鼠(β)pro-GDNF、人(γ)pro-GDNF和没有原区的人成熟GDNF，用322/(β)pro-GDNF(红色)和抗GDNF(绿色)双重免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图15B：在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用322/(β)pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。
图16A、16B和16C。321/pro-GDNF抗体识别CHO细胞中pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF的原-结构域特异性的Western印迹分析。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基换成2ml OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，将培养基浓缩，样品利用15％变性SDS-PAGE胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用多克隆321/pro-GDNF抗体(1∶500稀释)或抗成熟GDNF的多克隆D20抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)以及偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。泳道1：转染了人pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF的CHO细胞、细胞；泳道2：转染了人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(α)pro-GDNF的CHO细胞、细胞；泳道3：转染了人pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF的CHO细胞、培养基；泳道4：转染了人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(α)pro-GDNF的CHO细胞、培养基；泳道5：转染了人pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF的CHO细胞、细胞；泳道6：转染了人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(β)pro-GDNF的CHO细胞、细胞；泳道7：转染了人pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF的CHO细胞、培养基；泳道8：转染了人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(β)pro-GDNF的CHO细胞、培养基；泳道9：转染了表达GFP的空pEGFP-Nl载体的CHO细胞，细胞；泳道10：转染了人pAAV-MCS-pre-GDNF的CHO细胞，细胞；泳道11：转染了表达GFP的空pEGFP-Nl载体的CHO细胞，培养基；泳道12：转染了人pAAV-MCS-pre-GDNF的CHO细胞，培养基。图16A：用321/pro-GDNF抗体检测的样品。图16B：用D20抗体检测的样品。图16C：用321/pro-GDNF抗体检测(α)pro-GST和(β)pro-GST融合蛋白。
图17A、17B、17C和17D。320/(α)pro-GDNF抗体识别CH0细胞中pre-(α)pro-GDNF的原-结构域特异性的Western印迹分析。将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。转染后4小时，将培养基换成2ml OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，将培养基浓缩，样品利用15％变性SDS-PAGE胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用多克隆320/(α)pro-GDNF抗体(1∶500稀释)或多克隆D20抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)以及偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。细胞转染了以下构建体：泳道1小鼠pre-(α)pro-GDNF-pEGFP-Nl；泳道2人pre-(α)pro-GDNF-pEGFP-Nl；泳道3人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(α)pro-GDNF；泳道4人pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF；泳道5小鼠pre-(β)pro-GDNF-pEGFP-Nl；泳道6人pre-(β)pro-GDNF-pEGFP-Nl；泳道7人pAAV-IRES-hrGFP-pre-(β)pro-GDNF；泳道8人pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF；泳道9表达GFP的空pEGFP-Nl载体；泳道10没有原区的pAAV-MCS-pre-GDNF。图17A：用320/(α)pro-GDNF抗体检测的CHO细胞，细胞。图17B：用320/(α)pro-GDNF抗体检测的CHO细胞，培养基。图17C：用D20抗体检测的CHO细胞，细胞。图17D：用D20抗体检测的CHO细胞，培养基。
发明详述
缩略语
aa          氨基酸
ALS         肌萎缩侧索硬化症
AtT-20      细胞系小鼠垂体肿瘤细胞系
BDNF        脑来源的神经营养因子
BHK-21      幼仓鼠肾细胞系
bp          碱基对
BSA         牛血清清蛋白
CDR         补决定区
CHO         细胞系中国仓鼠卵巢细胞系
COS-7SV40   转化的猴肾细胞系
DMEM             达尔伯克氏改良伊格尔培养基
ELISA            酶联荧光吸收法
ER               内质网
FCA              弗氏完全佐剂
FCS              胎牛血清
FIA              弗氏不完全佐剂
GDNF             神经胶质细胞系来源的神经营养因子
GFP              绿色荧光蛋白
HC               海马
HEK-293细胞系    人胚胎肾细胞系
HPLC             高效液相层析
HRP              辣根过氧化物酶
HS               马血清
KLH              匙孔嘁血蓝蛋白
LTR              长末端重复
MALDITOF-MS      基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
MPL-TDM          单磷酰脂A-合成的海藻糖二霉菌酸酯
NGF              神经生长因子
nt               核苷酸
ORF              开放读码框
PBS              磷酸盐缓冲液
PC-6.3细胞系     大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC 12克隆
PD               帕金森氏症
PFA              多聚甲醛
RT               室温
RT-PCR           逆转录酶聚合酶链式反应
SD               标准差
TMB              3，3′，5，5′-四甲基联苯胺
TGF-β           转化生长因子β
UTR区            未翻译区域
利用RT-PCR分析，我们从小鼠肾和脑组织中以及人脑、肾和子宫组织中鉴定到编码GDNF mRNA剪接变体的三个cDNAs。为了进一步对这些cDNA分子进行表征，我们将其克隆到转移和表达载体中，并进行了测序。
这三个GDNF剪接变体mRNA之间的不同存在于编码GDNF蛋白的前原区的外显子1和2中，而外显子3中编码原区最后26aa和成熟GDNF的ORF在全部三个GDNF剪接变体中是相同的。与pre-(α)pro-GDNF相比，pre-(β)pro-GDNF mRNA的外显子2的3’末端缺少78bp(Grimm et al，Hum.MoI.Genet.，7：1873-1886(1998))。与pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF相比，pre-(γ)pro-GDNF mRNA缺少整个外显子2，但在外显子1的3’末端有61bp的独特序列。
为了研究人和小鼠(β)pro-GDNF和(γ)pro-GDNF是否分泌的，我们通过瞬时转染编码相应GDNF剪接变体的cDNA和Western印迹分析，分析了它们在不同细胞系的表达和分泌情况。我们发现，人和小鼠(β)pro-GDNF及其成熟GDNFs均从CHO、HEK-293、PC-6.3和AtT-20细胞系中分泌出来。此外，小鼠(γ)pro-GDNF及其成熟GDNF从CHO、PC-6.3和BHK-21细胞系分泌，人(γ)pro-GDNF(其中翻译起始密码子CTG被ATG起始密码子代替)及其成熟GDNF从BHK-21细胞系分泌。
为了分析小鼠和人(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF的分泌是组成性的还是被神经元活性刺激，即神经元活性依赖性的，我们在未去极化和去极化的分化PC-6.3细胞中利用瞬时GDNF cDNA转染、Western印迹分析、ELISA分析；在大鼠HC原代细胞中利用瞬时转染和ELISA分析，分析了它们的表达和分泌。结果显示(α)pFo-GDNF的分泌是组成性的，而(β)pro-GDNF的分泌是活性依赖性的，表明(β)pro-GDNF pro区域中缺失的26bp对活性依赖性分泌很关键。(γ)pro-GDNF的原区缺失相同的26bp，暗示其分泌也是活性依赖性的。
定义
除非另有定义，所有的技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的意义相同。为了清楚起见，给出以下定义。
“分离的”在用于分子时，是指从其天然所属环境成分中鉴定并分离和/或收集了该分子，因此是被“人类的手”由其天然状态改变过的。例如，分离的多核苷酸可以是载体或组合物的一部分，或者可以包含在细胞中，而仍是“分离的”，因为所述载体、组合物或具体细胞不是该多核苷酸的原始环境。术语“分离的”不包括被本领域认为与本发明的多核苷酸序列相比没有区别性特征的基因组或cDNA文库、全细胞总RNA或mRNA制剂、基因组DNA制剂、剪切过的全细胞基因组DNA制剂或其他组合物。
“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、利用核苷酸类似物制备的DNA或RNA类似物、以及衍生物、片段和同源物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选包含双链DNA。
“分离的核酸分子”与所述核酸的天然来源中存在的其他核酸分子是分开的。优选，分离的核酸不含这样的序列，所述序列在核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸的旁侧(即位于所述核酸的5′和3′末端)。而且，分离的核酸分子，比如cDNA分子，通过重组技术制备时，可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者通过化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物。
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(比如基因、cDNA或mRNA)的固有属性，即作为合成生物过程中其他聚合物和大分子的模板，所述聚合物和大分子或者具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或者具有确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白质，称为该基因“编码”蛋白质。编码链，即其核苷酸序列与mRNA相同并且序列表中通常给出的链，和非编码链，即作为基因或cDNA转录的模板的链，都可以称为“编码”蛋白或者所述基因或cDNA的其他产物。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包含内含子。
基因的“编码区”由基因编码链的核苷酸残基和基因非编码链的核苷酸构成，它们分别与所述基因的转录所产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
“基因组DNA”是与基因具有核苷酸序列同源性的DNA链。因此，它是细胞或生物体基因组中含有的全部DNA。
“寡核苷酸”包含一系列相连的核苷酸残基，所述寡核苷酸具有足够数量的核苷酸碱基，可以用于PCR反应或其他应用。可以基于或者由基因组或cDNA序列设计短的寡核苷酸序列，用于扩增、证实或揭示特定细胞或组织中存在相同、相似或互补的DNA或RNA。寡核苷酸包含核酸的部分。
“变体”是指与本发明的多核苷酸或多肽不同，但保持了关键特性的多核苷酸或多肽。通常，变体在整体上非常相似，许多区域中与本发明的多核苷酸或多肽是相同的。
“剪接变体”是由一个基因转录得到的不同成熟mRNA分子。这样的剪接过程称为选择性剪接，在真核细胞中可能发生。由一个基因转录和翻译产生的不同剪接变体蛋白，它们的功能可能有明显不同。
“严紧”同源物(即来源于人以外物种的pre-(γ)pro-GDNF剪接变体分子的核酸)或其他相关序列(例如旁系同源物)可以利用本领域公知的用于核酸杂交和克隆的方法，通过与作为探针的特定人序列的全部或部分进行低、中等或高严紧杂交获得。
利用cDNA、mRNA或替代的基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增技术可以用于扩增pre-(γ)pro-GDNF剪接变体。可以将这类核酸克隆到合适的载体中，通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术，例如自动DNA合成仪制备pre-(γ)pro-GDNF序列所对应的寡核苷酸。
“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异杂交并提供合成其互补多核苷酸的起点的多核苷酸。当多核苷酸引物被置于能够诱发合成的条件下，即在有核苷酸、互补多核苷酸模板和诸如DNA聚合酶的聚合剂的情况下，可发生这类合成。引物一般是单链的，但可以是双链。
引物一般是脱氧核糖核酸，但有许多合成的和天然的引物可以用于多种应用。引物与它被设计成要与之杂交的模板互补，从而作为合成的起始位点，但不需要反映模板的确切序列。在这种情况中，引物与模板的特异杂交取决于杂交条件的严紧度。引物可以标记上例如发光的、放射性的或者荧光部分，作为可检测部分。
术语“载体”用在本文中是指编码外源核酸的任何质粒或病毒。该术语还应当被理解为包括协助核酸转移到毒粒或细胞中的非质粒和非病毒的化合物，比如例如多聚赖氨酸化合物等。载体可以是适合作为将编码目标蛋白或其突变体的核酸递送到细胞的递送媒介的病毒载体，或者载体可以是适用于相同目的的非病毒载体。用于将DNA递送到细胞和组织的病毒和非病毒载体的实例是本领域已知的，在例如Ma et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12744-12746(1997))中有描述。病毒载体的实例包括，但不限于重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组禽痘病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒等(Cranage et al，EMBO J.，5：3057-3063(1986)；PCT申请WO 94/17810和PCT申请WO 94/23744)。非病毒载体的实例包括，但不限于细菌、真菌、哺乳动物、昆虫、植物或酵母载体或者脂质体、DNA的多胺衍生物等。
“探针”是不同长度的核酸序列，根据具体用途，优选有至少约10个核苷酸(nt)、100nt或许多(例如，6000nt)。探针用于检测相同、相似或互补的核酸序列。更长的探针可以从天然或重组来源获得，是高度特异的，比较短的寡聚探针杂交慢得多。探针可以是单链或双链的，其设计保证它在PCR、基于膜的杂交技术或类似ELISA技术中具有特异性。探针也可以与生物样品中的核酸分子杂交，由此能够直接使用在染色体作图、连锁分析、组织鉴定和/或分类以及多种法医学方法和本发明的诊断方法中。
“同源物”是来源于不同物种的特定基因的核酸序列或氨基酸序列。
“核酸序列同一性百分比(％)”定义为将序列对位排列并根据需要引入缺口以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与特定蛋白中相同的核苷酸的百分比。
ORF是带有起始密码子(ATG或CTG)并以三个“终止”密码子(TAA、TAG或TGA)之一结束的核苷酸序列。
术语“抗体”取其最广泛的含义，特别涵盖单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、二体和单链分子，以及抗体片段(例如Fab、F(ab′)和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性。该术语还涵盖编码上述抗体及其衍生物的DNA片段和cDNAs。
术语“单克隆抗体”用于本文是指从基本同源的抗体群(即构成群体的各个抗体是相同的，除了少量存在的可能天然发生的突变)中获得的抗体。单克隆抗体是高特异性的，针对的是单个抗原位点。并且，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每个单克隆抗体针对的是抗原上的单个决定簇。除了其特异性，单克隆抗体的优势还在于它们是通过杂交瘤培养合成的，不会污染其他免疫球蛋白。修饰词“单克隆”表明抗体是由基本同源的抗体群中获得的特点，不应理解为必须通过任何特定方法来制备。例如，适合用于本发明的单克隆抗体可以通过Kóhleretal，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或者通过重组DNA方法(参见例如，美国专利4,816,567(Cabilly et al)制备。“单克隆”抗体还可以利用例如Clackson et al，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI.Biol，222：581-597(1991)中描述的方法从噬菌体抗体文库中分离。
文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及这些抗体的片段，只要它们表现出需要的生物活性。所述嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的其他部分与来自另一物种的抗体或者属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或者同源，(Cabilly et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3273-3277(1984)；Cabilly et al，Gene，40：157-161(1985)；Cabilly et al，Gene，85：553-557(1989)；Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
本发明的抗体还可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。可以在哺乳动物中培育多克隆抗体，例如通过将免疫剂，如果需要的话，和佐剂一起给予各种宿主动物来诱发产生含有抗原特异的多克隆抗体的血清，其中所述宿主动物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等。通常，免疫剂和/或佐剂可以通过多次皮下或腹腔内注射给予哺乳动物。免疫剂可以包括前-原-GDNF多肽，多肽的合适的部分或融合蛋白。给蛋白质偶联上已知在被免疫动物中是免疫原性的试剂可能有用。这类免疫原性蛋白的实例包括，但不限于匙孔嘁血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A-合成海藻糖二霉菌酸酯)。本领域技术人员可以无需过多试验而选择出免疫接种方案。然后给哺乳动物取血，分析血清的前-原-GDNF抗体滴度。如果需要，可以给予哺乳动物强化剂直至抗体滴度提高。
非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链(比如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)或抗体的其他抗原结合亚序列)或其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段。很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种的CDR的残基(供体抗体)所代替，后者具有所需的特异性、亲和力和结合容量。在某些情况中，人免疫球蛋白Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含受体抗体或者导入的CDR或框架序列中都没有的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上全部至少1个，一般是两个可变结构域，其中全部或基本全部CDR区与非人免疫球蛋白的CDR区对应，全部或基本全部FR区是人免疫球蛋白序列。最优地，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。更详细内容参见Jones et al，Nature，321：522-525(1986)、Reichmann et al，Nature，332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol，2：593-596(1992)。人源化抗体包括灵长类化的抗体，其中所述抗体的抗原结合区来源于通过用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。
聚合酶链式反应(PCR)是不使用活生物体的酶法DNA复制技术。这项技术利用温度介导的酶-DNA聚合酶允许小量DNA被指数性地扩增。
逆转录-PCR(RT-PCR)是用于扩增一段确定的核糖核酸(RNA)分子的技术。RNA链首先被逆转录为它的互补DNA(cDNA)，然后利用PCR进行扩增。
DNA测序是确定给定DNA片段(称为序列)中核苷酸顺序的过程。
表达载体是用于向靶细胞中引入并表达特定DNA序列的环形DNA分子。表达质粒的构建是将例如含有所需基因的ORF的特定DNA片段克隆到表达载体的过程。
转染是将外来DNA导入细胞。转染包括在细胞上瞬时打开小孔，允许表达质粒进入。表达质粒一旦进入了细胞，该DNA序列编码的蛋白即通过细胞转录和翻译机制产生。质粒DNA没有整合到细胞基因组中，而只是瞬时表达了。
细胞培养是细胞系或从组织中分离的原代细胞在受控条件下生长的过程。细胞在合适的温度和混合气体中，生长和维持在细胞培养器里的培养基中。
Western印迹分析是检测给定样品中的蛋白的方法。该方法利用凝胶电泳将变性蛋白按照质量分开。分离后，将蛋白转移到膜上，利用能够识别蛋白的抗体在膜上进行检测。
酶联免疫吸收法(ELISA)分析是一种利用两种抗体检测样品中存在的抗体或抗原的技术。一种抗体是抗原特异性的，另一种与抗原-抗体复合体反应，并偶联了酶。该二抗可以导致发光的、放射性或荧光底物产生信号。
在免疫荧光分析中，利用一抗来检测特定蛋白表位。该一抗的检测通过标记了酶、放射标记或荧光团的二抗来实现。利用荧光或共聚焦显微镜来分析免疫荧光标记的细胞和组织样品。
本发明基于新发现的GDNF基因的新剪接变体-pre-(γ)pro-GDNF。本文描述的实施例显示，pre-(γ)pro-GDNF mRNA在人脑中表达(图4)，该剪接变体所编码的蛋白的分泌受到严格的生物和生理调控，表明(γ)pro-GDNF蛋白是比(α)pro-GDNF有效地多的治疗帕金森氏症、ALS、成瘾症、酗酒、局部缺血、癫痫和抑郁症的治疗分子。此外，还在肺和子宫中研究了pre-(γ)pro-GDNF mRNA的表达(数据未显示)。
治疗
pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF具有体内基因治疗用途，可用于给予哺乳动物，尤其是人来治疗与GDNF活性有关的或者可以得益于GDNF-反应性的疾病或病症。特别优选的是神经系统疾病，优选中枢神经系统疾病、帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、ALS、脊髓损伤、成瘾症和酗酒。
发明特别考虑了通过基因操纵来调控蛋白表达或活性。可以使用任何合适的载体将目的转基因导入动物。文献中曾描述过的示范性的载体包括复制缺陷的逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体(Kim et al，J.Virol，72：811-816(1998)；Kingsman & Johnson，Scrip Magazine，October，1998，pp.43-46.)、腺病毒(参见例如，美国专利5,824,544、美国专利5,707,618、美国专利5,792,453、美国专利5,693,509、美国专利5,670,488、美国专利5,585,362、Quantin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584(1992)、Stratford-Perricadet et al，J.Clin.Invest.，90：626-630(1992)和Rosenfeld et al，Cell，68：143-155(1992))、逆转录病毒(参见例如，美国专利5,888,502、美国专利5,830,725、美国专利5,770,414、美国专利5,686,278、美国专利4,861,719)、腺相关病毒(参见例如，美国专利5,474,935、美国专利5,139,941、美国专利5,622,856、美国专利5,658,776、美国专利5,773,289、美国专利5,789,390、美国专利5,834,441、美国专利5,863,541、美国专利5,851,521、美国专利5,252,479、Gnatenko et al，J.Investig.Med.，45：87-98(1997)、腺病毒-腺相关病毒杂交体(参见例如美国专利5,856,152)或者痘苗病毒或疱疹病毒(参见例如，美国专利5,879,934、美国专利5,849,571、美国专利5,830,727、美国专利5,661,033、美国专利5,328,688)、阳离子脂质体介导的基因转移(BRL)、脂质体载体(参见例如，美国专利5,631,237(Liposomes comprisingSendai virus proteins)]，以及其基因表达可以体内调控的病毒载体，和以上各种的组合。以上提到的全部文献通过引用全文并入本文。复制缺陷型腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒构成本发明的优选实施方案。
半透性的、可植入的膜装置在某些情形中可以作为递送药物的手段。例如，可以将分泌可溶性(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF或嵌合体的细胞包埋起来，然后这类装置可以植入患者。例如，植入患有帕金森氏症的患者的脑。参见Aebischer等的美国专利4,892,538、Aebischer等的美国专利5,011,472、Aebischer等的美国专利5,106,627、PCT申请WO 91/10425、PCT申请WO 91/10470、Winn et al，Exper.Neurology，113：322-329(1991)、Aebischer et al，Exper.Neurology，111：269-275(1991)和Tresco et al，ASAIO，38：17-23(1992)。
相应地，还包括预防或治疗神经损伤或其他(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF反应性细胞损伤的方法，所述方法包括将分泌(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF的细胞植入有需要的患者的体内。最后，本发明包括通过植入患者来预防或治疗神经损伤或其他细胞损伤的装置，所述装置包含半透性膜，和包埋在所述膜内分泌(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF的细胞，其中所述膜对(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF是通透性的，而患者中对细胞有害的因子不能透过。患者自己的被离体转化为产生(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF的细胞可以直接植入患者，任选不进行包埋。用于活细胞膜包埋的方法是本领域技术人员所熟悉的，制备包埋细胞及其向患者的植入无需过度试验即可实现。
因此，本发明包括通过将细胞植入有需要的患者体内来预防或治疗神经损伤的方法；天然能够产生或者经工程化能够分泌(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF的细胞。优选地，当患者为人时，分泌的(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF是可溶性的人(β)pro-GDNF或(γ)pro-GDNF。优选植入物是非免疫原性的和/或防止免疫原性的植入细胞被免疫系统识别。用于CNS递送，优选的植入部位是纹状体。
在采用病毒载体的实施方案中，优选的多核苷酸包含合适的启动子和多腺苷酸化序列以便促进在目标组织中的表达。对于本发明，适用于哺乳动物细胞表达的启动子/增强子包括，例如巨细胞病毒启动子/增强子(Lehneret al.，J.Clin.Microbiol，29：2494-2502(1991)；Boshart et al.，Cell，41：521-530(1985))、Rous肉瘤病毒启动子(Davis et al.，Hum.Gene Ther.，4：151(1993))、猴病毒40启动子、逆转录病毒的长末端重复(LTR)、角蛋白14启动子和α肌球蛋白重链启动子。
在基因治疗应用中，基因被导入细胞以便实现体内合成有疗效的基因产物，用于例如取代缺陷基因。“基因治疗”包括常规的基因治疗，这种情况通过一次治疗达到持久的效果)；和给予基因治疗剂，这种情况包括一次或者反复给予治疗有效的DNA或mRNA。反义RNAs和DNAs可以用作治疗剂来阻断某些基因的体内表达。研究显示，虽然由于细胞膜限制了它们的摄取造成其在胞内浓度低，短的反义寡核苷酸可以被输入细胞作为抑制剂(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：4143-4146(1986))。可以通过例如用不带电荷的基团取代带负电荷的磷酸二酯基使寡核苷酸改变以提高它们的摄入。
有许多技术可以将核酸导入活细胞。这些技术根据核酸是被体外、离体还是体内转移到目标宿主的细胞中而不同。适合将核酸转移到体内哺乳动物细胞的技术包括利用脂质体(Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)；Fraley，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352(1979)；Feigner，Sci.Am，276(6)：102-106(1997)；Feigner，Hum.Gene Ther.，7(15)：1791-1793，(1996))、电穿孔(Tur-Kaspa，et al，MoI.Cell Biol，6：716-718(1986)；Potter，et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：7161-7165(1984))、直接显微注射 (Harland and Weintraub，J.Cell Biol.，101：1094-1099(1985))、细胞融合、DEAE-右旋糖(Gopal，MoI.Cell Biol.，5：1188-1190(1985))、磷酸钙沉淀法(Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-467(1973)；Chen and Okayama，MoI.Cell Biol，7：2745-2752，(1987)；Rippe，et al，MoI.Cell Biol.，10：689-695(1990)、细胞超声波处理(Fechheimer，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467(1987))、利用高速微粒子射击的基因轰击(Yang，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9568-9572(1990)。目前优选的体内基因转移技术包括用病毒(一般是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau et al，Trends in Biotechnology，11：205-210(1993))。某些情况中，给核酸源提供靶向到目标细胞的试剂是可取的，比如靶细胞细胞表面上的膜蛋白的特异抗体、靶细胞上的受体的配体。采用脂质体的情况中，可以利用蛋白质进行导靶和/或协助摄取，所述蛋白质能够结合细胞表面上与胞吞相关的膜蛋白，这类蛋白包括例如对特定细胞类型嗜性的衣壳蛋白或其片段、内化参与循环的蛋白的抗体以及能够靶向到胞内位置并提高胞内半寿期的蛋白。受体介导的胞吞技术在例如Wu et al，J.Biol.Chem.，262：4429-4432(1987)和Wagner et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：3410-3414(1990)中有描述。有关目前已知的基因标记和基因治疗试验方案的综述见Anderson et al，Science，256：808-813(1992)。
在本发明的一个具体实施方案中，可以将表达构建体包埋在脂质体中。脂质体是囊状结构，其特征在于磷脂双层膜和内部的水性基质。多室脂质体具有通过水性基质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中可以自动形成所述脂质体。脂类成分在形成闭合的结构前进行自身重组，将水和溶解的溶质包裹在脂双层之间(Ghosh and Bachhawat，″In Liver Diseases，Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands，″Wu，G.，Wu，C，ed.，New York：Marcel Dekker，pp.87-104(1991))。向阳离子脂质体中加入DNA导致脂质体拓扑转换为光学双折射液晶凝聚球(Radler，et al，Science，275：810-814(1997))。这些DNA-脂质复合体是可能用于基因治疗和递送的非病毒载体。
本发明还考虑了涉及“脂转染”技术的多种商业方法。发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。已有研究显示这有助与细胞膜的融合，促进脂质体包埋的DNA进入细胞(Kaneda，et al.，Science，243：375-378(1989))。在其他实施方案中，脂质体可以与非组蛋白性染色体蛋白质复合或者与它一起使用(HMG-I)(Kato，et al.，J.Biol.Chem.，266：3361-3364(1991))。再一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者复合或一起使用。因为这类表达构建体已被成功地用于核酸的体外和体内转移和表达，它们可以用在本发明中。
可以用于将编码治疗基因的核酸递送到细胞的其他载体递送系统包括受体介导的递送媒介。这类媒介利用了几乎所有真核细胞中都存在的受体介导的胞吞对大分子的选择性摄取。因为各种受体的细胞类型特异性分布，递送可以是高度特异的(Wu and Wu，Adv.Drug Del.Rev.，12：159-167(1993))。
在发明的另一个实施方案中，表达构建体可以仅由裸露的重组DNA或质粒构成。这类构建体的转移可以通过以上提到的任何可以物理地或化学地透过细胞膜的方法来实现。这特别适用于体外转移，但也可以应用在体内使用。Dubensky等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：7529-7533(1984))成功地将多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝和脾内，表现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，83：9551-9555(1986))也展示直接腹膜内注射CaPO4沉淀的质粒造成了转染基因的表达。
本发明另一个向细胞转移裸露DNA表达构建体的实施方案可以包括粒子轰击。这种方法依赖的是将包被DNA的微粒加快到高速，使它们能够在不杀伤细胞的情况下穿透细胞膜并进入细胞(Klein，et ah，Nature，327：70-73(1987))的能力。已开发出给小粒子加速的几种装置。一种这类装置依赖高压放电产生电流，然后电流提供原动力(Yang，et ah，Proc.Natl.Acad.SciUSA，87：9568-9572(1990))。使用的微粒由生物惰性物质，比如钨或金珠构成。
本领域技术人员明白如何将基因递送应用于体内(in vivo)和离体(exvivo)情形。对于病毒载体，通常要制备病毒载体储液。根据病毒类型和可达到的滴度，可以给患者递送1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011或1x1012个感染性颗粒。通过比较相对的摄取效率，类似的数量可以推及脂质体或其他非病毒制剂。药物可接受组合物类的制剂在下文讨论。
给各种细胞类型考虑了多种途径。对于几乎任何细胞、组织或器官类型，考虑了系统递送。其他实施方案中，可以采取各种直接的、局部和区域性的措施。例如，可以给细胞、组织或器官直接注射表达载体或蛋白。
在不同的实施方案中，还考虑了离体基因治疗。在离体实施方案中，取出患者的细胞，保持在体外至少一段时间。在这个时间内，递送治疗剂，之后将细胞重新导入患者。
将基因转移到体内靶细胞的策略包括以下基本步骤：(1)选择其表达与CNS疾病或功能障碍相关的合适的转基因；(2)挑选和建立适宜有效的基因转移载体；(3)证明靶细胞转导和转基因表达稳定有效地进行；(4)证明体内基因治疗程序没有引起严重的有害效应；以及(5)证明宿主动物中出现希望的表型效应。
虽然可以使用其他载体，用于发明所述方法的优选载体是病毒和非病毒载体。选定的载体应当满足以下标准：1)载体必须能够感染靶细胞，因此必须挑选有合适宿主范围的病毒载体；2)被转移的基因应当能够在细胞中保留并表达较长的一段时间(而不引起细胞死亡)从而在细胞中稳定地存在并表达；以及3)载体应当对靶细胞，如果有的话，只有很小的损伤。
因为成年哺乳动物脑细胞不能分裂，选择的重组表达载体必须能够转染不分裂的细胞并在其中表达。当前已知具有这一能力的载体包括诸如腺病毒、腺相关病毒(AAV)的DNA病毒，和某些RNA病毒，比如基于HIV的慢病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马免疫缺陷病毒(EIV)。其他具有这一能力的载体包括单纯疱疹病毒(HSV)。但是，这些病毒中的一些(例如AAV和HSV)会产生毒性和/或有免疫原性。最近，建立了一个基于HIV的慢病毒载体系统，与其他逆转录病毒一样，可以将转基因插入宿主细胞的核内(增加表达的稳定性)，但是与其他逆转录病毒不同，该系统可以将基因插入不分裂细胞的核内。慢病毒载体曾被证实在直接注射后，能够稳定地感染脑细胞，并稳定地表达外来转基因而没有可检测到的来自病毒蛋白的致病性(参见，Naldini，et al.，Science，272：263-267(1996)，其公开内容通过引用并入本文)。遵照最先构建HIV-I逆转录病毒载体的研究人员的教导，本领域技术人员能够构建适用于发明所述方法的慢病毒载体(涉及逆转录病毒构建的更一般性的参考文献，参见例如Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，W.Freeman Co.(NY 1990)和Murray，E J，ed.，Methods inMolecular Biology，Vol.7，Humana Press(NJ 1991))。
重组AAV载体的作用很有效，感染相对长期，一般没有毒性，除非载体中重组了有毒的转基因。AAV是助手依赖型的细小病毒，由一个围绕着简单、没有包被的二十面体蛋白外壳的4.7kb单链DNA基因组构成。成年人群中大约85％是AAV血清阳性的。但是，没有与AAV感染关联的病理学。AAV依靠腺病毒或疱疹病毒作为助手来建立建立有成效的感染。在没有辅助病毒时，AAV基因组应对毒性攻击(UV辐射、羟基脲接触)时也会扩增。如果没有毒性攻击或者辅助病毒，野生型AAV将位点特异地整合到人的第19号染色体。整合由AAV Rep蛋白驱动，该蛋白介导在染色体整合位点形成AAV-染色体复合体。大部分病毒基因组(96％)将被去除，仅留下两个145碱基对(bp)的反向末端重复(ITRs)用于病毒基因组的包装和整合。本领域已建立了有效繁殖重组AAV、rAAV的技术：利用迷你腺病毒基因组质粒、在一个质粒中编码AAV包装功能和腺病毒辅助功能的质粒。而且，用于分离高度纯化的rAAV以及滴定rAAV储液的方法比较直接和迅速。为了跟踪rAAV介导的转基因表达，经常在rAAV中以双顺反子使用绿色荧光蛋白(GFP)，该蛋白是已被很好地研究过的238个氨基酸的荧光蛋白。借助不同启动子选择性和特异性地表达rAAV介导的基因转移也已鉴定。我们使用可以购买到的AAV Helper-free system(Stratagene)来构建我们的重组AAVs。利用常规重组DNA技术，可以将Pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF克隆到AAV系统载体/质粒中。
表达pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF-ATG的病毒载体
用于本发明重组表达神经系统生长因子的载体的构建可以利用常规技术实现，这些技术不需要对本领域技术人员详细说明。文中列出了构建AAV载体的具体方面。更详细的参考，普通技术人员可能希望查阅Maniatis et al.，in Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982)。
简单来说，重组表达载体的构建采用标准的连接技术。为了分析证实构建载体中的序列正确，可以用连接混合物转化宿主细胞并在合适的情况中，通过抗生素抗性选择成功的转化子。制备来自转化子的载体，通过限制酶切进行分析和/或通过例如Messing等的方法(Nucleic Acids Res.，9：309(1981))、Maxam等的方法(Methods in Enzymology，65：499(1980))或者本领域技术人员知道的其他合适方法测序。利用例如Maniatis等(Molecular Cloning，pp.133-134(1982))描述的常规的凝胶电泳将切割过的片段按照大小分离。
在转录、翻译或翻译后水平调控cDNA(pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF-ATG)的表达。转录起始是基因表达中的早期关键步骤。其取决于启动子和增强子序列，受到与这些序列相互作用的特异细胞因子的影响。许多原核基因的转录单位由启动子，在许多情况中还有增强子或调控元件组成(Banerji et al.，Cell 27：299(1981)；Corden et al.，Science，209：1406(1980)；和Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于逆转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的调控元件位于长末端重复中(LTR)(Weiss et al，eds.，The molecular biology of tumor viruses：RNA tumorviruses，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)(MLV)和Rous肉瘤病毒(RSV)LTRs含有启动子和增强子序列(Jolly et al.，Nucleic Acids Res.，11：1855(1983)；Capecchiet al.，In：Enhancer and eukaryotic gene expression，Gulzman and Shenk，eds.，pp.101-02，Cold Spring Harbor Laboratories(NY 1991))。其他强启动子包括来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和其他野生型病毒启动子。
美国专利5,720,720、6,027,931、6,071,889中，以及WO 99/61066中可以找到制备和使用rAAV的方法以及将rAAV体内递送给各种细胞的方法，上述文献均通过引用并入本文。存在不同血清型的AAV，它们表现出组织嗜性。因此，正确使用血清型取决于要被转导的组织。
关于利用腺相关病毒(AAV)和选定启动子在神经系统中进行成功的、定位、长期和无毒的转基因表达的方法，可以参考Klein et ah，ExperimentalNeurology，150：183-194(1998)，″Neuron-Specific Transduction in the RatSeptohippocampal or Nigrostriatal Pathway by Recombinant Adeno-associatedVirus Vectors″。
关于利用重组AAV，通过稳定表达神经营养因子NGF、GDNF、BDNF进行基因治疗的方法，以及产生的可神经化学定量的治疗效果，可以参考Klein et al.，Neuroscience，90：815-821(1999)，″Long-term Actions ofVector-deri ved Nerve Growth Factor or Brain-derived Neurotrophic Factor onCholine Acetyltransferase and Trk Receptor Levels in the Adult Rat BasalForebrain″。
另一个重要的参数是要递送到靶组织中的pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF的剂量。对于病毒载体，可以以每ml神经营养组合物中病毒克隆的数量来界定pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF的浓度。最佳情况，要利用病毒表达载体递送pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF，每单位剂量的pre-(γ)pro-GDNF应当包含2.5到25μl pre-(γ)pro-GDNF组合物，其中所述组合物包括存在于药物可接受液体中的病毒表达载体，每mlpre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF组合物中提供1010到1015的pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF表达病毒粒子。这样高的滴度对AAV尤其有用。对慢病毒来说，滴度通常更低，每ml108到1010转导单位(TU/ml)。
实验
实施例1
通过RT-PCR克隆GDNF剪接变体cDNAs和分析GDNF剪接变体niRNA的表达
我们通过RT-PCR从小鼠肾和脑细胞(利用第一对引物42和43，以及巢式引物46和47)以及人肾、子宫和脑细胞(利用第一对引物53和49，以及巢式引物48和54)中克隆了pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF cDNAs(图3和4)。用RNA提取试剂盒(Ambion)分离小鼠总RNA，人RNA购自Clontech。将来自不同组织的总RNA(5μg)作为模板，以寡聚(dT)(Promega)为引物，用逆转录酶(SuperscriptII，Invitrogen)合成第一链cDNAs。
用于克隆小鼠pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF以及人pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF的引物是：
小鼠Gdnf基因5’方向的第一引物(引物42)：
5-GCTCCTGCCCGAGGTC-3′(SEQ ID NO：7)
小鼠Gdnf基因3’方向的第一引物(引物43)：
5-CCTTTCTTCGC ACTGT AGC AG-3′(SEQ ID NO：8)
小鼠Gdnf基因5’方向的巢式引物(引物46)：
5-GTCCGGATGGGTCTCCTGG-3′(SEQ ID NO：9)
小鼠Gdnf基因3’方向的巢式引物(引物47)：
5-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3′(SEQ ID NO：10)
人Gdnf基因5’方向的第一引物(引物53)：
5-GACCTGTTGGGCGGGGCTC-3′(SEQ ID NO：11)
人Gdnf基因3’方向的第一引物T(引物49)：
5-CCTGGGAACCTTGGTCCCTTTC-3′(SEQ ID NO：12)
人Gdnf基因5’方向的巢式引物(引物48)：
5′-GCTCCAGCCATCAGCCCGG-S′(SEQ ID NO：13)
人Gdnf基因3’方向的巢式引物(引物54)：
5′-CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-S′(SEQ ID NO：14)
PCR反应在50μl或25μl体积中进行，其中含有2/5或1/5RT反应作为模板和3.75或1.86单位的酶混合液，混合液中分别含有热稳定的Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶(Roche)，以及按照制造商的说明Expand LongDistance Template PCR System试剂盒(Roche)。第一PCR反应后进行巢式PCR反应，其中使用1-2μl的第一PCR反应作为模板。在第一和巢式PCR反应中，采用以下条件扩增DNA：94℃(2分钟)；94℃(10秒)、62℃(30秒)、68℃(1分钟)，10个循环；94℃(15秒)、62℃(30秒)、68℃(1分20秒)，25个循环；68℃(7分钟)、4℃(5分钟)，1个循环。扩增的RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，然后直接将PCR片段测序，或者将片段克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)中，然后通过测序确认。DNA片段的测序用DyeTerminator(v3.1)试剂盒(Applied Biosystems)按照制造商的建议在ABI 3100Capillary测序仪上进行。
用于凝胶提取的人PCR片段测序的引物是：GDNF基因5’方向5’-GCTCCAGCCATCAGCCCGG-3′(SEQ ID NO：15)和GDNF基因3’方向5′-CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-3′(SEQ ID NO：16)。用于小鼠PCR片段测序的引物是：GDNF基因5’方向(SEQ ID NO：9)和GDNF基因3’方向5’-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3′(SEQ ID NO：10)。
为了分析各自mRNAs的表达，用限制酶xhol和HindIII从pCR2.1载体中切割小鼠和人pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF，连接到用相同限制酶切割好的pEGFP-Nl表达载体中。用于给插入的PCR片段测序的引物是5’方向5′-CAACGGGACTTTCCAAAATG-3′(SEQ IDNO：37)和3′方向3’-GGACACGCTGAACTTGTGG-5’(SEQ ID NO：38)。
为了进行进一步的表达分析，将人pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF克隆到pAAV-MCS和pAAV-IRE S-hrGFP表达载体(Stratagene)中，得到pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF、pAAV-IRES-hrGFP-pre-(α)pro-GDNF和pAAV-IRES-hrGFP-pre-(β)pro-GDNF构建体。克隆使用的引物有：
5′方向的引物(89)
5′-CAACAAGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3′(SEQ IDNO：39)
3′方向的引物(90)
3’-CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-5’(SEQ IDNO：40)
为了表达分析的进行，将人pre-(γ)pro-GDNF的翻译起始密码子CTG替换为常规的ATG翻译起始密码子，cDNA克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中产生pAAV-MCS-pre-(γ)pro-GDNF-ATG构建体。克隆使用的引物有：
5′方向的引物(91)
5′-CAACAAGGATCCATGGGACTTGGGGCACCTGGAGTTAATG-S′(SEQ ID NO：17)
3′方向的引物(92)
5′-CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAGCGG-S′(SEQID NO：18)
引物89和90，或者91和92与Dynazyme DNA聚合酶(Finnzymes)和Dynazyme 10x缓冲液用于PCR。PCR反应总体积是50μl，其中含有40ng在pEGFP-Nl载体中的人pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF作为模板。采用以下条件扩增DNA：95℃(5分钟)；95℃(45秒)、56℃(45秒)、72℃(1分钟)，25个循环；72℃(7分钟)、4℃(7分钟)，1个循环。扩增的PCR产物用限制酶BamR1和Xhol切割，连接到经相同限制酶切割的pAAV-MCS载体(Stratagene)中，然后通过测序确认。
用于给插入的PCR片段测序的引物5’方向是5-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3′(SEQ ID NO：41)，3’方向是3’-TA-GAAGGACACCTAGTCAGA-5′(SEQ ID NO：42).
实施例2
细胞培养
CHO、HEK-293、PC-6.3和AtT-20细胞系生长在含有抗生素，与10％FCS(Gibco)(对于CHO和HEK-293细胞)、10％HS(Gibco)和5％FCS(PC-6.3细胞)、10％FCS，4.5g/l葡萄糖和1.5g/l碳酸钠(AtT-20细胞)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。BHK-21细胞系生长在含有抗生素、7.5％FCS、0.04％胰蛋白胨磷酸盐培养液(Difco)和1％谷氨酸盐(Gibco)的基础培养基(MEM)中。用含有小鼠pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF，或者人pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF cDNA的pEGFP-Nl(Invitrogen)表达载体转染细胞。替代地，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染方案，用含有人pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF  或pre-(γ)pro-GDNF-ATG cDNA的pAAV-MCS或pAAV-IRES-hrGFP载体转染细胞。在Western印迹分析中，将被转染细胞在OptiMEM(Sigma)培养基中生长48小时，然后收集培养基，从细胞中制备蛋白提取物。用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Units(Millipore)将分泌蛋白(培养基)浓缩，或者利用小鼠抗GDNF抗体免疫沉淀GDNF。蛋白提取物在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，用D20抗体(Santa Cruz)通过Western印迹分析。在免疫荧光分析中，被转染细胞在正常的生长培养基中生长24小时，然后进行固定和通透化。用一抗和二抗将细胞染色，通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。
结果
结果显示人和小鼠(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF以及它们的成熟GDNFs从CHO细胞系中分泌出来(图5和6)。此外，它们还被HEK-293、PC-6.3和AtT-20细胞系分泌。小鼠(γ)pro-GDNF及其成熟GDNF可以从BHK-21(图7)、CHO和PC-6.3细胞系分泌，人(γ)pro-GDNF-ATG(其中CTG翻译起始密码子被ATG代替)及其成熟GDNF从BHK-21和COS-7细胞系分泌(图8)
实施例3
人pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF从分化的PC-6.3细胞和海马原代细胞中的分泌
PC-6.3细胞的分化和刺激
转染后，PC-6.3细胞生长在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、5％HS(Gibco)、2.5％FCS和50ng/ml NGF的分化培养基中。72小时后，移走培养基，换成含有或不含有50mM KCl的无血清DMEM。转染中使用的表达构建体是pEGFP中的人和小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF。ELISA分析中，含有不带终止密码子的大鼠前-原-BDNF(Volkmar Lessman博士惠赠，University of ohannes-Gutenberg，Mainz，Germany)的 pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)作为活性依赖性分泌的阳性对照(Haubensak et al.，J.Cell ScL，111：1483-93(1998))。这个构建体与其他使用的构建体克隆过程类似。在Western印迹分析中，5小时后收集培养基(上清)，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Units(Millipore)浓缩。蛋白提取物在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，用识别GDNF的D20抗体(Santa Cruz)通过Western印迹分析。在ELISA分析中，2小时后收集培养基，用GDNF EmaxImmunoAssay System(Promega)或者BDNF Emax ImmunoAssay System(Promega)分析。
转染分化PC-6.3细胞的免疫荧光分析
通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中产生含有人pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNF的表达构建体。转染前，PC-6.3细胞在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、5％HS(Gibco)、2.5％FCS和50ng/ml NGF的分化培养基中分化3天。转染使用的表达构建体是pEGFP中的人和小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF。转染后24小时，细胞用4％PFA固定，或者先用50mM KCl和50μg/ml环己亚胺(中止蛋白合成)刺激2小时，然后用4％PFA固定。用0.5％BSA(Sigma)封闭所有细胞，并用0.1％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。细胞与一抗，即多克隆抗-GDNF(Gene Way Biotech Inc.；1：750dilution)和成熟高尔基体的单克隆抗GM130(Abeam；1：100dilution)在0.5％BSA中，室温下温育1小时，清洗，然后用二抗，即偶联Cy2的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchlaboratories)和偶联Cy3的驴抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories)重复上述过程。最后用Immu-mount(Thermo electron corporation)盖上盖片。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。
海马原代神经元培养物、细胞的转染和去极化
为了制备海马神经元，将来自El 8大鼠的海马解剖。用溶于HBSS的0.25％胰蛋白酶在37℃将组织消化10-15分钟。加入DNaseI(1mg/ml)，用硅化玻璃移液管磨碎样品。细胞用含有10mM葡萄糖(Sigma)的HBBS洗三次。在悬浮液中，利用Rat Neuron Nucleofector Kit(Amaxa biosys-tems)，按照制造商的建议用含有人或小鼠pre-(α)pro-GDNF或pre-(β)pro-GDNFcDNA的pEGFP-Nl(Invitrogen)表达载体转染细胞。将细胞铺在包被多聚D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma)的培养板上，培养物生长在补充了L-谷氨酸盐(Gibco Invitrogen)和1x B-27(Gibco Invitrogen)的Neurobasal培养基(GibcoInvitrogen)中。经过4天培养后，移去培养基，换成含有或不含有50mM KCl的Neurobasal培养基(Gibco Invitrogen)。15-30分钟后，收集培养基，通过
Figure BPA00001167896000341
Immuno-Assay System(Promega)分析GDNF的浓度。
结果
免疫荧光分析的结果显示，在分化的PC-6.3细胞中，刺激前后，pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF编码的蛋白的位置有明显不同。未刺激PC-6.3细胞中，pre-(α)pro-GDNF编码的GDNF更经常仅位于高尔基复合体上，而不是囊泡+/-高尔基体上(图9)。相反，大部分pre-(β)pro-GDNF编码的GDNF位于囊泡+/-高尔基体上，小部分仅位于高尔基体。KCl刺激后，(β)pro-GDNF及其成熟GDNF形式比(α)pro-GDNF及其成熟GDNF形式更迅速地移动到囊泡腔内(图9)。Western印迹分析的结果显示pre-(α)pro-GDNF cDNA编码的小鼠和人GDNF均从分化的类神经元PC-6.3细胞中组成性地分泌，而(β)pro-GDNF cDNA编码的GDNF的分泌是活性依赖性的(图10和11)。这一结果进一步通过ELISA分析进行了证实，分析中大鼠BDNF的分泌作为阳性对照(图12)。这些结果表明，(β)pro-GDNF及其编码cDNA可能是比(α)pro-GDNF及其cDNA更有潜力的基因疗法治疗PD的治疗分子。
讨论
通过重组慢病毒载体递送在完整黑质纹状体多巴胺系统中长期体内表达pre-(α)pro-GDNF导致多巴胺合成中的关键酶-酪氨酸羟化酶蛋白被选择性地下调(Georgievska，et al.，J.Neuro-sci.，24：6437-6445(2004)；Sajadi，et al.，J.Neurochem.，93：1482-1486(2005))。并且，通过重组慢病毒载体递送，在6-羟基多巴胺损毁的帕金森氏症模型大鼠的纹状体中持续体内表达pre-(α)pro-GDNF诱导了保存的纹状体多巴胺终末中酪氨酸羟化酶的下调(Georgievska，et al.，Exp.Neurol，177：461-474(2002))。这非常可能是由于某种补偿机制，该机制中多巴胺神经元在持续的GDNF刺激下能够通过降低酪氨酸羟化酶活性对增加的多巴胺合成和释放进行补偿。Persephin是神经营养因子中GDNF家族的成员。试验非常清楚地显示，高浓度的persephin是神经毒性的(Tomac，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，99：9521-9526(2002))。最近在非人灵长类中进行的试验也表明，高浓度的GDNF诱发小脑毒性(Lang，et al，Ann.Neurol.，59：459-466(2006))。因此，今后的治疗应当避免高浓度的GDNF，并且优选在GDNF水平可以生理地调节的系统中进行。我们的体外结果显示，pre-(β)pro-GDNF编码的GDNF的分泌受到生物刺激的调节，而pre-(α)pro-GDNF编码的GDNF的分泌是组成性的。这使得(β)pro-GDNF及其编码cDNA是比(α)pro-GDNF及其cDNA潜力大得多的基因疗法治疗PD的治疗分子。
实施例4
病毒载体构建和病毒粒子制备
为了构建病毒载体，按照制造商的说明使用了AAV Helper-Free System(Stratagene)。利用合适的限制酶，将人pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF-ATG的编码序列插入pAAV-MCS的多克隆位点，或者替代的插入pAAV-IRES-hrGFP载体，分别得到载体pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-(γ)pro-GDNF-ATG或pAAV-IRES-hrGFP-pre-(α)pro-GDNF、pAAV-IRES-hrGFP-pre-(β)pro-GDNF、pAAV-IRES-hrGFP-pre-(γ)pro-GDNF-ATG。将以上提到的载体与pHelper和pAAV-RC载体一起共转染到AAV-293细胞中，导致产生表达pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF-ATG的重组AAV粒子。相应地，使用载体pAAV-IRES-hrGFP产生表达GFP的对照病毒粒子。
按照AAV Helper Free System(Stratagene)的制造商使用说明制备并纯化重组病毒粒子。将分装的重组病毒保存在-80℃。利用Southern斑点印迹确定病毒粒子数量。
实施例5
在帕金森氏症神经保护性动物模型中进行的体内基因转移
动物。重250-280g的雄性Wistar大鼠(Harlan)分成每组3到4只的组，喂养在22℃的室温，12:12小时的昼夜循环。自来水和鼠粮(Altromin 1324，Chr.Petersen A/S)任取。
病毒注射和6-OHDA损毁。所有立体定位注射参照Paxinos和Watson(The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic press，San Diego，1997)的图谱，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/P+1.0，L/M十2.7，D/V-4)，在左纹状体进行。异氟醚麻醉(诱导阶段是4.5％，手术阶段2.5％)下的立体定向手术基本按照以前的描述分两步进行(Kearns et ah，J.Neurosci.，17：7111-7118(1997))。给动物注射携带GFP的cDNA，或者pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG的cDNA的重组AAV载体(n＝5-7/组)。rAAV注射后14天，将动物再次麻醉，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/P+1.0，L/M+2.7，D/V-4)，向纹状体中注射一个剂量的20μg6-OHDA(Sigma；按游离基计算，溶解在补充了0.02％抗坏血酸的3或4μl冰冷盐水中)。注射速度是1μl/分钟，注射器在拔出前在原位再保留3分钟。注射6-OHDA之前，给予地昔帕明(Desipramine)(Sigma；15mg/kg，i.p.，1ml/kg)以防止6-OHDA摄入去甲肾上腺素能神经末端，从而保护这些神经末端不被破坏。
行为测试。rAAV注射后第10天，和注射6-OHDA的四周后，给大鼠注射安非他明(amphetamine)(2.5mg/kg i.p.)，并监测大鼠于120分钟内在自动转盘(automated rotometer bowls，Colbourn Instruments，Inc.，Allentown，PA)上的转体反应(turning response)。旋转试验后，将脑灌流并收集进行免疫组织化学分析。
酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析。6-OHDA注射28天后，用戊巴比妥钠将动物深度麻醉，经心脏灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4％多聚甲醛(PFA)。将脑解剖，在相同的固定剂中固定3-4小时，转移到25％蔗糖中48小时。在冰冻切片机上切成40μm的连续切片。按照以前的描述进行酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学(Kirik et al，Eur.J.Neu-rosci.，13：1589-1599(2001))。
形态学分析：SN细胞计数。利用光学分合法(West，et al，Anat.Rec，231：482-497(1991))估计SNpc中TH阳性细胞的数量。按照以前的描述(Sauer，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：8935-8939(1995))，用Olympus BX51显微镜上附带的Stereo Investigator platform(MicroBrightField)分析SNpc。简单来说，从每只动物中选择3个切片进行定量分析，这些切片来自有内侧尾核(medial terminal nucleus)(MTN)的SNpc中部(Paxinos和Watson图谱(paxinos，G.& Watson，C，1997，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic press，San Diego)中的A/P-5.3mm)。在低倍(4x)镜下大概地找出每个参考空间，用高倍(60x，油浸)物镜计数细胞。细胞数量表达为平均数量/切片。细胞计数利用光学分合法联合析象原则(dissector principle)和不偏计数规则。
统计分析。利用单向ANOVA和之后的Tukey/Kramer′s事后(post-hoc)检测，分析神经保护研究中的所有同侧旋转数量和TH阳性细胞数量。
实施例6
帕金森氏症神经修复动物模型中的体内基因转移动物。重250-280g的雄性Wistar大鼠(Harlan)分成每组3到4只的组，喂养在室温22℃，12:12小时的昼夜循环。自来水和鼠粮(Altromin 1324，Chr.Petersen A/S )任取。
病毒注射和6-OHDA损毁。所有立体定位注射参照Paxinos和Watson(The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic press，San Diego，1997)的图谱，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/P+1.0，L/M+2.7，D/V-4)，在左纹状体进行。异氟醚麻醉(诱导阶段是4.5％，手术阶段2.5％)下的立体定向手术基本按照以前的描述分两步进行(Kearns et ah，J.Neurosci.，17：7111-7118(1997))。利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(AfP+1.0，L/M+2.7，D/V-4)，给每个动物向纹状体中注射一个剂量的20μg 6-OHDA(Sigma；按游离基计算，溶解在补充了0.02％抗坏血酸的3μl冰冷盐水中)。注射速度是1μl/分钟，注射器在拔出前在原位再保留3分钟。注射6-OHDA之前，给予地昔帕明(Desipramine)(Sigma；15mg/kg，i.p.，1ml/kg)以防止6-OHDA摄入去甲肾上腺素能神经末端，从而保护这些神经末端不被破坏。6-OHDA注射后28天，将动物再次麻醉，给动物注射携带GFP的cDNA，或者pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG的cDNA的重组AAV载体(n＝5-7/组)。注射6-OHDA 21天后，以及递送rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(β)pro-GDNF或rAAV-pre-(γ)pro-GDNF-ATG后1、2、4和8周，给大鼠注射安非他明(2.5mg/kg i.p.)，并监测大鼠120分钟内在自动转盘(Colbourn Instruments，Inc.，Allentown，PA)上的转体反应。旋转试验后，将脑灌流并收集进行免疫组织化学分析。行为测试、酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析、形态学分析和黑质细胞计数如下进行：
酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析。AAV注射8周后，用戊巴比妥钠将动物深度麻醉，经心脏灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4％PFA。将脑解剖，在相同的固定剂中固定3-4小时，转移到25％蔗糖sucrose中48小时。在冰冻切片机上切成40μm的连续切片。按照以前的描述进行酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学分析(Kirik et al，Eur.J.Neu-rosci.，13：1589-1599(2001))。
形态学分析：SN细胞计数。利用光学分合法(West，et al，Anat.Rec，231：482-497(1991))估计SNpc中TH阳性细胞的数量。按照以前的描述(Sauer，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：8935-8939(1995))，用Olympus BX51显微镜上附带的Stereo Investigator platform(MicroBrightField)分析SNpc。简单来说，从每只动物中选择3个切片进行定量分析，这些切片来自有内侧尾核(MTN)的SNpc中部(Paxinos和Watson图谱(Paxinos，G.&Watson，C，1997，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic press，San Diego)中的A/P-5.3mm)。在低倍(4x)镜下大概地找出每个参考空间，用高倍(60x，油浸)物镜计数细胞。细胞数量表达为平均数量/切片。细胞计数利用光学分合法联合析象原则和不偏计数规则。
实施例7
病毒递送pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG在癫痫动物模型中的用途
电极埋植和病毒的脑室内注射。雄性Sprague Dawley大鼠(200-300g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，放在立体定位仪上。用带有特氟龙涂层的不锈钢丝制成的双极性电极埋植到右杏仁体基底外侧核(离前囟：-2.8mm前后向；+4.9mm横向；和-8.6mm背侧)(Paxinos and Watson，The Rat Brain inStereotaxic Coordinates.New York：Academic Press，Paper Back，1997)。对照大鼠给予4-8μl对照病毒(AAV-GFP)，其他大鼠立体定位注射4-8μl表达pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG的AAV，注射器尖位于右侧脑室(-0.8mm前后向；+1.5mm横向和-3.6mm背侧)(Paxinosand Watson，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.New York：AcademicPress，Paper Back，1997)。用牙科粘合剂和锚固螺丝将插管和电极紧紧固定在颅骨上，接地线连到一个锚固螺丝上(Binder et al.J.Neurosci.，19：1424-1436(1999))。开始点燃刺激前，允许动物在术后恢复4天。
点燃程序。每个点燃刺激的构成是频率为60Hz、1毫秒两相矩形脉冲串共1秒，振幅在癫痫样电图阈值(EST)之上100μA。EST是通过在刺激第一天从100μA开始以每分钟100μA的增幅确定的(Kokaia et al.Eur.J.Neurosci.，11：1202-1216(1999))。动物每天刺激两次，共11天(共22次刺激)。由一个对处理一无所知的观察者记录每次刺激的行为(癫痫类型)和电生理[癫痫样电图时程(ESD)]参数。癫痫行为类型按照Racine的分类法(Racine，1972)打分：0型，没有行为改变；1型，面部痉挛；2型，点头；3型，单侧前肢痉挛；4型，后肢直立，并双侧前肢痉挛；以及5型，后肢直立和跌倒(姿势控制丧失)。
动物分析。最后一次刺激后4或24小时或者1周，将动物断头。组织用氯化三苯四氮唑染色。利用原位标记分析检测皮层组织中的凋亡细胞。
实施例8
中风动物模型中rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(β)pro-GDNF和rAAV-pre-(γ)pro-GDNF-ATG的体内基因转移
rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(β)pro-GDNF或rAAV-pre-(γ)pro-GDNF-ATG向皮层递送。为了探讨表达pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG的重组rAAV载体作为中风基因疗法的潜能，将表达pre-(α)pro-GDNF，pre-(β)pro-GDNF or pre-(γ)pro-GDNF-ATG的rAAV载体注射到大鼠的皮层中，所述大鼠正经受暂时性双侧颈总动脉结扎30或90分钟(Arvidsson et al.，Neuro-biol.Dis.，14：542-556(2003))。如果rAAV注射动物皮层组织中的pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG水平明显高于注射了表达GFP的rAAV(rAAV-GFP)的对照动物，表明rAAV可以被递送到皮层组织中，并表达pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG基因。
前脑缺血的诱发。23只在缺血损伤时重280到290g的雄性Wistar大鼠(Taconic M&B A/S)喂养在12小时/12小时明暗环境下，食物和水任取。禁食过夜后，通过吸入3.5％氟烷，然后人工通风混在N2OiO2中的1-2％氟烷(70∶30)将动物麻醉。将尾动脉和静脉分别插管取血、记录血压并输注药物。用放置到直肠的温度计测量体温，利用加热垫将体温保持在大约37℃。分离颈总动脉。然后给予50IU肝素，氟烷浓度降低到0.5％，静脉内输注2mg/h维库溴铵(vecuronium bromide)(Organon Tek-nika B.V.，Boxtel，TheNetherlands)作为肌肉松弛剂。之后是30分钟的稳定状态，在这个过程中监测生理参数和脑电波(EEG)。通过双侧阻塞颈总动脉，并结合从颈静脉放血达到的低血压(动脉血压40-50mm Hg)来诱发缺血。10分钟后通过再灌注血液和移去堵塞夹恢复血液循环。在刚开始重新循环时，给予碳酸氢钠(静脉内给予0.5ml，50mg/ml)来防止系统酸中毒(Arvidsson et al.，Neuroscience，106：27-41(2001))。
动物分析。再灌注后4和24小时以及1周，将动物(每组n＝6)断头。假手术组动物(n＝5)同样处理，但没有阻塞颈总动脉。用氯化三苯四氮唑将组织染色。利用原位标记分析检测皮层组织中的凋亡细胞。
实施例9
胆碱能细胞死亡动物模型中的体内基因转移
给胆碱能细胞死亡大鼠模型注射病毒载体以确定利用体内基因递送，递送pre-(α)pro-GDNF，pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG载体防止神经元变性的程度和参数。为了准备动物模型，给成年雄性Wistar大鼠进行穹窿横切以诱发基底前脑胆碱能神经元死亡。将2.5到10μl范围内的Pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF-ATG载体(pAAV-MCS-pre-(α)pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-(β)pro-GDNF或pAAV-MCS-pre-(γ)pro-GDNF-ATG)或对照EGFP载体储液注射到胆碱能基底前脑，每ml(神经营养组合物)含有1010-1012颗粒。颗粒在3-5分钟内于以下坐标注射到右半球内：离脑表面AP-0.3；ML-0.5；DV-6。将皮肤缝合，允许动物存活2-4周。
实施例10
肌萎缩侧索硬化症(ALS)动物模型中的体内基因转移
概论。肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种涉及运动神经元选择性变性的不断进行性发展的致命疾病。预期GDNF是很有希望的ALS和其他运动神经元疾病的治疗剂。因为AAV已发展成安全性得到证实的基因递送系统，我们探索了在ALS的G93A小鼠模型中通过AAV载体肌内递送GDNFcDNAs的治疗效果。家族性ALS的G1H转基因小鼠模型携带带有Gly93Ala突变的人超氧化物歧化酶(SOD1)(Gurney et al.Science，264：1772-1775(1994))。因为携带pre-(α)pro-GDNF剪接异构体的AAV也已发展成安全性得到证实的ALS基因递送系统(Wang et al.Gene Ther.，9：381-383(2002))，我们探索了在ALS的G93A小鼠模型中通过AAV载体(rAAV-pre-(α)pro-GDNF，rAAV-pre-(β)pro-GDNF和rAAV-pre-(γ)pro-GDNF)肌内递送pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF和pre-(γ)pro-GDNF cDNA的治疗效果。
动物和病毒注射。带有G93A人SOD1突变(SOD1G93A)的雄性转基因小鼠从The Jackson Laboratory (Bar Harbor，ME)获得。AAV载体质粒在上文有详细描述。
在9-10周龄，将ALS小鼠随机分配到四肢(腓肠肌和肱三头肌)注射rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(β)pro-GDNF或rAAV-pre-(γ)pro-GDNF载体(n＝10)的三个处理组中，或者注射AAV-GFP载体(n＝5)和媒介(n＝5)的两个对照组之一。腓肠肌剂量是25μl，肱三头肌剂量为15μl。
行为测试。测试前，给小鼠三天来熟悉旋转杆装置(Rota-Rod/7650；或Rota-Rod Treadmill for Mice)。检测时，将小鼠放在转速为5、10和20rpm的旋转杆上，自动记录每只小鼠在杆上停留的时间。发病时间定义为如以前描述(Li et al.Science，288：335-339(2000))，小鼠不能在20rpm转速下在杆上停留5分钟的时候。如果小鼠在杆上保留＞5分钟，结束测试并评估为5分钟。小鼠每两天测试一次，直至它们不能执行这项工作。死亡记录为当小鼠被仰面朝上放置，不能在30秒内翻身时的死亡年龄(Li et al.Science，288：335-339(2000))。
形态学分析。肌肉切片(10μm)在冷的丙酮中固定，然后与作为一抗的兔抗GDNF D20多克隆抗体(1∶500；Santa Cruz)和作为二抗的生物素化的抗兔抗体(1∶400；Santa Cruz)温育。用3，3-二氨基联苯胺作为色原，通过链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体程序使切片显色(Vectastain ABC kits；VectorLaboratories )。
用于肌肉的双重免疫荧光染色，切片依次与封闭液、多克隆兔抗GDNFD20抗体(1∶500；Santa Cruz)、偶联FITC的羊抗兔IgG(1∶200；Santa Cruz)和偶联四甲基若丹明的α-金环蛇毒素(Molecular Probes)温育。切片在共聚焦激光扫描显微镜(TCSNT；Leica，Heidelberg，Germany)下检验和照相。
为了脊髓的形态学分析，获得Nissl、SMI-32或CTB免疫染色连续横截面切片(30μm)。按照制造商的试验方案，用Mouse-on-Mouse kit(M.O.Mkit)(Vector Laboratories)将悬浮切片对SMI-32免疫组织化学染色。经处理用于分析CTB免疫反应性的切片用5％兔血清封闭，然后与抗CTB抗体(1∶10000，针对CTB的羊抗血清)温育。通过标准ABC法将切片显色。
形态度量学分析(morphometric analysis)和细胞计数。用Olympus BX51显微镜和KS 400图像分析软件(Zeiss)，对用CCD相机捕获的图像进行形态学分析。在随机挑选区域内，由＞1000个纤维的计数计算肌肉纤维的平均面积。为了比较脊髓中运动神经元的数量，我们按照以前的描述(Lewis etal.Nat.Genet.，25：402-405(2000))，计数了每组中跨颈膨大和腰骶膨大的Nissl染色的切片以及SMI-32和CTB免疫染色的切片中的神经元。对于每只小鼠，每组第六连续切片中至少数20个切片。只有满足以下标准的大的细胞特征被包括在内：位于中央管(central canal)的侧线(lateral line)以下的前角(ventral horn)中；含有带核仁的明显的细胞核；以及具备至少一个厚(宽)thickprocess。
实施例11
脊椎损伤动物模型中的体内基因转移
概论。已证实向受损脊髓递送神经营养因子能够刺激神经元存活和再生。这表明缺少足够的营养支持是导致哺乳动物脊髓没有自发再生的一个因素。先前递送pre-(α)pro-GDNF是通过重组腺病毒(AdCMVgdnf或AdCMVlacZ)介导的，并在脊髓受损的成年大鼠中测试了对功能恢复和中枢神经元萎缩的作用。结果显示腺病毒介导递送的pre-(α)pro-GDNF在脊髓受损的大鼠中能够防止皮质脊髓运动神经元的退化性萎缩，并提高运动功能(Tang et al.Neuroreport；15：425-429(2004))。
利用提供营养支持的基因递送方法，我们将表达pre-(α)pro-GDNF、pre-(β)pro-GDNF或pre-(γ)pro-GDNF的AAV载体(rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(b)pro-GDNF或rAAV-pre-(γ)pro-GDNF)注射到脊髓损毁部位。我们从解剖学上分析了成年脊髓受损大鼠皮质脊髓束(CST)再生情况，从行为学的角度分析了感觉-运动功能的改善。
动物。所有试验在赫尔辛基大学(University ofHelsinki)的试验动物中心(Laboratory Animal Center)进行，试验动物研究和试验方案遵循芬兰国家立法、EU指令(86/609)、European Convention(ETS 123)和国家基因技术的规定。成年雌性Lewis大鼠(160-190gm)4到6只一组养在标准笼子里，12小时/12小时明暗循环，食物和水可任取。动物皮下注射Hypnorm(120μl/200g体重；Janssen Pharmaceutics)和多美康(Dormicum)(每200g体重0.75mg，溶于150μl；Roche Pharmaceuticals)麻醉。在这个较长的过程中，施用含有维生素A的眼膏来防止眼睛脱水。按照Liebscher等的程序(Liebscher et al.Ann.Neurol，58：706-719(2005))，用虹膜切开剪和锋利的尖刀在胸T8节段做一个T型损毁，包括脊髓背向部分，有主要的CST和CST的背外侧和腹内侧部分。
病毒的递送。动物分成四批(rAAV-pre-(α)pro-GDNF、rAAV-pre-(β)pro-GDNF、rAAV-pre-(γ)pro-GDNF和AAV-GFP)进行同样的手术和行为测试。试验以完全双盲方式进行：大鼠被随机编号，各组在笼子里混合。所有的试验人员对试验各阶段处理不知情，处理包括手术、保健、行为测试以及再生、出芽和损毁大小的评估。
手术前，在取得基础测量值之前，将所有动物为行为测试处理和训练4周。为了AAV注射，将大鼠随机分到试验组中：损毁+rAAV-pre-(α)pro-GDNF、损毁+rAAV-pre-(β)pro-GDNF、损毁+rAAV-pre-(γ)pro-GDNF、损毁+对照AAV-GFP。损毁后立即用1μl生理液冲洗伤口开始AAV注射。2周后，开始行为评估，并隔一周重复一次。5周后，单侧跟踪CST。手术9周后，在行为测试的最后，进行形态学分析。
BBB运动(locomotor)评分。所有的测试由数码摄像机监测，并以双盲方式分析。手术前，在预训练4周后，获取基础测量值。手术后，以一周的间隔进行行为评估。允许大鼠自由运动，在4分钟内由两名观察者对其使用后肢的能力进行评分。根据21分BBB运动分级法(Basso et al. J.Neurotrauma，12：1-12(1995))，评判关节活动、足爪放置、体重支撑和前/后肢协调性。
游泳试验。游泳试验的设置包括矩形有机玻璃盆(150x40x13cm)。水(23-25℃)的深度足够使大鼠不能碰到盆底。正常动物游泳是通过后肢和尾巴划水，前肢举在颌下不动(Stolz et al.Behav.Brain Res.，106：127-132(1999))。利用以45度放在池底的镜子从侧面和底部同时拍摄大鼠，每只大鼠监测5轮游泳情况。通过按照以下标准给它们的动作打分来分析大鼠的游泳表现：前肢使用：2分＝未使用(正常)，1分＝整个距离使用一个手臂或者半程使用两只手臂，0分＝一直使用两只手臂；后爪距离(支撑基础)：2分＝小距离，后腿在身体下方，1分＝腿在身体外侧，但爪子仍在身下，0分＝距离大，腿和脚都在身体外侧；后肢打水：2分＝打水有力，1分＝打水力量中等，0分＝虚弱或没有打水动作；尾巴动作：2分＝整个尾巴运动规律有力，1分＝部分运动，0分＝没有或者只有很弱的运动。因此正常的游泳可以得到7到8分，训练良好的大鼠常规地达到这一数值。
纤维计数和出芽评分
在全部纵切连续切片中，以最终400x放大倍数在三个限定的区域(0.25mm头尾轴宽度，距损毁部位尾端0.5mm、2mm和5mm)内计数从主要CST发出的再生纤维数量。由有经验的不了解情况的观察者，根据紧靠损毁头端的CST出芽的密度、异常途径、朝向损毁和损毁周围的弯曲、长度和分枝评分(0＝没有出芽，3＝非常强的出芽)。
实施例12
培育抗GDNF前原区的抗体320/(α)pro-GDNF、321/pro-GDNF和322/(β)pro-GDNF
肽合成
给每种待培育的抗体制备一种肽，共制备了三种。所述肽是：
肽A320：CGKRLLEAPAEDHSLGHRRVP(SEQ ID NO：46)，用于320/(α)pro-GDNF
肽A321：CPEDYPDQFDDVMD(SEQ ID NO：47)，用于321/pro-GDNF和
肽A322：CHTASAFPLPAANM(SEQ ID NO：48)，用于322/(β)pro-GDNF。
肽的制备基于利用Fmoc化学固相肽合成(SPPS)技术。Fmoc代表9-芴甲基氯甲酸酯(fluorenylmethyl chloroformate)(9H-(f)luoren-9-yl(m)eth(o)xy(c)arbonyl)，描述的是给氨基酸的N添加的Fmoc保护基团以防止不需要的反应，在酸性条件下稳定。合成按照标准程序(Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis，Taylor&Francis Group，2005)，以0.1mmol的规模从肽的C末端到N末端自动进行。合成过程中，氨基酸侧链的功能基团用永久性保护基团保护，这些保护基团在合成完成后被切割，但它们在合成过程中对所有化学试剂是稳定的。切割后，利用HPLC(高效液相色谱)技术控制肽纯度(肽溶解于乙腈)，HPLC不同流份的质量用MALDI TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)控制，并在冷冻干燥设备中冻干。此外，在HPLC中纯化2mg肽用于免疫(＞95％纯度)。肽-树脂保存在-20℃，肽粉末保存在+4℃。
KLH偶联
将2mg纯肽偶联到载体蛋白KLH(匙孔嘁血蓝蛋白)上以便在之后的免疫过程中刺激免疫反应。KLH很合适，因为它的分子量大(MW 4.5x105到1.3x107)、免疫原性强并且带有很多赖氨酸可以用于偶联。用于偶联到肽上，使用的是马来酰亚胺活化的KLH。马来酰亚胺基团与添加到肽N末端的半胱氨酸(每个肽只有一个Cys，避免内部Cys)的SH-基反应，以便确保定点偶联和未被遮蔽的肽用于免疫过程。反应在中性条件下进行，之后利用透析纯化。最终溶液是溶于PBS的偶联剂浓度为0.5mg/ml。用偶联前和后收集的样品(有和没有KLH的肽)，以Ellman测试控制偶联步骤。利用Ellman试剂(二硫双(2-硝基苯甲酸))或DTNB)进行Ellman测试来估计含有巯基的肽与KLH偶联的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook，2ndedition，Humana Press inc.2002，pp 595-596)。
免疫
免疫时间表：第0天-免疫前血清和第一次(I)免疫；第14天-第二次(II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA检测；第56天-第四次(IV)免疫；第66天-最后的取血和ELISA检测。第一次免疫使用了弗氏完全佐剂(FCA)，其他免疫使用弗氏不完全佐剂(FIA)。弗氏佐剂是油包水的乳剂，含有FCA，能够杀死结核分支杆菌，被用于增强免疫反应。将佐剂与KLH-肽偶联溶液小心地1∶1混合，皮下注射到两个部位。一个课题中，使用了2只兔子。从耳静脉(air vain)取血，凝结并离心制备血清。免疫前血清的量是～1ml，用于ELISA检测的初期血清是～0.3ml，最终血清～30ml。
ELISA
将适量的肽A320、A321或A322与牛血清清蛋白(BSA)偶联(与KLH偶联程序相同)。然后将该肽-BSA偶联物包埋到高容量蛋白结合微量滴定板上(每个样品一式两份)。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗体作为二抗，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)作为底物，通过标准ELISA检测免疫前、初期和最终血清。用ELISA检测仪测量450nm的光密度。
IgG-特异性纯化
IgG纯化采用了
Figure BPA00001167896000451
技术。
Figure BPA00001167896000452
合成亲和配体吸附剂被证实可以用于从血清、血浆、腹水、哺乳动物细胞培养物上清或转基因来源提纯抗体，它是替代蛋白A纯化的一种创新技术。从血抗血清纯化抗体是通过将它们与MAbsorbent A1P/A2P结合进行的。Mabsorbent合成亲和配体吸附剂“模拟”重组和天然蛋白A。但它们非常不同的是Mabsorbents能够结合所有IgG亚型。它能有效结合多种人和哺乳动物多克隆抗体(包括牛、小鼠、绵羊、山羊、马和兔)以及完整单克隆抗体、人源化抗体嵌合分子和抗体片段。
首先，按照随空柱子和Mabsorbent提供的使用说明准备柱子。简单来说，将吸附剂浆温和地混匀，加到柱子中，并用结合缓冲液平衡柱子。
其次，将稀释在结合缓冲液中的适量抗血清加入柱子，温育并使其流过柱子。血清中的抗体与MAbsorbent A1P/A2P结合。然后将柱子清洗，从亲和吸附剂上洗脱抗体并收集成2ml的流份。这之后，将柱子再次平衡用于新一轮纯化。可以反复进行这一步，直至所需量的抗血清被纯化。平衡和结合在中性pH进行，洗脱在酸性条件下进行。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCATM蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-20℃。
表位特异性纯化
表位特异性亲和纯化采用了NHS-活化的
Figure BPA00001167896000461
介质技术。NHS-活化的Sepharose可与抗原形成稳定的酰胺键，这里是与肽形成酰胺键，之后肽会结合血清中的抗体。抗体将被洗脱并收集。这个方法帮助纯化血清中抗给定肽的抗体。
首先，按照随空柱子和NHS-活化的
Figure BPA00001167896000462
介质提供的使用说明准备柱子。简单来说，将NHS-活化的介质加到空柱子中并清洗以除去储存液。将抗原溶解在偶联缓冲液中，加入柱子与Sepharose的活性基团在温育期间结合。然后将柱子立在TRIS缓冲液中以封闭任何未发生反应的活性基团。然后用pH值不同的两种不同的缓冲液(例如，第一种缓冲液pH8-9，第二种缓冲pH3-4)清洗柱子。
其次，用结合缓冲液将准备好的柱子平衡，并取稀释在PBS中的适量血液抗血清装柱。允许淤浆停留几分钟以便抗体与抗原结合。用不同pH(pH8-6.5)的结合缓冲液洗柱子，然后在酸性条件下洗脱抗体，收集每份1ml的流份。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCATM蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-2O℃。
pro-GDNF抗体特异性的表征
通过Western印迹和免疫荧光分析验证了pro-GDNF抗体的特异性。在免疫荧光分析中，将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染0.8μg质粒。用于转染的构建体是包含在pEGFP载体(Invitrogen)中人和/或小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF，以及包含在pAAV-MCS载体中蛋白编码起始密码子为ATG的人pre-(γ)pro-GDNF。包含在pAAV-MCS载体中缺少原区的人pre-GDNF作为对照(Pia Runeberg-Roos博士惠赠，Universityof Helsinki，Finland)。该构建体与其他所用构建体克隆过程类似。从空pEGFP-Nl载体表达重组GFP蛋白作为模拟转染对照。转染后4小时，将培养基换成含有10％FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后24小时，用4％仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用01％Triton X-100(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5％BSA中的一抗，即抗GDNF pro-结构域的多克隆320/(α)pro-GDNF(1∶200稀释)、32l/pro-GDNF(1∶200稀释)或322/(β)pro-GDNF(1∶200稀释)，和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1∶100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗即偶联Cy2的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories)和偶联Cy3的驴抗兔IgG(JacKson ImmunoResearch laboratories)重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。最后用Immu-mount(Thermo electron corporation)盖上盖片。通过显微镜(AX70Provis；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70；Olympus)获取图像。在Western印迹分析中，将生长在含有10％FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80％铺满时，每孔转染4μg质粒。用于转染的构建体是包含在pEGFP-NI载体(Invitrogen)中人和/或小鼠pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF，包含在pAAV-IRES-hrGFP载体(Stratagene)中的人pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF以及包含在pAAV-MCS载体(Stratagene)中的pre-(α)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF。包含在pAAV-MCS载体中缺少原区的人pre-GDNF作为对照。该构建体与其他所用构建体克隆过程类似。从空pEGFP-Nl载体表达重组GFP蛋白作为模拟转染对照。转染后4小时，将培养基换成2ml OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，将培养基浓缩，样品利用15％变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0.1％)中的5％牛奶封闭。通过ECL方法，用抗GDNF原-结构域的多克隆320/(α)pro-GDNF(1∶500稀释)或321/pro-GDNF(1∶500稀释)和抗成熟GDNF的多克隆D20抗体(Santa Cruz，1∶500稀释)，以及随后的偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1∶2000稀释)检测GDNF。
结果
免疫荧光分析结果显示，321/pro-GDNF抗体能够识别(α)pro-GDNF、(β)pro-GDNF和(γ)pro-GDNF的GDNF原-结构域，但不能识别缺少原区的GDNF蛋白或者重组GFP蛋白。此外，在未被转染的细胞中未看到特异性染色。用识别GDNF成熟部分的小鼠抗GDNF抗体也可以检测(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF以及缺少原区的GDNF蛋白(图13)。在免疫荧光分析中，320/(α)pro-GDNF抗体能够识别(α)pro-GDNF的GDNF原区，但不能识别(β)pro-GDNF、(γ)pro-GDNF、缺少原区的GDNF或者重组GFP蛋白。用识别GDNF成熟部分的小鼠抗GDNF抗体也可以检测(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF以及缺少原区的GDNF蛋白。除了小鼠抗GDNF染色，转染了pre-(β)pro-GDNF cDNA的细胞中还看到某些GFP信号(绿色)，很可能是从pEGFP-Nl载体泄露的(图14)。在免疫荧光分析中，322/(β)pro-GDNF抗体能够识别(β)pro-GDNF的GDNF原-结构域，但不能识别(α)pro-GDNF、(γ)pro-GDNF、缺少原区的GDNF或重组GFP蛋白。用识别GDNF成熟部分的小鼠抗GDNF抗体也可以检测(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF以及缺少原区的GDNF蛋白。除了小鼠抗GDNF染色，转染了pre-(β)pro-GDNF cDNA的细胞中还看到某些GFP信号(绿色)，很可能是从pEGFP-Nl载体泄露的(图15)。
Western印迹分析结果显示，321/pro-GDNF抗体能够识别(α)pro-GDNF和(β)pro-GDNF的GDNF原-结构域，但不能识别缺少原区的GDNF蛋白或重组GFP蛋白。此外，321/pro-GDNF抗体能够识别(α)pro-GST和(β)pro-GST融合蛋白。抗GDNF成熟部分的抗GDNF D20抗体能够识别(α)pro-GDNF、(β)pro-GDNF和缺少原区的GDNF蛋白(图16)。在Western印迹中，322/(α)pro-GDNF抗体能够识别(α)pro-GDNF的GDNF原-结构域，但不能识别(β)pro-GDNF或缺少原区的GDNF蛋白。抗GDNF成熟部分的抗GDNFD20抗体能够识别(α)pro-GDNF、(β)pro-GDNF和缺少原区的GDNF蛋白(图17)。
实施例13
培育pre-(γ)pro-GDNF的特异性抗体
根据如实施例12中所用的已知技术，制备包含pre-(γ)pro-GDNF肽特有的氨基酸序列的肽。
偶联
将纯肽偶联到载体蛋白KLH(匙孔嘁血蓝蛋白)上以便在之后的免疫过程中刺激免疫反应。用于偶联到肽上，使用的是马来酰亚胺活化的KLH。马来酰亚胺基团与添加到肽N末端的半胱氨酸(每个肽只有一个Cys，避免内部Cys)的SH-基反应，以便确保定点偶联和未被遮蔽的肽用于免疫过程。反应在中性条件下进行，之后利用透析纯化。最终溶液溶于PBS，偶联剂浓度为0.5mg/ml。用偶联前和后收集的样品(有和没有KLH的肽)，如实施例12所述通过Ellman测试控制偶联步骤。利用Ellman试剂(二硫双(2-硝基苯甲酸))或DTNB)进行Ellman测试来估计含有巯基的肽与KLH偶联的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook，2nd edition，Humana Press inc.2002，pp 595-596)。
免疫
按照以下方案给兔免疫：第0天-免疫前血清和第一次(I)免疫；第14天-第二次(II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA检测；第56天-第四次(IV)免疫；第66天-最后的取血和ELISA检测。第一次免疫使用了弗氏完全佐剂(FCA)，其他免疫使用弗氏不完全佐剂(FIA)。弗氏佐剂是油包水的乳剂，含有FCA，能够杀死结核分支杆菌，被用于增强免疫反应。将佐剂与KLH-肽偶联溶液小心地1∶1混合，皮下注射到两个部位。从耳静脉(air vain)取血，凝结并离心制备血清。免疫前血清的量是～1ml，用于ELISA检测的初期血清是～0.3ml，最终血清～30ml。
ELISA
将适量的用于免疫的肽与牛血清清蛋白(BSA)偶联(与KLH偶联程序相同)。然后将该肽-BSA偶联物包被到高容量蛋白结合微量滴定板上(每个样品一式两份)。然后，用BSA将板上的所有空结合位点封闭。由免疫前、初期和最终血清制备稀释液(在最后的ELISA过程中)，并加入微孔中。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗体作为二抗检测结合样品，从而形成“三明治”结构。在两个孔中用磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照，每个步骤后将板温育并清洗。最后，加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)后与HPR发生比色反应，用ELISA检测仪测量450nm的光密度。
抗体纯化
IgG纯化采用了技术。从血液抗血清纯化抗体是通过将它们与MAbsorbent A1P/A2P结合进行的。Mabsorbent合成亲和配体吸附剂“模拟”重组和天然蛋白A。首先，按照随空柱子和Mabsorbent提供的使用说明准备柱子。简单来说，将吸附剂浆温和地混匀，加到柱子中，并用结合缓冲液平衡柱子。
然后，将稀释在结合缓冲液中的适量抗血清加入柱子，温育并使其流过柱子。血清中的抗体与MAbsorbent A1P/A2P结合。然后洗柱子，从亲和吸附剂上洗脱抗体并收集成2ml的流份。这之后，将柱子再次平衡用于新一轮纯化。可以反复进行这一步，直至所需量的抗血清被纯化。平衡和结合在中性pH进行，洗脱在酸性条件下进行。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCATM蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-20℃。
表位特异性亲和纯化采用了NHS-活化的介质技术。NHS-活化的Sepharose可与抗原形成稳定的酰胺键，这里是与肽形成酰胺键，之后肽会结合血清中的抗体。抗体将被洗脱并收集。这个方法帮助纯化血清中抗给定肽的抗体。
首先，按照随空柱子和NHS-活化的
Figure BPA00001167896000503
介质提供的使用说明准备柱子。简单来说，将NHS-活化的
Figure BPA00001167896000504
介质加到空柱子中并清洗以除去储存液。将抗原溶解在偶联缓冲液中，加入柱子与Sepharose的活性基团在温育期间结合。将柱子立在TRIS缓冲液中以封闭任何未发生反应的活性基团。然后用pH值不同的两种不同的缓冲液(例如，第一种缓冲液pH8-9，第二种缓冲液pH3-4)洗柱子。
随后，用结合缓冲液将准备好的柱子平衡，并取稀释在PBS中的适量血液抗血清装柱。允许淤浆停留几分钟以便抗体与抗原结合。用不同pH(pH8-6.5)的结合缓冲液洗柱子，然后在酸性条件下洗脱抗体，收集每份1ml的流份。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCATM蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-20℃。
序列表自由格式(free text)
SEQ ID NO：1[223]：天然人pre-gamma-pro-GDNF
SEQ ID NO：3[223]：小鼠pre-gamma-pro-GDNF
SEQ ID NO：5[223]：人pre-gamma-pro-GDNF，带ATG
SEQ ID NO：7[223]：引物42
SEQ ID NO：8[223]：引物43
SEQ ID NO：9[223]：引物46
SEQ ID NO：10[223]：引物47
SEQ ID NO：11[223]：引物53
SEQ ID NO：12[223]：引物49
SEQ ID NO：13[223]：引物48
SEQ ID NO：14[223]：引物54
SEQ ID NO：15[223]：人GDNF 5′引物
SEQ ID NO：16[223]：人GDNF 3′引物
SEQ ID NO：17[223]：引物91
SEQ ID NO：18[223]：引物92
SEQ ID NO：19[223]：pre-gamma-pro aa序列，带Leu
SEQ ID NO：20[223]：pre-gamma-pro nt序列，带CTG
SEQ ID NO：21[223]：pre-gamma-pro aa序列，带Met
SEQ ID NO：22[223]：pre-gamma-pro nt序列，带ATG
SEQ ID NO：23[223]：截短的pre-gamma-pro-GDNF nt，带CTG
SEQ ID NO：25[223]：截短的pre-gamma-pro-GDNF nt，带ATG
SEQ ID NO：27[223]：V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，带Leu
SEQ ID NO：28[223]：V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，带CTG
SEQ ID NO：29[223]：V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，带Met
SEQ ID NO：30[223]：V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，带ATG
SEQ ID NO：31[223]：V38M pre-beta-pro-GDNF aa
SEQ ID NO：32[223]：V38M pre-beta-pro-GDNF nt
SEQ ID NO：33[223]：V64M pre-alfa-pro-GDNF aa
SEQ ID NO：34[223]：V64M pre-alfa-pro-GDNF nt
SEQ ID NO：35[223]：截短的pre-beta-pro-GDNF aa
SEQ ID NO：36[223]：截短的pre-beta-pro-GDNF nt
SEQ ID NO：37[223]：pEGFP 5′引物
SEQ ID NO：38[223]：pEGFP 3′引物
SEQ ID NO：39[223]：引物89
SEQ ID NO：40[223]：引物90
SEQ ID NO：41[223]：pAAV-MCS 5′引物
SEQ ID NO：42[223]：pAAV-MCS 3′引物
SEQ ID NO：43[223]：GDNF蛋白剪接变体alfa，beta或gamma中任一种的前原序列的C末端26个氨基酸的序列
SEQ ID NO：44[223]：人pre-alfa-pro-GDNF的原肽
SEQ ID NO：45[223]：人pre-beta-pro-GDNF的原肽
SEQ ID NO：46[223]：抗体320的表位(基于小鼠alfa-原序列)
SEQ ID NO：47[223]：抗体321的表位(基于pro-GDNF的C末端)
SEQ ID NO：48[223]：抗体322的表位(基于beta-原序列)
SEQ ID NO：49[223]：pre-alfa-pro-GDNF的前原区
SEQ ID NO：50[223]：pre-beta-pro-GDNF的前原区
SEQ ID NO：51[223]：人pre-beta-pro-GDNF
SEQ ID NO：51[223]：原肽
序列表
<110>莉娜.尼瓦莱塔(Lonka，Liina)
     马特.萨尔马(Saarma，Mart)
<120>GDNF剪接变体及其用途
<130>46816
<150>FI 20070808
<151>2007-10-25
<150>US 60/983,281
<151>2007-10-29
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>546
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(546)
<223>天然人pre-gamma-pro-GDNF
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(543)
<220>
<221>misc_signal
<222>(1)..(141)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(142)..(543)
<400>1
ctg gga ctt ggg gca cct gga gtt aat gtc caa cct agg gtc tgc gga       48
Leu Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
gac ccg atc cga gca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat       96
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg tca      144
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
-15                 -10                 -5              -1  1
cca gat aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg aat cgg cag      192
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
            5                   10                  15
gct gca gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt cgg aga ggc      240
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
        20                  25                  30
cag agg ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat      288
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
    35                  40                  45
gtc act gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt      336
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
50                  55                  60                  65
agg tac tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa      384
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys
                70                  75                  80
ata ttg aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta      432
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val
            85                  90                  95
ggg cag gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt      480
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
        100                 105                 110
tta gat gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa      528
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
    115                 120                 125
agg tgt gga tgt atc tga                                              546
Arg Cys Gly Cys Ile
130
<210>2
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
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        -45                 -40                 -35
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
-15                 -10                 -5              -1  1
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
            5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
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Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
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Met Gly Phe Gly Pro Leu Gly Val Asn Val Gln Leu Gly Val Tyr Gly
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gac cgg atc cga gcc aat atg cct gaa gat tat cct gac cag ttt gat       96
Asp Arg Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
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gac gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg tca      144
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Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
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Met Gly Phe Gly Pro Leu Gly Val Asn Val Gln Leu Gly Val Tyr Gly
        -45                 -40                 -35
Asp Arg Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
-15                 -10                 -5              -1  1
Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
            5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
        20                  25                  30
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
    35                  40                  45
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
50                  55                  60                  65
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ser Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys
                70                  75                  80
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val
            85                  90                  95
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
        100                 105                 110
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
    115                 120                 125
Arg Cys Gly Cys Ile
130
<210>5
<211>546
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(543)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(546)
<223>人pre-gamma-pro-GDNF，带ATG
<220>
<221>misc_signal
<222>(1)..(141)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(142)..(543)
<400>5
atg gga ctt ggg gca cct gga gtt aat gtc caa cct agg gtc tgc gga       48
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
gac ccg atc cga gca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat       96
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg tca      144
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
-15                 -10                 -5              -1  1
cca gat aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg aat cgg cag      192
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
            5                   10                  15
gct gca gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt cgg aga ggc      240
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
        20                  25                  30
cag agg ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat      288
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
    35                  40                  45
gtc act gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt      336
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
50                  55                  60                  65
agg tac tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa      384
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys
                70                  75                  80
ata ttg aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta      432
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val
            85                  90                  95
ggg cag gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt      480
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
        100                 105                 110
tta gat gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa      528
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lle Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
    115                 120                 125
agg tgt gga tgt atc tga                                              546
Arg Cys Gly Cys Ile
130
<210>6
<211>181
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
-15                 -10                 -5              -1  1
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
            5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
        20                  25                  30
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
    35                  40                  45
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
50                  55                  60                  65
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys
                70                  75                  80
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val
            85                  90                  95
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
        100                 105                 110
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
    115                 120                 125
Arg Cys Gly Cys Ile
130
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物42
<400>7
gctcctgccc gaggtc                         16
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物43
<400>8
cctttcttcg cactgtagca g                   21
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物46
<400>9
gtccggat gggtctcctgg                      19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物47
<400>10
cacagcagtc tctggagccg                     20
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物53
<400>11
gacctgttgg gcggggctc                      19
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物49
<400>12
cctgggaacc ttggtccctt tc                  22
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物48
<400>13
gctccagcca tcagcccgg                           19
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物54
<400>14
cacagcagtc tctggagccg g                        21
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人GDNF 5′引物
<400>15
gctccagcca tcagcccgg                           19
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人GDNF 3′引物
<400>16
cacagcagtc tctggagccg g                        21
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物91
<400>17
caacaaggat ccatgggact tggggcacct ggagttaatg    40
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物92
<400>18
ccaccactcg agtcagatac atccacacct tttagcgg      38
<210>19
<211>47
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(47)
<223>pre-gamma-pro aa序列，带Leu
<400>19
Leu Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
            20                  25                  30
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
        35                  40                  45
<210>20
<211>141
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(141)
<223>pre-gamma-pro nt序列，带CTG
<400>20
ctgggacttg gggcacctgg agttaatgtc caacctaggg tctgcggaga cccgatccga     60
gcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag ttcgatgatg tcatggattt tattcaagcc    120
accattaaaa gactgaaaag g                                              141
<210>21
<211>47
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(47)
<223>pre-gamma-pro aa序列，带Met
<400>21
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
            20                  25                  30
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
        35                  40                  45
<210>22
<211>141
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(141)
<223>pre-gamma-pro nt序列，带ATG
<400>22
atgggacttg gggcacctgg agttaatgtc caacctaggg tctgcggaga cccgatccga     60
gcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag ttcgatgatg tcatggattt tattcaagcc    120
accattaaaa gactgaaaag g                                              141
<210>23
<211>432
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(429)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(432)
<223>截短的pre-gamma-pro-GDNF nt，带CTG
<220>
<221>misc_signal
<222>(1)..(141)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(142)..(429)
<400>23
ctg gga ctt ggg gca cct gga gtt aat gtc caa cct agg gtc tgc gga       48
Leu Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
gac ccg atc cga gca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat       96
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    30                  -25                 -20
gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg cgg      144
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Arg
-15                 -10                 -5              -1  1
ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat gtc act gac ttg ggt ctg      192
Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu
            5                   10                  15
ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt agg tac tgc agc ggc tct      240
Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser
        20                  25                  30
tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa ata ttg aaa aac tta tcc      288
Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser
    35                  40                  45
aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta ggg cag gca tgt tgc aga      336
Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg
50                  55                  60                  65
ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt tta gat gat aac ctg gtt      384
Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val
                70                  75                  80
tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa agg tgt gga tgt atc tga      432
Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
            85                  90                  95
<210>24
<211>143
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Leu Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Arg
-15                 -10                 -5              -1  1
Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu
            5                   10                  15
Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser
        20                  25                  30
Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser
    35                  40                  45
Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg
50                  55                  60                  65
Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val
                70                  75                  80
Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
            85                  90                  95
<210>25
<211>432
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(429)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(432)
<223>截短的pre-gamma-pro-GDNF nt，带ATG
<220>
<221>misc_signal
<222>(1)..(141)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(142)..(429)
<400>25
atg gga ctt ggg gca cct gga gtt aat gtc caa cct agg gtc tgc gga       48
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
gac ccg atc cga gca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat       96
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg cgg      144
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Arg
-15                 -10                 -5              -1  1
ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat gtc act gac ttg ggt ctg      192
Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu
            5                   10                  15
ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt agg tac tgc agc ggc tct      240
Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser
        20                  25                  30
tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa ata ttg aaa aac tta tcc      288
Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser
    35                  40                  45
aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta ggg cag gca tgt tgc aga      336
Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg
50                  55                  60                  65
ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt tta gat gat aac ctg gtt      384
Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val
                70                  75                  80
tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa agg tgt gga tgt atc tga      432
Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
            85                  90                  95
<210>26
<211>143
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>26
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
        -45                 -40                 -35
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
    -30                 -25                 -20
Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Arg
-15                 -10                 -5              -1  1
Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu
            5                   10                  15
Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser
        20                  25                  30
Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser
    35                  40                  45
Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg
50                  55                  60                  65
Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val
                70                  75                  80
Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
            85                  90                  95
<210>27
<211>181
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(181)
<223>V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，带Leu
<400>27
Leu Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
            20                  25                  30
Asp Met Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
        35                  40                  45
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
65                  70                  75                  80
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
                85                  90                  95
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
            100                 105                 110
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys
        115                 120                 125
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val
    130                 135                 140
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
                165                 170                 175
Arg Cys Gly Cys Ile
            180
<210>28
<211>546
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(546)
<223>V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，带CTG
<400>28
ctgggacttg gggcacctgg agttaatgtc caacctaggg tctgcggaga cccgatccga     60
gcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag ttcgatgata tgatggattt tattcaagcc    120
accattaaaa gactgaaaag gtcaccagat aaacaaatgg cagtgcttcc tagaagagag    180
cggaatcggc aggctgcagc tgccaaccca gagaattcca gaggaaaagg tcggagaggc    240
cagaggggca aaaaccgggg ttgtgtctta actgcaatac atttaaatgt cactgacttg    300
ggtctgggct atgaaaccaa ggaggaactg atttttaggt actgcagcgg ctcttgcgat    360
gcagctgaga caacgtacga caaaatattg aaaaacttat ccagaaatag aaggctggtg    420
agtgacaaag tagggcaggc atgttgcaga cccatcgcct ttgatgatga cctgtcgttt    480
ttagatgata acctggttta ccatattcta agaaagcatt ccgctaaaag gtgtggatgt    540
atctga                                                               546
<210>29
<211>181
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，带Met
<400>29
Met Gly Leu Gly Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Pro Arg Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Ile Arg Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp
            20                  25                  30
Asp Met Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser
        35                  40                  45
Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly
65                  70                  75                  80
Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn
                85                  90                  95
Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe
            100                 105                 110
Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys
        115                 120                 125
Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val
    130                 135                 140
Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys
                165                 170                 175
Arg Cys Gly Cys Ile
            180
<210>30
<211>546
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(546)
<223>V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，带ATG
<400>30
atgggacttg gggcacctgg agttaatgtc caacctaggg tctgcggaga cccgatccga     60
gcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag ttcgatgata tgatggattt tattcaagcc    120
accattaaaa gactgaaaag gtcaccagat aaacaaatgg cagtgcttcc tagaagagag    180
cggaatcggc aggctgcagc tgccaaccca gagaattcca gaggaaaagg tcggagaggc    240
cagaggggca aaaaccgggg ttgtgtctta actgcaatac atttaaatgt cactgacttg    300
ggtctgggct atgaaaccaa ggaggaactg atttttaggt actgcagcgg ctcttgcgat    360
gcagctgaga caacgtacga caaaatattg aaaaacttat ccagaaatag aaggctggtg    420
agtgacaaag tagggcaggc atgttgcaga cccatcgcct ttgatgatga cctgtcgttt    480
ttagatgata acctggttta ccatattcta agaaagcatt ccgctaaaag gtgtggatgt    540
atctga                                                               546
<210>31
<211>185
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(185)
<223>V38M pre-beta-pro-GDNF aa
<400>31
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
            20                  25                  30
Asp Gln Phe Asp Asp Met Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg
        35                  40                  45
Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu
    50                  55                  60
Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys
65                  70                  75                  80
Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala
                85                  90                  95
Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu
            100                 105                 110
Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val
    130                 135                 140
Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp
145                 150                 155                 160
Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys
                165                 170                 175
His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
            180                 185
<210>32
<211>558
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(558)
<223>V38M pre-beta-pro-GDNF nt
<400>32
atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc     60
ccgctgcccg ccgcaaatat gccagaggat tatcctgatc agttcgatga tatgatggat    120
tttattcaag ccaccattaa aagactgaaa aggtcaccag ataaacaaat ggcagtgctt    180
cctagaagag agcggaatcg gcaggctgca gctgccaacc cagagaattc cagaggaaaa    240
ggtcggagag gccagagggg caaaaaccgg ggttgtgtct taactgcaat acatttaaat    300
gtcactgact tgggtctggg ctatgaaacc aaggaggaac tgatttttag gtactgcagc    360
ggctcttgcg atgcagctga gacaacgtac gacaaaatat tgaaaaactt atccagaaat    420
agaaggctgg tgagtgacaa agtagggcag gcatgttgca gacccatcgc ctttgatgat    480
gacctgtcgt ttttagatga taacctggtt taccatattc taagaaagca ttccgctaaa    540
aggtgtggat gtatctga                    558
<210>33
<211>211
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(211)
<223>V64M pre-alfa-pro-GDNF aa
<400>33
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser
        35                  40                  45
Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Met
    50                  55                  60
Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp
65                  70                  75                  80
Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg
            100                 105                 110
Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr
        115                 120                 125
Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr
    130                 135                 140
Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu
145                 150                 155                 160
Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln
                165                 170                 175
Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp
            180                 185                 190
Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys
        195                 200                 205
Gly Cys Ile
210
<210>34
<211>636
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(636)
<223>V64M pre-alfa-pro-GDNF nt
<400>34
atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc    60
ccgctgcccg ccggtaagag gcctcccgag gcgcccgccg aagaccgctc cctcggccgc    120
cgccgcgcgc ccttcgcgct gagcagtgac tcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag    180
ttcgatgata tgatggattt tattcaagcc accattaaaa gactgaaaag gtcaccagat    240
aaacaaatgg cagtgcttcc tagaagagag cggaatcggc aggctgcagc tgccaaccca    300
gagaattcca gaggaaaagg tcggagaggc cagaggggca aaaaccgggg ttgtgtctta    360
actgcaatac atttaaatgt cactgacttg ggtctgggct atgaaaccaa ggaggaactg    420
atttttaggt actgcagcgg ctcttgcgat gcagctgaga caacgtacga caaaatattg    480
aaaaacttat ccagaaatag aaggctggtg agtgacaaag tagggcaggc atgttgcaga    540
cccatcgcct ttgatgatga cctgtcgttt ttagatgata acctggttta ccatattcta    600
agaaagcatt ccgctaaaag gtgtggatgt atctga                              636
<210>35
<211>147
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(147)
<223>截短的pre-beta-pro-GDNF aa
<400>35
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
            20                  25                  30
Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg
        35                  40                  45
Leu Lys Arg Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr
    50                  55                  60
Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu
                85                  90                  95
Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln
            100                 105                 110
Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp
        115                 120                 125
Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys
    130                 135                 140
Gly Cys Ile
145
<210>36
<211>444
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(444)
<223>截短的pre-beta-pro-GDNF nt
<400>36
atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc    60
ccgctgcccg ccgcaaatat gccagaggat tatcctgatc agttcgatga tgtcatggat    120
tttattcaag ccaccattaa aagactgaaa aggcggggtt gtgtcttaac tgcaatacat    180
ttaaatgtca ctgacttggg tctgggctat gaaaccaagg aggaactgat ttttaggtac    240
tgcagcggct cttgcgatgc agctgagaca acgtacgaca aaatattgaa aaacttatcc    300
agaaatagaa ggctggtgag tgacaaagta gggcaggcat gttgcagacc catcgccttt    360
gatgatgacc tgtcgttttt agatgataac ctggtttacc atattctaag aaagcattcc    420
gctaaaaggt gtggatgtat ctga                                           444
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pEGFP 5′引物
<400>37
caacgggact ttccaaaatg                                                20
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pEGFP 3′引物
<400>38
ggacacgctg aacttgtgg                                                 19
<210>39
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物89
<400>39
caacaaggat ccatgaagtt atgggatgtc gtgg                                34
<210>40
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物90
<400>40
ccaccactcg agtcagatac atccacacct tttag                               35
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pAAV-MCS 5′引物
<400>41
attctgagtc caagctaggc                        20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pAAV-MCS 3′引物
<400>42
tagaaggaca cctagtcaga                        20
<210>43
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(26)
<223>GDNF蛋白剪接变体alfa，beta或gamma中任一种的前原序列的C末端26个氨基酸的序列
<400>43
Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe
1               5                   10                  15
Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
            20                  25
<210>44
<211>58
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(58)
<223>人pre-alfa-pro-GDNF的原肽
<400>44
Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro Ala Glu Asp
1               5                   10                  15
Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe
        35                  40                  45
Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
    50                  55
<210>45
<211>32
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(32)
<223>人pre-beta-pro-GDNF的原肽
<400>45
Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe
1               5                   10                  15
Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
            20                  25                  30
<210>46
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体320的表位(基于小鼠alfa-原序列)
<400>46
Cys Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp His Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
His Arg Arg Val Pro
            20
<210>47
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体321的表位(基于pro-GDNF的C末端)
<400>47
Cys Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp
1               5                   10
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体322的表位(基于beta-pro序列)
<400>48
Cys His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met
1               5                   10
<210>49
<211>77
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(77)
<223>pre-alfa-pro-GDNF前原区
<400>49
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser
        35                  40                  45
Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val
    50                  55                  60
Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg
65                  70                  75
<210>50
<211>51
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(51)
<223>pre-beta-pro-GDNF的前原区
<400>50
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
            20                  25                  30
Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg
        35                  40                  45
Leu Lys Arg
    50
<210>51
<211>558
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(555)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(558)
<223>人pre-beta-pro-GDNF
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(57)
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(153)
<223>原肽
<220>
<221>mat_peptide
<222>(154)..(555)
<400>51
atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc       48
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
    -50                 -45                 -40
gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc gca aat atg cca gag gat tat cct       96
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
-35                 -30                 -25                 -20
gat cag ttc gat gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga      144
Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg
                -15                 -10                 -5
ctg aaa agg tca cca gat aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag      192
Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu
        -1  1               5                   10
cgg aat cgg cag gct gca gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa      240
Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys
    15                  20                  25
ggt cgg aga ggc cag agg ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca      288
Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala
30                  35                  40                  45
ata cat tta aat gtc act gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag      336
Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu
                50                  55                  60
gaa ctg att ttt agg tac tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca      384
Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr
            65                  70                  75
acg tac gac aaa ata ttg aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg      432
Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val
        80                  85                  90
agt gac aaa gta ggg cag gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat      480
Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp
    95                  100                 105
gac ctg tcg ttt tta gat gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag      528
Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys
110                 115                 120                 125
cat tcc gct aaa agg tgt gga tgt atc tga                              558
His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
                130
<210>52
<211>185
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>52
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
    -50                 -45                 -40
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
-35                 -30                 -25                 -20
Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg
                -15                 -10                 -5
Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu
        -1  1               5                   10
Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys
    15                  20                  25
Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala
30                  35                  40                  45
Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu
                50                  55                  60
Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr
            65                  70                  75
Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val
        80                  85                  90
Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp
    95                  100                 105
Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys
110                 115                 120                 125
His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile
                130

Claims (50)

1.纯化和分离的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(γ)pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.修饰的人GDNF蛋白剪接变体(pre-(γ)pro-GDNF)，其中SEQ ID NO：2的氨基末端亮氨酸替换为甲硫氨酸，如SEQ ID NO：6所示。
3.人pre-(γ)pro-GDNF的成熟多肽部分，其包含SEQ ID NO：2中的氨基酸1到134和SEQ ID NO：2中的氨基酸-47到-1序列部分，所述-47到-1部分具有调控功能，但缺少信号序列。
4.权利要求1所述的人GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，其包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。
5.权利要求2所述的人GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，其包含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
6.如SEQ ID NO：21中所示的具备调控功能的信号序列部分。
7.权利要求1所述的人GDNF蛋白剪接变体的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的38个氨基酸，所述形式如SEQ ID NO：24所示。
8.权利要求2所述的人GDNF蛋白剪接变体的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的38个氨基酸，所述形式如SEQ ID NO：26所示。
9.人pre-(γ)pro-GDNF的截短的成熟多肽部分，包含SEQ ID NO：2中的氨基酸39到134，以及具有调控功能的SEQ ID NO：2中氨基酸-47到-1的信号序列部分。
10.权利要求1所述人GDNF蛋白剪接变体的V34M突变体，包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
11.权利要求2所述人GDNF蛋白剪接变体的V34M突变体，包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
12.纯化的、分离的V38M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(β)pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
13.截短的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(β)pro-GDNF)，其缺少成熟多肽部分N末端的38个氨基酸，包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。
14.纯化的、分离的V64M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(α)pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
15.多核苷酸，编码权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体或其部分。
16.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
17.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5所示的核酸序列。
18.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：20所示的核酸序列。
19.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：22所示的核酸序列。
20.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：23所示的核酸序列。
21.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：25所示的核酸序列。
22.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：28所示的核酸序列。
23.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：30所示的核酸序列。
24.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：32所示的核酸序列。
25.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：36所示的核酸序列。
26.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：34所示的核酸序列。
27.载体，其包含与表达调控元件可操纵地连接的权利要求15-26任一所述多核苷酸。
28.权利要求27所述的载体，其中所述载体是病毒或非病毒载体。
29.权利要求28所述的载体，其中所述病毒载体是重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒或重组禽痘病毒载体，或者是其中的基因的表达可以体内调控的病毒载体。
30.权利要求28所述的载体，其中所述非病毒载体是细菌、真菌、哺乳动物、昆虫、植物或酵母载体或者脂质体或DNA的多胺衍生物。
31.经转化或转染的、已从其天然环境分离的宿主细胞，包含权利要求27-30中任一项所述的载体。
32.抗体，所述抗体与GDNF蛋白剪接变体α、β或γ中任一种的前原序列中的C末端26个氨基酸部分特异结合，该部分具有如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
33.抗体，所述抗体与pre-(α)pro-GDNF蛋白剪接变体的pro区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。
34.抗体，所述抗体与pre-(α)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列。
35.抗体，所述抗体与pre-(β)pro-GDNF蛋白剪接变体的pro区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。
36.抗体，所述抗体与pre-(β)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。
37.抗体，所述抗体与具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的pre-(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体特异结合。
38.抗体，所述抗体与具有如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的pre-(γ)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区特异结合。
39.用在治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法中的GDNF蛋白剪接变体或其部分，所述剪接变体或其部分选自权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID NO：52所示的GDNF蛋白剪接变体。
40.GDNF蛋白剪接变体或其部分在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述剪接变体或其部分选自权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID NO：52所示的GDNF蛋白剪接变体。
41.用于治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法的多核苷酸，所述多核苷酸选自权利要求15所述的多核苷酸和如SEQ ID NO：51所示的多核苷酸。
42.多核苷酸在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述多核苷酸选自权利要求15所述的多核苷酸和如SEQ IDNO：51所示的多核苷酸。
43.权利要求40或42所述的用途，其中所述神经系统疾病是中枢神经系统疾病、脊髓损伤、成瘾症、酗酒、局部缺血、癫痫、抑郁症或中风。
44.权利要求40或42所述的用途，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏症、阿尔茨海默氏病或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
45.多核苷酸在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述多核苷酸选自权利要求16-25中任一项所述的多核苷酸和如SEQ ID NO：51所示的多核苷酸，其中体内生成的pre-(γ)pro-GDNF和pre-(β)pro-GDNF蛋白的分泌受到神经元和神经物理刺激的调控。
46.治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的pre-(γ)pro-GDNF蛋白或pre-(β)pro-GDNF蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸给予患有这类病症或疾病的个体。
47.权利要求46所述的方法，其中的pre-(γ)pro-GDNF蛋白是权利要求2、5、8和11中任一项所述的蛋白。
48.权利要求46所述的方法，其中的pre-(β)pro-GDNF蛋白选自权利要求12或13所述的蛋白和如SEQ ID NO：52所示的蛋白。
49.药物组合物，其包含与药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂联用的有效量GDNF蛋白剪接变体，其中所述蛋白剪接变体选自权利要求1-14中任一项所述的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID NO：52所示的GDNF蛋白剪接变体。
50.药物组合物，其在载体中包含有效量的选自权利要求16-26中任一项所述的多核苷酸和如SEQ ID NO：51所示的多核苷酸中的多核苷酸，所述载体适合将所述多核苷酸导入患有神经系统疾病或神经退行性疾病的患者的细胞中，从而能够体内合成治疗有效的GDNF蛋白产物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173489A (zh) * 2013-02-25 2013-06-26 潍坊易思特生物科技有限公司 用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法
CN103614481A (zh) * 2013-12-04 2014-03-05 徐州医学院 用于检测gdnf剪接变异体2、4的实时荧光定量pcr专用引物及方法
CN108064310A (zh) * 2015-03-04 2018-05-22 莫茨药物股份两合公司 用于增强细胞对肉毒神经毒素的特异性摄取的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2719582A1 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 Amarantus Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating parkinson's disease with manf
CA2803646A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Angiochem Inc. Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof
UA112981C2 (uk) * 2011-04-11 2016-11-25 Елі Ліллі Енд Компані Варіант людського gdnf
RU2527169C2 (ru) * 2012-10-15 2014-08-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ hGDNF ПОД КОНТРОЛЕМ ТЕМПЕРАТУРОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ПРОМОТОРА ДЛЯ РЕГУЛИРУЕМОЙ ЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА КАК В КЛЕТКАХ, ТАК И НЕПОСРЕДСТВЕННО В ОРГАНИЗМЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
EP2968462B1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 The Jackson Laboratory Methods for promoting wound healing and hair growth
AU2014301116B2 (en) 2013-06-28 2019-11-14 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Means and methods for the determination of the biological activity of Neurotoxin polypeptides in cells
AU2017263174A1 (en) 2016-05-13 2018-12-13 Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes Methods of treating diseases associated with ILC3 cells
CA3041980C (en) * 2016-10-31 2023-06-13 Kolon Life Science, Inc. Composition for alleviating or treating pain comprising two or more selected from the genes that code for: glutamate decarboxylase (gad), interleukin-10 (il-10) and glial cell-derived neurotrophic factor (gdnf)
US20240270855A1 (en) 2021-06-03 2024-08-15 Fundação D. Anna De Sommer Champalimaud E Dr. Carlos Montez Champalimaud Neuro-mesenchyme units control ilc2 and obesity via a brain-adipose circuit
KR20240110849A (ko) 2021-11-29 2024-07-16 상하이 레제네리드 테라피즈 컴퍼니 리미티드 Aadc/gdnf 폴리뉴클레오티드 및 이의 파킨슨병 치료에 있어서의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1197461A (zh) * 1995-09-28 1998-10-28 安姆根有限公司 截短的神经胶质细胞系来源的神经营养因子
WO1999053091A2 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Gsf Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit Gmbh Gdnf-kodierende dna, teile davon und gdnf-varianten
CN1343724A (zh) * 2000-09-20 2002-04-10 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 Gdnf突变体及其治疗应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5849571A (en) 1990-10-10 1998-12-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Latency active herpes virus promoters and their use
US6071889A (en) 1991-07-08 2000-06-06 Neurospheres Holdings Ltd. In vivo genetic modification of growth factor-responsive neural precursor cells
MX9205293A (es) 1991-09-20 1993-05-01 Syntex Sinergen Neuroscience J Factores neurotrofico derivado del glial
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5879934A (en) 1992-07-31 1999-03-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
US5661033A (en) 1992-11-25 1997-08-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Gene transfer using herpes virus vectors as a tool for neuroprotection
US5631237A (en) 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
WO1994017810A1 (en) 1993-02-12 1994-08-18 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1994023744A1 (en) 1993-04-16 1994-10-27 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
AU7676894A (en) 1993-08-27 1995-03-21 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Convection-enhanced drug delivery
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
WO1995017203A1 (en) * 1993-12-22 1995-06-29 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel nucleic acid sequences isolated from glial cells
FR2716682B1 (fr) 1994-01-28 1996-04-26 Centre Nat Rech Scient Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations.
US5686278A (en) 1994-03-25 1997-11-11 Indiana University Foundation Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5792453A (en) 1995-02-28 1998-08-11 The Regents Of The University Of California Gene transfer-mediated angiogenesis therapy
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
FR2732357B1 (fr) 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose
US5830725A (en) 1995-04-28 1998-11-03 The Board Of Trustees For The Leland Stanford Junior University Rapid, stable high-titre production of recombing retrovirus
US5773289A (en) 1995-06-06 1998-06-30 University Of Pittsburgh AAV directed targeted integration
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6027931A (en) 1995-08-03 2000-02-22 Avigen, Inc. High-efficiency AA V helper functions
US5830727A (en) 1995-11-18 1998-11-03 Human Gene Therapy Research Institute Herpes simplex virus amplicon mini-vector gene transfer system
US5770414A (en) 1996-02-20 1998-06-23 The Regents Of The University Of California Regulatable retrovirus system for genetic modification of cells
EP1080202B1 (en) 1998-05-27 2006-01-25 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors encoding aadc
US6610836B1 (en) 1999-01-29 2003-08-26 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics
CA2469658A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Lijun Wang Adeno-associated virus-mediated delivery of gdnf to skeletal muscles
EP1660659A2 (en) * 2003-09-05 2006-05-31 Licentia, Ltd. Gdnf-related neuropeptides
AU2006308312A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Nsgene A/S Implantable Biocompatible Immunoisolatory Vehicle for Delivery of GDNF
WO2007103182A2 (en) 2006-03-01 2007-09-13 Biogen Idec Ma Inc. Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1197461A (zh) * 1995-09-28 1998-10-28 安姆根有限公司 截短的神经胶质细胞系来源的神经营养因子
WO1999053091A2 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Gsf Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit Gmbh Gdnf-kodierende dna, teile davon und gdnf-varianten
CN1343724A (zh) * 2000-09-20 2002-04-10 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 Gdnf突变体及其治疗应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173489A (zh) * 2013-02-25 2013-06-26 潍坊易思特生物科技有限公司 用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法
CN103173489B (zh) * 2013-02-25 2015-09-09 潍坊易思特生物科技有限公司 用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法
CN103614481A (zh) * 2013-12-04 2014-03-05 徐州医学院 用于检测gdnf剪接变异体2、4的实时荧光定量pcr专用引物及方法
CN103614481B (zh) * 2013-12-04 2015-12-30 徐州医学院 用于检测gdnf剪接变异体2、4的实时荧光定量pcr专用引物
CN108064310A (zh) * 2015-03-04 2018-05-22 莫茨药物股份两合公司 用于增强细胞对肉毒神经毒素的特异性摄取的方法
CN108064310B (zh) * 2015-03-04 2021-06-11 莫茨药物股份两合公司 用于增强细胞对肉毒神经毒素的特异性摄取的方法

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