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CN102168045A - 一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法 Download PDF

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CN102168045A CN2010106045309A CN201010604530A CN102168045A CN 102168045 A CN102168045 A CN 102168045A CN 2010106045309 A CN2010106045309 A CN 2010106045309A CN 201010604530 A CN201010604530 A CN 201010604530A CN 102168045 A CN102168045 A CN 102168045A
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Abstract

本发明提供一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，该枯草芽孢杆菌制剂由包括以下步骤的制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液制成，其中以0.5％～5％(重量比)的接种量将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基，在压力为0.02～0.15MPa、搅拌转速为100～300转/分、通风比为1∶0.3～1.5(体积比)的条件下发酵20～40小时。本发明采用液体深层发酵法代替固体发酵法使得制备工艺的效率提高，通过进一步优化各步骤采用的培养基的组成以及发酵工艺条件，使得最终产品中的枯草芽孢杆菌活菌含量得到大幅度提高；该枯草芽孢杆菌制剂耐酸、耐胆盐，在肠道环境中保持高效稳定；芽孢形成率高，更耐高温，便于加工和保存。

Description

一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法。
背景技术
畜禽肠道内的微生物与饲料在体内的消化吸收有着密切关系，其直接影响到体内的合成代谢。保持肠道内有益菌群保持正常可以预防畜禽感染疾病，对抗有害菌，同时产生乳酸、过氧化氢以及抗菌物质，促进营养物质的消化吸收。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)呈杆状，直径为0.6～1.0μm，长1.5～2.0μm。芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大，革兰氏反应阳性。菌落粗糙，不透明，不闪光，扩张，呈污白色或微带黄色。在畜牧和养殖业中，枯草芽孢杆菌相比其他有益细菌具有其独特的优势：它的肠道内定殖力强，繁殖速度快；能够产生大量的内生消化酶，可提高日增重和饲料转化率，可抗拉稀、抗应激、优化环境；抗逆性强、耐酸碱和高温高压，在饲料加工和储存过程中不易失活。将其应用于饲料工业中，可以有效调节畜禽肠道中的菌群平衡，明显改善肠道微生态环境，抑制有害菌生长，提高免疫力，降低发病率，增加成活率；促进生长，提高日增重，提高饲料消化吸收率，降低饲养成本，改善肉质；使畜禽对冷热应激、断奶应激、食物应激、环境变化等有很好的抵抗作用；优化生态环境，降低动物舍内氨气、硫化氢等有害气体的浓度，减少粪便中有机物的排泄。因此，枯草芽孢杆菌被广泛应用于饲料添加剂的生产中。但是，现有的枯草芽孢杆菌制剂普遍存在所含活菌数量不够高的缺陷，另外其在运输、保存和使用过程中的稳定性较差，不能完全有效地适应外界环境以及畜禽体内环境，这些都导致现有枯草芽孢杆菌制剂的效力降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于饲料添加剂的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，该枯草芽孢杆制剂的活菌含量更高，并且在畜禽肠道环境和外部环境中更加高效稳定。
用于实现上述目的的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
以0.5％～5％(重量/重量)的接种量将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基，在压力为0.02～0.15MPa、搅拌转速为100～300转/分、通风比为1∶0.3～1.5(体积/体积)的条件下发酵20～40小时；其中，按重量百分比计算，所述发酵培养基包含一种或几种选自豆饼粉0.1％～3％、尿素0.1％～2％、硫酸铵0.05％～0.3％、磷酸氢二铵0.05％～0.3％、大豆蛋白胨0.05％～0.3％、酵母膏1％～3％、鱼粉0.1％～1.2％、豆粕粉0.1％～5％、棉粕0.01％～0.1％和豆粕水解液0.1％～5％的氮源；一种或几种选自大米粉0.05％～2.1％、面粉0.1％～3.5％、葡萄糖0.05％～1.0％、乳糖0.1％～0.8％、淀粉0.05％～0.5％、蔗糖0.05％～0.5％、玉米粉0.1％～1.5％、玉米淀粉0.1％～1.5％和麸皮0.05％～0.5％的碳源；以及碳酸钙0.05％～0.8％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.40％，硫酸锰0.01％～0.06％，氯化钠0.05％～0.5％，氯化钾0.05％～0.3％，磷酸二氢钾0.005％～0.07％和碳酸氢钠0.005％～0.03％，pH为7.0～7.5。
在上述制备方法中，优选地，豆粕水解液是由豆粕与水的混合物在pH为9～11、温度为80～90℃的条件下水解20～60分钟制得的，其中豆粕与水的质量比为1～5∶100。
在上述制备方法中，优选地，枯草芽孢杆菌种子液的制备方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基，于28～45℃下培养15～36小时得到单菌落；所述斜面培养基包含牛肉浸膏5.0～15.0g/mL，大豆蛋白胨5.0～15.0g/mL，酵母膏5.0～15.0g/mL，氯化钠5.0～15.0g/mL，葡萄糖3.0～10.0g/mL和琼脂20～30g/mL，pH为7.0～7.5；
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种于菌液培养基，在28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时得到枯草芽孢杆菌液；所述培养基包含蛋白胨5～15g/mL，牛肉膏2～8g/mL和氯化钠3～8g/mL，pH为7.4；
(3)将步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌液以0.5％～5％接种量(重量/重量)接种于种子培养基，于28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时得到枯草芽孢杆菌种子液；按重量百分比计算，所述菌液培养基包含玉米粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.1％～1.0％，豆饼粉0.5％～3％，鱼粉0.1％～1.5％，碳酸钙0.31％～1.69％，硫酸铵0.05％～0.15％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.06％和硫酸锰0.01％～0.06％。
在上述制备方法中，优选地，发酵培养基在发酵前先在105～130℃下灭菌20～40分钟。
另一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌液体制剂，该液体制剂包含根据上述制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液；优选地，该液体制剂包含的枯草芽孢杆菌活菌数≥1×1010CFU/mL。
又一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌粉体制剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)向上述制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液中加入10％～70％(g/mL)的硫酸铵水溶液和助滤剂，进行过滤；
(2)将滤饼在进风温度为120～180℃、进料速度为50～200转/分、出口温度为70～90℃的闪蒸干燥机中进行闪蒸。
在上述粉体制剂的制备方法中，优选地，过滤为向上述制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液中加入10％～70％(g/mL)的硫酸铵水溶液和助滤剂，搅拌10～60分钟后静置10～120分钟，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为30～60℃，过滤压力为2～5kg/cm2。
在上述粉体制剂的制备方法中，优选地，助滤剂选自碳酸钙、珍珠岩和硅藻土中的一种或几种；优选地，按照重量百分比计算，所述枯草芽孢杆菌发酵液包含助滤剂1％～6％。
本发明还提供了上述粉体制剂的制备方法制备的枯草芽孢杆菌粉体制剂；优选地，该粉体制剂包含的枯草芽孢杆菌活菌数≥1×1011CFU/g。
在一方面，本发明提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含上述枯草芽孢杆菌液体制剂或枯草芽孢杆菌粉体制剂。
在本发明的一个具体实施方案中，枯草芽孢杆菌液体制剂以及粉体制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：采用常规方法将枯草芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于28～45℃下培养15～36小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述一级斜面培养基为按下述比例和成分配制的混合物：牛肉浸膏5.0～15.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，酵母膏5.0～15.0g，氯化钠5.0～15.0g，葡萄糖3.0～10.0g，琼脂20～30g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.5；
(2)枯草芽孢杆菌二级液体培养：采用常规方法将步骤(1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为20～200mL/500mL，在28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述二级培养液为按下述比例和成分配制的混合液：蛋白胨5～15g，牛肉膏2～8g，氯化钠3～8g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；
(3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：将步骤(2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液以0.5％～5％的重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基中于28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；所述三级枯草芽孢杆菌种子液的培养基包含(重量百分比)：玉米粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.1％～1.0％，豆饼粉0.5％～3％，鱼粉0.1％～1.5％，碳酸钙0.31％～1.69％，硫酸铵0.05％～0.15％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.06％和硫酸锰0.01％～0.06％；
(4)枯草芽孢杆菌液体发酵：发酵罐通蒸汽于100～130℃下保温灭菌20～60分钟后，将发酵底物粉碎到60～120目放入发酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量与发酵底物的重量之比为100∶2～15，然后通高压蒸汽升温至105～130℃，并保温20～40分钟后自然冷却15～45分钟，通冷却水冷却至28～45℃，无菌条件下接入步骤(3)中所述的三级枯草芽孢杆菌种子液，接种量为0.5％～5％(重量比)，罐压为0.02～0.15MPa，搅拌转速为100～300转/分，通风比为1∶0.3～1.5(体积比)，发酵时间为20～40小时，直至得到活菌数达到1×1010CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液；按重量百分比计算，所述发酵底物中的氮源为豆饼粉0.1％～3％、尿素0.1％～2％、硫酸铵0.05％～0.3％、磷酸氢二铵0.05％～0.3％、大豆蛋白胨0.05％～0.3％、酵母膏1％～3％、鱼粉0.1％～1.2％、豆粕粉0.1％～5％、棉粕0.01％～0.1％和豆粕水解液0.1％～5％中的一种或几种；所述的发酵底物中的碳源为大米粉0.05％～2.1％、面粉0.1％～3.5％、葡萄糖0.05％～1.0％、乳糖0.1％～0.8％、淀粉0.05％～0.5％、蔗糖0.05％～0.5％、玉米粉0.1％～1.5％、玉米淀粉0.1％～1.5％和麸皮0.05％～0.5％中的一种或几种；所述发酵底物中除氮源和碳源外的其他成分包括(重量比)：碳酸钙0.05％～0.8％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.40％，硫酸锰0.01％～0.06％，氯化钠0.05％～0.5％，氯化钾0.05％～0.3％，磷酸二氢钾0.005％～0.07％和碳酸氢钠0.005％～0.03％，pH为7.0～7.5；所述的豆粕水解液为豆粕与水的混合物，豆粕含量1％～5％，在pH为9～11、温度为80～90℃的条件下水解20～60分钟。该枯草芽孢杆菌发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌液体制剂。
所述枯草芽孢杆菌粉体制剂的制备还包括如下步骤(5)：
(5)采取盐析、板框过滤和闪蒸干燥工艺，向上述枯草芽孢杆菌发酵液中加入10％～70％(g/mL)的硫酸铵水溶液后，再加入一定比例的助滤剂，搅拌10～60分钟后静置10～120分钟；然后压入板框过滤机进行过滤，过滤温度为30～60℃，过滤压力为2～5kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在20％～50％(重量比)；板框过滤后的滤饼直接进入气流干燥机进行干燥，进风温度为120～180℃，进料速度为50～200转/分，物料出口温度为70～90℃，最终物料水分为0.5％～5％(重量比)，得到的枯草芽孢杆菌粉剂的活菌数≥1×1011 CFU/g；按重量百分比计算，所述助滤剂为碳酸钙1％～6％、珍珠岩1％～5％和硅藻土1％～5％中的一种或几种。
本发明的枯草芽孢杆菌液体制剂或粉体制剂的使用方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌液体制剂或粉体制剂与饲料混合或拌料；在猪的全价料中的添加比例为500～2000克/吨全价饲料；在肉鸡和肉鸭全价料中的添加比例为500～2000克/吨全价饲料；在蛋鸡和蛋鸭料中的添加比例为500～2000克/吨全价饲料；在牛和羊等反刍动物全价料中的添加比例为1000～3000克/吨精料；在水产动物饲料中的添加比例为500～1000g/(亩·米)；
(2)也可直接口服或加入水中饮用。
本发明提供两种枯草芽孢杆菌微生态制剂，它们分别达到了如下的质量标准：
液体制剂为棕黄色液体，具有浓郁的臭脚丫味道，活菌数达到1×1010CFU/mL以上，芽孢形成率≥90％。铅≤10mg/kg，无机砷≤3mg/kg，氟≤100mg/kg，大肠杆菌≤3000个/100g，黄曲霉毒素B1≤10μg/kg，沙门氏菌未见检出，符合国家饲料卫生标准。
粉体制剂为浅黄或白色粉末，活菌数≥1×1011 CFU/g，芽孢形成率≥90％。干燥粉剂的水分含量为0.5％～5％，菌体得率为90％。铅≤10mg/kg，无机砷≤3mg/kg，氟≤100mg/kg，大肠杆菌≤3000个/100g，黄曲霉毒素B1≤10μg/kg，沙门氏菌未见检出，符合国家饲料卫生标准。
本发明的枯草芽孢杆菌液体制剂或粉体制剂及其制备方法与现有技术相比具有以下显著的优点：
(1)本发明采用液体深层发酵法代替固体发酵法使得制备工艺的效率得到提高，通过进一步优化各步骤采用的培养基的组成以及发酵工艺条件，使得最终产品中的枯草芽孢杆菌的活菌含量被大幅度提高，其中液体制剂中的活菌含量可达1×1010 CFU/mL，粉体制剂中的活菌含量可达1×1011 CFU/g，充分地保证了枯草芽孢杆菌制剂的有效性；
(2)本发明制备的枯草芽孢杆菌制剂耐酸、耐胆盐，在肠道环境中保持高效稳定，为枯草芽孢杆菌制剂的广泛推广使用奠定了基础；
(3)本发明的枯草芽孢杆菌制剂中枯草芽孢杆菌的芽孢形成率高，更耐高温，便于加工和保存；
(4)本发明的枯草芽孢杆菌制剂无毒副作用、无耐药性、无残留，成本低、效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1制备枯草芽孢杆菌液体制剂-L1
1)枯草芽孢杆菌的一级斜面培养：以购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏号为ACCC10619的枯草芽孢杆菌作为出发菌株。采用常规方法将枯草芽孢杆菌ACCC10619接种于一级斜面培养基上，于30℃培养24小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述培养基为按下述比例和成分配制的混合物：牛肉浸膏5.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母膏5.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0；
2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：采用常规方法将步骤1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为100mL/500mL，在30℃、150转/分的条件下培养15小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述二级培养液为按下述比例和成分配制的混合液：蛋白胨15g；牛肉膏2g；氯化钠3g；蒸馏水1000mL；pH为7.4；
3)枯草芽孢杆菌的三级扩大培养：将步骤2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液以0.5％的重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于30℃、150转/分的条件下培养36小时，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；所述培养基包含(重量比)：玉米粉0.5％；葡萄糖1.0％；豆饼粉3％；鱼粉0.1％；碳酸钙1.69％；硫酸铵0.05％；磷酸氢二钾0.01％；硫酸镁0.01％；硫酸锰0.01％；
4)枯草芽孢杆菌液体发酵：发酵罐通蒸汽于130℃下保温灭菌40分钟后，将发酵底物粉碎到60目放入发酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为100∶2，然后通高压蒸汽升温至130℃，并保温40分钟后自然冷却45分钟，通冷却水冷却至30℃，无菌条件下接入步骤3)中所述的三级枯草芽孢杆菌种子液，接种量为0.5％(重量比)，罐压为0.05MPa，搅拌转速为150转/分，通风比为1∶0.5(体积比)，发酵时间为40小时；直至得到活菌数达到1×1010 CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液；按重量百分比计算，所述发酵底物包含硫酸铵0.2％、碳酸钙0.6％、鱼粉0.4％、豆粕粉3％、葡萄糖0.7％、玉米粉1.5％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸镁0.02％和硫酸锰0.02％，pH为7.0～7.5。
实施例2制备枯草芽孢杆菌液体制剂-L2
1)枯草芽孢杆菌的一级斜面培养：以购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏号为ACCC10619的枯草芽孢杆菌作为出发菌株。采用常规方法将枯草芽孢杆菌ACCC10619接种于一级斜面培养基上，于28℃下培养36小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述成分和比例配制的混合物：牛肉浸膏15.0g；大豆蛋白胨15.0g；酵母膏5.0g；氯化钠5.0g；葡萄糖10.0g；琼脂30g；蒸馏水1000mL；pH为7.4；
2)枯草芽孢杆菌二级液体培养：采用常规方法将步骤1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量200mL/500mL，在28℃、300转/分的条件下培养36小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级培养液为按下述成分和比例配制的混合液：蛋白胨15g；牛肉膏8g；氯化钠3g；蒸馏水1000mL；pH为7.4；
3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：将步骤2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液以5％的重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于28℃、300转/分的条件下培养36小时，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；所述的三级枯草芽孢杆菌种子液的培养基包含(重量比)：玉米粉2.0％；葡萄糖1.0％；豆饼粉3％；鱼粉1.5％；碳酸钙0.31％；硫酸铵0.15％；磷酸氢二钾0.06％；硫酸镁0.06％和硫酸锰0.06％；
4)枯草芽孢杆菌液体发酵：发酵罐通蒸汽于121℃保温灭菌30分钟后，将发酵底物粉碎到120目放入发酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为100∶15，然后通高压蒸汽升温至130℃，并保温40分钟后自然冷却30分钟，通冷却水冷却至28℃，无菌条件下接入步骤3)中所述的三级枯草芽孢杆菌种子液，接种量为5％(重量比)，罐压为0.10MPa，搅拌转速为300转/份，通风比为1∶1.5(体积/体积)，发酵时间为40小时；直至得到活菌数达1×1010 CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液；所述的发酵底物包含氯化钠0.3％、酵母膏1％、鱼粉1.2％、大米粉1.4％、面粉3.5％、葡萄糖0.5％、硫酸镁0.4％、硫酸锰0.02％、氯化钾0.2％、磷酸二氢钾0.03％和碳酸氢钠0.02％，pH为7.0～7.5。
实施例3制备枯草芽孢杆菌液剂-L3
1)枯草芽孢杆菌一级斜面培养：以获自中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC11508的枯草芽孢杆菌作为出发菌株。采用常规方法将枯草芽孢杆菌CGMCC11508接种于一级斜面培养基上，于36℃下培养20小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述成分和比例配制的混合物：牛肉浸膏5.0～15.0g，大豆蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂25g，蒸馏水1000mL，pH为7.5；
2)枯草芽孢杆菌二级液体培养：采用常规方法将步骤1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为150mL/500mL，在36℃、200转/分的条件下培养20小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级培养液为按下述成分和比例配制的混合液：蛋白胨15g，牛肉膏2g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；
3)枯草芽孢杆菌三级扩大培养：将步骤2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液以4.5％的重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于36℃、200转/分的条件下培养18小时，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；所述的三级枯草芽孢杆菌种子液培养基包含(重量比)：玉米粉0.2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉3％，鱼粉1.5％，碳酸钙0.7％，硫酸铵0.10％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸镁0.03％和硫酸锰0.03％；
4)枯草芽孢杆菌液体发酵：发酵罐通蒸汽于126℃保温灭菌20分钟后，将发酵底物粉碎到80目放入发酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为100∶10，然后通高压蒸汽升温至126℃，并保温30分钟后自然冷却30分钟，通冷却水冷却至36℃，无菌条件下接入步骤3)中所述的三级枯草芽孢杆菌种子液，接种量为4％(重量比)，罐压为0.05MPa，搅拌转速为200转/分，通风比为1∶1(体积/体积)，发酵时间为35小时，直至得到活菌数达1×1010 CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液；所述的发酵底物包含(重量比)：豆饼粉5％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.4％、葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.3％、碳酸钙0.2％，硫酸镁0.04％和磷酸二氢钾0.06％，pH 7.0～7.5；
实施例4制备枯草芽孢杆菌液剂-L4
1)枯草芽孢杆菌的一级斜面培养：以获自中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC11627的枯草芽孢杆菌作为出发菌株。采用常规方法将枯草芽孢杆菌CGMCC11627接种于一级斜面培养基上，于32℃下培养24小时，得到一级枯草芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述成分和比例配制的混合物：牛肉浸膏5.0g，大豆蛋白胨15.0g，酵母膏5.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0；
2)枯草芽孢杆菌的二级液体培养：采用常规方法将步骤1)培养的一级枯草芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为150mL/500mL，在32℃、180转/分的条件下培养15小时，得到二级枯草芽孢杆菌种子液；所述的二级培养液为按下述成分和比例配制的混合液：蛋白胨15g；牛肉膏2g；氯化钠3g；蒸馏水1000mL；pH为7.4；
3)枯草芽孢杆菌的三级扩大培养：将步骤2)得到的二级枯草芽孢杆菌种子液以0.5％重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于32℃、180转/分的条件下培养36小时，得到三级枯草芽孢杆菌种子液；所述的培养基包含(重量比)：玉米粉0.5％；葡萄糖1.0％；豆饼粉3％；鱼粉0.1％；碳酸钙1.69％；硫酸铵0.05％；磷酸氢二钾0.01％；硫酸镁0.01％和硫酸锰0.01％；
4)枯草芽孢杆菌液体发酵：发酵罐通蒸汽于130℃保温灭菌40分钟后，将发酵底物粉碎到80目放入发酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为100∶5，然后通高压蒸汽升温至130℃，并保温40分钟后自然冷却45分钟，通冷却水冷却至30℃，无菌条件下接入步骤3)中所述的三级枯草芽孢杆菌种子液，接种量为0.5％(重量比)，罐压为0.05MPa，搅拌转速为180转/分，通风比为1∶0.5(体积比)，发酵时间为36小时；直至得到活菌数达1×1010 CFU/mL的枯草芽孢杆菌发酵液；所述的发酵底物包含(重量比)：酵母粉3％、3％的豆粕水解液3％、葡萄糖0.7％、玉米淀粉1.5％、碳酸钙0.5％，pH为7.0～7.5。
实施例5制备枯草芽孢杆菌粉剂-S1
向实施例1制得的发酵液中加入10％(g/mL)的硫酸铵水溶液后，再加入4％(重量比)碳酸钙助滤，搅拌10分钟后静置10～120分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。过滤温度为30℃，过滤压力为2kg/cm2。板框过滤的物料水分保持在20％(重量比)。板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥。进风温度为120℃，进料速度为50转/分，物料出口温度为70℃。最终物料水分为0.5％(重量)，制剂的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例6制备枯草芽孢杆菌粉剂-S2
向实施例2制得的发酵液加入70％(g/mL)的硫酸铵水溶液后，再加入5％(重量比)珍珠岩助滤，搅拌60分钟后静置120分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。过滤温度为60℃，过滤压力为5kg/cm2。板框过滤的物料水分保持在50％(重量比)。板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥。进风温度为180℃，进料速度为200转/分，物料出口温度为90℃。最终物料水分为5％(重量比)，制剂的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例7制备枯草芽孢杆菌粉剂-S3
向实施例3制得的发酵液加入35％(g/mL)的硫酸铵水溶液后，再加入3％(重量比)碳酸钙、1％(重量比)珍珠岩助滤，搅拌30分钟后静置60分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。过滤温度为40℃，过滤压力4kg/cm2。板框过滤的物料水分保持在30％(重量比)。板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥。进风温度为160℃，进料速度为100转/分，物料出口温度为80℃。最终物料水分为1.5％(重量比)，制剂的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例8制备枯草芽孢杆菌粉剂-S4
向实施例4得到发酵液加入50％(g/mL)硫酸铵水溶液后，再加入4％(重量比)碳酸钙、2％(重量比)珍珠岩助滤，搅拌30分钟后静置60分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。过滤温度为39℃，过滤压力为4kg/cm2。板框过滤的物料水分保持在30％(重量比)。板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥。进风温度为130℃，进料速度为200转/分，物料出口温度为85℃。最终物料水分为2.0％(重量比)，制剂的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例9枯草芽孢杆菌制剂的耐高温性
以4％(重量比)的比例将实施例1制备的枯草芽孢杆菌液剂加到预混料或全价料中进行制粒处理，并检测菌株的存活率。分别在80、85、90、95、100℃下制粒处理10分钟，芽孢存活率分别为100％、95.2％、90.9％、88.2％、85.4％(结果见表1)，说明该枯草芽孢杆菌制剂可以耐受高温制粒处理并保持良好的活性。
表1枯草芽孢杆菌剂在不同制粒温度下处理10分钟后的芽孢存活率(×1011CFU/g)
Figure BSA00000397728500111
实施例10枯草芽孢杆菌制剂的耐酸性
将实施例5制备的枯草芽孢杆菌粉剂在人工模拟胃液(pH为2.0、3.0、4.0)中37℃下处理2小时，菌株存活率分别达到3.0％、20.6％和97.6％；在人工模拟胃液(pH为2.0、3.0、4.0)中37℃下处理4小时，菌株的存活率分别达到2.2％、12.0％和59.8％；在人工模拟胃液(pH为2.0、3.0、4.0)中37℃下处理6小时，菌株的存活率分别达到1.2％、9.0％和50.4％；说明该枯草芽孢杆菌制剂可以在经过胃液后并保持相当高的活性而到达肠道。
表2枯草芽孢杆菌粉剂在人工模拟胃液中37℃下处理2、4或6小时后的存活结果(×1011CFU/g)
Figure BSA00000397728500121
实施例11枯草芽孢杆菌制剂的储存稳定性
以4％的重量比将实施例7制备的枯草芽孢杆菌粉剂在预混料中贮存3个月、6个月和12个月，其菌株存活率分别为96.5％、91.3％和82.1％，说明该枯草芽孢杆菌制剂的储存性良好，可以在一定的时期内保持较高的活菌数量，保证制剂的活性。
表3枯草芽孢杆菌粉剂在预混料中贮藏3、6或12个月后的菌株存活率(×1011CFU/g)
Figure BSA00000397728500122
实施例12枯草芽孢杆菌制剂在猪生产中的应用
选择同批的杜×长×大三元杂保育出栏健康活泼仔猪120头，根据体重及性别比例相近的原则将小猪分为A、B两组，其中A组为对照组，B组为试验组，各设3个重复，每组20头，公、母各占1/2；A组饲喂常规玉米-豆粕型日粮；B组在A组日粮的基础上添加0.1％(重量比)的实施例2制备的枯草芽孢杆菌制剂。试验结果如下所示：
表4显示各组猪只体重、净增重和平均日增重。从上表可见，在试验初期，各组猪只体重差异均不显著(P＞0.05)。试验期间A组、B组日增重分别为568和672g，添加枯草芽孢杆菌添加剂的试验B组平均日增重比对照组提高18.30％；添加枯草芽孢杆菌菌剂的B组，料肉比优于对照组；添加枯草芽孢杆菌菌剂后腹泻率较对照组降低。以上的结果说明：将枯草芽孢杆菌制剂添加入猪饲料中时，在增加猪体重、减少料肉比、特别是降低腹泻率方面具有良好的作用。
表4添加枯草芽孢杆菌制剂对仔猪生产的影响
  项目   A组   B组
  平均始重(kg/头)   18.40±1.02   19.60±0.10
  平均末重(kg/头)   33.45±2.00   38.84±1.1.48
  全期净增重(kg/头)   17.46±1.02   18.92±2.03
  平均日增重(g/头·日)   568±12   672±21
  平均耗料量(kg/头)   41.33±2.01   41.99±3.02
  日采食量(kg/头·日)   1.33±0.02   1.40±0.03
  料重比   2.39±0.05   2.13±0.06
  腹泻率(％)   7.48   3.58
*腹泻率＝腹泻头日数/总头日数。
实施例13枯草芽孢杆菌制剂在肉仔鸡生产中的应用
选择1日龄肉仔鸡360只，分为两组，每组3个重复，每个重复60只鸡，A组饲喂普通玉米-豆粕型日粮，B组在A组日粮基础上添加0.1％的枯草芽孢杆菌菌剂(实施例3)；在肉仔鸡1日龄、28日龄、49日龄分别以重复为单位称重，并统计耗料量，计算0～4周和4～7周龄的死亡只数、增重、采食量以及料肉比。结果见表5。
表5的数据表明，B组鸡的体重比空白对照组提高56g；同时，B组鸡的耗料量也明显低于对照组。说明添加枯草芽孢杆菌添加剂可明显提高肉鸡的增重，也能提高饲料转化效率，节约饲料开支，提高经济效益。
表5添加枯草芽孢杆菌剂对肉仔鸡生产性能的影响
  组别   增重(kg)   采食量(kg)   料肉比
  A   2.320±0.068   5.188±0.005   2.223±0.075
  B   2.376±0.114   5.186±0.004   2.179±0.125
实施例14枯草芽孢杆菌制剂在蛋鸡生产中的应用
将300只30周龄产蛋鸡随机分为2个处理，每个处理3个重复，每个重复50只鸡。试验预饲期10天，2个处理日粮分别为：对照组(A)、添加枯草芽孢杆菌(实施例6)的试验组(B)。试验过程记录各试验重复鸡只2个月产蛋情况。
添加枯草芽孢杆菌降低了产蛋鸡的饲料效率，日粮中添加0.01％(重量比)浓缩型蛋鸡用微生态型复合预混料显著降低了饲料效率(P＜0.01)说明枯草芽孢杆菌对于提高鸡的饲料效率有显著效果。此外，添加枯草芽孢杆菌的产蛋鸡群中没有出现鸡只死亡、淘汰和瘫痪的情况，没有出现破蛋和其它异常蛋情况，鸡群健康。
表6添加枯草芽孢杆菌对蛋鸡生产性能的影响
  项目   A   B
  产蛋率(％)   85.24±1.19   86.01±3.16
  破蛋和异常蛋率(％)   0.05   0.01
  每枚蛋重(g)   66.14±0.51   65.68±0.40
  饲料效率(％)   2.12±0.05   2.08±0.02

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
以0.5％～5％(重量比)的接种量将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基，在压力为0.02～0.15MPa、搅拌转速为100～300转/分、通风比为1∶0.3～1.5(体积比)的条件下发酵20～40小时；其中，按重量百分比计算，所述发酵培养基包含一种或几种选自豆饼粉0.1％～3％、尿素0.1％～2％、硫酸铵0.05％～0.3％、磷酸氢二铵0.05％～0.3％、大豆蛋白胨0.05％～0.3％、酵母膏1％～3％、鱼粉0.1％～1.2％、豆粕粉0.1％～5％、棉粕0.01％～0.1％和豆粕水解液0.1％～5％的氮源；一种或几种选自大米粉0.05％～2.1％、面粉0.1％～3.5％、葡萄糖0.05％～1.0％、乳糖0.1％～0.8％、淀粉0.05％～0.5％、蔗糖0.05％～0.5％、玉米粉0.1％～1.5％、玉米淀粉0.1％～1.5％和麸皮0.05％～0.5％的碳源；以及碳酸钙0.05％～0.8％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.40％，硫酸锰0.01％～0.06％，氯化钠0.05％～0.5％，氯化钾0.05％～0.3％，磷酸二氢钾0.005％～0.07％和碳酸氢钠0.005％～0.03％，pH为7.0～7.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述豆粕水解液是由豆粕与水的混合物在pH为9～11、温度为80～90℃的条件下水解20～60分钟制得的，其中豆粕与水的质量比为1～5∶100。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基，于28～45℃下培养15～36小时得到单菌落；所述斜面培养基包含牛肉浸膏5.0～15.0g/mL，大豆蛋白胨5.0～15.0g/mL，酵母膏5.0～15.0g/mL，氯化钠5.0～15.0g/mL，葡萄糖3.0～10.0g/mL和琼脂20～30g/mL，pH为7.0～7.5；
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种于菌液培养基，在28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时得到枯草芽孢杆菌液；所述菌液培养基包含蛋白胨5～15g/mL，牛肉膏2～8g/mL和氯化钠3～8g/mL，pH为7.4；
(3)将步骤(2)获得的枯草芽孢杆菌液以0.5％～5％(重量比)接种量接种于种子培养基，于28～45℃、100～300转/分的条件下培养15～36小时得到枯草芽孢杆菌种子液；按重量百分比计算，所述种子培养基包含玉米粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.1％～1.0％，豆饼粉0.5％～3％，鱼粉0.1％～1.5％，碳酸钙0.31％～1.69％，硫酸铵0.05％～0.15％，磷酸氢二钾0.01％～0.06％，硫酸镁0.01％～0.06％和硫酸锰0.01％～0.06％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基在发酵前先在105～130℃下灭菌20～40分钟。
5.一种枯草芽孢杆菌液体制剂，该液体制剂包含根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液；优选地，该液体制剂包含的枯草芽孢杆菌活菌数≥1×1010CFU/mL。
6.一种枯草芽孢杆菌粉体制剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)向根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液中加入10％～70％(克/毫升)的硫酸铵水溶液和助滤剂，进行过滤；
(2)将滤饼在进风温度为120～180℃、进料速度为50～200转/分、出口温度为70～90℃的闪蒸干燥机中进行闪蒸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述过滤为向根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备的枯草芽孢杆菌发酵液中加入10％～70％(克/毫升)的硫酸铵水溶液和助滤剂，搅拌10～60分钟后静置10～120分钟，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为30～60℃，过滤压力为2～5kg/cm2。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述助滤剂选自碳酸钙、珍珠岩和硅藻土中的一种或几种；优选地，按照重量百分比计算，所述枯草芽孢杆菌发酵液包含1％～6％的助滤剂。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的制备方法制备的枯草芽孢杆菌粉体制剂；优选地，该粉体制剂包含的枯草芽孢杆菌活菌数≥1×1011CFU/g。
10.一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌液体制剂或根据权利要求9所述的枯草芽孢杆菌粉体制剂。
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