CN102178939A - 治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏及其制备方法。所述的盐酸溶菌酶无菌乳膏的原料成分为盐酸溶菌酶、司盘、泊洛沙姆、吐温、山梨醇、磷酸二氢钠、羟苯乙酯、液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、十六醇、十八醇、白凡士林和无菌水。本发明还提供盐酸溶菌酶外用无菌乳膏的制备方法，通过溶解、高温灭菌、滤膜过滤除菌、低速均质、高速均质、搅拌、降温、无菌灌装制得。该盐酸溶菌酶外用无菌乳膏经皮肤外用给药的形式，用来治疗皮肤溃疡，包括褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡。

Description

治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏及其制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

皮肤溃疡，包括褥疮溃疡、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡，是指局部皮肤或粘坏死，崩解、脱落所形成的局限性缺损。

在我国，皮肤溃疡及褥疮疾病为常见病、多发病。皮肤溃疡·褥疮病因是因神经营养紊乱及血液循环障碍，局部组织持续缺血、营养不良而发生的软组织坏死，如不及时治疗，可诱发其他器官并发症。据有关文献报道，皮肤溃疡·褥疮疾病在我国医院发病率为3％～14％，据不完全统计：每年约有数万人之多死于皮肤溃疡·褥疮合并症，全球皮肤溃疡影响着全球大约1800万人。

目前治疗皮肤溃疡·褥疮疾病分为对因处理、局部治疗、手术治疗、支持治疗、药物治疗方法等。

对因处理：如过敏性(药疹)的要切断过敏源；糖尿病病足，要注意血糖的控制；物理化学的损伤，要注意远离致病源；职业病，尽量的消除致病的条件等。局部治疗：溃疡清创换药；清除坏死组织、瘢痕、陈旧肉芽组织、异物等。局部理疗：氦氖激光、超短波、红外线等局部照射。手术治疗：对于溃疡面积较大、长期换药未愈应考虑手术治疗。支持治疗：包括良好的局部制动、抬高患部、良好的护理等，注意水电解质的平衡，给予高蛋白高能量和维生素的饮食，提高病人的免疫力。药物的治疗：抗过敏药物，抗寄生虫药物、抗生素、以及促进溃疡愈合的药物等。

总之，以上治疗方法都存在不同程度的缺陷，使临床应用受到很大限制。为满足广大患者的临床需求，本领域技术人员多年来一直在寻求研制开发安全、高效，质量可控、使用方便的治疗皮肤溃疡的外用药物。

目前在国内盐酸溶菌酶制剂主要以口服固体制剂(口含片、肠溶片)，口含片临床用于急慢性咽喉炎，口腔黏膜溃疡及咳痰困难，肠溶片临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、等。迄今为止，用于治疗治疗皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)的盐酸溶菌酶无菌外用药物尚未有上市。

中国专利文件200410020816.7公开了一种人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途，涉及在制备治疗由细菌、真菌、病毒、变态反应、职业性、物理性、神经功能障碍性、免疫性引起的皮肤病变、感染、溃烂疾病的药物中的应用。中国专利文件200410020736.1公开了人溶菌酶在制备治疗伤口感染不愈溃烂的药物中的新用途，在烧、烫伤和糖尿病及艾滋病导致伤口不愈合引起的感染伤口溃烂的药物中的新用途。

按照中国药典2010版以及欧洲药典、美国药典用于烧伤或严重创伤的软膏剂、乳膏剂、凝胶剂，应是无菌制剂。制剂所用的原料药、辅料以及生产条件不灭菌或灭菌方法不当的话，在临床上容易产生二次染菌，造成创伤面更难愈合，治疗效果很不理想或对溃疡面产生更大的危害。此外，专用于治疗皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)的盐酸溶菌酶无菌外用药物，特别是盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂尚未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种治疗皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏及其制备方法。

术语说明：

本发明所述的皮肤溃疡，是指褥疮溃疡、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡。

盐酸溶菌酶，英文名Lysozyme hydrochloride，CAS登录号9066-59-5。

发明详述

一种治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏，原料质量份包括以下组分：

A：盐酸溶菌酶50～80份，酶活性6200～20000单位/mg；

B：司盘50～80份、泊洛沙姆30～60份、吐温30～50份、山梨醇20～40份、磷酸二氢钠10～20份、羟苯乙酯1～10份；

C：液体石蜡220～260份、单硬脂酸甘油酯30～50份、十六醇10～30份、十八醇10～30份、白凡士林70～100份；

D：无菌水449～500份。

根据本发明，优选的，一种治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏，原料质量份包括以下组分：

A：盐酸溶菌酶50～60份，酶活性12000～16000单位/mg；

B：司盘-4050～60份、泊洛沙姆6830～50份、吐温-8030～40份、山梨醇20～30份、磷酸二氢钠10～15份、羟苯乙酯1～5份；

C：液体石蜡220～240份、单硬脂酸甘油酯30～40份、十六醇10～20份、十八醇10～20份、白凡士林70～80份；

D：无菌水450～470份。

根据本发明以上所述的技术方案，B组各组分加无菌水溶解，作为水相；C组各组分熔融，作为油相，水相和油相分别121～125℃高温灭菌；A组分盐酸溶菌酶加无菌水溶解，滤膜过滤除菌；灭菌后的水相、盐酸溶菌酶和油相进行混合、剪切、搅拌，制得无菌乳膏。

根据本发明，所述盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)在十万级洁净区内，按配比称取B组各组分，加适量无菌水溶解，作为水相；

(2)在十万级洁净区内，按配比称取C组各组分，在65～70℃水浴上熔融，作为油相；

(3)在十万级洁净区内，按配比称取A组分盐酸溶菌酶，加余量的无菌水溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至百级无菌车间已灭菌的罐内，常温备用；

(4)将步骤(1)制得的水相和步骤(2)制得的油相分别在121～125℃条件下灭菌30分钟，分别输送至百级无菌车间已灭菌的罐内存放，在65～70℃保温备用；

(5)在百级无菌条件下，将步骤(3)制得的盐酸溶菌酶料液与步骤(4)保温备用的水相混合，搅拌均匀，升温至65～70℃保温备用，得盐酸溶菌酶水相料液；

(6)在百级无菌条件下，搅拌下将步骤(4)保温备用的油相加入到步骤(5)的盐酸溶菌酶水相料液中，在温度65～70℃条件下，先1000～1750r/min低速剪切8～10分钟，然后2500～2880r/min高速剪切4～5分钟；停止剪切，开启搅拌，转速为60～90r/min，继续搅拌5～10分钟，然后再在搅拌转速为30～50r/min缓慢搅拌，开始降温，降温至30～35℃时停止搅拌，制得盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂产品。

将上述产品进行无菌包装，检验，入库。

上述步骤(6)的操作是在剪切罐中进行，剪切罐为本领域常规设备。

需要说明的是，在以上制备方法中，所有用于物料输送的管道必须预先通过灭菌处理。

就制备方法而言，以上是本发明的优选方法，但不限于此。本领域的技术人员根据其熟知的知识，可以适当加以调整。以上所述盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂制备方法中未特别限定的，可参照现有技术。

本发明的特点：

1、盐酸溶菌酶乳膏为皮肤局部外用无菌制剂，制备工艺中最关键的就是灭菌技术。根据本发明制剂辅料各成分的理化性质，如果采用非热力灭菌方法，如过滤法，因油相基质黏稠，难以过滤。经综合考虑本制剂的特点，本发明特别采用高温湿热灭菌工艺对制剂辅料的水相、油相进行灭菌。

2、本发明制剂产品有效成分盐酸溶菌酶高温条件下易发生变性，不适于采用高温灭菌法。考虑到盐酸溶菌酶在水中溶解性较好，根据本品生产过程中，本发明先将盐酸溶菌酶溶解后再加入到水相中，选择过滤法灭菌，以保证本制剂既符合国家药典要求，又能达到灭菌的目的。

本发明所述的制备方法中盐酸溶菌酶乳膏无菌制剂质量标准如下、但不限于此。

盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂质量标准

本品含盐酸溶菌酶不得少于标示量的90％。

【形状】本品为乳白色乳膏剂

【鉴别】

(1)取本品适量(相当于2mg盐酸溶菌酶)，加水5ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显紫红色。

(2)取本品适量，加醋酸-醋酸钠缓冲液(取无水醋酸钠6.7g，加水约900ml，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000ml，摇匀。)制成每1ml中含盐酸溶菌酶0.4mg的溶液，照分光光度法《中国药典2010年版二部附录IV A》测定，在280nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.39～0.49。

【检查】

溶解性取本品1g，加水20ml搅拌，应能完全溶解。

PH值取本品1g溶于20ml蒸馏水中，在测定PH值，应在3.5～6.5间。

粘度依照《中国药典2010年版二部附录VI G第二法》

粒度照粒度和粒度分布测定法《中国药典2010年版附录IX E第一法》检查，均不得检出大于180um的粒子。

无菌照无菌检查法《中国药典2010年版附录XI H》检查，应符合规定。

其他本品应符合《中国药典2010年版附录I F》乳膏项下的其他要求。

【溶菌酶含量】

供试品溶液的制备称取乳膏(5％)适量(相当于盐酸溶菌酶25mg)，置试管中，加入氯仿5ml，破乳完全后，用PH6.2磷酸盐缓冲溶液萃取，置分液漏斗中，取上层。萃取3次，每次20ml，再用20mlPH6.2磷酸盐缓冲溶液冲洗试管和分液漏斗，合并至100毫升量瓶中，用PH6.2磷酸盐缓冲溶液定刻度。精密移取2mL置50ml容量瓶中，加pH6.2磷酸盐缓冲液至刻度，做为供试品溶液备用。

标准品溶液制备精密称取盐酸溶菌酶标准品25毫克，置100ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液溶解，定容至刻度。分别精密移取1mL、2mL溶液置50ml容量瓶中，加PH6.2磷酸盐缓冲溶液至刻度，做为标准溶液(1)及标准溶液(2)。样品溶液，标准溶液(1)标准溶液(2)置冰浴中保存

底物悬浮液的制备称取盐酸溶酶小球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml，在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。

测定法精密量取盐酸溶菌酶底物试液4ml，在35℃水浴中加热5分钟，精密移取在水浴提前加热3分钟的样品溶液100μl，加入底物试液中，并在35℃水浴中加热10分钟后，再精密量取1mol/L的盐酸溶液0.5mL加入底其中，摇匀。以水做为空白，在波长640nm处，紫外可见分光光度法测量样品溶液的吸收值Ast。标准溶液(1)、标准溶液(2)按以上方法测定吸光度As₁、As₂。

每g溶菌酶的单位＝ $[\frac{\mathrm{Ws}}{2\mathrm{Wt}}\×(\frac{{\mathrm{As}}_1-{\mathrm{As}}_t}{{\mathrm{As}}_1-{\mathrm{As}}_2}+1)]$

Ws：溶菌酶标准品称取量

Wt：样品称取量×规格

As₁：标准溶液(1)吸收度

As₂：标准溶液(2)吸收度

本发明的治疗皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)的外用药物的盐酸溶菌酶乳膏无菌制剂，采用盐酸溶菌酶为本发明药物的有效成分，与精选药用辅料，通过溶解、高温灭菌、滤膜过滤除菌、低速均质、高速均质、搅拌、降温、无菌灌装等工艺制成药剂。经过皮肤外用药物给药，对不同时期的皮肤溃疡(褥疮、烫伤溃疡、小腿部溃疡、带状疱疹后溃疡、糖尿病性溃疡、术后溃疡)都显示了它具有较好的临床作用。更为详细的效果实验将在实施例中予以说明。

附图说明

图1-图8是用实施例3的盐酸溶菌酶无菌乳膏作为供试品做的家兔皮肤刺激试验结果图。图1-8均显示表皮完整，无充血及炎症细胞浸润。其中，

图1是家兔头/完整皮肤用药侧图，病理编号：T429-10-1，HE5×；

图2是家兔头/完整皮肤对照侧图，病理编号：T429-10-2，HE5×；

图3是家兔尾/完整皮肤用药侧图，病理编号：T430-10-1，HE5×；

图4是家兔尾/完整皮肤对照侧图，病理编号：T430-10-2，HE5×；

图5是家兔左前/破损皮肤用药侧图，病理编号：T431-10-1，HE5×；

图6是家兔左前/破损皮肤对照侧图，病理编号：T431-10-2，HE5×；

图7是家兔右前/破损皮肤用药侧图，病理编号：T432-10-1，HE5×；

图8是家兔右前/破损皮肤对照侧图，病理编号：T432-10-2，HE5×。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1-3原辅料说明：

实施例1、盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂及制备

1、原辅材料投料量配比(质量比)：

盐酸溶菌酶∶司盘∶泊洛沙姆∶吐温∶山梨醇∶磷酸二氢钠∶羟苯乙酯∶液体石蜡∶单硬脂酸甘油酯∶十六醇∶十八醇∶白凡士林∶无菌水＝50∶50∶30∶30∶20∶10∶1∶220∶30∶10∶10∶70∶450。

2、制备

(1)在十万级洁净区内；取司盘-805000g、泊洛沙姆-683000g、吐温-403000g、磷酸二氢钠1000g、羟苯乙酯100g和山梨醇2000g，加无菌水30000g溶解，作为水相；

(2)在十万级洁净区内；取液体石蜡22000g、十六醇1000g、十八醇1000g、白凡士林7000g、单硬脂酸甘油酯3000g，在65～70℃水浴上熔融，作为油相；

(3)在十万级洁净区内；取盐酸溶菌酶5000g，加入无菌水15000g中，通过已灭菌的物料输送管道用0.22μm滤膜过滤除菌后；抽入百级无菌车间内，常温备用；

(4)将步骤(1)制得的水相和步骤(2)制得的分别在121～125℃条件下灭菌30分钟，通过已灭菌的物料输送管道，将料液输送至百级无菌车间已灭菌的罐内分别放置，在65～70℃保温备用；

(5)在百级无菌车间内，步骤(3)制得的盐酸溶菌酶料液与步骤(4)保温备用的水相混合，搅拌均匀，升温至65～70℃保温备用，得盐酸溶菌酶水相料液；

(6)在百级无菌车间内；在不断搅拌将步骤(4)保温备用的油相加入到步骤(5)的盐酸溶菌酶水相料液中，将所得混和物抽入剪切罐中；在温度65～70℃条件下，开启剪切机低速1000～1650r/min剪切10分钟，然后高速2500～2780r/min剪切5分钟；关闭剪切机，开启搅拌；转速为60～90r/min，继续搅拌5～10分钟，然后再在搅拌转速为30～50r/min缓慢搅拌，开始降温，降温至33℃时停止搅拌。制得盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂产品。

(7)产品无菌包装，检验，入库。

实施例2、盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂及制备

1、原辅材料投料量配比(质量比)：

盐酸溶菌酶∶司盘∶泊洛沙姆∶吐温∶山梨醇∶磷酸二氢钠∶羟苯乙酯∶液体石蜡∶单硬脂酸甘油酯∶十六醇∶十八醇∶白凡士林∶无菌水＝60∶60∶50∶40∶30∶15∶5∶240∶40∶20∶20∶80∶470。

2、制备

(1)在十万级洁净区内；称取司盘6000g、吐温4000g、泊洛沙姆5000g、磷酸二氢钠1500g、羟苯乙酯500g和山梨醇3000g，加无菌水30000g，并溶解，作为水相；

(2)在十万级洁净区内；称取液体石蜡24000g、十六醇2000g、十八醇2000g、白凡士林8000g、单硬脂酸甘油酯4000g，在65～70℃水浴上熔融，作为油相；

(3)在十万级洁净区内；称取盐酸溶菌酶6000g，加入无菌水17000g中，通过已灭菌的物料输送管道用0.22μm滤膜过滤除菌后；抽入百级无菌车间内，常温备用；

步骤(4)、(5)与实施例1的相应步骤相同。

(6)在百级无菌车间内；在不断搅拌将步骤(4)保温备用的油相加入到步骤(5)的溶菌酶水相料液中，将所得混和物抽入剪切罐中；在温度67～70℃条件下，开启剪切机低速1200～1750r/min剪切9分钟，然后高速2600～2880r/min剪切5分钟；关闭剪切机，开启搅拌；转速为70～90r/min，继续搅拌5～10分钟，然后再在搅拌转速为40～50r/min缓慢搅拌，开始降温，降温至32℃时停止搅拌。制得盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂产品。

(7)产品无菌包装，检验，入库。

实施例3、盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂及制备

1、原辅材料投料量配比(质量比)：

盐酸溶菌酶∶司盘∶泊洛沙姆∶吐温∶山梨醇∶磷酸二氢钠∶羟苯乙酯∶液体石蜡∶单硬脂酸甘油酯∶十六醇∶十八醇∶白凡士林∶无菌水＝55∶55∶40∶35∶25∶12.5∶3∶230∶35∶15∶15∶75∶460。

2、制备

(1)在十万级洁净区内，称取司盘5500g、泊洛沙姆4000g、吐温3500g、磷酸二氢钠1250g、羟苯乙酯300g和山梨醇2500g，加无菌水30000g溶解，作为水相；

(2)在十万级洁净区内，称取液体石蜡23000g、十六醇1500g、十八醇1500g、白凡士林7500g、单硬脂酸甘油酯3500g，在65～70℃水浴上熔融，作为油相；

(3)在十万级洁净区内，称取盐酸溶菌酶5500g，加入16000g无菌水中，通过已灭菌的物料输送管道用0.22μm滤膜过滤除菌后；抽入百级无菌车间内，常温备用；

步骤(4)、(5)与实施例1的相应步骤相同。

(6)在百级无菌车间内；在不断搅拌将步骤(4)保温备用的油相加入到步骤(5)的盐酸溶菌酶水相料液中，将所得混和物抽入剪切罐中；在温度66～70℃条件下，开启剪切机低速1300～1750r/min剪切9分钟，然后高速2700～2880r/min剪切4分钟；关闭剪切机，开启搅拌；转速为80～90r/min，继续搅拌5～10分钟，然后再在搅拌转速为30～50r/min缓慢搅拌，开始降温，降温至31℃时停止搅拌。制得盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂产品。

(7)无菌包装，检验，入库。

实施例4、盐酸溶菌酶无菌乳膏豚鼠Buehler实验

取实施例1的盐酸溶菌酶无菌乳膏作为供试品。所述的药品浓度百分比均为质量百分比。

取健康雄性豚鼠40只，按体重随即分为赋形剂对照组10只、2、4-二硝基氯苯阳性对照组10只和盐酸溶菌酶无菌乳膏供试品组20只，分盒饲养。药前24h将豚鼠脊柱左侧肋腹部面积约3×3cm²刮毛，阳性对照组称取1％2、4-二硝基氯苯0.2g，赋形剂对照组和供试品对照组分别称取盐酸溶菌酶无菌乳膏各0.2g，涂于豚鼠左侧脱毛区，轻柔用玻璃纸及2.5×2.5cm²二层纱布覆盖，再用固定装置将药物封闭、固定。6小时后用温水洗净涂抹区域的药物。第7天和第14天以同样方式重复致敏1次，供3次。本次致敏后14天右侧脱毛区先用温水洗净给药处皮肤，然后阳性对照组称取0.1％2、4-二硝基氯苯0.2g，赋形剂对照组和供试品对照组分别称取盐酸溶菌酶无菌乳膏各0.2g，涂与豚鼠右侧脱毛区，轻柔用玻璃纸及2.5×2.5cm²二层纱布覆盖，再用固定装置将药物封闭、固定。6小时用温水洗净涂抹区药物。激发去掉药物后24h、48h仔细观察皮肤红斑、水肿和其他异常反应，按表1对红斑和水肿评分，计算过敏发生率。根据表2判定过敏反应发生程度。

表1皮肤过敏反应程度的评分标准

皮肤反应强度	分值
		红斑
无红斑	0
		轻微可见红斑	1
中度红斑	2

严重红斑	3
		肿性红斑	4
水肿
		无水肿	0
轻度水肿	1
		中度水肿	2
严重水肿	3
		最大总积分	7

反应平均值＝(红斑形成总分+水肿形成总分)/合计动物数。

表2皮肤过敏性评价标准供试品组和赋形剂对照

过敏反应发生率(％)	分级	过敏反应强度
			0-8	I	弱敏
9-18	II	轻度致敏
			29-64	III	中度致敏
65-80	IV	强致敏
			81-100	V	极强致敏

过敏反应发生率＝出现皮肤红斑或水肿的动物数/受试动物数。

试验期间，每日对豚鼠进行观察，豚鼠的体外特征、精神状态、行为活动和呼吸等方面未见明显异常。第一次致敏前、末次致敏和激发时称重并计算每组每次体重的

各组与赋形剂组进行比较，结果无明显差异。结果见表3

表3溶菌酶无菌乳膏对豚鼠体重增长的影响

组别	初次致敏	末次致敏	激发
				赋形剂对照组	341.3±5.0	375.2±5.0	408.8±5.4
阳性对照组	343.9±12.0	377.5±11.9	410.9±12.0
				供试品组	345.4±18.6	379.0±18.4	412.3±18.5

注：对照组n＝10、供试品组n＝20

供试品组和赋形剂对照组豚鼠激发区皮肤在各个时间点均未出现红斑和水肿，反应平均值为0，过敏反应发生率为0，致敏反应为阴性。阳性对照组豚鼠激发区皮肤在去掉药物24h、48h均出现红斑和水肿，反应平均值分别为1.7和1.8，过敏反应发生率为100％，呈极强致敏性。结果见表4

表4豚鼠主动皮肤过敏反应评分

本实验条件下，盐酸溶菌酶无菌乳膏对豚鼠无明显主动皮肤致敏作用。

实施例5、盐酸溶菌酶无菌乳膏家兔皮肤刺激试验

取实施例3的盐酸溶菌酶无菌乳膏作为供试品做此实验。实验结果如图1-图8所示：

其中，图1，皮下组着、表皮、皮肤附属结构完整，未见充血、变性、坏死及炎症反应(头/完整皮肤用药侧)；图2，表皮完整，无充血及炎症细胞浸润(头/完整皮肤对照侧)；图3，皮下组着、表皮、皮肤附属结构完整，未见充血、变性、坏死及炎症(尾/完整皮肤用药侧)；图4，表皮完整，无充血及炎症细胞浸润(尾/完整皮肤对照侧)；图5，表皮损伤，有炎症细胞浸润和渗出物(左前/破损皮肤用药侧)；图6，表皮损伤，有炎症细胞浸润和渗出物(左前/破损皮肤对照侧)；图7，表皮损伤，有炎症细胞浸润和渗出物(右前/破损皮肤用药侧)；图8，表皮损伤，有炎症细胞浸润和渗出物(右前/破损皮肤对照侧)。

取健康成年的家兔8只，♀♂各半。正常皮肤于给药前24小时将动物背部脊柱两侧毛用电推脱毛，脱毛面积为3×3cm²。破损皮肤脱毛方法同正常皮肤制备。脱毛区以75％酒精局部消毒，用无菌针头脱毛局部″#″形划痕，以渗血为度。采用同体左右侧自身对比法。正常皮肤组给药时先用75％酒精局部消毒，称取供试品和赋形剂各0.5g，分别涂于家兔右、左侧脱毛区(给药面积3×3cm²)，然后用双层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用固定装置加以封闭、固定。4小时后用温水洗净涂抹区域的药物。每次给药应连续在同一部位给药，破损皮肤组同法给予药物。每天给药1次，连续给药7天。末次给药去除受试物后1、24、48、72h观察并记录涂抹部位红斑和水肿等刺激反应情况，及上述变化的恢复情况和恢复时间。观察结束后空气栓塞法处死1/2动物，♀♂各半，然后将所取皮肤组织用4％中性甲醛溶液固定，HE染色后进行组织病理学检查。剩余动物继续观察14天，必要时再次进行组织病理学检查。按照表5对去除药物1h及再次给药前观察记录红斑及水肿等，并对红斑和水肿评分。计算完每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每只动物积分值，按表6进行刺激强度评价。

表5皮肤刺激反应评分标准

刺激反应	分值
		红斑
无红斑	0
		轻度红斑(勉强可见)	1
中度红斑(明显可见)	2
		重度红斑	3
紫红色红斑到轻度焦痂形成	4
		水肿
无水肿	0
		轻度水肿(勉强可见)	1
中度水肿(明显隆起)	2
		重度水肿(皮肤隆起1mm，轮廓清楚)	3
严重水肿(皮肤隆起1mm以上并有扩大)	4
		高总积分	8

表6皮肤刺激强度评价

分值	评价
		0-0.49	无刺激性
0.5-2.99	轻度刺激性
		3.0-5.99	中度刺激性
6.0-8.0	强刺激性

试验期间，家兔一般状况良好，每次给药前、药物去除1h后和末次给药去除药物后1、24、48和72h及恢复期观察结束后观察用药局部未见明显红斑、水肿、色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等症状，评分分值为0。

病理检查可见，完整皮肤组用药(见附图1、附图3)侧下组织、表皮、皮肤附件结构完整、清晰，未见充血变性、坏死及炎症反应，与赋形剂对照侧比较未见明显的差异；对照侧(见附图2、附图4)表皮完整，无充血及炎性细胞浸润等；破损皮肤组用药侧(见附图5、附图7)取材组织均可见表皮损伤、炎性反应与渗出物，与赋形剂对照侧比较未见明显差异。可能与破损皮肤制备时机械损伤所致，推测与药物无关。破损皮肤对照侧(见附图6、附图8)可见表皮损伤、炎性细胞浸润及渗出物。

本试验条件下，盐酸溶菌酶无菌乳膏对家兔皮肤组织无明显刺激作用。

Claims (3)

1.一种治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏，其特征在于，原料质量份包括以下组分：

A：盐酸溶菌酶50～80份，酶活性6200～20000单位/mg；

B：司盘50～80份、泊洛沙姆30～60份、吐温30～50份、山梨醇20～40份、磷酸二氢钠10～20份、羟苯乙酯1～10份；

C：液体石蜡220～260份、单硬脂酸甘油酯30～50份、十六醇10～30份、十八醇10～30份、白凡士林70～100份；

D：无菌水449～500份。

2.如权利要求1所述的治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏，其特征在于，原料质量份包括以下组分：

A：盐酸溶菌酶50～60份，酶活性12000～16000单位/mg；

B：司盘-4050～60份、泊洛沙姆6830～50份、吐温-8030～40份、山梨醇20～30份、磷酸二氢钠10～15份、羟苯乙酯1～5份；

C：液体石蜡220～240份、单硬脂酸甘油酯30～40份、十六醇10～20份、十八醇10～20份、白凡士林70～80份；

D：无菌水450～470份。

3.如权利要求1或2所述的治疗皮肤溃疡的盐酸溶菌酶外用无菌乳膏的制备方法，包括如下步骤：

(1)在十万级洁净区内，按配比称取B组各组分，加适量无菌水溶解，作为水相；

(2)在十万级洁净区内，按配比称取C组各组分，在65～70℃水浴上熔融，作为油相；

(3)在十万级洁净区内，按配比称取A组分盐酸溶菌酶，加余量的无菌水溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至百级无菌车间已灭菌的罐内，常温备用；

(4)将步骤(1)制得的水相和步骤(2)制得的油相分别在121～125℃条件下灭菌30分钟，分别输送至百级无菌车间已灭菌的罐内存放，在65～70℃保温备用；

(5)在百级无菌条件下，将步骤(3)制得的盐酸溶菌酶料液与步骤(4)保温备用的水相混合，搅拌均匀，升温至65～70℃保温备用，得盐酸溶菌酶水相料液；

(6)在百级无菌条件下，搅拌下将步骤(4)保温备用的油相加入到步骤(5)的盐酸溶菌酶水相料液中，在温度65～70℃条件下，先1000～1750r/min低速剪切8～10分钟，然后高速2500～2880r/min剪切4～5分钟；停止剪切，开启搅拌，转速为60～90r/min，继续搅拌5～10分钟，然后再在搅拌转速为30～50r/min缓慢搅拌，开始降温，降温至30～35℃时停止搅拌，制得盐酸溶菌酶无菌乳膏制剂产品。

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