CN102105592A

CN102105592A - 使脂质糖基化的方法

Info

Publication number: CN102105592A
Application number: CN2009801287400A
Authority: CN
Inventors: 卡斯滕·M·克拉夫; R·梅尔达尔; 勒内·米凯尔森
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: International N&H Denmark ApS
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2009-07-16
Publication date: 2011-06-22
Also published as: BRPI0915937A2; AU2009275223A1; WO2010010463A9; WO2010010463A3; US20110223283A1; GB0813581D0; AU2009275223B2; EP2315840A2; AR072834A1; WO2010010463A2; MX2011000821A

Abstract

本发明公开了用于使具有游离羟基基团的脂质糖基化的方法，所述方法包括使所述脂质接触单糖部分源和转糖苷酶。特别地，本发明公开了在食品中原位生产糖基化脂质的方法。

Description

使脂质糖基化的方法

技术领域

本发明涉及酶的新用途。特别地，本发明涉及转糖苷酶在多个新应用中的用途，特别是在向脂质转移葡萄糖以及具有改进乳化性质的食品中的用途。

背景技术

转葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20)(也称作D-葡糖基转移酶或α-葡糖苷酶)可作为TGL-500^TM商购自Danisco/Genencor。此酶可源自真菌源，特别是黑曲霉(Aspergillus niger，Genbank登录号D45356.1和SwissProt登录号P56526.1)。

上述转葡糖苷酶的主要应用是生产异麦芽低聚糖(IMO)，其为小α-1，6支链低聚糖，参见‘Novel α-Glucosidase from Aspergillus nidulans with Strong Transglycosylation Activity’N.(Kato et al.(2002))。通过应用转葡糖苷酶由麦芽糖/麦芽糊精生产可商购的IMO产品：终产品包含异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖的混合物。TGL-500^TM在与α-D-葡萄低聚糖一起温育时催化水解反应和转移反应。转移反应最常发生在C-6位的羟基基团，从而由D-葡萄糖生产异麦芽糖，由潘糖生产麦芽糖。

此前已发现由转葡糖苷酶催化的α-烷基葡糖苷一步合成法(Busquet，M.-P.et al.(1998).Monsan，P.et al.)。来自Talaromyces duponti和黑曲霉的转葡糖苷酶已被用于催化葡糖基单元从α-1，4连接的碳水化合物供体转移到烷基醇，例如1-丁醇，从而产生烷基葡糖苷。

糖脂和磷脂是小麦面粉内源极性脂质组分的主要成分。特别地，糖脂在面包制造期间充当表面活性剂和/或乳化剂。糖脂对面包的体积、质地和老化具有积极影响(Pomeranz，Y.(1971))。因此，糖脂在面包制造期间可用作乳化剂和/或表面活性剂，以改进面包的体积、质地和老化速率。糖脂主要改进烘焙产品的乳化性质。

发明内容

第一方面，本发明包括用于使具有游离羟基(-OH)基团的脂质糖基化的方法，所述方法包括使所述脂质接触本文定义的单糖部分(monosaccharide moiety)源(source)和本文定义的转糖苷酶。

第二方面，本发明包括通过使具有游离羟基(-OH)基团的脂质接触本文定义的单糖部分源和本文定义的转糖苷酶，将单糖部分转移到所述脂质的方法。

第三方面，本发明包括用于改进食品乳化性质的方法，所述方法包括使本文定义的所述食品或食品中间品接触如本文定义的单糖部分源、本文定义的脂质和本文定义的转糖苷酶。

第四方面，本发明包括用于在食品中原位生产糖基化脂质的方法，所述方法包括使本文定义的所述食品或食品中间品接触本文定义的单糖部分源，本文定义的脂质以及本文定义的转糖苷酶。

第五方面，本发明包括本文定义的转糖苷酶在将单糖部分转移到本文定义的具有游离羟基(-OH)基团的脂质中的应用。

第六方面，本发明包括本文定义的转糖苷酶在改进食品乳化性质中的应用，其中所述食品包括本文定义的具有游离羟基(-OH)基团的脂质和本文定义的单糖部分源。

其他方面，本发明包括用于改进食品的组合物和通过上述方法形成的食品。下文将更详细地阐述这些内容。

附图说明

图1说明了在实施例1中TGL-500在体外产生的单葡糖基甘油单酯(MGMG)和二葡糖基甘油单酯(DGMG)的量；

图2说明了在实施例1中TGL-500在体外产生的单葡糖基甘油二酯(MGDG)的量；

图3说明了实施例2的生面团在发酵后的单半乳糖基/葡糖基甘油单酯(MGMG)含量(％)；

图4说明了实施例2的生面团在发酵后的二半乳糖基/葡糖基甘油单酯(DGMG)含量(％)；

图5说明了实施例2的生面团在发酵后的单半乳糖基/葡糖基甘油二酯(MGDG)含量(％)；

图6说明了实施例2的生面团在发酵后的二半乳糖基/葡糖基甘油二酯(DGDG)含量(％)；

图7说明了实施例2的面包屑中单半乳糖基/葡糖基甘油单酯(MGMG)含量(％)；

图8说明了实施例2的面包屑中二半乳糖基/葡糖基甘油单酯(DGMG)含量(％)；

图9说明了实施例2的面包屑中单半乳糖基/葡糖基甘油二酯(MGDG)含量(％)；

图10说明了实施例2的面包屑中二半乳糖基/葡糖基甘油二酯(DGDG)含量(％)；

图11说明了实施例3中通过应用麦芽糊精作为底物，由TGL-500在体外产生的MGMG和DGMG；和

图12说明了通过应用蔗糖作为底物，由TGL-500在体外产生的MGMG和DGMG。

具体实施方式

下文描述了本发明的优选实施方式。除非另有特别说明，所述优选实施方式应用于本发明的所有方面，包括本文描述和请求保护的所有方法、应用和产品。

糖基化作用/转糖苷酶

一方面，本发明包括用于使脂质糖基化的方法，所述方法包括使所述脂质接触本文定义的单糖部分源和本文定义的转糖苷酶。

在本申请中，术语“糖基化作用”和“糖基化”是指在单糖部分异头位的半缩醛羟基和脂质受体分子上游离羟基的氧之间形成糖苷键，并随后脱去水分子。所形成的糖苷键可以是α-或β-糖苷键。

本发明是基于本文定义的转糖苷酶能够将单糖部分，特别是葡萄糖部分转移到本文定义的脂质的惊人发现。通过应用脂质，特别是甘油单酯和甘油二酯作为生面团体系中葡萄糖部分的受体底物，在原位产生甘油糖脂：预期此类化合物在生面团体系中发挥强乳化性质。已知小麦面粉包含非常少量的半乳糖基修饰的甘油单酯和甘油二酯，例如单半乳糖基甘油单酯和二半乳糖基甘油单酯，这些甘油酯具有很好的乳化作用(参见Carter et al.(1956)，Carter et al.(1961)和Carter et al.(1961)，以及Pomeranz，Y.(1987))。

在本申请中，术语“转糖苷酶”旨在涵盖能够将本文定义的单糖部分从一个分子转移到另一个分子的任何酶。当所述单糖部分是葡萄糖部分时，使用术语“转葡糖苷酶”。优选所述转糖苷酶是转葡糖苷酶。

如上文概述，已知转糖苷酶(特别是转葡糖苷酶)能够将单糖部分转移到其他碳水化合物：但是，此前并未发现此类酶能够将单糖部分转移到脂质。

在一个实施方式中，所述转糖苷酶归类于酶分类(Enzyme Classification)(E.C.)3.2.1.20。

在一个实施方式中，所述转糖苷酶归类于碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)database)的糖苷水解酶家族31。此数据库描述于http://www.cazy.org/和Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)。此分类系统基于结构和序列特征，而非底物特异性：由于序列和折叠类似性之间存在直接关系，此分类：(i)与其单独的底物特异性相比，更好地反映了这些酶的结构特征，(ii)有助于揭示这些酶之间的进化关系，和(iii)提供了用于推导机制信息的便捷工具。在此分类中，糖苷水解酶(EC 3.2.1.-)是分布广泛的酶类，其水解两个或更多碳水化合物之间的糖苷键，或者碳水化合物和非碳水化合物部分之间的糖苷键。关于糖苷水解酶(糖苷酶和转糖苷酶)分类的更多描述可见于Henrissat B(1991)，Henrissat B，Bairoch A(1993)，Henrissat B，Bairoch A(1996)，Davies G，Henrissat B(1995)and Henrissat B，Davies GJ(1997)。

在另一个实施方式中，可根据其进行的反应，从功能上来描述转糖苷酶或转葡糖苷酶。在本发明中，可使用在实施例1所述条件下将糖部分转移到脂质的酶。

可以通过其在体外将糖部分从适合的单糖源转移到C10甘油单酯的能力来确定适合用于本发明的酶。

可用于检测本发明中使用的候选酶，以确定其是否能够将糖部分转移到脂质的试验实例包括以下步骤：

将候选酶与C10甘油单酯的溶液以及适合的单糖源一起温育；和

通过液相色谱-质谱分析确定糖是否被转移到甘油单酯。

例如，可在实施例1所述条件下，以候选酶代替TGL-500进行此类试验。

在一个实施方式中，所述转糖苷酶可得自于或得自于活的生物体。适合的转糖苷酶来自于细菌或真菌。优选转糖苷酶来自于真菌。

在一个实施方式中，所述转糖苷酶来自于真菌源，或与来自于真菌源的转葡糖苷酶具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

在优选的实施方式中，所述转糖苷酶源自曲霉菌(Aspergillus)种(species)，特别是选自黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、烟曲霉(Aspergullus fumigatus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的曲霉菌种，或者与源自曲霉菌种的转葡糖苷酶具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

在特别优选的实施方式中，所述转糖苷酶是SEQ ID No.1编码的黑曲霉转葡糖苷酶，或与其具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

所述转葡糖苷酶可经过翻译后修饰，例如切除信号肽或糖基化的修饰。

氨基酸序列

在本发明中可使用如本文定义的能够将单糖部分转移到脂质的转糖苷酶的氨基酸序列，特别是具有下文所述SEQ ID No.2的氨基酸序列的转糖苷酶。

本文中使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”含义相同。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”含义相同。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”含义相同。

可从适当的来源制备/分离氨基酸序列，或通过合成制备氨基酸序列，或通过使用重组DNA技术制备。

本发明使用的蛋白质可与其他蛋白，特别是其他酶，例如淀粉酶、蛋白酶或脂肪酶结合使用。因此，本发明还涵盖了包含酶组合的组合物，其中所述组合包括用于本发明的转糖苷酶和其他酶，所述其他酶可以是，例如本文描述的另一种转糖苷酶。在下文部分中讨论了这方面的内容。

序列同一性/序列同源性/变体/责源物/衍生物

本发明还包括与本文限定的氨基酸序列，或具有本文定义的特定性质的多肽具有一定序列同一性或序列同源性的多肽的应用。特别地，本发明包括与下文所述SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有一定序列同一性的肽，或其同源物。在本文中，术语“同源物”是指与目标氨基酸或目标核苷酸序列具有序列同一性的实体。在本文中，术语“同源性”可等同于“序列同一性”。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留了转糖苷酶功能活性和/或增强了转糖苷酶活性的多肽。

在本文中，所采用的同源序列包括与目标序列具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。同源物通常将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可将同源性视为类似性(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本文中，优选以术语序列同一性表示同源性。

在特别优选的实施方式中，所述转糖苷酶是具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示序列的黑曲霉转葡糖苷酶，或与其具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性的序列。

可通过目测进行序列同一性比对，但更常借助于易于获得的序列比对程序进行。这些商用计算机程序使用复杂的比较算法来比对两条或更多的序列，所述序列最好地反映可能导致所述两条或更多序列之间差异的进化事件。因此，这些算法利用了对同一性或类似氨基酸的比对加分，并对间隙插入、间隙延伸和不类似氨基酸比对罚分的记分系统进行操作。比较算法的记分系统包括：

i)在每次插入空位时给出罚分(空位罚分)，

ii)在现存空位每延伸额外一位时给出罚分(延伸罚分)，

iii)对相同氨基酸的比对给出高分，并且

iv)对不相同氨基酸的比对给出不同的分数。

大多数比对程序允许更改空位罚分。然而，在使用此类软件进行序列比对时，优选使用默认值。

根据所谓替换矩阵(substitution matrix)的记分矩阵确定对不相同氨基酸的比对给出的分数。此类替换矩阵提供的分数反映了在进化过程中一个氨基酸被另一个氨基酸取代的可能性不同，并且依赖于待取代氨基酸的物理/化学性质的事实。例如，极性氨基酸被另一种极性氨基酸取代的可能性大于被疏水性氨基酸取代的可能性。因此，记分矩阵将对相同的氨基酸给出最高的分数，对不相同但近似的氨基酸给出较低的分数，而对不相同且不近似的氨基酸给出更低的分数。最常用的记分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff et al.(1978)，Jones et al.(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff and Henikoff(1992))和Gonnet矩阵(Gonnet et al.(1992))。

用于进行此类比对的适合的计算机程序包括，但不限于Vector NTI(Invitrogen Corp.)，以及ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(Higgins DG & Sharp PM(1988)、(1992)，Thompson et al.(1994)，Larkin et al(2007))。可由www.expasy.org的ExPASy蛋白质组学服务器选择不同的比对工具。可进行序列比对的软件的另一个实例是可得自于美国国家生物技术信息中心主页的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上找到，并且首次描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215；403-410。

一旦由软件产生比对，即可计算相似性％或序列同一性％。软件通常将其作为序列比对的一部分进行，并产生数值结果。

在一个实施例中，优选使用ClustalW软件进行序列比对。优选使用以下配对比对参数进行ClustalW比对：

替换矩阵	Gonnet 250
		空位开放罚分：	20
空位延伸罚分：	0.2
		空位结束罚分：	无

ClustalW2可得自于，例如欧洲生物信息研究所的EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk，工具栏-序列分析-ClustalW2。目前，ClustalW2工具的具体网址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。

因此，本发明还包括如本文定义的蛋白质的任意氨基酸序列的变体、同源物和衍生物的应用，特别是如下文定义的SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的那些或由SEQ ID No.1编码的那些。

所述序列，特别是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4，也可具有氨基酸残基的删除、插入或取代，从而产生沉默突变或导致功能等价物。只要保留了所述物质的次级结合活性，可基于残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质上的类似性进行谨慎的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有类似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

本发明还包括保守取代(本文中使用的取代和替换均表示现有氨基酸残基与可选残基之间的相互交换)，其可发生在所谓同类取代(like-for-like substitution)，例如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等。也可发生非保守取代，即从一类残基到另一类残基，或涉及并入非天然氨基酸，例如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

可通过，例如碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)、脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)的分类之内进行保守取代。

也可通过非天然氨基酸进行替换，所述非天然氨基酸包括α^*和α-二取代^*氨基酸、N-烷基氨基酸^*、乳酸^*、天然氨基酸的卤化衍生物，例如三氟酪氨酸^*、p-Cl-苯丙氨酸^*、p-Br-苯丙氨酸^*、p-I-苯丙氨酸^*、L-烯丙基-甘氨酸^*、β-丙氨酸^*、L-α-氨基丁酸^*、L-γ-氨基丁酸^*、L-α-氨基异丁酸^*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸^*、L-蛋氨酸砜^*、L-正亮氨酸^*、L-正缬氨酸^*、p-硝基-L-苯丙氨酸^*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸^*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-Phe^*、五甲基-Phe^*、L-Phe(4-氨基)^#、L-Tyr(甲基)^*、L-Phe(4-异丙基)^*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)^*、L-二氨基丙酸和L-Phe(4-苯甲基)^*。出于上述讨论(涉及同源或非保守取代)的目的，使用符号^*表示衍生物的疏水性质，而使用^#表示衍生物的亲水性质，^#*表示两性性质。

变体氨基酸序列可包括可插入到序列任意两个氨基酸残基之间的适合的间隔子基团；除了氨基酸间隔子，如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，所述间隔子基团还包括烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。本领域技术人员还可充分理解另一类变体，其涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，所用“类肽形式”是指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而不是α-碳原子上。类肽形式的肽的制备方法在本领域是公知的，例如Simon RJ et al.(1992)、Horwell DC.(1995)。

在优选的实施方式中，所述转葡糖苷酶是由具有SEQ ID No.1所示序列的核酸编码的具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示氨基酸序列的黑曲霉转葡糖苷酶，或与其具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的酶。

一方面，优选本发明中使用的酶为纯化的形式的。术语“纯化的”是指给定的成分以高水平存在。理想地，该成分是存在于组合物中的主要活性成分。

量/浓度

本发明糖基化方法中所需的转糖苷酶的量没有特别限制。

在一个实施方式中，本发明糖基化方法中需要有效量的转糖苷酶。特别地，在一个实施方式中，本发明提供了用于使具有游离羟基基团的脂质糖基化的方法，所述方法包括使所述脂质接触单糖部分源和有效量的转糖苷酶。

在一个实施方式中，本发明的食品包含有效量的转糖苷酶。特别地，在一个实施方式中，本发明提供了用于改进食品的组合物，其包含：如本文定义的转糖苷酶；如本文定义的单糖部分源；和如本文定义的脂质。

在本申请中，术语“有效量”是指能够使可测量量的单糖部分转移到脂质受体分子的转糖苷酶的量。

可使用液相色谱-质谱法(LC-MS)测量转移到脂质受体分子的单糖部分的量。

例如，可在反应期间的不同时间点测量反应混合物中单糖源量的减少，或糖脂量的增加。

转糖苷酶可以以任意浓度存在，只要该浓度能够实施将单糖部分，特别是葡萄糖部分转移到脂质的上述所需功能。

在一个实施方式中，转糖苷酶以每克脂质受体0.02-200个转葡糖苷酶活性单位(U)的浓度存在，优选0.08-50U，且最优选0.2-20U。

在一个实施方式中，转糖苷酶以每摩尔脂质受体0.0001-1个转葡糖苷酶活性单位(U)的浓度存在，优选0.0005-0.2U，且最优选0.001-0.1U。

在本文中，一个转葡糖苷酶活性单位(U)被定义为当底物为麦芽糖时，每分钟产生1微摩尔潘糖所需的酶量。

被转移的单糖

由转糖苷酶转移到脂质的单糖部分的性质不是特别重要。所述单糖部分可具有D-或L-构型。此外，所述单糖部分可以是醛糖或酮糖部分。

适合地，所述单糖部分可具有3-8个碳原子，优选4-6个，且更优选5或6个碳原子。在一个实施方式中，所述单糖部分是己糖部分(即具有6个碳原子)，其实例包括己醛糖，例如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖，和己酮醣，例如果糖和山梨糖。优选地，所述己糖部分是葡萄糖部分。

在另一个实施方式中，所述单糖部分是戊糖部分(即具有5个碳原子)，例如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。优选地，戊糖部分是阿拉伯糖或木糖部分。

单糖源

本发明待转移的单糖部分源不是特别重要，只要其包含通过在转移过程期间被酶水解的糖苷键与所述源分子其他部分相连的单糖部分。

然而，优选本发明的单糖源是高级糖(即二糖、寡糖或多糖)，其包含通过糖苷键连接在一起的多于一个的单糖部分，酶的作用在于水解高级糖中的一个或多个糖苷键，并将单糖转移到脂质。在这方面，形成高级糖的单糖部分可相同或不同，并可各自独立地具有D-或L-构型。

形成高级糖的单糖部分可各自独立地为醛醣或酮糖部分，并可具有相同或不同数量的碳原子。适合地，各单糖部分可具有3-8个碳原子，优选4-6个，且更优选5或6个碳原子。

在一个实施方式中，形成高级糖的单糖部分是己糖部分，其实例包括己醛糖，例如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖，和己酮醣，例如果糖和山梨糖。优选地，此类高级糖的己糖部分包括一个或多个葡萄糖部分。在一个特别优选的实施方式中，此类高级糖的所有己糖部分都是葡萄糖部分。

在另一个实施方式中，形成高级糖的单糖部分是戊糖部分，例如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。优选地，此类高级糖的戊糖部分是阿拉伯糖部分或木糖部分。

形成高级糖的单糖部分通过糖苷键连接在一起。当所述单糖部分是己糖部分时，所述糖苷键可以是1-α，1′-α糖苷键、1，2′-糖苷键(其可以是1-α-2′或1′-β-2′糖苷键)、1，3′-糖苷键(其可以是1-α-3′或1-β-3′糖苷键)、1，4′-糖苷键(其可以是1-α-4′或1-β-4′糖苷键)、1，6′-糖苷键(其可以是1-α-6′或1-β-6′糖苷键)、或其任意组合。

在一个实施方式中，高级糖包括2个单糖单元(也就是二糖)。适合的二糖的实例包括麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽酮糖(isomaltulose)、乳糖、蔗糖、纤维二糖、黑曲霉糖、曲二糖、海藻糖(trehalose)和蔗糖异构糖(trehalulose)。

在另一个实施方式中，高级糖包括链中的3-10个单糖单元(也就是寡糖)，所述链可为直链或支链。优选所述寡糖包含3-8个单糖单元，更优选3-6个单糖单元。适合寡糖的实例包括麦芽糊精、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、松三糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖和纤维七糖。

在另一个实施方式中，高级糖是多糖，其包含通过糖苷键连接在一起的至少10个单糖单元。此类多糖通常包含至少40个单糖单元，例如至少100个，如至少200个，包括至少500个，例如至少1000个，如至少5000个，例如10000个，如至少50000个，例如100000个单糖单元。

此类多糖中的单糖单元可以连接成链，可以为支链或直链：在本文中，此类多糖被称作“链状多糖”。或者，单糖单元也可连接成环(其可具有，例如10-200，优选10-100，更优选10-50，且最优选10-20个单糖单元)，其可具有一个或多个(优选1或2个)侧链，每个侧链包含1-6个(优选1-4，更优选1或2个)单糖单元：在本文中，此类多糖被称作“环状多糖”。

在一些实施方式中，所述多糖包含10-500000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含100-1000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含1000-10000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含10000-100000个单糖单元。在一些实施方式中，所述多糖包含40-3000，优选200-2500个单糖单元。

此类多糖的实例包括淀粉及其衍生物(例如阳离子或阴离子、氧化或磷酸化的淀粉)、直链淀粉、支链淀粉、糖原、纤维素或其衍生物(例如羧甲基纤维素)、海藻酸或其盐或衍生物、聚葡萄糖、果胶、普鲁兰多糖(pullulan)、角叉菜胶、刺槐豆胶，以及瓜耳胶及其衍生物(例如阳离子或阴离子瓜耳胶)。

在一个实施方式中，所述多糖包括淀粉。淀粉是葡萄糖聚合物，其中吡喃葡萄糖单元通过α-连接结合。其由直链淀粉和支链淀粉的混合物构成。直链淀粉由通过1，4′-α-糖苷键连接在一起的数百个葡萄糖分子的直链组成。与此不同，支链淀粉是由数千个葡萄糖单元组成的支链分子，其主链包含1，4′-α-糖苷键，但每隔约25个葡萄糖单元具有1，6′-α-糖苷分枝。

在一个实施方式中，所述多糖包括糖原。糖原是在动物中发现的多糖，其由葡萄糖残基的支链构成。

在一个实施方式中，所述多糖包括纤维素。纤维素是由通过1，4′-β-糖苷键结合在一起的数千个葡萄糖单元形成的聚合物。

优选的单糖部分源包括蔗糖、麦芽糖和麦芽糊精。特别优选的单糖部分源是蔗糖。

下表2中列出了本领域已知转糖苷酶，以及此类转糖苷酶能够水解的高级糖(因此是用于转移单糖部分的潜在单糖源)的实例。

表2

在另一个实施方式中，所述单糖源可以是单糖磷酸酯。可通过，例如下文所述的三磷酸腺苷(ATP)与单糖的磷酸转移酶催化反应形成此类化合物。

在一个实施方式中，单糖部分源和/或脂质优选不是小麦面粉。

在一个实施方式中，单糖源与脂质的比例足以在反应混合物中提供1∶1的单糖∶脂质比例。各单糖可被转移到一个脂质以形成一个糖脂。因此，作用于单糖源的每个水解反应，可由一个脂质分子形成一个糖脂分子。

在另一个实施方式中，提供相对于脂质的量为过量的单糖，从而使单糖∶脂质比例大于1∶1。可使用过量的单糖源驱动反应平衡向生产糖脂的方向移动。

优选单糖∶脂质比例至少为1∶1，优选至少1.5∶1，至少2∶1，至少2.5∶1或至少3∶1。

可在反应期间的不同时间点添加额外的单糖源以使得单糖过量，并使整个反应中的反应平衡有利于糖脂的生产。

在另一个实施方式中，提供相对于单糖的量为过量的脂质，从而使单糖∶脂质比例小于1∶1。

优选单糖∶脂质比例小于1∶1，优选小于0.6∶1，小于0.5∶1，小于0.4∶1或小于0.3∶1。

在一个实施方式中，单糖部分源的添加量可以是面粉的10重量％-20重量％，例如面粉的8重量％-12重量％(烘焙百分比)。

脂质受体

在本发明中，所述脂质可以是脂溶性(亲脂性)的天然存在或合成分子，其具有游离羟基(-OH)基团，并且能够与转移的单糖部分形成糖苷键。适合的脂质实例包括脂肪酸、脂肪醇、单甘油脂和多甘油脂(特别是甘油单酯和甘油二酯)、糖脂和磷脂等。在本发明的范围内，所述脂质受体可包括脂质的混合物。

本发明中的脂质可以不是甘油三酯，例如菜籽油或黄油。甘油三酯不是用于本发明转移反应的受体分子。甘油三酯可被例如脂肪酶部分水解，从而形成可用于本发明转移反应的受体分子(脂质)。

所述“亲脂性”是指可溶于非极性有机溶剂。优选所述非极性有机溶剂具有一个或多个以下性质：

(a)低介电常数(例如，小于20，优选小于10的介电常数)；和/或

(b)弱或零偶极矩(例如，小于1D，优选小于0.5D的偶极矩)；和/或

(c)没有或基本没有氢键合基团(O-H和/或N-H)。

此类非极性有机溶剂的实例包括脂肪烃，例如戊烷、己烷、庚烷，脂环烃，例如环己烷，芳香烃，例如苯、甲苯或二甲苯，醚类，例如乙醚，和卤代烃，例如二氯甲烷、三氯甲烷(氯仿)和1，2-二氯乙烷。

所述脂质通常包含一个或多个直链或支链，饱和或不饱和的烃基(例如烷基、烯基或炔基)基团，优选所述烃基具有至少4个碳原子，优选6个碳原子，例如至少10个碳原子，例如至少12，至少14，至少16，至少18，至少20或至少22个碳原子。优选所述烃基基团是烷基基团。或者，所述烃基基团包含烯基基团，其可具有例如1-5个双键，优选1、2或3个双键。

在一个实施方式中，所述脂质包含一个或多个直链或支链，饱和或不饱和的烃基(例如烷基、烯基或炔基)，优选所述烃基具有至少4-40个碳原子，优选6-40个碳原子，例如至少10-40个碳原子，例如至少12-40，至少14-40、16-40、18-40、20-40或22-40个碳原子，更优选10-24，特别是12-22，特别是14-18，如16-18个碳原子。优选所述烃基基团是烷基基团。或者，所述烃基基团包含烯基基团，其可具有例如1-5个双键，优选1、2或3个双键。

在一个实施方式中，所述脂质包括一个或多个直链或支链，饱和或不饱和的酰基基团，即式R-C(＝O)-的基团，其中R是烃基基团。所述酰基基团通常具有至少4-40个碳原子，优选6-40个碳原子，例如至少10-40个碳原子，例如至少12-40，至少14-40、16-40、18-40、20-40或22-40个碳原子，更优选10-24，特别是12-22，特别是14-18，如16-18个碳原子。优选所述酰基基团是烷酰基基团。或者，所述酰基基团包含烯酰基基团，其可具有例如1-5个双键，优选1、2或3个双键。

酰基基团的实例包括：饱和酰基基团，例如丁酰基(丁酰)、己酰基(己酰)、辛酰基(辛酰)、癸酰基(癸酰)、十二烷酰基(月桂酰)、十四烷酰基(肉豆蔻酰)、十六烷酰基(棕榈酰)、十八烷酰基(硬脂酰)、二十烷酰基(花生四烯酰)、二十二碳酰基(山嵛酰)和二十四碳酰基(lignoceroyl)基团，和不饱和酰基基团，例如顺式-十四烷-9-烯酰基(肉豆蔻烯酰基)、顺式-十六烷-9-烯酰基(棕榈烯酰基)、顺式-十八烷-9-烯酰基(油烯基)、顺，顺式-9，12-十八烷二烯酰基(亚油烯基)、顺，顺，顺式-9，12，15-十八碳三烯酰基(亚麻烯基)和顺，顺，顺，顺式-5，8，11，14-二十碳五烯酰(花生四烯酰)基团。

下文描述了适合作为本发明受体的一些典型脂质类型。

在优选的实施方式中，所述脂质为单甘油脂(monoglycerolipid)或多甘油脂(polyglycerolipid)。在本文中，术语“单甘油脂或多甘油脂”的定义为包含通过酯键与一个或多个酰基基团(并且任选地与本文定义和例示的其他额外基团，例如糖部分)共价结合的一个或多个甘油部分的化合物。酰基链的典型和优选长度如上文定义和例示。

所述单甘油脂或多甘油脂必须具有至少一个游离羟基(-OH)基团，以使得能够发生单糖转移。在本发明中，优选所述游离羟基基团存在于所述分子的甘油部分上。然而，在侧链(例如连接的糖部分)上具有一个或多个游离羟基基团的单甘油脂或多甘油脂也包含在本发明的范围之内。

在优选的实施方式中，所述脂质包含通过酯键与一个或多个酰基基团共价结合的一个甘油部分，所述酰基的典型和优选长度如上文的定义和例示。任选地，甘油部分也可与本文定义和例示的其他基团，例如糖部分结合。在本文中，将此类化合物称作“单甘油脂”，或简称为“甘油脂”。甘油脂主要由单取代、二取代和三取代的甘油构成，其中最为熟知的是甘油的脂肪酸酯(三酰甘油)，也被称作甘油三酯。

其他亚类的代表为甘油糖苷(glycosylglycerols)，其特征在于存在通过糖苷键与甘油连接的一个或多个糖残基。在这方面，所述糖残基可以是如本文定义和例示的单糖、二糖、寡糖或多糖。因此，在本发明的范围内，转糖苷酶能够将另外的单糖部分转移到已经与单糖结合的甘油脂(即单糖甘油脂)，从而形成与两个单糖结合的甘油脂(即二糖甘油脂)。在这方面，两个单糖可与甘油骨架上两个单独的OH基团结合，或相互结合以组成与甘油部分上的一个OH基团相连的二糖部分。

在可选的实施方式中，所述脂质为二甘油脂(diglycerolipid)。在本文中，术语“二甘油脂”是指具有通过醚键彼此共价结合的两个甘油部分(即双甘油)，其中至少一个甘油部分通过酯键与一个或多个酰基基团共价结合的脂质，所述酰基的典型和优选长度如上文的定义和例示。在这方面，所述两个甘油部分可通过任意可能基团的醚键结合：双甘油单元的实例包括如下所示的α，α′-双甘油、α，β-双甘油、β，β-双甘油和环式双甘油，其中优选α，α′-双甘油。任选地，所述脂质还可包含可与本文定义和例示的其他基团，例如糖部分。

在可选的实施方式中，所述脂质为多甘油脂。在本文中，术语“多甘油脂”是指具有通过醚键彼此共价结合的两个以上(优选3-10，更优选3或4个)甘油部分，其中至少一个甘油部分与一个或多个酰基基团共价结合的脂质，所述酰基的典型和优选长度如上文的定义和例示。在这方面，所述甘油部分可通过任意可能基团的醚键结合。任选地，所述脂质还可包含可与本文定义和例示的其他基团，例如糖部分。

在优选的实施方式中，所述脂质受体为甘油单酯或甘油二酯。在本文中，术语“甘油单酯”(也称作单酰甘油)是指具有通过酯键与单个甘油部分(所述甘油部分的其他两个OH基团为游离的，从而与单糖形成糖苷键)共价结合的一个酰基基团的化合物。类似地，在本文中，术语“甘油二酯”(也称作二酰甘油)是指具有通过酯键与甘油分子(所述甘油部分的其他OH基团为游离的，从而与单糖形成糖苷键)共价结合的两个酰基基团的化合物。

此类甘油单酯和甘油二酯的酰基基团可相同或不同。此外，在本发明的范围内，所述脂质受体可包含甘油单酯和/或甘油二酯的混合物。

所述酰基基团可存在于甘油分子三个碳原子的任意一个上。因此，在本发明的范围内，所述脂质受体可包含1-单酰甘油、2-单酰甘油、1，2-二酰甘油或1，3-二酰甘油。

适合的甘油单酯和甘油二酯的酰基基团可具有4-40个碳原子，优选6-40个碳原子，例如8-30个碳原子，特别是10-24个碳原子，例如10、12、14、16、18、20、22或24个碳原子。优选酰基基团具有10-22个，优选14-18个碳原子。所述酰基基团可彼此独立地为直链或支链。

适合的甘油单酯和甘油二酯的酰基基团可为饱和或不饱和的。不饱和的酰基基团可具有例如1-5个双键，优选1、2或3个双键。

在另一个实施方式中，所述脂质受体为甘油糖脂(glycoglycerolipid，也称作糖基甘油酯glycosylglyceride)。在本文中，术语“甘油糖脂”在用于限定脂质受体分子时，是指包含通过酯键与一个或多个酰基基团(其典型和优选长度如上文的定义和例示)共价结合的单个甘油部分，并且具有通过糖苷键与所述甘油部分连接的一个或多个单糖部分的脂质，只要其包含至少一个游离羟基基团，以使得能够发生转移。甘油糖脂上存在多于一个单糖部分时，单糖可与甘油骨架上的不同氧原子结合，或彼此结合以组成与甘油部分上一个氧原子连接的二糖、寡糖或多糖部分，或其任意组合。

脂肪酰基(包括脂肪酸)是通过乙酰-CoA引物与丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA基团的链延长而合成的不同分子组。脂肪酰基结构代表复杂脂质的主要脂质结构单元，因此是生物脂质的最主要基本分类之一。碳链可以是饱和或不饱和的，并可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团相连。脂肪酰基的实例包括源自花生四烯酸的二十碳脂肪酸衍生物(eicosanoids)，其包括前列腺素、白细胞三烯和血栓素(thromboxane)。脂肪酰基分类中的其他主要脂质类型是脂肪酯和脂肪酰胺。脂肪酯包括重要的生化中间产物，例如蜡酯、脂肪酰硫酯辅酶A衍生物、脂肪酰硫酯ACP衍生物和脂肪酰肉碱。所述脂肪酰胺包括N-酰基乙醇胺，例如花生四烯酸乙醇胺。

所述脂肪酰基通常包括直链或支链，饱和或不饱和的酰基基团，即式R-C(＝O)-的基团，其中R是烃基基团。所述酰基基团通常具有4-40个碳原子，优选6-40个碳原子，例如至少10-40个碳原子，例如至少12-40，至少14-40、16-40、18-40、20-40或22-40个碳原子，更优选10-24，特别是12-22，特别是14-18，如16-18个碳原子。优选所述酰基基团是烷酰基基团。或者，所述酰基基团包含烯酰基基团，其可具有例如1-5个双键，优选1、2或3个双键。

普遍存在于自然界中的甘油磷脂，也被称作磷脂，是细胞脂质双层中的关键成分，并且参与代谢和信号转导。可基于真核细胞和真细菌中甘油骨架sn-3位极性头基团的性质，或者古细菌中甘油骨架sn-1位极性头基团的性质，将甘油磷脂细分成不同的类。生物膜中发现的甘油磷脂的实例有：磷脂酰胆碱(也称作PC或GPCho，和卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)、磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺和N-酰基溶血磷脂酰乙醇胺。除了充当细胞膜的主要成分以及细胞内蛋白和细胞间蛋白的结合位点之外，真核细胞中的一些甘油磷脂，例如磷脂酰肌醇和磷脂酸，是膜衍生的第二信使的前体或膜衍生的第二信使本身。这些羟基基团中的一个或两个通常被长链脂肪酸(链中的碳原子数通常如上文所述)酰化，但在原核生物中，也有与烷基连接和与1Z-烯基连接的(缩醛磷脂)甘油磷脂，以及二烷基醚变体。

例如胆固醇及其衍生物的固醇脂，以及甘油磷脂和鞘磷脂是膜脂的重要成分。还包含相同的稠合四环核结构的类固醇具有如激素和信号转导分子的不同生物作用。C18类固醇包括雌激素家族，而C19类固醇包括雄激素，例如睾丸激素和雄酮。C21亚类包括孕激素，以及糖皮质激素和盐皮质激素。包括不同形式维生素D的脂溶性类固醇衍生物(secosteroids)的特征在于核结构B环的裂解。固醇的其他实例为胆汁酸及其结合物，其在哺乳动物中为胆固醇的氧化衍生物并在肝脏中合成。

糖脂描述了脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容结构的化合物。在糖脂中，糖取代了存在于甘油脂和甘油磷脂中的甘油骨架。最常见的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖磷脂A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其由多至七个脂肪酰基链衍生。大肠杆菌(E.coli)生长所需的最小脂多糖是Kdo₂-脂质A，这是由两个3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化的葡糖胺的六酰化二糖。

在可选的实施方式中，所述脂质受体为溶血磷脂。溶血磷脂包含具有通过酯键与甘油氧原子共价结合的唯一酰基基团(如以上所定义和例示)的甘油部分，以及与另一个甘油氧原子共价结合以形成磷脂的磷酸基团：因此，所述溶血磷脂具有位于剩余甘油碳原子上的游离OH基团。适合的溶血磷脂包括溶血磷脂酰胆碱(也称作溶血PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)、磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺和N-酰基溶血磷脂酰乙醇胺。可通过水解相应磷脂上的一个酯键原位形成溶血磷脂。

在一个实施方式中，单糖源与脂质的比例足以在反应混合物中提供1∶1的单糖∶脂质比例。各单糖可被转移到一个脂质以形成一个糖脂。因此，对于单糖源的各水解反应，可由一个脂质分子形成一个糖脂分子。

可在反应期间的不同时间点添加额外的单糖源以确保单糖过量，并使整个反应中的反应平衡有利于糖脂的生产。

优选单糖∶脂质比例小于1∶1，优选小于0.6∶1，小于0.5∶1、小于0.4∶1或小于0.3∶1。

在一个实施方式中，脂质的添加量不高于(up to)面粉重量的10重量％，例如不高于面粉重量的3重量％，1.5重量％或不高于1重量％(烘焙百分比)。

糖脂产物

一个或多个单糖部分向脂质的转糖苷酶介导转移产生糖脂产物。在本文中，术语“糖脂”包括具有(优选通过糖苷键，但不限于此)与脂质上的氧原子共价结合的一个或多个单糖部分的任何脂质(如上文定义和例示)。当糖脂产物上存在多于一个的单糖部分时，所述单糖部分可与脂质上的分离氧原子直接结合。或者和/或此外，单糖部分可彼此结合以组成与脂质上的一个氧原子连接的二糖、寡糖或多糖部分。

在优选的实施方式中，所述糖脂产物是甘油糖脂(也称作糖基甘油酯)。在本文中，术语“甘油糖脂”在用于限定产物时，是指包含通过酯键与一个或多个酰基基团(其典型和优选长度如上文的定义和例示)共价结合的单个甘油部分，并且具有通过糖苷键与所述甘油部分连接的一个或多个单糖部分的脂质。所述产物可(并且通常确实)具有优选位于一个或多个单糖部分上的游离羟基基团。甘油糖脂产物上存在多于一个的单糖部分时，单糖可与甘油骨架上的不同氧原子结合，或彼此结合以组成与甘油部分上一个氧原子连接的二糖、寡糖或多糖部分，或其任意组合。因此，在本发明的范围内，转糖苷酶可将其他单糖部分转移到甘油糖脂底物以产生具有额外单糖部分的另一个甘油糖脂。

在可选的实施方式中，所述脂质为二甘油糖脂(glycodiglycerolipid)。在本文中，术语“二甘油糖脂”是指具有通过醚键彼此共价结合的两个甘油部分(即双甘油)，其中至少一个甘油部分通过酯键与一个或多个酰基基团(所述酰基的典型和优选长度如上文的定义和例示)共价结合，并且具有通过糖苷键与双甘油骨架上的氧原子共价结合的一个或多个单糖部分的脂质。形成双甘油骨架的所述两个甘油部分可通过任意可能基团的醚键结合：双甘油单元的实例包括如上文所示的α，α′-双甘油、α，β-双甘油、β，β-双甘油和环式双甘油，其中优选α，α′-双甘油。

在另一个实施方式中，所述糖脂是聚甘油糖脂(glycopolyglycerolipid)。在本文中，术语“聚甘油糖脂”是指具有通过醚键彼此共价结合的两个以上(优选3-10，更优选3或4个)甘油部分，其中至少一个甘油部分与一个或多个酰基基团(所述酰基的典型和优选长度如上文的定义和例示)共价结合，并且具有通过糖苷键与聚甘油骨架上的氧原子共价结合的一个或多个单糖部分的化合物。在这方面，所述甘油部分可通过任意可能基团的醚键结合。

在优选的实施方式中，单糖部分向甘油单酯或甘油二酯的转移产生的产物选自单葡糖基甘油单酯、多葡糖基甘油单酯(例如，二葡糖基甘油单酯、三葡糖基甘油单酯)、单葡糖基甘油二酯、多葡糖基甘油二酯(例如，二葡糖基甘油二酯、三葡糖基甘油二酯)或其混合物。如上文所述，当转移到脂质受体的单糖部分多于一个时，所述单糖部分可与甘油氧原子，或另一个单糖，或其任意组合结合。

在一个实施方式中，从反应混合物分离所述糖脂产物(优选甘油糖脂)。从反应混合物分离糖脂产物允许产物用于各种应用，特别地，可在一些食品、一些洗衣和清洁应用中添加纯化或分离的糖脂，以避免糖基转移反应中的其他反应物和产物污染和可能的副反应。可通过多种常规技术中的一种或多种分离所述产物，所述常规技术包括溶剂提取、蒸馏、结晶、清洗和沉淀。

在一个实施方式中，从反应混合物分离(或可选地)，然后纯化所述糖脂产物(优选甘油糖脂)。纯化从反应混合物分离的糖脂产物改进了产物的质量，使其更适合用于各种应用，特别地，可在一些食品以及一些洗衣和清洁应用中添加纯化或分离的糖脂。可通过多种常规技术的一种或多种纯化所述产物，所述常规技术包括色谱、溶剂提取、沉淀、蒸馏和结晶。

分离和/或纯化的

一方面，优选本发明的糖脂产物为分离的形式。术语“分离的”是指糖脂产物至少基本不包含至少一种在反应混合物中与所述糖脂产物结合的其它成分。

一方面，优选本发明的糖脂产物为纯化的形式。术语“纯化的”是指给定的成分以高水平存在。理想地，该成分是存在于组合物中的主要成分。优选其存在水平为至少约90％，或至少约95％，或至少约98％，其中所述水平是在相对于目标总组合物的干重/干重基础上测定的。

糖脂的原位生产

在本发明的优选方面，在组合物，特别是食品或食品中间品组合物(如下文定义)或洗衣组合物中原位进行糖基化。优选向组合物的其他组分中添加转糖苷酶、单糖源和脂质中的至少一种。更优选添加这些成分中的两种，且最优选向组合物中添加所有三种组分。然而，在本发明的范围内，组合物的一种或多种其他成分可部分或完全地作为单糖源、脂质或二者。

食品中的原位生产

因此，另一方面，本发明包括用于在食品或食品中间品组合物中原位生产糖基化脂质的方法，所述方法包括使本文定义的所述食品或食品中间品接触本文定义的单糖部分源、本文定义的脂质和本文定义的转糖苷酶。

在本发明的一方面，优选产品为烘焙产品(如下文定义)。此外，优选食品中间品为生面团(dough)。

在本发明的此方面，优选单糖部分源和/或脂质不是小麦面粉。

在本发明的此方面(以及下文所述的其他烘焙应用)，优选单糖部分源是蔗糖。由于蔗糖比麦芽糖便宜很多，在烘焙应用中，蔗糖是比麦芽糖更适合的供体底物。此外，尽管不希望被理论束缚，但认为酵母的蔗糖发酵比麦芽糖发酵更稳定。

在本发明的一些方面，可向食品添加过量的单糖源，例如蔗糖，以充当食品中的甜味剂，并提供足以用于糖基化反应的单糖源。在这些方面，添加到食品或食品中间品的单糖源的量应足以提供用于糖基化反应的单糖源，并使食品足够的甜。因此，所添加的单糖源的量取决于食品的理想甜度。

因此，在本发明的此方面，单糖部分源的添加量不高于30重量％，例如不高于25重量％，20重量％，15重量％，12重量％，8重量％或5重量％(烘焙百分比)。在本发明的一些方面，单糖源的添加量为约10重量％至约20重量％，例如约8重量％至约12重量％。在一些方面，单糖部分源可小于5重量％。

在本发明的此方面，优选所述脂质选自甘油单酯或甘油二酯。脂质的添加量可不高于10重量％，例如不高于3重量％，1.5重量％或1重量％(烘焙百分比)。在一些方面，所添加的脂质可小于1重量％。

烘焙产品中成分的百分比可表示为烘焙百分比。烘焙百分比是指面粉的重量等于100％。所有的其他成分按面粉重量的比例计算。由成分的重量除以总面粉的重量再乘以100＝成分％。如果有多于一种类型的面粉，则所添加的所有类型的面粉的总重量相加在一起等于100％。

洗衣组合物中的原位应用

另一方面，本发明包括用于在洗衣组合物中原位生产糖基化脂质的方法，所述方法包括使本文定义的转糖苷酶接触本文定义的单糖部分源和本文定义的脂质。

在本发明的此方面，所述洗衣组合物包括一种或多种转糖苷酶、单糖源和/或脂质。

所述洗衣组合物可进一步包含脂肪酶(E.C.3.1.1)。所述洗衣组合物进一步包括含有一种或多种转糖苷酶、单糖源和/或脂质的染剂(stain)。所述染剂可包含甘油三酯和/或甘油二酯和/或甘油单酯。所述染剂可位于表面上例如织物上，因此，所述洗衣组合物可包含表面例如织物。

在一个实施方式中，洗衣组合物包含如本文定义的转糖苷酶、单糖源和包含甘油二酯和/或甘油单酯的染剂。通过转糖苷酶将单糖部分转移到脂质，并产生糖脂。

在一个实施方式中，所述染剂包含甘油三酯，且所述洗衣组合物还包含脂肪酶。脂肪酶对甘油三酯的水解提供了甘油二酯和/或甘油单酯源。通过转糖苷酶将单糖部分转移到甘油二酯和/或甘油单酯，形成糖脂。

在一个实施方式中，将甘油三酯、甘油二酯或甘油单酯转化成糖脂有助于从织物除去包含脂质的染剂。

在一个实施方式中，所添加的或在洗衣组合物中原位产生的糖脂有助于从织物除去包含脂质的染剂。

组合

根据本发明，可将转糖苷酶(特别是转葡糖苷酶)与一种或多种其他活性剂组合使用。所述组合在组合物特别是在食品中一起使用时可提供包括协同作用在内的很多优点。

具体地，根据本发明，可将转糖苷酶(特别是转葡糖苷酶)与作为活性剂的一种或多种其他酶组合使用。所述组合在组合物特别是在食品中一起使用时可提供包括协同作用在内的很多优点。

在一个实施方式中，所述其他酶是另一种转糖苷酶(特别是转葡糖苷酶)，以便将两种(或更多)不同的转糖苷酶(特别是转葡糖苷酶)组合使用。尽管不希望被理论束缚，但一种转葡糖苷酶可催化一个葡萄糖部分转移到甘油单酯受体，而另一种转葡糖苷酶可催化葡糖基部分转移到所得糖基甘油单酯，从而延长甘油单酯的葡聚糖链。

在一个实施方式中，所述其他酶是糖苷酶(E.C.3.2.1)。尽管不希望被理论束缚，认为将糖苷酶与本发明转糖苷酶组合的特别优点在于糖苷酶能够水解较长链的高级糖的糖苷键，产生较短链的高级糖(特别是二糖和寡糖)，而较短链的高级糖的单糖部分会比较长链的高级糖的单糖部分更易于转移到脂质。特别地，所述糖苷酶可包括淀粉酶，例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)或β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。此类淀粉酶能够将淀粉水解成较短链的寡糖，例如麦芽糖：与从原始淀粉分子相比，葡萄糖部分从麦芽糖到脂质的转移更为容易。

在一个实施方式中，所述其他酶是己糖基转移酶(E.C.2.4.1)。尽管不希望被理论束缚，认为将己糖基转移酶与本发明转糖苷酶组合的特别优点在于己糖基转移酶能够从本发明转糖苷酶通常无活性的化合物转移单糖部分，从而形成其他化合物，例如本发明转糖苷酶能够起作用从而将单糖部分转移到脂质的单糖或高级糖(特别是二糖和寡糖)。此外，尽管不希望被理论束缚，认为葡糖基转移酶和其他己糖基转移酶能够将一个或多个葡糖基部分转移到一个或多个葡糖基部分，所述葡糖基部分已存在于脂质上，或此前通过本发明转糖苷酶转移到脂质上，从而延长脂质上的葡聚糖链。

在另一个实施方式中，所述其他酶是羧酸脂水解酶(E.C.3.1.1)。尽管不希望被理论束缚，认为将羧酸脂水解酶与本发明转糖苷酶组合的特别优点在于羧酸脂水解酶能够将甘油三酯(其缺少接受单糖部分必须的游离OH基团)部分水解成本发明的优选脂质受体分子，甘油单酯和甘油二酯。特别地，羧酸脂水解酶可包含羧酸酯酶(E.C.3.1.1.1)。

在另一个实施方式中，所述其他酶是磷酸转移酶(E.C.2.7.1)。尽管不希望被理论束缚，认为将磷酸转移酶与本发明的转糖苷酶组合的特别优点在于可生成带负电的甘油糖脂作为具有改性性质的终产物。磷酸转移酶能够转移到例如麦芽糖的葡萄糖部分，随后通过转糖苷酶转移到脂质，产生带电的乳化剂。或者，磷酸转移酶本身也可将磷酸转移到甘油糖脂。或者，可将磷酸基团转移到甘油骨架上的另一个游离OH。特别优选的磷酸转移酶实例是归类于E.C.2.7.1.61、2.7.1.63、2.7.1.79和2.7.1.142的那些。

适合与本发明转糖苷酶组合的其他类型酶的实例包括氧化酶(E.C.1.1.3)和O-酰基转移酶(特别是归类于E.C.2.3.1.43的那些)。

在一个实施方式中，本发明的洗衣组合物可包含本发明转糖苷酶与一种或多种其他酶的组合，所述其他酶例如蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶，和/或其组合。所选酶的性质通常应与所选洗涤剂相容(例如，最佳pH，与其他酶或非酶成分的相容性等)，并且所述酶应当以有效量存在。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括来自动物、植物或微生物的那些。化学修饰或蛋白工程化突变体也是适合的。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如微生物碱性蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的那些，如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如美国专利No.6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的胰蛋白酶)和镰刀菌(Fusarium)蛋白酶(参见例如WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体，但并不限于此。适合的商购蛋白酶包括Alcalase

Savinase

Esperase

和Kannase^TM(Novozymes，前Novo Nordisk A/S)；Maxatase

Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect

Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(GenencorInternational，Inc.)。

脂肪酶：所述其他酶可以是能够水解羧酸酯键以释放羧酸的脂肪酶(EC 3.1.1)。脂肪酶的实例包括三酰甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)、半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)和脂蛋白脂肪酶A2(EC 3.1.1.34)，但不限于此。更具体地，适合的脂肪酶包括来自毛霉(Mucor miehei)、镰孢菌(F.venenatum)、柔毛腐质霉(H.lanuginosa)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、尖孢廉孢菌(F.oxysporum)的脂肪酶，来自异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)的糖脂酶(例如GRINDAMYL^TM POWERBake 4050(Danisco A/S))，及其变体、同源物和衍生物。适合的脂肪酶包括来自于细菌或真菌的那些。化学修饰或蛋白工程化突变体也是包括在内。有用脂肪酶的实例包括，但不限于来自腐质霉属(Humicola，又名嗜热真菌属，Thermomyces)，例如柔毛腐质霉(H.lanuginosa，又名疏绵状嗜热丝孢菌，T.lanuginosus)(参见例如EP 258068和EP 305216)和特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)，斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌株SD 705(参见例如WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如Dartois et al.(1993))，嗜热脂肪杆菌芽孢(B.stearothermophilus)(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)。可用于制剂的其他脂肪酶变体包括描述于，例如以下文献的那些：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105。一些商购的脂肪酶包括Lipolase

和Lipolase

Ultra(Novozymes，前Novo Nordisk A/S)。

聚酯酶：适合的聚酯酶包括，但不限于WO 01/34899(Genencor International，Inc.)和WO 01/14629(Genencor International，Inc.)中描述的那些，并可以与本文讨论的其他酶的任意组合的形式包括。

淀粉酶：所述组合物可包括淀粉酶，例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC 3.2.1.3)。这些可包括来自细菌或真菌的淀粉酶，还包括化学修饰或蛋白工程化突变体。可商购的淀粉酶包括，例如Duramyl

Termamyl^TM、Fungamyl

和BAN^TM(Novozymes，前Novo NordiskA/S)、Rapidase

和Purastar

(Genencor International，Inc.)、LIQUEZYME^TM、NATALASE^TM、SUPRAMYL^TM、STAINZYME^TM、FUNGAMYL和BAN^TM(Novozymes A/S)、RAPIDASE^TM、PURASTAR^TM和PURASTAROXAM^TM(Genencor International Inc.)，但不限于此。

过氧化物酶/氧化酶：可用于所述组合物的适合的过氧化物酶/氧化酶包括来自于植物、细菌或真菌的那些。化学修饰或蛋白工程化突变体也是包括在内。有用过氧化物酶的实例包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的来自鬼伞属(Coprinus)，例如灰益鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。商购的过氧化物酶包括GUARDZYME

(Novozymes A/S)。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括来自于细菌或真菌的那些。化学修饰或蛋白工程化突变体也是包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌、单胞杆菌、腐质霉、镰刀菌、梭孢壳霉(Thielavia)、支顶孢菌(Acremonium)的纤维素酶，例如由例如美国专利Nos.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259中公开的特异腐质霉、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)和尖孢廉孢菌生产的真菌纤维素酶。可用的示例性纤维素酶是对织物具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是，例如EP 0495257；EP531372；WO 99/25846(Genencor International，Inc.)；WO 96/34108(Genencor International，Inc.)；WO 96/11262；WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531 315、美国专利Nos.5,457,046、5,686,593和5,763,254中描述的那些。商购的纤维素酶包括Celluzyme

和Carezyme

(Novozymes，前Novo Nordisk A/S)；Clazinase^TM和Puradax

HA(Genencor International，Inc.)；和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

可商购甘露糖的实例是来自丹麦Novozymes的MANNAWAY^TM。

食品

本发明特别适合用于改进食品，特别是生面团和由生面团制备的烘焙食品的乳化性质。

因此，在另一方面，本发明包括用于改进食品乳化性质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触本文定义的单糖部分源、本文定义的脂质以及本文定义的转糖苷酶(特别是归类于E.C.3.2.1.20的转葡糖苷酶和/或碳水化合物活性酶数据库的糖苷水解酶家族31)。

一方面，本发明包括用于改进食品乳化性质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触本文定义的单糖部分源、本文定义的脂质以及本文定义的转葡糖苷酶，条件是所述单糖部分源和脂质不是小麦面粉或麦芽提取物。

在本文中，术语“食品中间品(food product intermediate)”是指在加工食品过程中的非终末食品。在与所述单糖部分原、脂质和转糖苷酶接触时，此类食品中间品可包含生产食品必须的所有成分或仅包含一些成分。一方面，所述食品中间品是包含谷物面粉，优选小麦面粉的生面团。

另一方面，本发明还包括用于改进食品乳化性质的组合物，其包含单糖部分源(如上文定义，特别是葡萄糖部分源)、脂质(如上文定义，特别是甘油单酯和/或甘油二酯)和如上文定义的转糖苷酶(特别是归类于E.C.3.2.1.20的转葡糖苷酶和/或碳水化合物活性酶数据库的糖苷水解酶家族31)。

另一方面，本发明还包括用于改进食品的组合物，其包含单糖部分源(如上文定义，特别是葡萄糖部分源)、脂质(如上文定义，特别是甘油单酯和/或甘油二酯)和如上文定义的转糖苷酶(特别是归类于E.C.3.2.1.20的转葡糖苷酶和/或碳水化合物活性酶数据库的糖苷水解酶家族31)。

一方面，本发明包括用于改进食品的组合物，其包含本文定义的转糖苷酶、本文定义的单糖部分源和本文定义的脂质，条件是所述单糖部分源和脂质不是小麦面粉或麦芽提取物。

另一方面，本发明还包括由一种或其他上述组合物和/或上述方法制备的食品(特别是生面团和由生面团制备的烘焙产品)。如果需要，上述方法通常还包括将所得生面团在适合的条件下烘焙。

出于本发明的目的，术语“烘焙产品”和/或“烘焙的产品”是指包含谷物面粉的产品，例如意大利面制品、面条和膨松面包产品，包括：面包块、小圆面包(rolls)或吐司面包、丹麦酥皮饼、甜面团产品、叠层面团产品(laminated dough)、液体奶油面糊、松饼、炸圈饼、饼干、曲奇、薄脆饼干和蛋糕。为了避免争议，在一个实施方式中，术语“烘焙产品”和/或“烘焙的产品”不包括意大利汤团(gnocchi)和蒸粗麦粉(couscous)。

出于本发明的目的，术语“生面团”是指适合制备上述烘焙产品的生面团。术语生面团不包括用于制备例如意大利汤团和蒸粗麦粉的产品的生面团。

生面团的成分包括面粉、水和发酵剂，例如酵母或常规的化学发酵剂。然而，在本发明的范围内，可向生面团混合物中添加任选的生面团成分。

此类其他任选的生面团成分通常包括常规使用的生面团成分，例如盐，甜味剂，如糖、糖浆或人工甜味剂，液体物质包括起酥油、人造奶油、黄油或动物或植物油，甘油和一种或多种生面团添加剂，例如淀粉、调味剂、乳酸菌培养物、维生素、矿物质、水胶体，例如海藻酸、角叉菜胶、果胶、植物胶，包括例如瓜耳胶和刺槐豆胶，和膳食纤维物质。

在烘焙产品和生面团中，原位产生的不同甘油糖脂的比例取决于甘油单酯和甘油二酯和单糖源的可得性。不同的甘油糖脂具有不同的乳化剂性质。在烘焙产品和生面团中，二葡糖基甘油单酯DGMG是最强的乳化剂，然后是单葡糖基甘油单酯MGMG，然后是二葡糖基甘油二酯DGDG，然后是单葡糖基甘油二酯MGDG。

下文将仅通过实施例的方式描述本发明。

实施例

实施例1：通过TGL-500在体外葡糖基化甘油单酯

在基于缓冲剂的体外系统中检测作为转葡糖苷酶受体底物的基于C10的甘油单酯。

总体积为50ml的反应由以下成分组成：

50mM乙酸钠(pH 6.0)

30％(按重量计)的C10甘油单酯

5％(按重量计)的麦芽糖

将甘油单酯溶解，并通过Ultra Turrax处理20秒分散溶液。通过添加100U转葡糖苷酶L-500(TGL-500)(Genencor，批号102-04208-001)启动反应并在搅拌下于45℃温育。在18小时和26小时后，向反应物中添加额外的2.5g麦芽糖，以使得反应混合物的平衡能够有利于糖脂形成。在42小时后，添加额外的25U TGL-500。在反应启动后0、18小时、42小时和96小时后取样，并冷冻干燥。

通过液相色谱-质谱法(LC-MS)分析样品的甘油糖脂组成。通过与正离子模式下电喷雾电离质谱在线偶联的反相高效液相色谱(HPLC/ESP-MS)分析样品。所述柱是C18柱，且梯度基于水/丙酮。添加用于在正离子模式下形成加成物的乙酸钠。单葡糖基甘油单酯(MGMG)和二葡糖基甘油单酯(DGMG)的量随时间显著增加(图1)。起始材料包含3％甘油二酯，并且除形成MGMG和DGMG之外，我们还能确定单葡糖基甘油二酯(MGDG)的生成，其随时间而增加(图2)。

可由此LC-MS分析确定，转葡糖苷酶能够将葡糖基单元转移到甘油单酯，从而产生单葡糖基甘油单酯和二葡糖基甘油单酯。此外，我们已证明转葡糖苷酶能够将葡糖基单元转移到甘油二酯，从而产生葡糖基甘油二酯。

实施例2：在烘焙品中原位产生甘油糖脂

转葡糖苷酶TGL-500的葡聚糖供体底物是麦芽糖和麦芽糊精，为了提供TGL-500的最佳条件，检测麦芽糖，将其添加到发酵面团(sponge)中，并按照下文给出的配方进行烘焙。在此实施例中测试的转葡糖苷酶是转葡糖苷酶L-500(TGL-500)(可得自于Danisco/Genencor，批号102-04208-001)。按照下表3和4给出的配方进行烘焙试验。

在发酵后，收集生面团样品以及最终面包的面包屑样品，将10g样品冻干，然后提取脂质。为了提取脂质，将冻干样品在咖啡磨研磨，并通过800微米筛。在带有螺盖的15ml离心管中称量1.5g冻干样品。添加7.5ml水饱和的丁醇(WSB)。将离心管在沸水浴中放置10分钟。将离心管放置在Rotamix，并在室温下以45rpm混合20分钟。随后，将样品重新在沸水浴中放置10分钟，再于室温下在Rotamix上以30rpm进一步混合30分钟。将离心管以3500g离心5分钟。将5ml上清液转移到试管中。在氮气流中蒸发WSB至干燥。通过气相色谱(GC)分析脂质样品的甘油糖脂组成。鉴定并定量样品中糖(半乳糖基和葡糖基)修饰的甘油单酯和甘油二酯。在通过GC分析时，半乳糖基和葡糖基修饰的脂质在色谱分析上是相同的(identical)。

结果显示于图中3-10，其中使用了以下缩写：

MGMG：单半乳糖基/葡糖基甘油单酯

DGMG：二半乳糖基/葡糖基甘油单酯

MGDG：单半乳糖基/葡糖基甘油二酯

DGDG：二半乳糖基/葡糖基甘油二酯

图中编号1-4的各配方的试验方案如下所示：

1：无TGL-500，8％蔗糖

2：12.5ml/kg TGL-500，8％蔗糖

3：12.5ml/kg TGL-500，8％麦芽糖

4：12.5ml/kg TGL-500，4％蔗糖，4％麦芽糖

可以得出结论，通过在生面团系统中应用转葡糖苷酶，能够原位产生甘油糖脂(其可用作乳化剂)。在向生面团系统中添加麦芽糖(方案3和4)时，所产生的甘油糖脂的量增加。还观察到在添加TGL-500和蔗糖的方案2中，甘油糖脂含量比方案1增大。

实施例2中使用的配方：

表3-发酵面团

表4-生面团

丙酸钙(Sigma-Aldrich)	0.25	5
			压缩酵母	0.9	18
抗坏血酸，(DKSK，Denmark)	60ppm	0.12
			水	总水量的35％	415
偶氮二酰胺(Sigma-Aldrich)	40ppm	0.08

仪器：

混合仪：Hobart(发酵面团)；Diosna(生面团)

醒面成形柜

模子：Glimek

烘箱：MIWE Roll in

方法：

发酵面团：

1.将所有成分在Hobart上以第一速度混合1分钟，并以第二速度混合3分钟；

2.发酵面团的温度必须为约24℃；

3.将发酵面团在25℃，85％相对湿度下发酵。

生面团：

1.将发酵面团与盐之外的所有其他成分在Diosna以低速混合1分钟，再以高速混合2分钟；

2.添加盐-以高速混合8分钟；

3.称量所有4个批次550g，并模制；

4.将生面团在室温下静置10分钟；

5.在Glimek模制：1:4-2:3-3:15-4:12-两侧宽度8；

6.将生面团装罐；

7.在43℃，95％RH发酵至高度(约65分钟)；

8.在200℃烘焙26分钟；

9.从罐中取出面包，冷却70分钟，然后称量并测量体积。

实施例3-使用麦芽糊精和蔗糖为供体，通过TGL-500在体外葡糖基化甘油单酯

在基于缓冲剂的体外系统中，应用基于C10的甘油单酯作为转葡糖苷酶受体底物。

总体积为50ml的反应由以下成分组成：

50mM乙酸钠(pH 6.0)

30％(按重量计)的C10甘油单酯

5％(按重量计)的麦芽糊精或蔗糖

将甘油单酯溶解，并通过Ultra Turrax处理20秒分散溶液。通过添加100U TGL-500启动反应并在搅拌下于45℃温育。在3小时、18小时和22小时后，向反应物中添加额外的2.5g麦芽糊精或蔗糖，以确保反应混合物的平衡有利于糖脂形成。在18小时后添加额外的25U TGL-500。在反应启动后0、20小时和120小时后取样并冷冻干燥。

通过LC-MS分析样品的甘油糖脂组成。单葡糖基甘油单酯(MGMG)和二葡糖基甘油单酯(DGMG)的量随时间显著增加(图11和图12)。

根据LC-MS分析，能够确定转葡糖苷酶能够将葡糖基单元从麦芽糊精和蔗糖转移到甘油单酯。

以上说明书中提到的所有公开均通过引用并入本文。本发明描述各方法和系统的各种改变和变体对本领域技术人员而言都是显而易见的，不脱离本发明的范围。尽管已结合具体优选实施方式描述本发明，但应理解，本发明的保护范围绝不应仅限于此具体实施方式。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员而言显而易见的实施本发明所述方式的各种改进都落入权利要求书的范围之内。

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Claims

1.用于使具有游离羟基基团的脂质糖基化的方法，所述方法包括使所述脂质接触单糖部分源和转糖苷酶。

2.如权利要求1所述的方法，还包括从反应混合物分离糖基化的脂质。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括纯化糖基化的脂质。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶是转葡糖苷酶。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶归类为酶分类(E.C.)3.2.1.20。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶归类为碳水化合物活性酶数据库的糖苷水解酶家族31。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶来自于真菌，或与来自于真菌的转糖苷酶具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶来自于曲霉菌(Aspergillus)种，或与来自于曲霉菌种的转糖苷酶具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述曲霉菌种选自黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)组成的组。

10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述转糖苷酶是黑曲霉的转糖苷酶(SEQ ID No.2或SEQ ID No.4)，或与其具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列同一性的序列。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述脂质是单甘油脂和多甘油脂。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述脂质是单甘油脂。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述脂质是二甘油脂。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述脂质是多甘油脂。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述脂质选自甘油单酯或甘油二酯。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述甘油单脂具有一个饱和或不饱和的具有4-40个碳原子的酰基链。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述甘油单脂具有一个饱和或不饱和的具有10-22个碳原子的酰基链。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述甘油二脂具有两个饱和或不饱和的具有4-40个碳原子的酰基链。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述甘油二脂具有两个饱和或不饱和的具有10-22个碳原子的酰基链。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述单糖部分是葡萄糖部分。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述单糖部分源是二糖。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述二糖选自麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽酮糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、黑曲霉糖、曲二糖、海藻糖和蔗糖异构糖。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述二糖是蔗糖。

24.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述单糖部分源是寡糖。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述寡糖选自麦芽糊精、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、松三糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖和纤维七糖。

26.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述单糖部分源是多糖。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述多糖选自淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、纤维素或其衍生物、海藻酸或其盐或衍生物、聚葡萄糖、葡聚糖、果胶、普鲁兰多糖、角叉菜胶、刺槐豆胶和瓜耳胶。

28.将单糖部分转移到权利要求1或11-19中任一项限定的脂质的方法，其通过使所述脂质接触权利要求1和21-27中任一项限定的单糖部分源以及权利要求1和4-10中任一项限定的转糖苷酶来进行。

29.改进食品的组合物，其包含转糖苷酶、单糖部分源和脂质。

30.如权利要求29所述的改进食品的组合物，其包含权利要求1和4-10中任一项限定的转糖苷酶、权利要求1或20-27中任一项限定的单糖部分源和权利要求1或11-19中任一项限定的脂质。

31.如权利要求29或30所述的改进食品的组合物，其中所述食品选自生面团和由生面团制备的烘焙产品。

32.如权利要求29-31中任一项所述的改进食品的组合物，其中所述单糖部分源是蔗糖。

33.改进食品乳化性质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触单糖部分源、脂质和转糖苷酶。

34.如权利要求33所述的改进食品乳化性质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触权利要求1或20-27中任一项限定的单糖部分源、权利要求1或11-19中任一项限定的脂质和权利要求1或4-10中任一项限定的转糖苷酶。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述食品选自生面团和由生面团制备的烘焙产品，所述方法还包括必要时使所得生面团在适合的条件下烘焙。

36.用于在食品中原位生产糖基化脂质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触单糖部分源、脂质和转糖苷酶。

37.如权利要求36所述的用于在食品中原位生产糖基化脂质的方法，所述方法包括使所述食品或食品中间品接触权利要求1或20-27中任一项限定的单糖部分源、权利要求1或11-19中任一项限定的脂质和权利要求1或4-10中任一项限定的转糖苷酶。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述食品是烘焙产品。

39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述食品中间品是生面团。

40.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述单糖部分源是蔗糖。

41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述单糖部分源的添加量不高于30重量％。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述单糖部分源的添加量为10-20重量％，例如8-12重量％。

43.如权利要求33-42中任一项所述的方法，其中所述脂质选自甘油单酯或甘油二酯。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述脂质的添加量不高于10重量％，例如不高于3重量％，不高于1.5重量％或不高于1重量％。

45.食品，其是由权利要求29-32中任一项所述的组合物形成的。

46.食品，其是由权利要求33-44中任一项所述的方法生产的。

47.转糖苷酶的应用，其用于将单糖部分转移到脂质。

48.如权利要求47所述的转糖苷酶的应用，所述转糖苷酶如权利要求1或4-10中任一项所限定，用于将单糖部分转移到权利要求1或11-19中任一项限定的脂质。

49.如权利要求47或48所述的应用，其中所述单糖部分向脂质的转移在食品或食品中间品中原位发生。

50.如权利要求47或48所述的应用，其中所述单糖部分向脂质的转移在洗衣组合物中原位发生。

51.权利要求1或4-10中任一项限定的转糖苷酶用于改进食品的乳化性质的应用，所述食品包括权利要求1或11-19中任一项限定的脂质和权利要求1或20-27中任一项限定的单糖部分源。