CN101629954B - 对虾白斑症病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对虾白斑症病毒免疫检测芯片，其结构包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个4×4的抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线隔开。本发明采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的多克隆抗体(多抗)，取待检个体的靶器官组织制备待检样品液，直接将待测样品液与固定有多抗的芯片孵育，以捕获抗原使其结合在芯片上，再加上荧光标记的特异性单抗探针，通过CCD芯片扫描仪读取结果。其优点在于能同时检测多个样品中的白斑症病毒，用于养殖生产中虾类/蟹类白斑症病毒病的快速、准确检测，及进出口虾类/蟹类中WSSV的检疫。
Description
技术领域
本发明涉及海水养殖动物病原检测技术的改进，具体涉及一种用于检测对虾白斑症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的免疫检测芯片或微阵列、制备方法及其应用，其属于免疫学、病毒学及生物芯片技术交叉领域。
背景技术
疾病严重威胁对虾养殖业的发展，各种病害给对虾养殖造成了重大损失，而病害控制中的不合理用药，造成耐药性、药物残留和在环境中的扩散问题，严重影响了食品安全和环境公共卫生，因此，养殖对虾疾病的早期准确检测诊断对疾病的预防和控制尤为重要。由白斑症病毒(WSSV)引起的白斑症病毒病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，导致很高的对虾死亡率，给对虾养殖业造成了巨大的损失。WSSV可以自然感染对虾(中国对虾、日本对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾、刀额新对虾等)、蟹类(天津厚蟹、日本大眼蟹、三疣梭子蟹等)、桡足类等，主要感染宿主的鳃、上皮、造血组织、皮下组织、淋巴器官等。
鉴于目前白斑症病毒病尚无有效的治疗方法，快速准确的病毒检测技术已成为各国学者研究的焦点之一。白斑症病毒病的诊断主要是依靠实验室内对白斑症病毒检测来确诊，常用检测技术有电镜技术，PCR法，DNA探针原位杂交法，免疫荧光抗体技术，免疫组织化学技术，酶联免疫吸附检测法，斑点免疫印迹技术等。电镜技术使用可靠但耗时长；PCR法灵敏度高，可用于无症状水产动物的病原检测，但易污染且易出现假阳性；DNA探针原位杂交法具有高度的特异性和敏感性，但是，应用同位素标记核酸探针作分子杂交有放射性，操作复杂，而非放射性标记探针往往敏感性较差；酶联免疫吸附检测法及斑点免疫印迹技术是目前常用的检测方法，但被检组织的内源酶会对其检测结果产生干扰，导致假阳性的出现。这些检测技术都存在一定的局限性，效率低，耗时长，实用性较差。因此，建立一种适用于对虾白斑症病毒的快速、准确、简便的检测诊断技术势在必行，以期达到早发现、早预防的目的，而新发展起来的生物芯片技术为其提供了强有力的技术平台，对虾白斑症病毒单克隆抗体的成功研制，为利用WSSV单克隆抗体建立对虾白斑症病毒病的免疫芯片检测诊断技术奠定了基础。白斑症病毒病多样品检验并行处理的免疫芯片技术，在对虾养殖过程中病毒的检测上具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述现状和对虾不具备获得性免疫功能的特点，本发明的目的是提供一种能同时检测多个样品中的白斑症病毒的免疫检测芯片，用于养殖生产中虾类/蟹类白斑症病毒病的快速、准确检测，及进出口虾类/蟹类中WSSV的检疫。
本发明的另一个目的是提供上述白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述免疫检测芯片在养殖对虾白斑症病毒检测中的应用。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种对虾白斑症病毒免疫检测芯片，其结构包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个4×4的抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线隔开。A液：渗透压小于360mOsm/kg的低渗液；B液：吐温-磷酸盐缓冲液(PBST)；C液：Cy3标记的鼠抗白斑症病毒单克隆抗体(单抗)探针，探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的鼠抗白斑症病毒核衣壳单抗D和鼠抗白斑症病毒囊膜单抗E(简称为：单抗D、E)，单抗D和E杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200422和CCTCC-C200421，保藏日期：2004年12月14日。
本发明以现有技术的实际特点：由于其一，对虾不具备获得性免疫功能，体内无抗体的形成，因此不能用间接法检测样品中的抗体；其二，对养殖对虾疾病的检测诊断是一个群体的概念，可以通过对多个个体的检测达到对群体做出诊断的目的。因此，本发明根据这些特点，采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的多克隆抗体(多抗)，取待检个体的靶器官组织制备待检样品液，直接将待测样品液与固定有多抗的芯片孵育，以捕获抗原使其结合在芯片上，再加上荧光标记的特异性单抗探针，通过CCD芯片扫描仪读取结果。
对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗体的获得及纯化
从患白斑症病毒病对虾的鳃等靶器官中提取WSSV，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗WSSV抗体。
复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株单抗D和单抗E，注射小鼠腹腔生产腹水，得到大量高效价、高特异性的鼠抗WSSV单抗。
取亲和层析纯化后的单抗D和单抗E，混合后，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠抗WSSV单抗的抗体(兔抗鼠Ig的抗体)。
使用Amersham Phamacia Biotech公司的亲和层析柱(HiTrap Protein G SepharoseColumn)纯化所得抗体。
(2)Cy3标记的抗体探针的制备
按照Amersham Phamacia Biotech公司的产品说明书，使用荧光素Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗WSSV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。
(3)载玻片的预处理
将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温作用1h，双蒸水冲洗，晾干。
(4)琼脂糖凝胶基片的制备
配制0.6～1.4％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2mL琼脂糖溶液铺覆在60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，载玻片在37℃下过夜干燥；使用前用0.02mol/L NaIO4溶液室温下活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。
(5)抗体的固定
①用pH7.4的含10％～60％甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释兔抗WSSV抗体，使其浓度为0.5～0.0001mg/mL；稀释兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量为50～70nL，点直径为500～600μm。每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置0.5～2.5h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域分别滴加不同的封闭液(1～5％牛血清白蛋白、5％脱脂奶粉、1％明胶、甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸)进行封闭，37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
本发明的对虾WSSV免疫检测芯片的应用，所述该应用的步骤如下：
(1)用于检测的样品包括：虾/蟹等的鳃、血淋巴等或桡足类等，取样，与A液约按1∶10(W/V)的比例混合，匀浆，再沉降5～10min，取上清作为检测样品，待检。
(2)将待检样品加到上述芯片的不同亚阵列中，加样量为10μL/阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，再加稀释的C液(Cy3标记的鼠抗WSSV单抗)，10μL/阵列，37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，晾干。
(3)激光扫描
上述检测芯片用晶
EcoScanTM-100CCD扫描仪扫描成像，激发波长为532nm，检测波长为585nm，荧光信号用Lab-chipscanner 2.0软件分析。
检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有WSSV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无WSSV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列质量控制点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，检测结果为无效。
(4)病毒的定量检测及最低检测限
分离纯化的WSSV稀释至25.6μg/mL，再按二倍比稀释所得的8个抗原浓度分别与检测芯片上的8个亚阵列孵育，经抗体探针检测，扫描分析后结果如图3所示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。信号强度分析显示相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，提示所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析。此抗体微阵列所能检测到的最低抗原浓度为0.8μg/mL。
所述芯片载体具有经过亲和硅烷处理后，并用琼脂糖凝胶修饰的玻璃表面，该表面为三维多孔结构，经NaIO4活化后，可以使抗体以物理吸附和共价连接两种方式固定在其上，同时，其亲水环境还有利于保持固定在上面的抗体蛋白的活性。所述的抗体是兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，但不仅仅限于这两种抗体。
所述的琼脂糖浓度为1.2％为宜。
所述的磷酸盐甘油缓冲液甘油浓度为50％。
所用于点样的亲和层析纯化后兔抗WSSV抗体最适浓度为0.1mg/mL。
所述的用点样仪将抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片表面的不同区域点样，其放置温度为37℃，饱和湿度下放置2h。
所述的封闭液为3％牛血清白蛋白，封闭时间为60min。
所述的待检样品加到芯片上后，37℃饱和湿度放置15～30min；芯片上加稀释的抗体探针后，37℃饱和湿度下放置15～30min。
所述芯片单张玻片点有8个亚阵列，可以根据实际需要增加亚阵列数量，能够实现更多样品的同时检测。
本发明的优点在于可以同时检测多个样品或同一个体的多个不同组织中的WSSV，它结构简单，成本低廉，通量易于扩充，实现多样品的同时平行检测，增加了不同标本数据之间的可比性，可简便、快速、准确地检测水产养殖动物如：虾类和蟹类中的WSSV。对样品要求简单，少量样品即可满足检测需要，并大大简化了现有检测技术的样品处理步骤。同时由于阳性控制及阴性控制的设置及捕获抗体的重复点样，增加了实验结果的可靠性。反应相对较快，整个检测过程不超过2h，操作过程便捷，一般人员即可操作，并且能够相对定量检测病原，适用于对虾、蟹类等的养殖过程中白斑症病毒病的快速、简便、准确的检测及水产动物的出入境检验检疫等。
附图说明
图1对虾白斑症病毒免疫检测芯片结构示意图及点样分布图。
1-芯片载体，2-琼脂糖凝胶层，3-抗体微阵列，4-芯片专用围栏或Super PAP Pen划线，5-标签区域。点样分布：①含50％甘油的PBS，作为阴性对照；②、③为兔抗WSSV抗体；④兔抗鼠Ig的抗体，作为阳性对照及固定对照等质量控制。
图2抗原浓度与信号强度的关系及免疫芯片的检测限。
a-h所检测的抗原浓度依次为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/mL。
图3：用对虾白斑症病毒免疫检测芯片检测不同来源对虾样品中WSSV的CCD扫描图(扫描仪的荧光强度设定为88％)。
A1、A2表明样品中WSSV浓度较高，A3、A4、B1、B2、B4表明样品中未检出WSSV，B3表明样品中WSSV含量较低。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来详细说明本发明。
本发明所用仪器及试剂如下：
小型手动芯片点样系统(购自Whatman公司)；晶EcoScanTM-100CCD扫描仪(购自北京博奥生物公司)；Cy3抗体标记试剂盒(购自GE公司)；HiTrap Protein GSepharose Column(购自GE公司)；1640(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；牛血清白蛋白(购自SIGMA公司)；Tween-20(购自SIGMA公司)；二甲基亚砜(购自SIGMA公司)。
实施例1：
1.抗体的获得及纯化
从白斑症病毒病的对虾靶器官提取WSSV，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗WSSV抗体。
复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株单抗D和单抗E，注射小鼠腹腔生产腹水，得到大量高效价、高特异性的鼠抗WSSV单抗。
取亲和层析纯化后的单抗D和单抗E，混合后，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠Ig的抗体。
使用Amersham Phamacia Biotech公司的亲和层析柱(HiTrap Protein G SepharoseColumn)纯化所得抗体。
2.Cy3标记的抗体探针的制备
按照Amersham Phamacia Biotech公司的Cy3产品说明书，使用荧光素Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗WSSV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。
3.载玻片的预处理
将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温作用1h，双蒸水冲洗，晾干。
4.芯片结构设计
该芯片结构如图1所示，包括芯片载体(1)、铺覆于芯片载体(1)上的琼脂糖凝胶层(2)，琼脂糖凝胶层(2)上固定有两排四列共8个4×4的抗体微阵列(3)，点样量为50-70nL，点直径为500～600μm。各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线(4)隔开。所述的芯片载体为标准载玻片，在玻片一端可以留出标签区域(5)。
5.琼脂糖凝胶基片的制备
配制0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min完全溶解，将2mL琼脂糖溶液铺覆在60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，玻片在37℃下过夜干燥；使用前用0.02mol/L NaIO4溶液室温下活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的PBS甘油缓冲液稀释兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在不同浓度琼脂糖修饰的载玻片表面的不同区域点样，芯片结构及点阵分布如图1所示，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
实施例2：
步骤1、2、3、4同实施例1。
5.琼脂糖凝胶基片的制备
配制1.2％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min完全溶解，将2mL琼脂糖溶液铺覆在60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，玻片在37℃下过夜干燥；使用前用0.02mol/L NaIO4溶液室温下活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的分别含10％、20％、30％、40％、50％、60％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在载玻片表面的不同区域点样，每张芯片两排三列共6个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，为含不同浓度甘油的PBS缓冲液稀释的抗体。其中第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
实施例3：
步骤1、2、3、4、5同实施例2。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗WSSV抗体，使其浓度为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001mg/mL。
②用点样仪将不同浓度抗体稀释液在载玻片表面的不同区域点样，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列为不同浓度的兔抗WSSV抗体，各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
实施例4：
步骤1、2、3、4、5同实施例2。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在载玻片表面的不同区域点样，点阵分布如图1所示，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度分别放置0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
实施例5：
步骤1、2、3、4、5同实施例2。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在载玻片表面的不同区域点样，点阵分布如图1所示，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域分别滴加1％～5％牛血清白蛋白、5％脱脂奶粉、1％明胶、甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸等封闭液进行封闭，37℃饱和湿度放置15min、30min、45min、60min、90min、120min，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
实施例6：
检测对虾白斑症病毒采用的是夹心法。
步骤1、2、3、4、5同实施例2。
6.抗体的固定
①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗WSSV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL。
②用点样仪将此抗体稀释液在载玻片表面的不同区域点样，点阵分布如图1所示，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗WSSV抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。
③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
7.病原的检测
①取待检样品(虾/蟹等的鳃或血淋巴或桡足类等)，与A液约按1∶10(W/V)的比例混合，匀浆，再沉降5-10min，取上清液作为检测样品，待检。
②将待检样品加入上述芯片同一载体不同亚阵列中，加样量为10μL/阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。37℃饱和湿度孵育15min、30min、45min、60min、90min、120min，洗涤，在玻片上加稀释的C液，10μL/阵列，37℃饱和湿度放置孵育15min、30min、45min、60min、90min、120min，洗涤，晾干。
③激光扫描
上述检测芯片用晶
EcoScanTM-100CCD扫描仪扫描成像，激发波长为532nm，检测波长为585nm，荧光信号用Lab-chipscanner 2.0软件分析。
检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有WSSV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无WSSV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列阳性对照及质量控制出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，检测结果无效。
实施例7：
抗原的定量分析及最低检测限：
取制备好的对虾WSSV免疫检测芯片，将纯化的WSSV稀释至25.6μg/mL，再按二倍比稀释所得的8个抗原浓度分别与玻片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后，扫描结果利用计算机软件处理。结果显示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。信号强度分析显示相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，由此可见所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析，根据标准曲线，即可算出待检样品的病毒含量。此抗体微阵列所能检测到的病毒最低浓度为0.8μg/mL。
实施例8：
对虾白斑症病毒免疫检测芯片的特异性检测：
取正常虾/蟹鳃、血淋巴等，经PCR检测未感染WSSV，组织匀浆后沉降，取上清，与对虾白斑症病毒免疫检测芯片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后扫描，无荧光信号，证实所制备的白斑症病毒检测芯片与组织无交叉反应。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
（1）抗体的制备及纯化
制备兔抗白斑症病毒抗体，兔抗鼠Ig的抗体，鼠抗白斑症病毒单克隆抗体，亲和层析法纯化所得抗体；
（2）Cy3标记单克隆抗体探针的制备
将亲和层析纯化后的鼠抗白斑病毒单抗用Cy3标记，并过凝胶柱纯化；
（3）载玻片的预处理
将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温下作用1h，双蒸水冲洗，晾干；
（4）琼脂糖凝胶基片的制备
配制0.6～1.4％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2ml琼脂糖溶液铺覆在经60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁载玻片上；待琼脂糖凝固后，将玻片在37℃下过夜干燥；使用前在室温下用0.02mol/L NaIO4溶液活化30min，超纯水冲洗3遍，用氮气流吹干，室温干燥处保存；
（5）抗体的固定
① 用pH 7.4的含10%～60%甘油的PBS缓冲液稀释兔抗白斑症病毒抗体，使其浓度为0.5～0.0001mg/mL、稀释兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL；
② 用点样仪将此抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量为50～70nL，点直径为500～600μm；每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗白斑症病毒抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照；各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元；37℃饱和湿度放置0.5~2.5h，洗涤，晾干；
③向载玻片上点有抗体的区域滴加1～5％牛血清白蛋白，或5％脱脂奶粉，或1％明胶，或甘氨酸，或谷氨酸，或酪氨酸进行封闭，37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。
2.根据权利要求1所述的对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于用Cy3标记亲和层析纯化后的鼠抗白斑症病毒单抗作为抗体探针，并使用兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。
3.根据权利要求1所述的对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于Cy3标记的抗体探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的鼠抗白斑症病毒核衣壳单抗D和鼠抗白斑症病毒囊膜单抗E。
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120926 |
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