CN102132159A

CN102132159A - 鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102132159A
Application number: CN2010800023499A
Authority: CN
Inventors: 绳秀珍; 徐晓丽; 战文斌
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2030-08-03
Also published as: CN102132159B; CN101629955A; WO2011015131A1; CN101629955B

Abstract

本发明公开了一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或SuperPAPPen划线隔开。本发明采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的抗体，取病毒靶器官制备待检样品液，将待测样品液与固定有病原抗体的芯片孵育，再加荧光标记的特异性单抗探针，通过CCD扫描仪读取结果。该方法能同时检测多种样品或同一样品不同组织中淋巴囊肿病毒。

Description

说明书鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用技术领域本发明涉及海水养殖动物病原检测技术的改进，具体涉及一种用于检测鱼类淋巴囊肿病毒（Lymphocyst i s di sease virus , LCDV ) 的免疫检测芯片或微阵列及其制备方法与应用，其属于免疫学、病毒学及生物芯片交叉技术领域。背景技术鱼类淋巴囊肿病是一种慢性病毒病，患病鱼的表皮、鰭和尾部等处出现菜花样囊肿，影响其商品价值或导致鱼死亡。淋巴囊肿病的病原为淋巴囊肿病毒（LCDV) , 属于虹彩病毒科（Iridoviridae )。淋巴囊肿病流行地区较广，呈世界性分布，目前已知至少 42科 125种以上的海水、咸水和半咸水鱼类可被 LCDV感染。自 1997年牙鲆淋巴囊肿病在我国首次大规模暴发以来，我国山东、河北、广东、浙江等省养殖的石斑鱼、真鲷、美国红鱼、许氏平鈾、军曹鱼等均发生过此病，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。与其他的病毒病一样，鱼类淋巴囊肿病毒病缺乏有效的治疗药物。 LCDV感染具有潜伏期长的特点，使 LCDV极易随着亲鱼与鱼苗在不同地区间的交流而传播，因此，养殖生产中急需 LCDV的快速准确检测技术，以期达到早发现早预防的目的。

国内外检测鱼类病毒的方法大致包括电镜技术， PCR法， DNA探针原位杂交法，免疫荧光抗体技术，免疫组织化学技术，酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹技术等。但这些检测技术局限性大，灵敏度、特异性、准确性多不能兼顾，不能用于多样品同时并行检测。因此，建立一种适用于鱼类淋巴囊肿病毒的简便、快速、准确、多样品并行处理的检测诊断技术势在必行，而新发展起来的蛋白芯片技术为其提供了强有力的技术平台，微量化的反应既可节约昂贵的试剂又可结合动力学的快速分析，在蛋白质水平上提供了一个廉价快速的测试手段，在诊断领域具有相当广阔的应用前景。另外，鱼类淋巴囊肿病毒单克隆抗体的成功研制，为利用单克隆抗体建立鱼类淋巴囊肿病的免疫芯片检测诊断技术奠定了基础。发明内容针对上述现状，本发明的目的是提供一种能同时检测多种样品或同一样品不同组织中淋巴囊肿病毒的免疫检测芯片，用于海水养殖鱼类中 LCDV的快速、灵敏、准确的检测，以及进出口鱼类中 LCDV的检疫。

本发明的另一个目的是提供上述鱼类 LCDV免疫检测芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述免疫检测芯片在养殖鱼类 LCDV检测中的应用。本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其结构包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen划线隔开。 A液：渗透压小于 360mOsm/kg的低渗液； B液：吐温- 磷酸盐缓冲液（PBST ) ； C液： Cy3标记的鼠抗 LCDV的单克隆抗体（单抗）探针，探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的特异性抗 LCDV单抗（简称： LCDV单抗 B和单抗 C)，杂交瘤细胞的保藏号分别为： CCTCC一 C200419禾 P CCTCC— C200420 , 保藏日期： 2004年 12月 14日。 LCDV与该两株单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于病毒囊膜上。

本发明以现有技术的实际特点：其一，鱼类体内有免疫球蛋白一 IgM的形成，但血清中 IgM的标记程序较为复杂；其二，对海水养殖动物疾病的诊断是一个群体的概念，可以通过对多个个体的检测达到对群体做出诊断的目的。因此，本发明根据这些特点，采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的抗体，取待检个体病毒靶器官制备待检样品液，直接将待测样品液与固定有病原抗体的芯片孵育，再加荧光标记的特异性单抗探针，通过 CCD扫描仪读取结果。

鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

( 1 ) 抗体的制备及纯化

从患淋巴囊肿病的牙鲆体表肿瘤中提取 LCDV, 常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗 LCDV抗体。

复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株（LCDV单抗 B和单抗 C )，注射一定数量的杂交瘤细胞入小鼠腹腔生产腹水，得到大量高浓度、高特异性、高效价的鼠抗 LCDV单抗。

取亲和层析纯化后的 LCDV单抗 B和单抗 C，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠抗 LCDV单抗的抗体（兔抗鼠 Ig的抗体）。

使用 Amersham Phamacia Biotech 公司的亲禾口层析柱 ( HiTrap Protein G Sepharose Column) 纯化所得抗体。

( 2 ) Cy3标记的单克隆抗体探针的制备

按照 Amersham Phamacia Biotech 公司的产品说明书，使用荧光素 Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗 LCDV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。

( 3 ) 载玻片的预处理将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入 0.4 %的亲和硅烷的乙酸溶液中，调 pH至 4.5，室温作用 lh，双蒸水冲洗，晾干。

( 4 ) 琼脂糖凝胶基片的制备

配制 1.2 %的琼脂糖溶液，微波炉煮沸 3min，使其完全溶解，将 2mL琼脂糖溶液铺覆在 60 °C预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，玻片在 37 °C下过夜干燥；使用前用 0.02mol/L NaIO₄溶液室温下活化 30min，超纯水彻底冲洗 3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。

( 5 ) 抗体的固定

① 用 pH7.4的含 50 %甘油的磷酸盐缓冲液（PBS ) 稀释兔抗 LCDV抗体使其浓度为 0.5~0.0001 mg/mL; 稀释兔抗鼠 Ig的抗体使其浓度为 0.1mg/mL。

② 用点样仪将此抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，点样量为 50~70nL, 点直径为 500~600μιη。每张芯片两排四列共 8个 4 X 4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗 LCDV抗体，第四列所点样品为兔抗鼠 Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。 37 °C饱和湿度放置 2h，洗涤，晾干。

③ 在载玻片上点有抗体的区域滴加 3 %牛血清白蛋白封闭， 37°C饱和湿度放置 lh，洗涤，晾干， 4 °C密封保存，得到鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片。

本发明的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的应用，所述该应用步骤如下：

( 1 ) 用于检测的鱼类组织包括：鱼体表瘤状物、表皮、脾、胃、肠等，取样与 A 液约按 1 : 10 ( W/V) 的比例混合，匀浆，反复冻融 3~4次，超声破碎后，低温离心， 5000rpm, 15min，取上清作为检测样品，待检。

( 2 ) 将不同待检样品加到上述芯片的不同亚阵列中，加样量为 10μΙ7阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。37 °C饱和湿度放置 0.25~2h，洗涤，再加稀释的 C液（Cy3标记的鼠抗 LCDV单抗）， 10μΙ7阵列， 37 °C饱和湿度放置 0.25~2h，洗涤，晾干。

( 3 ) 激光扫描

上述检测芯片用晶芯 ®E_C0S_Can™ -100 CCD扫描仪扫描成像，激发波长为 532nm，检测波长为 585nm，荧光信号用 Lab-chipscanner 2.0软件分析。检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有 LCDV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无 LCDV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列阳性对照及质量控制点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，则检测结果为无效。

( 4 ) 病毒的定量检测及最低检测限

分离纯化后 LCD V稀释至 25.6 g/mL，再按二倍比稀释所得的 8个抗原浓度分别与载玻片上的 8 个亚阵列孵育，经抗体探针检测，扫描分析后结果如图 3所示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。以抗原浓度的对数为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在 0.8~12.8 g/mL范围内，相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，提示所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析。此抗体微阵列所能检测到的最低抗原浓度为 1.6 g/mL。

所述芯片载体具有经过亲和硅烷处理后，并用琼脂糖凝胶修饰的玻璃表面，该表面为三维多孔结构，经 NaI0₄活化后，可以使抗体以物理吸附和共价连接两种方式固定在其上，同时，其亲水环境还有利于保持固定在上面的抗体蛋白的活性。所述的抗体是兔抗 LCDV抗体、兔抗鼠 Ig的抗体，但不仅仅限于这两种抗体。

所用于点样的亲和层析纯化后兔抗 LCDV抗体最适浓度为 0.5mg/mL。

所述的待检样品加到芯片上后， 37°C饱和湿度放置 30min，玻片上加稀释的抗体探针后， 37°C饱和湿度下放置 30min。

所述芯片单张玻片点有 8个亚阵列，可以根据实际需要增加亚阵列数量，能够实现更多样品的同时检测。

本发明的优点在于可以同时检测多个样品或同一个体的多个不同组织中的 LCDV, 它结构简单，成本低廉，通量易于扩充，实现多样品的同时平行检测，增加了不同标本数据之间的可比性，可快速、准确、简便地检测多种养殖鱼类体内的 LCDV。对样品要求简单，少量样品即可满足检测需要，并大大简化了现有检测技术的样品处理步骤，甚至可以在不杀死养殖动物的情况下取材检测。同时由于阳性控制及阴性控制的设置及捕获抗体的重复点样，增加了检测结果的可靠性。另外免疫芯片反应相对较快，操作过程便捷，一般人员即可操作，并且能够相对定量检测病原，适用于养殖过程中病毒病的快速、准确的检测。附图说明图 1. 鱼类淋巴囊肿病毒免疫芯片结构示意图及点样分布图。其中， 1-芯片载体， 2- 琼脂糖凝胶层， 3-抗体微阵列， 4-芯片专用围栏或 Super PAP Pen划线， 5-标签区域。点样分布： ①含 50%甘油的 PBS，作为阴性对照； ②、 ③为兔抗 LCDV抗体； ④兔抗鼠 Ig 的抗体，作为阳性对照及固定对照等质量控制。图 2. 鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片检测不同来源鱼类样品中 LCDV的 CCD扫描图（扫描仪的荧光强度设定为 88 % )。 Al、 A2表明样品中未检出 LCDV; A3、 B3表明样品中 LCDV浓度较高； B2、 B4表明样品中含一定量的 LCDV, 但浓度较 A3、 B3低； A4、 B1表明样品中 LCDV含量较低。

图 3. 抗原浓度与信号强度的关系及此免疫芯片的检测限。所检测的抗原浓度依次为 25.6、 12.8、 6.4、 3.2、 1.6、 0.8、 0.4、 0.2 g/mL。以抗原浓度的对数值为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在 0.8~12.8 g/mL范围内，相对荧光信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例来详细说明本发明。本发明所用仪器及试剂如下：小型手动芯片点样系统（购自 Whatman公司）；晶芯 ®EcoScan^TM -100 CCD扫描仪（购自北京博奥生物公司）； Cy3抗体标记试剂盒（购自 GE公司）； HiTrap Protein G Sepharose Column (购自 GE公司）； 1640 (购自 GIBCO公司）；胎牛血清（购自 HYCLONE公司）；牛血清白蛋白（购自 SIGMA公司）； Tween-20 (购自 SIGMA公司）；二甲基亚砜（购自 SIGMA公司）。实施例 1 :

1. 抗体的制备及纯化

从患淋巴囊肿病毒病的牙鲆体表瘤状物中提取 LCDV, 常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗 LCDV抗体。

复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株单抗 B和单抗 C，注射一定数量的杂交瘤细胞入小鼠腹腔生产腹水，得到大量高浓度、高特异性、高效价的鼠抗 LCDV单抗。

取亲和层析纯化后的单抗 B和单抗 C混合，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠 Ig的抗体。

使用 Amersham Phamacia Biotech 公司的亲和层析柱 ( HiTrap Protein G Sepharose

Column) 纯化所得抗体。

2. Cy3标记的单克隆抗体探针的制备

按照 Amersham Phamacia Biotech 公司的 Cy3产品说明书，使用荧光素 Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗 LCDV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。

3. 载玻片的预处理将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的玻片浸入 0.4 % 的亲和硅烷的乙酸溶液中，调 pH至 4.5，室温作用 lh，双蒸水冲洗，晾干。

4. 琼脂糖凝胶基片的制备

配制 1.2 %的琼脂糖溶液，微波炉煮沸 3min完全溶解，将 2mL琼脂糖溶液铺覆在 60 °C 预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，载玻片在 37 °C下过夜干燥；使用前用 0.02mol/L NaIO₄溶液室温下活化 30min，超纯水彻底冲洗 3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。

5. 芯片结构设计及点阵分布

该芯片结构如图 1所示，包括芯片载体（1 )、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层（2)，琼脂糖凝胶层上固定有两排四列共 8个 4 X 4的抗体微阵列（3 )，点样量为 50-70nL，点直径为 500~600μιη。各个微阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen划线（4 ) 隔开。所述的芯片载体为标准载玻片，在玻片一端可以留出标签区域（5 )。

6. 抗体的固定

① 用 pH 7.4的含 50 %甘油的 PBS缓冲液稀释兔抗 LCDV抗体，使其浓度为 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001、 0.0005、 0.0001 mg/mL。

② 用点样仪将此不同浓度抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，每张芯片两排四列共 8个 4 X 4亚阵列，每个亚阵列为不同浓度的兔抗 LCDV抗体，各个亚阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。 37°C饱和湿度放置 2h，洗涤，晾干。

③ 在载玻片上点有抗体的区域滴加 3 %牛血清白蛋白进行封闭， 37 °C饱和湿度放置 lh，洗涤，晾干， 4 °C密封保存，得到鱼类 LCDV免疫检测芯片。实施例 2 : 步骤 1、 2、 3、 4、 5同实施例 1。

6.抗体的固定

① 用 pH 7.4 的含 50 %甘油的 PBS 缓冲液稀释兔抗 LCDV 抗体，使其浓度为

0.5mg/mL; 稀释兔抗鼠 Ig的抗体使其浓度为 0. 1mg/mL。

② 用点样仪将此抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，点阵分布如图 1所示，每张芯片两排四列共 8个 4 X 4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，其中，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液，作为阴性对照；第二、三列所点样品为兔抗 LCDV抗体；第四列所点样品为兔抗鼠 Ig的抗体作为阳性对照及固定对照等质量控制点。各个亚阵列之间用芯片专用围栏 Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。 37 °C饱和湿度放置 2h，洗涤，晾干。

③ 在载玻片上点有抗体的区域滴加 3 %牛血清白蛋白进行封闭， 37 °C饱和湿度放置 lh，洗涤，晾干， 4 °C密封保存，得到鱼类 LCDV免疫检测芯片。实施例 3 : 检测鱼类淋巴囊肿病毒采用的是夹心法。

步骤 1、 2、 3、 4、 5、 6同实施例 2。

7. 病原的检测

①取待检鱼类组织（表皮、鳃、胃或肠等），与 A液约按 1 : 10 ( W/V) 的比例混合，匀浆，反复冻融 3~4次，超声破碎后，低温离心， 5000rpm X 15min，取上清液作为检测样品，待检；

②将待检样品加入上述芯片同一载体不同亚阵列中，加样量为 10μΙ7阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。 37 °C饱和湿度孵育 15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min, 洗涤，在芯片上加稀释的 C液， 10μΙ7阵列， 37 °C饱和湿度放置孵育 15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min, 洗涤，晾干； ③激光扫描

上述检测芯片用晶芯 ®E_C0S_Can™ -100 CCD扫描仪扫描成像，激发波长为 532nm，检测波长为 585nm，荧光信号用 Lab-chipscanner 2.0软件分析。检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有 LCDV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无 LCDV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列阳性对照及固定点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，检测结果无效。实施例 4 : 抗原的定量分析及最低检测限：

取制备好的鱼类 LCDV免疫检测芯片，将分离纯化的 LCDV稀释至 25.6 g/mL，再按二倍比稀释所得的 8个抗原浓度分别与玻片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后，扫描结果利用计算机软件处理。结果显示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。以抗原浓度的对数值为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在 0.8~12.8g/mL范围内，相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，提示所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析。此抗体微阵列所能检测到的最低抗原浓度为 1.6 g/mL。实施例 5 : 鱼类 LCDV免疫检测芯片的特异性检测：

取正常鱼组织（鳃、胃、表皮等），经 PCR检测未感染 LCDV, 组织破碎后匀浆，反复冻融后超声破碎，低温沉降 10min，取上清，与鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后扫描，无荧光信号，证实所制备的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片与组织无交叉反应。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。工业实用性本发明为养殖鱼类病毒、细菌等各类病原的检测诊断提供了技术平台，适用于养殖过程中的疾病监控及水产动物的出入境检验检疫等，有着广阔的应用前景，能够有效避免养殖鱼类疾病的传播与流行。

Claims

权利要求书

1、一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其特征在于它包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层，琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen划线隔开。

2、根据权利要求 1所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其特征在于所述的芯片载体为标准载玻片，所述芯片载体具有经过亲和硅烷处理后，并用琼脂糖凝胶修饰的玻璃表面，该表面为三维多孔结构，经 NaI0₄活化后，可以使抗体以物理吸附和共价连接两种方式固定在其上。

3、根据权利要求 1或 2所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其特征在于所述的抗体是兔抗淋巴囊肿病毒抗体、兔抗鼠 Ig的抗体。

4、根据权利要求 1所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：

( 1 ) 抗体的制备

制备兔抗淋巴囊肿病毒抗体，兔抗鼠 Ig 的抗体，鼠抗淋巴囊肿病毒单克隆抗体（单抗)，亲和层析法纯化所得抗体；

(2) Cy3标记单克隆抗体探针的制备

将亲和层析纯化后的鼠抗淋巴囊肿病毒单抗用 Cy3标记，并过凝胶柱纯化；

( 3 ) 载玻片的预处理

将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入 0.4 %的亲和硅烷的乙酸溶液中，调 pH至 4.5，室温下作用 lh，双蒸水冲洗，晾干；

(4) 琼脂糖凝胶基片的制备

配制 1.2 %的琼脂糖溶液，微波炉煮沸 3min，使其完全溶解，将 2ml琼脂糖溶液铺覆在经 60°C预热的亲和硅烷处理过的清洁载玻片上；待琼脂糖凝固后，将玻片在 37°C下过夜干燥；使用前在室温下用 0.02mol/L NaI0₄溶液活化 30min，超纯水冲洗 3遍，用氮气流吹干，室温干燥处保存；

( 5 ) 抗体的固定

① 用 pH 7.4 的含 50%甘油的 PBS 缓冲液稀释兔抗淋巴囊肿病毒抗体，使其浓度为 0.5~0.0001mg/mL 稀释兔抗鼠 Ig的抗体，使其浓度为 O. lmg/mL;

②用点样仪将此抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量为 50~70nL，点直径为 500~600μιη。每张芯片两排四列共 8个 4 X 4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗淋巴囊肿病毒抗体，第

1 四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠 Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或 Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。 37°C饱和湿度放置 2h，洗涤，晾干；

③向载玻片上点有抗体的区域滴加 3 %牛血清白蛋白进行封闭， 37°C饱和湿度放置 lh，洗涤，晾干， 4°C密封保存，得到鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片。

5、根据权利要求 4所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于用 Cy3 标记亲和层析纯化后的鼠抗淋巴囊肿病毒单抗作为抗体探针，并使用兔抗鼠 Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。

6、根据权利要求 4所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于 Cy3 标记抗体探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的特异性抗淋巴囊肿病毒囊膜单抗 B和单抗〇。

7、根据权利要求 1所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片在养殖鱼类淋巴囊肿病毒检测中的应用。

8、根据权利要求 7所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的应用，其特征在于它包括如下步骤：

( 1 ) 用来检测的组织包括：鱼类体表瘤状物、表皮、胃、肠等，取样后与 A液约按 1 : 10 (W/V) 的比例混合，匀浆，反复冻融 3~4次，超声破碎后，低温离心， 5000rpmX 15min，取上清作为检测样品，待检；

(2)将不同待检样品加到上述芯片不同亚阵列中， 37°C饱和湿度放置 0.25~2h，洗漆，再加稀释的 Cy3标记的鼠抗淋巴囊肿病毒的单抗探针， 37°C饱和湿度放置 0.25~2h，洗涤，晾干；

( 3) 激光扫描

上述玻片用晶 ®E_COS_Can ^TM -100 CCD扫描仪扫描成像，图像用专业分析软件分析，根据荧光信号的强弱，得到样品中鱼类淋巴囊肿病毒含量的定性定量分析结果。

9、根据权利要求 8所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的应用，其特征在于使用夹心法检测鱼体内淋巴囊肿病毒，即所述抗体芯片与样品中的淋巴囊肿病毒反应形成的复合体，被高特异性的 Cy3标记的抗体探针所识别，在 532nm的激光下呈现绿色荧光。

10、根据权利要求 8所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的应用，其特征在于待检样品加到芯片上后， 37°C饱和湿度放置 30min，玻片上加稀释的荧光抗体后， 37°C饱和湿度放置 30min。

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