CN102239244A - 用于截留和返回细胞的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于截留和返回在连续地或间歇地被穿流的器皿中的细胞的装置和方法。本发明还涉及一种借以能截留和返回在连续地或间歇地被穿流的器皿中的细胞的装置的制造方法。

Description

用于截留和返回细胞的方法和装置

本发明涉及一种用于截留（rückhalten）和返回（rückführen）在连续地或间歇地被穿流的器皿（Gefäß）中的细胞的装置，该装置可以在生物反应器的内部或外部工作。本发明还涉及一种用于在生物反应器的内部或外部截留和返回细胞的方法。本发明还涉及一种借以能截留和返回在连续地或间歇地被穿流的器皿中的细胞的装置的制造方法。

在制造生物活性物质和药物活性产品时，培养动物细胞和植物细胞具有重要意义。特别是经常在营养介质自由悬浮液中进行的细胞培养要求较高，因为与微生物相反，细胞对机械的剪应力和营养物质供应不足很敏感。

通常，对动物细胞系和植物细胞系进行间歇性培养。其缺点是，由于培养基（Substrat）浓度、产物浓度和生物质浓度持续变化，所以很难实现优化地供养细胞。在发酵结束时还会积聚副产物，例如坏死细胞的组成部分，这些副产物在以后处理时通常要付出很大的代价才能去掉。因此由于所述原因，但特别是在制造不稳定产物时，优选使用连续工作的生物反应器，所述产物例如可能因为分解蛋白的侵蚀而受损。

使用连续的生物反应器可以实现较高的细胞密度，且与此关联地实现较高的生产率，如果满足以下要求：

• 足够地且剪切小地给细胞供应以培养基、特别是溶解氧；

• 彻底去除在呼吸时产生的二氧化碳；

• 高效、剪切小、防堵塞的细胞截留系统，用于产生较高的细胞浓度；

• 生物反应器的长期稳定性（无菌、流体动力特性）。

除了连续的运行方式外，具有高效细胞截留系统的生物反应器例如还可以用于培养具有特别高的细胞密度的预培养物（Vorkulture）。于是以不连续的方式使用细胞截留系统，以便取出几乎没有生物质的细胞培养物上层清液（Zellkulturüberstand）。然后再次给预培养物反应器装填新鲜的营养介质，与简单的间歇性运行相比，通过这种方式可以使得培养物具有较高的细胞密度。

通常，为了剪切小地给细胞供应以溶解氧，利用膜片引入无气泡的气体。例如可以将膜片作为软管缠绕到篮式静子（Korbstator）上（Henzler, H.-J., Kauling, J., Oxygenation of cell cultures, Bioprocess Engineering, 9, 1993, 61-75, EP A 0172478, EP A 0240560）。为了得到较大的物质交换面积，使得这些软管以尽可能小的间距紧密地并排布置。

借助于剪切小的径向输送的搅拌机构如板式或锚式搅拌器，使得同心地布置的软管膜片在径向上被穿流，以便减小液体方面的物质输送阻力。

给细胞供应以溶解氧的另一种方案是，吹入含有氧气的气泡。但由于粗大的气泡和与其相关联的少量输送的物质的特定相界面比较小，所以吹入粗大的气泡和使用搅拌机构分散气泡能得到有限的较低的细胞密度。而且，细胞的生存能力因为机械的剪切应力而受损，当在对于细胞培养而言非同寻常的较高的效率范围内使用搅拌机构分散气泡时就会随之产生所述剪切应力（WO 03/020919 A2）。

出于这个原因，近几年来，提出一种吹入小气泡的方案，用于给细胞供应以氧气（Nienow, A.W., Reactor Engineering in Large Scale Animal Cell Culture, Cytotechnology, 50, 1-3, 2006, 9-33, Varley, J., Birch, J., Reactor design for large scale Suspension animal cell culture, Cytotechnology, 29, 3, 2004, 177-205）。

借助于由金属材料和陶瓷材料构成的特定的烧结体、过滤板或激光穿孔的板来产生小气泡，其中穿孔或者孔通常小于15μm。若气体空管速度（Gasleerrohrgeschwindigkeit）小于0.5m/h，则产生很小的气泡，在细胞培养物中通常使用的介质内，所述很小的气泡发生聚结的趋势很小。搅拌器的任务仅仅是将在生物反应器中的小气泡分散开，而不是产生小气泡。

为了能在连续运行的生物反应器中实现高的细胞密度（每毫升有>2亿个存活细胞），还需要有效地截留细胞。所需要的截留率取决于细胞的生长率和灌注率q/V（每个生物反应器体积V的介质流量q）。

过去曾提出用于连续运行的生物反应器的不同的细胞截留系统，这些系统通常设置在生物反应器外部。其原因是为了维护和清洁目的易于够到细胞截留系统。

为了使得特别是由于供氧不足和二氧化碳去除不彻底而对细胞造成的伤害保持得尽可能小，希望细胞截留系统具有较小的工作容积，进而相关地使得细胞滞留时间较短。

除了膜片式过滤器、按照利用静止膜片和活动膜片的横流过滤的原理工作的机组外，还使用特殊的离心器和重力分离器。

在借助于膜片过滤器进行细胞截留的情况下，能观察到沉积物或污垢，这会妨碍可靠地无维护地长期运行。只要快速地流过膜片表面，就能减少沉积物。但这种要求与剪切小的细胞培养物发酵这一基本前提相矛盾。

已研发出专用的剪切小的离心器，用于在离心场中分离细胞。但这种离心器在不维护的情况下只能工作几个星期。由于在进行维护工作时需要更换离心部件，故增大了细菌感染（Insterilität）的风险。

从细胞培养液中分离细胞的另一种方案是，使用重力分离器。在培养细胞时主要使用的重力分离器是沉降容器（Absetzbehälter）和倾斜管道分离器。与简单的沉降容器相比，倾斜管道分离器具有体积显著减小的优点。出版物（Henzler, H.-J., Chemie-Technik, 1, 1992, 3）描述了在倾斜管道分离器中的细胞截留，这些倾斜管道分离器可以在逆流、交流和直流中工作。被穿流的管道横截面可以设有板或管。专利说明书US 5,817,505 和EP 0 699 101 Bl要求保护用于在逆流分离器中截留细胞的倾斜管道分离器的使用权利。在WO2003020919 A2中记载了特别是逆流和交流分离器，以及与用于截留细胞的不同的预分离器（例如旋液分离器）的组合。

倾斜管道分离器通过外部回路与生物反应器连接。为此需要软管管路和泵，使用它们增加了设备复杂性，进而增大了发生故障的风险。而且增大了细胞受到的剪切应力。

为了减少细胞在重力分离器中的新陈代谢活动并减少结垢，提出将细胞培养液（Zellkulturbrühe）在其通向重力分离器的路径上降温冷却。在温度较低时，新陈代谢活动减少，这对细胞较长时间地滞留在生物反应器外部肯定有利。在重力分离器内部形成温度梯度和密度梯度会导致产生降低效率的自由对流这种流动现象，此点通过限制冷却温度来避免。

还记载过一种生物反应器，其中细胞截留系统设置在生物反应器内部。在EP 0 227 774 Bl中记载了一种连续工作的发酵罐，在该发酵罐中在气升式环流反应器内部进行细胞截留。气升式环流引导细胞悬浮液围绕由垂直的分隔壁构成的内部的流体静止的沉降区。在沉降区中分离出来的细胞返回到运动的细胞悬浮液中，同时在沉降区的顶端取出培养物上层清液。但所述垂直作用的截留设备的缺点是难以缩放比例（Skalierbarkeit）。这导致分离器容积相对于发酵区比例过大地增大。结果是细胞在供养不足的分离器中滞留时间太久，致使反应器系统的生产率降低。

因此基于现有技术提出如下任务，提供一种用于截留和返回动物的和植物的细胞的有效的方法，采用连续式或间歇式工作的方法，其考虑到了细胞对机械的剪切应力的敏感性，并考虑到了给细胞供应以充足的营养物质，其考虑到了制药工业的维护、清洁和杀菌工艺要求，使用这种方法能降低复杂性和发生故障的风险。

因此，本发明的主题是一种用于截留和返回在被穿流的器皿中的细胞的装置，其包括多个并排布置的管道，其中这些管道形成竖直的中空柱体，并相对于中空柱体的纵轴线倾斜在10°和60°之间的角度ß。

被穿流的器皿可以是生物反应器，或者是与生物反应器连接的用于细胞截留和返回的器皿。

可以连续地或间歇地对器皿进行穿流，优选连续地进行穿流。

这些管道在下端敞口。它们在上端通入到共同的具有至少一个管路的环形腔中，经由所述管路可以从器皿输送收获流。

在这些管道中对细胞和细胞培养溶液（Zellkulturlösung）进行分离。从生物反应器中连续地取出收获流，由此将细胞培养溶液和细胞吸入到管道中。细胞沉积在倾斜布置的管道内部，且如同传统的倾斜管道分离器那样，相对于流入的收获流逆流地又从管道流出，进而留在器皿中。与细胞分离的细胞培养溶液通过管道被输入到管道上方的环形腔中，最终从器皿中输出。

管道具有多边形的、椭圆形的或圆形的横截面。按照现有技术已知的倾斜管道板具有矩形的型面。就矩形型面而言，将用于沉积的细胞的分离面设计成平整的。横截面宽度为d的方形管道所具有的分离器面积要大于具有同样直径d的圆形管道。但已令人意想不到地发现，当在具有直径d的圆形管道中截留和返回细胞时，尽管分离器面积较小，其效率却与具有横截面宽度d的矩形管道的效率相同。一种可能的解释是，在横截面为圆形时，由于接触面积较小，在沉积的细胞与管道内壁之间的摩擦也较小，因而细胞易于滑出。也可以联想到是雪崩效应在起作用。因为沉积的细胞在圆形横截面的管道中，通过朝向竖直轴线上的最低点的附加的压实过程而上下堆叠，故它们要比在横截面为矩形的情况下更易于相互推挤。这最终使得位于分离器中的细胞减少，进而增大了自由通流横截面。

因此，优选管道具有朝向其底侧减小的横截面。特别优选管道横截型面在底侧呈半圆形或椭圆形。使用的管道具有朝向底侧减小的横截面，而不是按照现有技术的直板，这使得细胞明显加速地滑动，从而可以防止管道中的溶解氧可能会耗尽。在本发明的装置的一种优选的实施方式中，管道具有圆形的横截面。

对管道的设计（数量、直径、长度）总是取决于有待截留的细胞的种类、生物反应器大小和产量。

所需要的分离器面积A_erf可按照方程1，由沉积速度ws、灌注率q/V（每个生物反应器体积V的介质流量q）和生物反应器体积得到。效率η考虑到了倾斜管道分离器相对于竖直分离器的效率减小（方程2）。

对于矩形横截面和柱体形横截面而言，理论上的分离器面积A_th可以按照在文献（H.-J. Binder, Sedimentation aus Ein- und Mehrkornsuspensionen in schräg stehenden, laminar durchströmten Kreis- und Rechteckrohren, Dissertation Berlin, 1980）公开的方案，由方程3和方程4近似地得到：

A_erf=灌注率∙V/ws （方程1）

A_th=A_erf/η （方程2）

矩形时：A_th≈Z∙sin(ß)∙d∙L （方程3）

柱体形时：A_th≈Z∙sin(ß)∙d∙L∙3∙π/16 （方程4）

在这里，Z是管道的数量，ß是管道相对于重力方向倾斜的角度，d是管道的内直径，L是管道的长度，π是圆周率(π=3.14159...)。

角度ß取决于细胞的沉降和滑动特性，且优选为10°≤ß≤60°。根据一种优选的实施方式，角度ß在15°和45°之间，特别优选在25°-35°之间。为了改善滑动特性，可以利用合适的机构例如气动的或电动的振动器使得装置振动。若体积浓度或细胞密度>2亿个细胞/毫升且振动可能性有限，则20°≤ß≤35°的角度是特别优选的。

可以考虑使得角度沿着管道长度而改变。

管道宽度d（最大横截面宽度，在型面为圆形时为管道的直径）优选为d≥3mm，以便防止管道堵塞。根据一种优选的实施方式，所使用的管道的宽度为3mm-100mm，优选为5mm-20mm，特别优选为5mm，以便一方面可靠地防止堵塞状态，而另一方面保持分离器空间和生物反应器空间的减小时空收益（Raumzeitausbeute）的体积比尽可能小。

在设计管道长度时应考虑保持层流条件（Re<2300；Re=雷诺数）。在装入到容器中时，管道长度取决于在竖直方向可供使用的容器内直径，或者取决于在反应器中有待实现的液位。较短的管道长度由于压力损失减小而导致分布问题，这特别是在从上面的环形腔取出收获溶液时需要繁琐的分布装置，用于减小取出速度。在这种情况下，在取出部位的动态压力将比管道中的压力损失至少小5-10倍。就此而言，管道长度大于0.1m被视为在技术上可以实现，而管道长度优选为0.2m-5m，或者特别优选为0.4m-2m。

本发明的装置包括2-10⁶个管道，优选10-100000个管道，特别优选100-10000个管道。

由管道构成的竖直的中空柱体的壳层包括一层或多层管道。优选它包括1-100层，特别优选―尤其在安装于生物反应器内部的情况下―包括1-10层。这些层可以呈环形或螺旋形地一圈绕一圈地布置。这些层可以与静子（Stator）连接，静子提供了机械固定。

柱体在其装入到生物反应器中的情况下所具有的高度优选为生物反应器的装填高度的30％-95％，特别优选60％-90％。这种安装方式允许有向地环流柱体。环流柱体能提供的优点是，例如在热交换时，或者在已安装分离器装置的情况下在安装传感器时，还能利用柱体形的生物反应器壁。通过环流还引起或者有利于颗粒悬浮。生物反应器的有利的底部形状具有倒圆的圆角，或者被设计成碟形底或圆形底。当靠近底部在中央输送气体时，沉积的颗粒例如微生物细胞或真核生物细胞通过环流被输送至底部中央，在这里，通过吹入气体引起的向上的流体必要时在搅拌系统的辅助下将这些颗粒带走和打散。在所述安装状况下，视有待安装的分离器面积或有待环形或螺旋形地安装的管道层数量而定，有利的柱体直径为反应器直径的50-85％。这里必须要确保位于生物反应器壁和静子之间的环形面能够占柱体横截面的5-300％、特别优选100％。通过这种方式来保证能以较高的效率引起环流，而不会有过大的摩擦损失。所需要的分离器面积取决于细胞的沉积特性以及所追求的灌注率和细胞浓度。优选的灌注率在0.2-40 l/天的范围内，特别优选在0.5和20 l/天之间。视细胞的沉积特性而定（取决于细胞的浓度、大小和积聚趋势），每个生物反应器体积的优选的分离器面积在0.1和100m²/m³之间的范围内，特别优选在2和20m²/m³之间的范围内。

柱体的向外的和向内的壳层面优选都密封，以便防止细胞进入到管道中间腔中，进而防止结垢。

本说明书意义下的柱体由两个平行的平的面（基面和顶面）与一个壳层面或柱体面限定而成，所述壳层面或柱体面通过平行线形成。沿着并不位于该面上的直线移动平的导向曲线（Leitkurve），由此产生所述柱体。相应地，由管道形成的柱体可以具有不同的形状。该柱体例如可以是圆形柱体、基面为椭圆形的柱体，或者是棱柱体，即基面为多边形（三角形、四边形、五边形…）的柱体。也可以考虑其它形状，例如设置截锥形的柱体。该柱体优选是基面为圆形或椭圆形的柱体。柱体具有内部的管道（中空柱体），该管道平行于壳面伸展，并优选具有与基面相同的横截面形状。

优选将管或软管用作管道。例如考虑塑料或金属作为材料。优选使用本领域技术人员公知的塑料，如特氟隆、硅树脂橡胶（下面简称为硅树脂）、聚乙烯或聚丙烯。针对管或软管优选使用具有不易粘附的生物质的材料。硅树脂是特别合适的，因为它能以对于制药过程足够的品质得到很好的处理。而且硅树脂能透过氧气，从而能实现甚至在管道内部供应氧气，直至达到一定程度。为此可以给管道周围的外腔吹入含有氧气的气体。这种气体通过气体输入和输出管路被馈入到管道的中间腔中，即馈入到上面的和下面的管道边框（Kanalfassung）之间。

本发明的装置作为整体或者本发明的装置的一些部分优选是一次性用品，用于避免清洁问题。

在本发明的装置的一种优选的实施方式中，使用硅树脂软管作为管道。硅树脂软管优选相互连接成基垫，并一层或多层地缠绕到柱体形的静子上，直至达到所希望的分离器面积。由倾斜地布置的软管构成的基垫优选是一次性用品，这使得用于提供按照制药准则被清洁的截留系统的代价减小到最低。

根据一种用于制造本发明的装置的优选的方法，作为管道，将软管或管缠绕到柱体上。各个绕圈在此优选紧密地相互贴靠。可以上下叠置地缠绕多层软管或管，如果在装置中需要多层管道。各个绕圈优选机械地例如通过粘接而相互连接。以后的管道的长度相应于柱体周围的绕圈的周长。若忽略管道膨胀，则管道长度L可近似地按照方程5由柱体的周长U得到（π=圆周率）

L=U/π （方程5）

绕圈的数量给出了以后的管道的数量Z。

接下来，横向于绕圈将缠绕好的管或缠绕好的软管切开。所述切开沿围绕柱体的螺旋线进行（例如参见图3）。在这里，螺旋线的斜度给出了倾斜的管道的以后的角度ß。结果得到了由一层或多层倾斜的管道构成的基垫（例如参见图4）。该基垫可以在倾斜的端部连接，从而产生一种长筒（中空柱体）。该长筒可以在需要时套到支撑体（静子）上（例如参见图5）。管道的底侧保持敞口，而顶侧与保持件连接，使得在管道上方产生环形腔，在装置工作时，流经各个管道的液体流汇集到该环形腔中。

建议使得中空柱体的内侧和外侧对外密封，以便防止细胞培养溶液和细胞进入到管道之间的中间腔中而引起结垢。还应在中空柱体的底侧和顶侧使得管道之间的中间腔密封地封闭，以便防止细胞培养溶液和细胞进入。通过管道外腔密封地封闭这一特殊的设计特征，可以给给腔吹入富含氧气的气体。通过使用用于管道的能透过氧气的材料、优选硅树脂，可以在分离器腔中给被截留的细胞供应以氧气。

根据另一种优选的制造方法，本发明的装置由成型化的膜片构成（例如参见图6）。成型化的膜片优选具有平整的面和带有一系列间距保持恒定的接片和槽的面。螺旋状或皮层状地将膜片一层或多层地例如缠绕到静子上，由此形成管道。在这里，槽朝向敞口侧分别被相邻层的平整的面或者被静子的壁封闭。

管道的几何形状由接片高度hs与管道宽度b的比值确定。视情况而定（可变形性、弹性、深冲能力），在技术上可实现的hs/b比值在0.33-5之间。这里需要注意，两个尺寸hs和b均应大于或等于3mm，或者优选大于或等于5mm。优选的hs/b比值为0.5-3。接片宽度bs由膜片材料的机械强度来决定。接片宽度bs应尽可能小，以便实现每个分离器体积的较大的剪切面积。同时它不应被选择得太小，以便能允许在没有形状变化的情况下力配合地与下层连接。

在螺旋状地缠绕时，需要与基垫连接的斜坡状的接头，以便能在过渡处在发酵腔与取出腔之间实现轴向密封。

在皮层状地缠绕时，为了增大单层的强度，最好从层到层在正的与负的仰角（Anstellwinkel）之间交替地变换管道方向。因此在本发明的装置的一种实施方式中，具有倾斜布置的管道的基垫皮层状地设置，其中每个皮层都由形成中空柱体的基垫构成，各个基垫同与其相邻的基垫相比，可以相对于基垫的纵轴线之一扭转180°。根据一种优选的实施方式，每个第二层的基垫都扭转180°。

可以直接在膜片制造时通过造型，或者通过使得凹凸不平的热变形或冷变形的膜片与平整的膜片（例如利用粘接技术）连接，来制得成型化的膜片。凹凸不平的（geprägt）膜片和平整的膜片的材料特性可以针对其不同的功能（凹凸不平的膜片的良好的滑动特性和形状稳定性、平整的膜片的良好的密封特性）来优化，也就是说，通过选择合适的本领域技术人员公知的具有相应表面品质的材料，来进行适配调整。

因为在利用膜片式管道的制造方法中，针对所产生的装置，仅能以较大的代价实现用气体环绕吹洗管道，由此引起物质输送，所以规定这种类型的装置优选在生物反应器外部使用。

所述的方法允许简单且成本低廉地制造用于截留和返回细胞的装置。通过选择将管或软管缠绕在其上面的柱体、绕圈数量、绕圈间距、层数量和剖切螺旋线的斜度，可以简单而精确地确定以后的装置的几何结构。以后的装置的几何结构也可以简单而精确地通过选择被穿孔的膜片和绕圈（层）的数量来确定。

所述方法特别是允许成本低廉地制造一次性部件，使用一次性部件能使得用于提供按照制药准则被清洁的截留系统的代价减小到最低。

本发明的装置可以简单地在生物反应器内部或外部连接和运行。连接、运行和维护是毫无问题的。将本发明的装置或者本发明的装置的一些部分设计成一次性部件消除了清洁问题。

在生物反应器内部使用本发明的装置减小了在沉降区中形成温度梯度和密度梯度，从而能可靠地避免并非所愿的对流和与此相关联的对细胞截留的效率造成的不利影响。将倾斜管道-板-分离器设置在生物反应器内部相比于例如设置在外部还减小了整个装备的复杂性和发生故障的风险。

因此根据一种优选的实施方式，在生物反应器内部使用分离器设备。在这里，该分离器设备将发酵区分成两个区域，即柱体形的内腔和环形的外腔。

优选本发明的装置与用于产生环流的机构相组合。环流将其中含有细胞的细胞培养溶液输送穿过柱体形的内腔，沿着柱体形装置的外表面穿过环形的外腔，然后又穿过柱体形的内腔。用于产生环流的合适的机构例如是机械的搅拌器或吹气系统。特别优选通过用于吹入小气泡的系统来实现环流，从而通过吹入气泡既能实现输入氧气，又能引起在两个发酵区域之间的自然的环流，而无需使用附加的搅拌机构。通过这种方式，所述高度集成的反应器能实现用于细胞培养发酵的众多优点：

• 环流反应器剪切小，且具有出色的混合特性和气体供应特性；

• 通过环流，尽管安装有分离器，但可以为了热量交换而继续使用反应器壁，从而保证集成到已有的发酵设备中；

• 通过将可缩放比例的（即分离器体积随着生物反应器体积成比例地放大）截留面安装在生物反应器内部，省去了在高压灭菌之后生物反应器与分离器的耦联，这种耦联具有较高的感染风险。此外可以省去全部输送细胞的泵以及省去众多的外部软管管路。其结果特别是避免在冷却了的分离器区与又被加热的发酵区之间的热交换、减小剪切应力和增大过程鲁棒性。

•相对于收获流逆流地从分离器滑回到生物反应器中的细胞，通过环流无延迟地且无需其他泵，特别是剪切小地被输送回到生物反应器的供养良好的局部区域中。

根据一种特别优选的实施方式，生物反应器与本发明的装置相组合，被设计成气升式生物反应器（例如参见EP 0 227 774 Bl），在这种反应器中，气体例如空气被导入到生物反应器的朝向上方的部分中，该部分在本领域中也已知为升液器（Riser）。优选吹入小气泡，其中使用表面活性剂可以有助于避免泡沫以及有助于细胞保持远离剪切力大的气态的界面。升液器的上端和下端与生物反应器的另一向上的部分的上端和下端连接，该部分在本领域中已知为降液器（Downcomer）。基本上为柱体形的气升式生物反应器的一种广泛使用的变型方案包含设置在中央的柱体形的导管，该导管将气升式生物反应器分成升液部分（升液器）和降液部分（降液器），升液部分位于导管内部，降液部分位于导管和气升式生物反应器容器外壁之间的环形腔内。也可以使得升液部分位于导管和容器外壁之间的环形腔内，而降液部分位于导管内部。在升液器的下端输送例如富含氧气的气体，这减小了在升液器中的悬浮培养液的平均密度，致使升液器中的液体向上流动，所述液体因而被降液器中所含有的也流回到升液器下端的液体接替。通过这种方式产生液体循环，这种液体循环使得悬浮培养液充分混合，并使得细胞保持悬浮，即处于自由悬浮中。被如此搅动的生物反应器的优点在于，给细胞供应以充足的溶解于营养介质中的氧气，并彻底地去除在呼吸时产生的二氧化碳，而无需运动的部件如机械的搅拌器。升液器和降液器的横截面积基本相同。

根据一种特别优选的实施方式，本发明的装置形成在连续工作的气升式生物反应器的降液器和升液器之间的导管。本发明的装置被温度相仿的悬浮培养液环流，通过这种方式避免自由对流的流动现象。

另一种优选的实施方式是，在空间上分开地布置发酵区和分离区，也就是说，本发明的装置在外部与生物反应器连接。通过至少两个泵，优选剪切小的软管泵来保证给分离器供料。这些泵允许从生物反应器腔中取出细胞培养溶液、在通过热交换器冷却之后将细胞培养溶液输送至沉降机组、从沉降机组取得收获流、将浓缩流输送回到生物反应器。

用于冷却发酵介质所需要的冷却装置可以集成到分离器的壳体中，分离器优选是一次性部件，因而冷却装置也是一次性部件，从而无需清洁该主要的装置。

由生物反应器和内部或外部的截留设备构成的灌注式反应器可以按照公知的方式运行。营养介质被连续地输出，无细胞的细胞培养物上层清液被连续地排出。灌注式反应器可以在灌注率q/V（每个生物反应器体积V的介质流量q）较高的情况下运行，如果这在生物上有意义，且有足够的分离器面积可供使用。

具有内部或外部的截留装置的生物反应器也可以按如下方式工作，即首先使得培养物间歇性地生长。如果介质消耗到一定程度，使得无法再明显地形成生物质，则通过内部或外部的截留装置将几乎没有生物质的培养物上层清液取出。于是可以利用生物反应器中的所得到的空间，以便输送新鲜的营养介质，由此可以实现进一步生长，进而实现较高的整体生物质生产率。这种方法例如适合于被灌输给很大的生物反应器的预培养物，因为这种方法能提高已有的预培养物反应器的生产率。

生物反应器用于培养在试管内和在自由悬浮液中或者在微载体上生长的细胞。优选的细胞包括原生动物以及人体、动物或植物本原的粘着性的和非粘着性的真核细胞，其例如能通过遗传工程予以改变，以便制得专门的有效制药物质，如病毒、蛋白质、酶、抗体或诊断组织。特别优选使用适合于高效率制药生产的细胞，例如纤毛虫、昆虫细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HKB细胞（通过人HEK 293-细胞系与人Burkitt淋巴瘤细胞系2B8的融合而产生）或杂交瘤细胞。

本发明的主题还是一种用于截留和返回在被穿流的器皿中的细胞的方法。连续地或间歇性地将新鲜的和/或准备好的介质输送给器皿，并将用过的介质通过用于截留和返回位于器皿中的细胞的装置排出。该装置由多个倾斜布置的管道构成，这些管道形成竖直的中空柱体，并相对于中空柱体的纵轴线倾斜在10°和60°之间的角度ß，优选倾斜在15°和45°之间的角度ß，特别优选倾斜在25°-35°之间的角度ß。

在倾斜布置的管道中优选产生一种流动速度，这种流动速度允许维持按照Re<2300的层流状态，由此避免朝向重力场沉积的细胞降低效率地重悬浮。

雷诺数Re可以根据方程6，由在横截面上平均的流动速度w、流动介质的动粘度v和管道的内直径d来算得：

Re=(w∙d/v) 方程（6）

在这种情况下，在管道内壁上产生小于在管道中间的流动速度。细胞沉积在管道中，并在管道的底侧与流动方向相逆地朝向管道下端滑动。优选在器皿中产生环流，这种环流将管道下端的细胞带走，并将这些细胞散布在器皿中。环流优选作为绕流围绕由管道构成的竖直的中空柱体的内表面和外表面绕行。本发明的方法因此优选与在被连续穿流的器皿中的环流相组合。没有细胞的细胞培养溶液经由管道被输入到设置在管道上方的环形腔中，并最终重器皿中输出。

本发明的方法可以在生物反应器内部实施。在这种情况下，细胞在生物反应器内部被截留。在生物反应器和分离区中存在一致的温度，从而避免在分离器中产生对流流动。然而在这种状况下，细胞仍能继续其新陈代谢和呼吸氧气。通过用富含氧气的气体吹洗装置的外腔，可以抑制氧气消耗，并缓解其生理上的后果。在这种情况下，氧气穿过可透过氧气的管道壁扩散到流体管道中，该流体管道至少在下面的管道横截面中，即在细胞浓度较高的区域中，通过在那里集中进行的输入过程和沉积过程，可以视为被相对良好地混合。位于这些区域中的滑下的细胞在系统中仅滞留短暂的时间，故低于优化的细胞供应浓度的时间也比较短暂，这在大多数情况下可以不受损害地承受。由于在某些情况下滞留时间很长，为10-45分钟，故在上面的管道横截面中供养细胞很紧要，所以在这些区域中供应氧气已表明特别有所助益。

本发明的方法也可以在生物反应器外部实施。维持将具有细胞的细胞培养溶液从生物反应器输入到器皿中，在该器皿中设置有多个倾斜布置的管道，这些管道形成竖直的中空柱体。在该器皿中，对细胞和细胞培养溶液进行分离，其方式为，将经由管道输送混合物，细胞沉积在管道中，并与流动方向相逆地滑至管道端部，最终到达沉降区，这些细胞可以从该沉降区又被输送回到生物反应器中。优选使得细胞在外部的器皿中冷却，以便延缓新陈代谢，进而抑制会降低生产率的对细胞的供养不足。在冷却的悬浮液中，从外部通过吹洗管道给沉积的细胞供应氧气并非绝对必要。通常情况下，将细胞培养溶液冷却至分离器的环境温度就完全足够了，故除了所希望的新陈代谢效果外，还可靠地避免了对流流动。

本发明的方法允许有效地截留和返回在被连续穿流的器皿中的细胞。在截留和返回时，仅有较小的剪切力作用到细胞上，这种剪切力通常易于被细胞所承受。细胞在管道中保持在发酵温度或较低的温度水平，并被供应以营养物质。需要时，可以通过附加地给管道中间腔或者管道外侧吹气来优化物质交换。

该方法还允许截留和返回在如下器皿中的细胞，即在该器皿中，与在间歇性的没有介质交换的培养过程中相比，通过连续的或不连续的介质交换，将实现较高的细胞密度。通过这种方式可以有利地采用该方法，以便提高预培养反应器的生产率，这种反应器的生物质用于灌输非常大的间歇性运行的生物反应器。该方法还使得补料-分批发酵桶得到广泛应用，在这种发酵桶中，生物质在收获产品时聚集，以便按照所谓的重复补料-分批模式灌输新的发酵桶。

下面对照附图详细地介绍本发明的实施例，而本发明并不局限于此。

图1示意性地示出本发明的装置的一个实施方式。圆形横截面的管道（10）形成中空的柱体（20）。柱体的外壳包括一层倾斜布置的管道。这些管道相对于柱体纵轴线倾斜角度ß。在工作时，该纵轴线优选与重力方向一致。图1（a）为侧视图；图1（b）为沿着穿过图1（a）中的柱体（20）的虚线剖切的从上向下的横剖视图。

图2示意性地示出在圆形横截面的管道（10）中细胞分离的情况。从下面给管道（10）装填细胞悬浮液。在管道的上端引出收获流（2）。细胞潴留物（3）沉积在管道的底侧，并与流动方向相逆地滑向管道下端。

图3示意性地示出用于制造由倾斜布置的管道构成的基垫（Matte）的方法。管或软管（200）沿着柱体（300）缠绕。在这里，为了得到尽可能大的分离器面积，使得绕圈在狭小的空间上紧密地相互贴靠。这些绕圈优选相互机械地连接，以便在以后切割时确保能保持管道方向。为此，这些管道可以点状地或面状地直接相互连接，或者沿着柱体外表面通过承载层例如织物或纤维网相互连接。优选通过粘接进行连接。本领域技术人员已知的与管道的材料特性和表面特性一致的粘接组分适合作为粘接剂。在硅树脂软管的情况下，优选使用硅树脂粘接剂，这种粘接剂在所要求的FDA质量等级中在市场上有供货。在进行粘接时需要注意，这些软管并不紧密地相互连接，以便允许对可通过气体的管道进行气体绕流。在粘接之后，沿着螺旋形地围绕柱体伸展的用虚线示出的切割线（210）将软管基垫分开，并从柱体拉下。结果就得到了由倾斜布置的管道构成的基垫，如图4中所示。

图4示意性地示出由圆形横截面的管道（10）构成的基垫（220），这些管道相对于沿着管道底侧的虚线倾斜角度ß设置。这种基垫（220）可按照图3中所示的且在针对于图3进行的说明中所述的方法得到。倾斜的纵向边（230、231）可以相互连接，以便得到本发明的用于截留和返回细胞的装置的一层分离管道。为了增大面积，可以将多个层呈皮层状地沿着它们的纵向边（230、231）相互粘接。也可以将基垫螺旋状地上下缠绕成多个层。在这两种情况下产生一种长筒（中空柱体（20）），其带有一层或多层倾斜布置的管道（10）（例如参见图1、图5）。该长筒可以套到机械的支撑体（静子）上。

图5为本发明的装置的底侧的示意性的立体图。围绕软管静子（5）设置有一层圆形横截面的管道（10）。这些管道相对于中空柱体（20）的纵轴线倾斜角度ß。

图6（a）示出成型化的膜片（250）的一个范例。该膜片具有一系列间距保持恒定的槽（251）和接片（252）。

图6（b）为图6（a）的膜片的沿着线B-B剖切的剖视图。该膜片可以被裁切成基垫。这种基垫的横截面例如与图6（b）中的膜片区段相同。多个基垫可以面状地上下叠置并相互连接，其中一个基垫的接片（252）与其上面的基垫的平整的底面连接，从而槽形成沿着接片闭合的管道。相互连接的基垫于是可以形成竖立的中空柱体，并类似于图4的范例在侧面连接。也可以围绕静子缠绕一层或多层成型化的膜片。在这种情况下，槽（251）朝向开口侧分别被相邻层或者被静子的壁封闭，同时形成管道。

就图6（a）和（b）类型的膜片而言，得到了一种矩形横截型面的管道。也可以考虑使用具有其它型面的膜片。在图6（c）中例如示出了具有半圆形槽型面的膜片。由此相应地得到其它几何形状的管道。

图7（a）示范性地示出一种成型化的膜片，它是由通过粘接剂（270）相互连接的凹凸不平的（geprägt）膜片（260）和平整的密封膜片（265）构成的复合结构。

图7（b）示出三个成型化的膜片（250）的连接情况，其中一个膜片的平整的底面分别与其下面的膜片的接片连接，由此得到多个并排布置的管道（10）。

图8示出本发明的装置的一种设计情况，其横截面垂直于由管道（10-1、10-2）构成的中空柱体的纵轴线。圆形基面的中空柱体包括环形布置的两层圆形横截面的管道（（10-1）=第一层管道，（10-2）=第二层管道）。优选利用壳层使得中空柱体对外且对内密封（对外（13），对内（14）），这样就不会有细胞进入到管道（10-1、10-2）之间的中间腔（15）中而产生结垢（Fouling）。

图9中以横剖视图示范性地示出细胞截留系统（400）在被吹入气泡（blasenbegast）的生物反应器（100）中的安装情况。细胞截留系统包括倾斜布置的管道（10），这些管道围绕软管静子（5）多层地布置。为明了起见，这些管道（10）在图中竖直地示出。但根据本发明，这些管道相对于软管静子（5）的纵轴线倾斜。通过气体分配器（40）产生的优选微细的气泡负责在被向上穿流的供有气体的在所示范例中位于中央的反应器区（51）和未供有气体的被向下穿流的靠近壁的反应器区（52）之间自然地环流。通过这种方式，除了输送氧气外，还以气态-液态方式负责反应器的充分混合。在细胞截留系统（400）中的细胞分离之后，在生物反应器（100）的顶端接管处取得收获流（2）。在细胞截留系统（400）中分离出来的颗粒随着环流被输送回到供有气体的反应器中央。通过环流还有效地防止在反应器中产生沉积。废气经由反应器顶端上的接管（42）排出。通过与细胞截留系统（400）连接的气体输入和输出管路（21）和（22）给围绕分离软管的外腔供应气体。其它引向/引自环流反应器（100）的输入和输出管路是介质供应管（30）和在双壳层（60）中的用于生物反应器（100）的温度调节的调温介质输入管路（61）和输出管路（62）。

图10示出软管形式的管道（10）的布置情况，这些软管缠绕成多层（软管基垫），并在下连接部位（11）和上连接部位（12）被包封（einfassen）。为明了起见，这些管道（10）在图中竖直地示出。但根据本发明，这些管道相对于软管静子（5）的纵轴线倾斜。形成连接部位（11）和（12）的材料例如是本领域技术人员已知的例如优选基于硅树脂基的柔性粘接材料，这种材料紧密地包绕优选由硅树脂制成的形成管道（10）的软管，且在朝向内侧和外侧的两个径向方向上提供了平整的密封面。借助于密封面可以实现对软管静子（5）以及对壳层（13）的密封效果。壳层（13）以突出于软管基垫的凸缘对与软管静子（5）连接的顶端部件（27）密封。通过图8中所示的密封的结构，确保软管周围的空间不会充满液体。根据一种优选的设置方案，用富含氧气的气体来吹充软管之间的中间腔，以便在沉积过程期间改善对沉积的细胞的氧气供应。顶端部件（27）与软管静子（5）通过斜面（28）而连接，该斜面将防止细胞沉积。焊接在斜面（28）上的收获物接管（22）紧贴在管道（10）的上方通入到环形腔（24）中。为了在收获物接管数量有限的情况下确保有利的液体分布，建议例如切向导流、分形流体分布或者安装挡板（25）。

图11中示出集成到分离设备（110）中的细胞截留系统（400）被外部设置时的传统的方法方案。为了在生物反应器出口中减少细胞的呼吸活动，在取出之后尽快将细胞的温度在冷却装置（90）中降低到较低的水平。通过这种方式防止细胞在细胞截留系统（400）中在氧气有限的状态下滞留太久，而滞留太久有可能在生理上损害细胞。在所示范例中，分离器（110）由细胞截留系统（400）和集成的冷却装置（90）构成。生物反应器（100）和分离器（110）之间的液体流通过剪切小的（scherarm）泵（91）和（92）来调节。也可以考虑其它布置方案，例如将两个泵（91）和（92）放置在生物反应器出口（Bioreaktorablauf）中。

图12中示出集成到壳体（80）中的由细胞截留系统（400）和冷却装置（90）构成的分离器（110）。细胞培养液（1）经由必要时应通风的降液管（72）在细胞截留系统（400）的下方冷却地被引入到分离器中。沿着升液管（77）进行冷却，在该升液管中，冷却液体相对于向下流动的细胞培养液逆流地上升。升液管（77）的较薄的壁厚、冷却介质在升液管和潜管（76）和（77）之间的间隙中的高速度以及细胞培养液在降液管（72）和升液管（76）之间的螺旋状流动，负责特别顺畅地输送热量，进而实现冷却器的紧凑的构造方式。在进入到锥体中之前，建议减小细胞培养液的速度，以便防止集中的已经分离的细胞物质再次盘旋升起。为了保证较大的进入横截面，冷却装置不应下拉到入口区域中。视速度而定，建议附加地安装挡板（74）。在细胞沉积物从细胞截留系统（400）滑回到锥体（70）中之后，可以在锥体尖端去掉细胞潴留物（3）。已表明，可以应用的锥角为20°-70°。为了防止结构过高，锥角应优选尽可能地小，然而同时能可靠地避免堵塞状态。因此，40°-60°的锥角属于优选的实施方式。在充分振动（Vibration）的情况下，45°的锥角是特别优选的。为了给沉积的细胞物质供应氧气，可以从外部经由焊接到壳体（80）中的连接接管输入气体（21）和输出气体（22）。在供应气体时，需要使用由软管构成的管道（10）。

附图标记列表

1 细胞培养液

2 收获物

3 细胞潴留物

5 软管静子

10 倾斜的管道

12 上连接部位

13 外部壳层

14 内部壳层

15 中间腔

20 柱体

21 气体输入

22 气体输出

24 环形通道

25 挡板

27 顶端部件

28 下滑面

30 介质输入

40 气体分配器

41 气体供应

42 气体排出

50 环流

51 向上流

52 向下流

60 双壳层

61 输入调温介质

62 输出调温介质

70 锥体

71 锥角

72 降液管

73 螺旋

74 挡板

76 潜管

77 升液管

80 壳体

81 支架

82 振动器

90 冷却器

91 回流泵（Rücklaufpumpe）

92 收获泵

100 生物反应器

110 集成的分离器

200 管/软管

210 切割线

220 由管/软管构成的基垫

230 基垫的纵向边

231 基垫的纵向边

250 成型化的膜片

251 槽

252 接片

260 凹凸不平的膜片

265 密封膜片

270 粘接剂

300 柱体

400 细胞截留系统

Claims (15)

1.一种用于截留和返回在连续地或间歇地被穿流的器皿中的细胞的装置，包括多个并排布置的管道，其中这些管道形成竖直的中空柱体，并相对于中空柱体的纵轴线倾斜在+10°和+60°之间的角度ß。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，管道具有朝向管道底侧宽度减小的横截面，优选具有圆形的或椭圆形的横截面。

3.如权利要求1至2中任一项所述的装置，其特征在于，中空柱体的壳层具有1至100层的管道。

4.如权利要求1至3中任一项所述的装置，其特征在于，管道具有3mm-30mm的内直径。

5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，管道由软管构成，优选由硅树脂软管构成。

6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，还包括用于给管道的外表面和/或中间腔吹气的机构。

7.如权利要求1至6中任一项所述的装置，还包括用于产生穿过中空柱体且沿着中空柱体外表面的环流的机构。

8.如权利要求1至7中任一项所述的装置，其特征在于，集成有冷却装置。

9.如权利要求1至7中任一项所述的装置用作连续工作的气升式生物反应器的导管的用途。

10.一种用于截留和返回在连续地或间歇地被穿流的器皿中的细胞的方法，其中经由多个并排布置的管道输送含有细胞的介质，细胞沉积在这些管道中，且细胞又从这些管道滑出，其特征在于，这些管道形成竖直的中空柱体，并相对于中空柱体的纵轴线倾斜在10°和60°之间的角度ß。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，通过吹气和/或搅拌引起介质穿过中空柱体并沿着中空柱体的外表面环流。

12.如权利要求10或11中任一项所述的方法，其特征在于，附加地对管道的外表面和/或管道之间的中间腔进行吹气。

13.一种用于截留和返回细胞的装置的制造方法，其特征在于，通过螺旋形的或皮层形的缠绕，使得包括膜片或基垫的并排布置的管道或者槽形成为中空柱体，该中空柱体具有一层或多层相对于中空柱体的纵轴线倾斜地布置的管道。

14.如权利要求13所述的方法，其中包括基垫的并排布置的管道的形成方式为，使得管或软管围绕柱体缠绕1至100层，使得相邻的绕圈相互机械地连接，沿着螺旋形地围绕柱体伸展的剖切线将由多个绕圈构成的复合结构切开。

15.如权利要求13所述的方法，其中包括膜片的并排布置的槽的形成方式为，将凹凸不平的或者热成型或冷成型的膜片与平整的膜片连接成膜片复合结构。

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