CN102180985B - 艾蒿多糖提取及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种艾蒿多糖提取及纯化方法，将艾蒿原料用浓度为12％～14％乙醇溶液渗漉法在温度55℃～65℃下提取多糖，将艾蒿提取液用过滤器过滤再经喷雾干燥，得到灰白色粗多糖固体；取1克所述粗多糖固体，加10毫升生理盐水搅拌溶解，向多糖溶液中加进占所述多糖溶液总体积20％的氯仿和4％的正丁醇，振荡20min，在离心机转速为3000r/min条件下离心15min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述步骤；采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱脱盐，将糖试剂盒检测到的多糖溶液合并，冻干，得白色粉末，即为成品。本方法工艺简单，可操作性强，要求设备简单，所得多糖收率最高，纯度也最大，还可以对提取艾蒿黄酮后的废渣进行再提取。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种艾蒿多糖提取及纯化方法。
【背景技术】
艾蒿与中国人的生活有着密切的关系，每至端午节之际，人们总是将艾蒿置于家中以“避邪”，秆枯后的株体泡水熏蒸以达消毒止痒，产妇多用艾蒿水洗澡或熏蒸。传统药性理论认为艾蒿有理气血，逐寒湿、温经、止血、安胎等作用。现代实验研究证明，艾蒿具有抗菌及抗病毒作用；平喘、镇咳及祛痰作用；止血及抗凝血作用；镇静及抗过敏作用；护肝利胆作用等。
艾蒿多糖是从艾蒿植物中提取的多糖类物质，科学研究证明艾蒿多糖可以降低血脂，平衡人体血液糖分，无任何毒副作用，常用来保健品和食品添加剂。艾叶的热水提取物一多糖加入人的血清中，能使血清补体值下降，并证明这是补体激活的结果。日本山田氏也发现艾叶热水提取物有强烈的补体活性，活性的主要成分为酸性多糖。黄石理工学院对艾蒿多糖的结构及药理活性进行了研究，阐明了具有药理活性艾蒿多糖的结构，发现艾蒿多糖具有免疫及抗菌和抗肿瘤活性。由此可见，艾蒿多糖有较为广阔的医用前景。
多糖大多为无定形化合物，无甜味和还原性，难溶于水；多糖被酶或酸水解，产生代聚糖或单糖，在热水中形成胶体溶液，具有多样生物学活性。大多数多糖有一定的极性，可以溶解在水、低浓度乙醇或低浓度甲醇中，不溶于非极性有机溶剂或高浓度的醇类溶剂。
用水提法提取多糖效果好，成本低，但能溶解在水溶液中的其他物质也多，如水解植物蛋白等，这给后来的纯化造成一定的困难，如：去除蛋白质会使多糖损失增大、无机物去除不净等。因此在水溶液中加入一定量(低浓度)的醇类物质作为提取介质，在不影响提取收率的前提下，尽量避免蛋白质等其他物质的析出。提取温度是另一个重要因素，温度越高，可溶性物质溶出率高，溶出速度也越快，但高温下多糖更易水解为还原性糖，从而使多糖失去活性。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种多糖收率最高，纯度也最大的艾蒿多糖提取及纯化方法。
本发明的技术方案是：艾蒿多糖提取及纯化方法，包括以下步骤，
1.将艾蒿原料用浓度为12％～14％乙醇溶液渗漉法在温度55℃～65℃下提取多糖，将艾蒿提取液用过滤器过滤再经喷雾干燥，得到灰白色粗多糖固体；经测算多糖收率(产品与原料之比g/g×100％，下同)为2.8％，总糖含量为63.2％。
2.取1克所述粗多糖固体，加10毫升生理盐水搅拌溶解，采用Savag’s法去蛋白，即向多糖溶液中加进占所述多糖溶液总体积20％的氯仿和4％的正丁醇，振荡20min，在离心机转速为3000r/min条件下离心15min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述步骤；
3.采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱脱盐，将糖试剂盒检测到的多糖溶液合并，冻干，得白色粉末，即为成品，经测算收率为1.7％，总糖含量为98.8％。
作为上述方案的进一步改进，所述艾蒿原料为提取艾蒿黄酮后的废渣或者是脱脂后的艾蒿粉。未经处理的艾蒿粉也可以直接用于提取多糖，但粗多糖的色素含量偏高，使粗多糖的颜色偏深，对多糖品质有影响。
本发明的原理在于：
1.实验证明，用浓度为12％～14％乙醇溶液提取多糖，所得多糖收率最高，纯度也最大。实验数据见表一、表二以及附图1。
表一：几种溶剂在65℃下粗多糖提取效果对照表
表二：加入不同浓度乙醇时粗多糖收率变化表
| 乙醇浓度 | 收率％ |
| 0 | 2.74 |
| 2 | 2.79 |
| 4 | 2.8 |
| 6 | 2.8 |
| 8 | 2.8 |
| 10 | 2.8 |
| 12 | 2.81 |
| 14 | 2.79 |
| 16 | 2.75 |
| 18 | 2.63 |
| 20 | 2.41 |
2植物多糖在水溶液中尤其在高温下不稳定，温度过高易造成多糖分解为还原糖，本方法经实验后得出结论：将温度控制在55℃～65℃时多糖水解率为5％～8％，多糖析出为最大量。实验数据见表三、表四及图2、图3。
表三：100克原料在不同温度下的粗多糖中含糖量(克)
表四：不同温度下艾蒿多糖水解率
| 温度(65℃) | 水解率(％) |
| 55 | 5 |
| 60 | 6 |
| 65 | 8 |
| 70 | 13 |
| 75 | 17 |
3.经对比实验，用采用Savag’s法去除蛋白，蛋白残余量最低，多糖损失率最小，具体数据见表五。
表五：几种去除蛋白方法多糖损失率比较
| 方法 | 蛋白残余量％ | 多糖损失率％ |
| 盐酸沉淀法 | 1.5 | 11 |
| 三氯乙酸沉淀法 | 3 | 8 |
| Savag’s法 | 1.1 | 7 |
本发明的优点在于：本方法工艺简单，可操作性强，要求设备简单，所得多糖收率最高，纯度也最大，不仅能使用艾蒿原粉进行生产，还可以对提取艾蒿黄酮后的废渣进行再提取，大大提高了总体经济效益。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1为乙醇浓度与多糖收率关系图，
图2为提取温度与多糖收率关系图，
图3为多糖分解与温度的关系图，
图4为本发明使用的设备组成图。
【具体实施方式】
实施例一：以12％乙醇65℃下提取
将25公斤干艾蒿(根部以上)，粉碎过20目筛，得到艾蒿原粉和艾绒，艾绒另行收集加工。将艾蒿原粉用石油醚(规格为60-90)和乙酸乙酯的混合液(配比为8∶2)润湿、装入渗漉器、排气，再用50升前述的石油醚和乙酸乙酯的混合液渗漉，温度为50℃，流速为每分钟20毫升，浸出液直接接到蒸馏器内，溶剂在85℃蒸发上升经冷凝管重新回滴入渗漉器内，最后将含有艾精油的浸出液(提取液1)分流出去用于提炼艾精油。
将渗漉器里的脱脂艾蒿粉取出，摊开并不断翻动，使其自然风干。用70％乙醇对脱脂艾蒿粉进行润湿、装入渗漉器、排气，用70％的乙醇溶剂渗漉，温度为70℃，流速为每分钟15毫升。48小时后，将艾蒿粉压榨，得到压榨液和提取液(提取液2)合并共90升，真空浓缩至18升，加浓硫酸调pH值为2，静置30分钟，离心、沉淀经干燥后称重，得艾蒿黄酮粗品为3.075公斤。
将提取过艾蒿黄酮后的艾蒿废渣晾干，称取1千克装于渗滤器中，压实并置于65℃水箱中，以12％的乙醇溶液将渗滤器浸满，使原粉充分吸涨，4小时后开动蠕动泵，流速为每分钟20毫升，当流出液检测不出糖时(试剂盒检测)，将提取液(5.2升)过滤，喷雾干燥后得灰白色固体28.53克，收率为2.85％，固体中总糖含量为63％，蛋白含量为18％。如果用浓度大于12％，小于等于14％的乙醇溶液提取多糖，收率为2.79，比12％的略少。因此浓度等于12％的乙醇溶液收率最高。
另外，实验表明：将温度控制在55℃～65℃时，多糖水解率为5％～8％，多糖析出为最大量，从整体上看，提取多糖温度在65℃时综合效果最好。
取10克粗多糖，加100毫升生理盐水搅拌溶解，加20毫升氯仿和4毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，倾出上清液，计体积为90毫升，再加入18毫升氯仿和3.6毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，收集上清液。
将处理好的Sephadex G-100葡聚糖凝胶装入层析柱(直径为1.5厘米，长度为30厘米)中，控制蠕动泵使流速为5毫升/分钟，用总糖试剂盒检测流出液，合并含糖溶液。冻干后得白色固体。称重为5.82克，收率为5.82×2.853/1000×100％＝1.66％，检测度体中蛋白含量为1％，多糖含量为98.8％。
实施例二以水65℃下提取
将提取过艾蒿黄酮后的艾蒿废渣晾干，称取1千克装于渗滤器中，压实并置于65℃水箱中，以水溶液将渗滤器浸满，使粉渣充分吸涨，4小时后开动蠕动泵，流速为每分钟20毫升，当流出液检测不出糖时(试剂盒检测)，将提取液(5.2升)过滤，喷雾干燥后得灰白色固体27.95克，收率为2.8％，固体中总糖含量为51.7％。
取10克粗多糖，加100毫升生理盐水搅拌溶解，加20毫升氯仿和4毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，倾出上清液，计体积为90毫升，再加入18毫升氯仿和3.6毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，收集上清液
将处理好的Sephadex G-100葡聚糖凝胶装入层析柱(直径为1.5厘米，长度为30厘米)中，控制蠕动泵使流速为5毫升/分钟，用总糖试剂盒检测流出液，合并含糖溶液。冻干后得白色固体。称重为4.55克，收率为4.55×2.795/1000×100％＝1.27％，检测度体中蛋白含量为1.6％，多糖含量为97.2％。
实施例三：以12％乙醇85℃下提取
将提取过艾蒿黄酮后的艾蒿废渣晾干，称取1千克装于渗滤器中，压实并置于85℃水箱中，以12％的乙醇溶液将渗滤器浸满，使粉渣充分吸涨，4小时后开动蠕动泵，流速为每分钟20毫升，当流出液检测不出糖时(试剂盒检测)，将提取液(5.2升)过滤，喷雾干燥后得灰白色固体30.67克，收率为3.07％，固体中总糖含量为65％。其中还原糖(3’5’-二硝基水杨酸比色法测定)18％，实际多糖含量仅为47％。
实施例四：以10％乙醇65℃下提取
将提取过艾蒿黄酮后的艾蒿废渣晾干，称取1千克装于渗滤器中，压实并置于65℃水箱中，以10％的乙醇溶液将渗滤器浸满，使粉渣充分吸涨，4小时后开动蠕动泵，流速为每分钟20毫升，当流出液检测不出糖时(试剂盒检测)，将提取液(5.2升)过滤，喷雾干燥后得灰白色固体27.86克，收率为2.78％，固体中总糖含量为61％，蛋白含量为28％。
与实施例一相比，粗多糖提取物中蛋白含量大，给以后去除蛋白带来困难。
实施例五：以脱脂后的艾蒿粉提取
将脱脂后的艾蒿粉晾干，称取1千克装于渗滤器中，压实并置于65℃水箱中，以10％的乙醇溶液将渗滤器浸满，使粉渣充分吸涨，4小时后开动蠕动泵，流速为每分钟20毫升，当流出液检测不出糖时(试剂盒检测)，将提取液(5.5升)过滤，喷雾干燥后得墨绿色固体(含部分叶绿素)28.89克，收率为2.89％，固体中总糖含量为57％，蛋白含量为27％。
取10克粗多糖，加100毫升生理盐水搅拌溶解，加20毫升氯仿和4毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，倾出上清液，计体积为90毫升，再加入18毫升氯仿和3.6毫升正丁醇，快速搅拌、振荡，离心(3000r/min)15min，收集上清液
将处理好的Sephadex G-100葡聚糖凝胶装入层析柱(直径为1.5厘米，长度为30厘米)中，控制蠕动泵使流速为5毫升/分钟，用总糖试剂盒检测流出液，合并含糖溶液。冻干后得白色(带有极淡绿色)固体。称重为4.32克，收率为4.32×2.889/1000×100％＝1.25％，检测度体中蛋白含量为1.79％，多糖含量为96.6％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.艾蒿多糖提取及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将艾蒿原料用浓度为12％～14％乙醇溶液渗漉法在温度55℃～65℃下提取多糖，将艾蒿提取液用过滤器过滤再经喷雾干燥，得到灰白色粗多糖固体；
(2)取1克所述粗多糖固体，加10毫升生理盐水搅拌溶解，向多糖溶液中加进占所述多糖溶液总体积20％的氯仿和4％的正丁醇，振荡20min，在离心机转速为3000r/min条件下离心15min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述步骤；
(3)采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱脱盐，将糖试剂盒检测到的多糖溶液合并，冻干，得白色粉末，即为成品。
2.根据权利要求1所述艾蒿多糖提取及纯化方法，其特征在于：所述艾蒿原料为为提取艾蒿黄酮后的废渣或者是脱脂后的艾蒿粉。
3.根据权利要求1所述艾蒿多糖提取及纯化方法，其特征在于：所述乙醇溶液浓度为12％。
4.根据权利要求1所述艾蒿多糖提取及纯化方法，其特征在于：所述多糖提取温度为65℃。
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