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CN102099025A - Pm00104与另一抗肿瘤剂的联合疗法 - Google Patents

Pm00104与另一抗肿瘤剂的联合疗法 Download PDF

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CN102099025A CN2009801276302A CN200980127630A CN102099025A CN 102099025 A CN102099025 A CN 102099025A CN 2009801276302 A CN2009801276302 A CN 2009801276302A CN 200980127630 A CN200980127630 A CN 200980127630A CN 102099025 A CN102099025 A CN 102099025A
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Abstract

本发明涉及PM00104与其他抗癌药物的联合，以及这些联合在癌症治疗中的用途。

Description

PM00104与另一抗肿瘤剂的联合疗法
发明领域
本发明涉及PM00104与其他抗癌药物的联合，特别是选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的其他抗癌药物。
发明背景
当身体的一部分中的细胞开始失控地生长时就产生了癌症。尽管有许多种癌症，但是它们都来自异常细胞的失控的生长。癌细胞可以侵袭邻近的组织并可以通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部分。有几种主要类型的癌症。癌是来自上皮细胞的恶性新生物，其是失控和进行性的异常生长。上皮细胞覆盖身体的包括器官、血管内衬(lining)和其他小腔在内的内表面和外表面。肉瘤是来自骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织中的细胞的癌症。白血病是来自诸如骨髓的血液形成组织的癌症，并导致产生大量的异常血细胞并进入血流。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是来自免疫系统的细胞的癌症。
另外，癌症是侵袭性的并且趋向于浸润周围的组织并引起转移。癌症可以直接扩散入周围的组织并且还可以通过淋巴系统和循环系统扩散至身体的其他部分。
许多治疗对于癌症是可用的，包括对局限性疾病的手术和放射以及化疗。然而，对于许多癌症类型可用的治疗的效果是有限的，并且亟需表现出临床益处的新的改进形式的治疗。这对于表现出重病和/或转移性疾病的患者以及以前已用建立的疗法进行治疗后复发进行性疾病的患者是特别真实的，所述建立的疗法由于获得抗性或由于相关毒性而限制给予治疗变得无效或不能忍受。
20世纪50年代以来，在癌症的化疗治疗上已经取得了重大进展。不幸的是，所有癌症患者中超过50％对初始疗法无应答或者在治疗的初始应答后经历复发，并最终死于进行性转移疾病。因此，对设计和发现新抗癌剂的不断投入是非常重要的。
理想的抗肿瘤药物会选择性地杀死癌细胞，相对于其对于非癌细胞的毒性具有宽指数，并且即使延长暴露于药物后还会保留其对抗癌细胞的功效。不幸的是，使用已知试剂的目前的化疗都不具有理想的特征(profile)。大部分具有非常窄的治疗指数，并且另外暴露于轻微亚致死浓度的化疗剂的癌细胞可以产生对该试剂的抗性，并且经常对数种其他抗肿瘤剂产生交叉抗性。
PM00104是jorumycin和renieramycin以及番红菌素和番红霉素化合物相关的生物碱。Jorumycin是分离自太平洋裸鳃亚目动物海蛞蝓(Jorunna funebris)的皮肤及粘液的天然化合物(Fontana A.，et al.，Tetrahedron(2000)，56，7305-8)。另外据公开，renieramycin家族分离自海绵和被囊动物(James M.F.et al.J.Am.Chem.Soc.(1982)，104，265-269；Oku N.，et al.Journal Natural Products(2003)，66，1136-9)。番红菌素和番红霉素化合物公开于Manzanares I.，et al.Curr.Med.Chem.Anti-Cancer Agents(2001)，1，257-276以及WO 00/18233和WO01/87894。
PM00104已经表现出对抗实体和非实体肿瘤细胞系的显著体外活性以及小鼠中诸如乳腺和前列腺的几种异种移植的人细胞系显著体内活性。对PM00104的作用机制的初步探索提示细胞周期改变、DNA结合性质和转录抑制。该化合物具有以下化学结构：
Figure BPA00001294546600021
对于PM00104的更多细节，参见WO 01/87894。另外，对于PM00104的药物组合物和给药剂量及安排，阅读人可参见WO2007/052076和WO 2008/135792，通过具体引用将其并入本文。
由于癌症是动物和人的首要死亡原因，所以为了获得安全且有效的疗法来给予患有癌症的患者，已经进行了并仍然正在进行一些努力。本发明要解决的问题是提供在癌症治疗中有用的抗癌疗法。
发明概述
本发明证实，PM00104增强其他抗癌剂的抗肿瘤活性，特别是选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的其他抗癌药物，因此，可以将PM00104与其他抗癌剂成功地用于联合疗法以治疗癌症。
因此，本发明涉及利用联合疗法来治疗癌症的药物组合物、试剂盒、方法以及PM00104在制备用于联合疗法的药物中的用途。
根据本发明的一方面，我们提供了基于PM00104或其药学可接受的盐并且利用另一抗癌药物的用于治疗癌症的有效联合疗法。
在另一实施方案中，本发明包括治疗癌症的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐，以及在给予PM00104之前、期间或之后给予的治疗有效量的另一抗癌药物。这两种药物可以形成同一组合物的部分，或者作为用于同时或不同时给药的分别的组合物提供。
在另一方面，本发明包括增加或增强抗癌药物在癌症治疗中的治疗效果的方法，该方法包括给予需要该治疗的患者治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐。在给予其他抗癌药物之前、期间或之后给予PM00104。
在另一实施方案中，本发明包括PM00104或其药学可接受的盐在制备用于在与另一抗癌药物的联合疗法中治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明包括在用于治疗癌症的联合疗法中使用的药物组合物，其包含PM00104或其药学可接受的盐和/或另一抗癌药物以及药学可接受的载体或赋形剂。
本发明还包括用于治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含PM00104或其药学可接受的盐的剂型和/或另一抗癌药物的剂型，以及联合使用两种药物的说明书。
在一优选的方面，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的协同联合。
附图简述
图1-3.Hs746T(图1)、AGS(图2)和HGC-27(图3)细胞中，PM00104与顺铂联合的抑制效果。
图4-6.Hs746T(图4)、AGS(图5)和HGC-27(图6)细胞中，PM00104与SN38联合的抑制效果。
图7-9.Hs746T(图7)、AGS(图8)和HGC-27(图9)细胞中，PM00104与5-FU联合的抑制效果。
图10-12.Hs746T(图10)、AGS(图11)和HGC-27(图12)细胞中，PM00104与多柔比星联合的抑制效果。
图13-15.Hs746T(图13)、AGS(图14)和HGC-27(图15)细胞中，PM00104与多西他赛(docetaxel)联合的抑制效果。
图16-18.Hs746T(图16)、AGS(图17)和HGC-27(图18)细胞中，PM00104与奥沙利铂(oxaliplatin)联合的抑制效果。
图19-20.5637(图19)和UM-UC-3(图20)细胞中，PM00104与吉西他滨(gemcitabine)
Figure BPA00001294546600041
联合的抑制效果。
图21-22.5637(图21)和UM-UC-3(图22)细胞中，PM00104与顺铂联合的抑制效果。
图23-26.BxPC-3(图23)、PANC-1(图24)、MIA PaCa-2(图25)和SW1990(图26)细胞中，PM00104与吉西他滨
Figure BPA00001294546600042
联合的抑制效果。
图27.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(140mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中MIA PaCa-2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图28.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、厄洛替尼(erlotinib)(100mg/kg/天)或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中MIA PaCa-2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图29.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、厄洛替尼(50mg/kg/天)或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中MIA PaCa-2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图30.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(180mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图31.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、厄洛替尼(50mg/kg/天)或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图32.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、厄洛替尼(30mg/kg/天)或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图33.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、厄洛替尼(15mg/kg/天)或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图34.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、顺铂(5mg/kg/天)或PM00104加顺铂治疗的小鼠中UM-UC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图35.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(180mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中UM-UC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图36.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、紫杉醇(15mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中UM-UC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图37.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、顺铂(5mg/kg/天)或PM00104加顺铂治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图38.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、紫杉醇(10mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图39.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、5-FU(50/100mg/kg/天)或PM00104加5-FU治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图40.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、伊立替康(irinotecan)(20mg/kg/天)或PM00104加伊立替康治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图41.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多柔比星(6mg/kg/天)或PM00104加多柔比星治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图42.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多西他赛(16mg/kg/天)或PM00104加多西他赛治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图43.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多西他赛(8mg/kg/天)或PM00104加多西他赛治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图44.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、奥沙利铂(8mg/kg/天)或PM00104加奥沙利铂治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图45.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、奥沙利铂(4mg/kg/天)或PM00104加奥沙利铂治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图46.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、5-FU(100mg/kg/天)或PM00104加5-FU治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图47.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、5-FU(50mg/kg/天)或PM00104加5-FU治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图48.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多西他赛(16mg/kg/天)或PM00104加多西他赛治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图49.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多西他赛(8mg/kg/天)或PM00104加多西他赛治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图50.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、奥沙利铂(8mg/kg/天)或PM00104加奥沙利铂治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图51.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、奥沙利铂(4mg/kg/天)或PM00104加奥沙利铂治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图52.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、多柔比星(6mg/kg/天)或PM00104加多柔比星治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图53.用对照、PM00104(0.45mg/kg/天)、多柔比星(6mg/kg/天)或PM00104加多柔比星治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图54.用对照、PM00104(0.23mg/kg/天)、多柔比星(6mg/kg/天)或PM00104加多柔比星治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图55.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、紫杉醇(12.5mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图56.用对照、PM00104(0.45mg/kg/天)、紫杉醇(12.5mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图57.用对照、PM00104(0.23mg/kg/天)、紫杉醇(12.5mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图58.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、顺铂(5mg/kg/天)或PM00104加顺铂治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图59.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、顺铂(3mg/kg/天)或PM00104加顺铂治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图60.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、伊立替康(18mg/kg/天)或PM00104加伊立替康治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图61.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、伊立替康(10mg/kg/天)或PM00104加伊立替康治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图62.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、紫杉醇(25mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图63.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、紫杉醇(12.5mg/kg/天)或PM00104加紫杉醇治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图64.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、索拉非尼(sorafenib)(60mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中HepG2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图65.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、索拉非尼(30mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中HepG2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图66.用对照、PM00104(0.6mg/kg/天)、索拉非尼(60mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中HepG2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图67.用对照、PM00104(0.6mg/kg/天)、索拉非尼(30mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中HepG2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图68.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、索拉非尼(60mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中PLC/PRF/5肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图69.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、索拉非尼(30mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中PLC/PRF/5肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图70.用对照、PM00104(0.45mg/kg/天)、索拉非尼(60mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中PLC/PRF/5肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图71.用对照、PM00104(0.45mg/kg/天)、索拉非尼(30mg/kg/天)或PM00104加索拉非尼治疗的小鼠中PLC/PRF/5肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图72.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(5mg/kg/天)或PM00104加贝伐珠单抗治疗的小鼠中SK-OV-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图73.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、贝伐珠单抗(2.5mg/kg/天)或PM00104加贝伐珠单抗治疗的小鼠中SK-OV-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图74-76.肺癌细胞系：A-549(图74)、NCI-H460(图75)和NCI-H23(图76)细胞中PM00104联合吉西他滨的抑制效果。
图77-79.肺癌细胞系：A-549(图77)、NCI-H460(图78)和NCI-H23(图79)细胞中PM00104联合紫杉醇的抑制效果。
图80-82.肺癌细胞系：A-549(图80)、NCI-H460(图81)和NCI-H23(图82)细胞中PM00104联合顺铂的抑制效果。
图83-85.乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(图83)、BT-474(图84)和MCF-7(图85)细胞中PM00104联合吉西他滨的抑制效果。
图86-88.乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(图86)、BT-474(图87)和MCF-7(图88)细胞中PM00104联合紫杉醇的抑制效果。
图89-91.乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(图89)、BT-474(图90)和MCF-7(图91)细胞中PM00104联合多柔比星的抑制效果。
图92-94.结肠癌细胞系：HCT-116(图92)、LoVo(图93)和HT-29(图94)细胞中PM00104联合5-氟尿嘧啶(5-FU)的抑制效果。
图95-97.结肠癌细胞系：HCT-116(图95)、LoVo(图96)和HT-29(图97)细胞中PM00104联合奥沙利铂的抑制效果。
图98-100.结肠癌细胞系：HCT-116(图98)、LoVo(图99)和HT-29(图100)细胞中PM00104联合伊立替康的抑制效果。
图101.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、贝伐珠单抗(5mg/kg/天)或PM00104加贝伐珠单抗治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图102.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、贝伐珠单抗(2.5mg/kg/天)或PM00104加贝伐珠单抗治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图103.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、坦罗莫司(temsirolimus)(20mg/kg/天)或PM00104加坦罗莫司治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图104.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、坦罗莫司(10mg/kg/天)或PM00104加坦罗莫司治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图105.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(180mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图106.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(90mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图107.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(180mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图108.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、吉西他滨(90mg/kg/天)或PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图109.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、培美曲赛(pemetrexed)(125mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图110.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、培美曲赛(100mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图111.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、培美曲赛(125mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图112.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、培美曲赛(100mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图113.用对照、PM00104(0.9mg/kg/天)、培美曲赛(100mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中H-Meso-1肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
图114.用对照、PM00104(0.45mg/kg/天)、培美曲赛(100mg/kg/天)或PM00104加培美曲赛治疗的小鼠中H-Meso-1肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
发明详述
我们发现当将其他抗癌药物与PM00104联合时，PM00104极大地增强了这些抗癌药物的抗癌活性。因此，本发明涉及提供基于PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物联合的癌症的有效治疗。
在另一方面，本发明涉及使用PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的协同联合。可以通过应用本文所述的方法学来获得这样的协同联合，所述方法学包括实施例1至24所示的那些方法学以及分析协同联合的结果。
在本申请中，“癌症”表示包括肿瘤、瘤形成以及恶性组织或细胞所导致的任何其他恶性疾病。
除非另外指明，本文所用的术语“治疗(treating)”表示逆转、缓和、抑制疾病的进程、减弱疾病的症状或病理基础、或者预防该术语所应用的病症或疾病状况或者所述病症或疾病状况的一种或多种症状。除非另外指明，本文所用的术语“治疗(treatment)”指治疗(treating)行为，其中“治疗(treating)”按照上文所定义。
本说明书中各处所用的术语“联合”表示包括在相同或不同时间给予患有癌症的患者在同一或分别的药物制剂中的所涉及的治疗剂。如果在不同时间给予治疗剂，则它们应当在时间上足够接近地进行给药以发生增强或协同应答。
在另一方面，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐在用于通过使用PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的联合疗法来有效地治疗癌症的药物的制备中的用途。
在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐与治疗有效量的另一抗癌药物联合给予需要这样的治疗的患者。
根据肿瘤的类型和疾病的发展阶段，本发明的治疗方法的抗癌效果包括但不限于抑制肿瘤生长、延缓肿瘤生长、肿瘤的消退、肿瘤的收缩、肿瘤大小和/或肿瘤标志物减少、停止治疗时肿瘤再生长时间的增加、疾病进展减缓以及预防转移。预期的是，当给予诸如人类患者的需要这样的治疗的患者本发明的治疗方法时，所述治疗方法会产生例如通过抗癌效果的程度、应答率、疾病进展时间或存活率所测定的效果。特别是，本发明的治疗方法适用于人类患者，特别是对以前的化疗复发或难治愈的那些人类患者。还设想成为一线疗法。
如上文所述，PM00104是海洋化合物jorumycin和renieramycin以及番红菌素和番红霉素化合物相关的生物碱，其具有以下结构：
本文的术语“PM00104”旨在涵盖任何药学可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药，或给予患者时能够提供(直接或间接)本文所述的化合物的任何其他化合物。可以通过本领域已知的方法进行所述盐、溶剂化物、水合物和前药的制备。
可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成药学可接受的盐。通常，例如，通过使游离酸或碱形式的这些化合物与化学计算量的合适碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备这样的盐。通常，诸如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质是优选的。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐；以及有机酸加成盐，例如乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐，例如钠盐、钾盐、钙盐和铵盐；以及有机碱盐，例如乙二胺盐、乙醇胺盐、N，N-二烯基乙醇胺盐、三乙醇胺盐和碱性氨基酸盐。
PM00104的任何前药化合物在本发明的范围和实质内。术语“前药”以其最广泛的含义使用，并且包括在体内转化成PM00104的那些衍生物。前药可以在生物条件下水解、氧化或以其他方式反应来提供PM00104。前药的实例包括但不限于PM00104的衍生物和代谢物，其包括可生物水解的部分，例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲以及可生物水解的磷酸酯类似物。通常可以利用公知的方法来制备前药，如Burger“Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed.(药物化学和药物发现第6版)(Donald J.Abraham ed.，2001，Wiley)和“Designand Applications of prodrugs(前药的设计与应用)”(H.Bundgaard ed.，1985，Harwood Academic Publishers)所述的那些方法。
另外，本文所涉及的任何药物可以为游离化合物或溶剂化物(如水合物)的晶体形式，并且两种形式都旨在处于本发明的范围内。溶剂化的方法在本领域是公知的。
可以按照WO 01/87894所公开的合成方法来制备本发明所用的PM00104，通过引用的方式将该国际申请并入本文。
可用的PM00104的药物组合物包括具有适于静脉内给药的赋形剂的溶液、悬浮液、乳状液、冻干组合物等。优选地，可以以无菌冻干产品提供和保存PM00104，所述无菌冻干产品包含适合于治疗用途的制剂中的PM00104和赋形剂。特别是，包含蔗糖和缓冲为合适的pH值的磷酸盐的制剂是优选的。关于PM00104制剂的其他指导提供于WO 2007/052076，通过引用的方式将其整体并入本文。
优选地通过静脉内输注给予PM00104或其药物组合物或包含该化合物的药物组合物。可以使用高达72小时的输注时间，更优选为1至24小时，并且约1、约3或约24小时是最优选的。允许进行治疗而不需要在医院过夜停留的短输注时间是特别理想的。然而，若需要，输注可以为约24小时或甚至更长。
优选地，周期性地进行PM00104给药。在优选的给药方法中，通常在每个周期的第一天给予患者PM00104静脉内输注，然后使患者在该周期的剩余时间内恢复。每个周期的优选持续时间通常为3或4周；按需要可以给予多个周期。按需要，根据个体患者状况和对治疗的耐受性进行剂量延迟和/或剂量减少以及安排调整。关于PM00104给药和剂量的其他指导，参见例如WO 2008/135792，通过具体引用的方式将其并入本文。
在本发明中，特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物在癌症治疗中的联合，所述癌症选自肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。
另外，特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物在癌症治疗中并且更特别的是在选自肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤的癌症治疗中的联合，所述另一抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
在优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与抗肿瘤铂配位络合物在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、膀胱癌、肺癌和结肠直肠癌的癌症治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于顺铂、奥沙利铂、卡铂、BBR3464、沙铂、四铂、奥马铂(ormiplatin)和异丙铂。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与顺铂、奥沙利铂、卡铂、BBR3464、沙铂、四铂、奥马铂和异丙铂的联合，甚至更优选的是与顺铂和奥沙利铂在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、膀胱癌、肺癌和结肠直肠癌的癌症的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与抗代谢物在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌和间皮瘤的癌症的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、氟达拉滨、氨基蝶呤、培美曲赛、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁和硫鸟嘌呤。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、氟达拉滨、氨基蝶呤、培美曲赛、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁和硫鸟嘌呤的联合，甚至更优选的是与5-氟尿嘧啶、培美曲赛和吉西他滨在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌和间皮瘤的癌症的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与有丝分裂抑制剂在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、膀胱癌、肺癌和乳腺癌的癌症的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨的联合，甚至更优选的是与紫杉醇和多西他赛在癌症治疗中并且更特别的是在选自胃癌、膀胱癌、肺癌和乳腺癌的癌症的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与蒽环类在癌症治疗中并且更特别的是在胃癌和乳腺癌的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹蒽醌(pixantrone)和戊柔比星。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与柔红霉素(aunorubicin)、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹蒽醌和戊柔比星的联合，甚至更优选的是与多柔比星在癌症治疗中并且更特别的是在胃癌和乳腺癌的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与拓扑异构酶I和/或II抑制剂在癌症治疗中并且更特别的是在胃癌和结肠直肠癌的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于托泊替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、卢比替康、依托泊苷和替尼泊苷。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与托泊替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、卢比替康、依托泊苷和替尼泊苷的联合，甚至更优选的是与SN-38和伊立替康在癌症治疗中并且更特别的是在胃癌和结肠直肠癌的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与抗肿瘤单克隆抗体在癌症治疗中并且更特别的是在卵巢癌和肺癌的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、阿仑珠单抗和吉妥珠单抗。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、阿仑珠单抗和吉妥珠单抗的联合，甚至更优选的是与贝伐珠单抗在癌症治疗中并且更特别的是在卵巢癌和肺癌的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与酪氨酸激酶抑制剂在癌症治疗中并且更特别的是在选自肝细胞癌和胰腺癌的癌症的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于厄洛替尼、索拉非尼、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布(cediranib)、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、卡纳替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼和凡他尼布。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与厄洛替尼、索拉非尼、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、卡纳替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼和凡他尼布的联合，甚至更优选的是与厄洛替尼和索拉非尼在癌症治疗中并且更特别的是在选自肝细胞癌和胰腺癌的癌症的治疗中的联合。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及PM00104或其药学可接受的盐与mTOR抑制剂在癌症治疗中并且更特别的是在肺癌的治疗中的联合。这种化疗组包括但不限于坦罗莫司、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和42-(二甲基亚膦酰)西罗莫司(deforolimus)。特别优选的是PM00104或其药学可接受的盐与坦罗莫司、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和42-(二甲基亚膦酰)西罗莫司的联合，甚至更优选的是与坦罗莫司在癌症治疗中并且更特别的是在肺癌的治疗中的联合。
本发明包括本文所涉及的任何药物的任何药学可接受的盐，可以通过以前公开的常规化学方法从母体化合物合成所述药学可接受的盐。
PM00104或其药学可接受的盐和其他抗癌药物可以以分别的药物提供，用于同时或不同时给药。优选地，PM00104和其他抗癌药物以分别的药物提供，用于在不同时间给药。当在不同时间分别给药时，可以首先给予PM00104或其他抗癌药物。另外，可以在同一天或不同天给予两种药物，并且在治疗周期中，它们可以利用相同的安排或不同的安排进行给药。因此，本发明的药物组合物可以在单一药学可接受的制剂中包含全部组分(药物)。或者，可以将组分单独配制并互相联合给药。本发明中可以使用本领域技术人员是已知的各种药学可接受的制剂。另外，可以利用不同给药途径来给予联合的药物。例如，药物之一可以为适合于口服给药的形式，如片剂或胶囊；而另一种药物则为适合于胃肠外注射的形式(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)，如无菌溶液、悬浮液或乳状液。或者，可以通过相同的给药途径来给予两种药物。本领域技术人员可以基于给药模式和组合物组分的溶解度特性来进行适用于本发明的制剂的选择。
联合的化合物的正确剂量会根据特定的制剂、应用的模式以及特定的部位、治疗的患者和肿瘤而变化。还应当考虑其他因素，如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄率、患者的状况、药物联合、反应敏感性以及疾病的严重性。可以在最大耐受剂量内进行连续给药或周期性给药。
在另一方面，本发明涉及用于在癌症治疗中与另一抗癌药物联合给予PM00104的试剂盒，该试剂盒包括提供至少一个周期的剂量单位的PM00104或其药学可接受的盐，以及两种药物联合使用的打印说明书。
在相关的方面，本发明涉及用于在癌症治疗中与另一抗癌药物联合给予PM00104的试剂盒，该试剂盒包括提供至少一个周期的剂量单位的PM00104或其药学可接受的盐，提供至少一个周期的剂量单位的另一种抗癌药物，以及两种药物联合使用的打印说明书。
在另一方面，本发明还提供了用于在癌症治疗中与另一抗癌药物联合使用的药物组合物，该药物组合物包含PM00104或其药学可接受的盐和药学可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本发明还提供了用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含PM00104或其药学可接受的盐，另一抗癌药物以及药学可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本发明还提供了PM00104或其药学可接受的盐在制备与另一抗癌药物的联合疗法治疗癌症的药物中的用途。
在相关的方面，本发明还提供了PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物联合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了PM00104或其药学可接受的盐用于治疗癌症，其包括与治疗有效量的另一抗癌药物联合给予治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐。
在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括联合给予治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐和治疗有效量的另一抗癌药物，其中所述联合可以共同或分别给予。在本发明的优选实施方案中，以协同有效量给予PM00104或其药学可接受的盐和其他抗癌药物。
在一实施方案中，癌细胞与PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的联合接触，或以其他方式用PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的联合来处理癌细胞。癌细胞(cancer cells)优选为人的癌细胞，并包括癌细胞(carcinoma cell)、肉瘤细胞、白血病细胞和淋巴瘤细胞。更优选地，癌细胞为以下癌症的细胞：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。特别地，癌细胞包括人胃癌细胞、人膀胱癌细胞和人胰腺癌细胞。另外，所述联合提供了针对癌细胞的协同抑制效果，特别是针对人胃癌细胞、人膀胱癌细胞、人胰腺癌细胞、人肺癌细胞、人结肠直肠癌细胞和人乳腺癌细胞的协同抑制效果。
例如，所述联合抑制接触的癌细胞的增殖或存活。与未接触的癌细胞相比，接触的癌细胞的较低水平增殖或存活支持PM00104或其药学可接受的盐与所选的另一抗癌药物的联合有效地治疗癌症患者。
在另一方面，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包括使所述癌细胞与有效量的PM00104或其药学可接受的盐和另一抗癌药物共同地或分别地联合接触。
在另一方面，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包括使所述癌细胞与PM00104或其药学可接受的盐和另一抗癌药物的协同联合共同地或分别地接触，其中所述联合与(i)PM00104或其药学可接受的盐而无另一抗癌药物，或(ii)另一抗癌药物而无PM00104相比，提供了提高的针对癌细胞生长的抑制。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含有效量的PM00104或其药学可接受的盐，用于与另一抗癌药物联合使用来抑制癌细胞的生长。
在相关的方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的有效联合，用于抑制癌细胞的生长。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的协同联合，用于抑制癌细胞的生长，其中所述联合与(i)PM00104或其药学可接受的盐而无另一抗癌药物，或(ii)另一抗癌药物而无PM02734相比，提供了提高的针对癌细胞生长的抑制。
在另一实施方案中，PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的联合在体内抑制肿瘤生长或减小肿瘤大小。特别地，所述联合在体内抑制癌细胞(carcinoma cells)、肉瘤细胞、白血病细胞和淋巴瘤细胞的生长。优选地，所述联合在体内抑制以下癌症的细胞的生长：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。特别地，癌细胞包括人胃癌细胞、人膀胱癌细胞、人胰腺癌细胞、人肝细胞癌细胞、人肺癌细胞、人间皮瘤细胞和人卵巢癌细胞。类似地，所述联合在体内减小癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤肿瘤的大小。优选地，所述联合减小以下癌症的大小：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。特别地，所述联合在体内减少人肝细胞癌、间皮瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤和卵巢肿瘤的大小。
例如，所述联合在动物模型中抑制人癌症异种移植物的肿瘤生长或减小人癌症异种移植物的大小，特别是人肝细胞癌、间皮瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤和卵巢肿瘤异种移植物的大小。给予了所述联合的动物模型中人癌症异种移植物的生长减少或大小减小也支持PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物的联合有效地治疗癌症患者。
根据本发明的实施方案，通过将联合两种药物(PM00104与另一药物)的治疗的平均肿瘤重量与另一药物单一疗法治疗的平均肿瘤重量比较来评价肿瘤生长抑制。另外，用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准如下：
-当联合疗法的应答大于与联合疗法所用相同安排和剂量上下的作为单一试剂(单一疗法)给予的最大活性药物的最佳应答时，确定增强作用。
-通过比较单一疗法治疗的肿瘤生长抑制百分比与联合治疗的肿瘤生长抑制百分比来确定加成性，比较方式如下：
1.对于作为单一疗法以联合中所用的剂量给予的每种药物，以100-％T/C测定肿瘤生长抑制百分比。通过将治疗组(T)的平均肿瘤重量与对照组(C)中的平均肿瘤重量比较来获得％T/C(T/C×100％)。
2.将两个分数相加以确定“预期应答”，如果每种试剂产生与作为单一疗法给予时相同的应答。
3.从对联合治疗组所测定的肿瘤生长抑制百分比中减去该“预期应答”：
a.负数表示联合两种药物的效果小于加成。
b.如果所得的数接近0，则联合两种药物的效果被确定为加成。
c.正数表示联合两种药物的效果大于加成。
因此，联合治疗的大于加成的效果对应于协同效果，其中两种药物的联合效果在治疗上优于根据单独给予每种药物时的效果所预期的效果。
因此，在另一方面，本发明提供了减小肿瘤大小的方法，该方法包括共同或分别地联合给予有效量的PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物。
在另一方面，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法，该方法包括联合给予有效量的PM00104或其药学可接受的盐与另一抗癌药物。
在相关的方面，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法，该方法包括共同或分别地给予PM00104或其药学可接受的盐与抗癌药物的有效联合。
下文的实施例进一步对本发明进行举例说明。实施例不应当理解为对本发明范围的限制。
为了提供更简洁的描述，本文给出的某些定量表达未用术语“约”限定。应当理解，不论是否明确地使用术语“约”，本文给出的每个量意图表示实际给定的值，并且还意图表示基于本领域技术人员合理推断的这些给定值的近似值，包括由于这些给定值的实验和/或测量条件所导致的等同值或近似值。
实施例
实施例1.测定PM00104与化疗剂联合对人胃癌细胞系的作用的体外研究
本研究的目的是测定PM00104增强胃癌治疗中所用的化疗剂的抗肿瘤活性的能力。
评价了以下试剂与PM00104的联合：顺铂、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、多西他赛和奥沙利铂。该测定所选择的人胃癌细胞系如下：Hs746T、HGC-27和AGS细胞系。Hs746T和AGS细胞系生长于补充了10％胎牛血清(FBS)、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)中。HGC-27细胞系生长于补充了20％FBS和2mM L-谷氨酰胺的伊思考夫改良达尔伯克氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)(IMDM)中。
以两个部分进行筛查：
a.在测定的第一组中，在每个肿瘤细胞系暴露于药物72小时后，测定每种药物的IC50值。
在37℃、5％CO2和98％湿度下，将所有的细胞系保持于它们各自的生长培养基中。生长培养基配方不含有抗生素。平板接种的前一天，向细胞提供新鲜的完全生长培养基。收获(平板接种)的当天，通过台盼蓝排除染色方法计数细胞。
将细胞收获并以150μL培养基中10,000个细胞的密度接种于96孔微量滴定板中，并且孵育24小时，以允许细胞在添加药物前贴壁。为了收集参考数据，于时间0(孵育细胞24小时后)对未处理的细胞进行MTS测定。
在即将添加至平板之前，于100％DMSO中以2.0mg/mL制备PM00104、顺铂、SN38和5-FU的储备溶液。对于多柔比星和奥沙利铂两种药物，在用于组织培养的无菌水中以2.0mg/mL制备它们的储备溶液。在乙醇中以2.0mg/mL制备多西他赛的储备溶液。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以实现最终的4×治疗浓度。每孔添加50μL每种稀释的测试物。
通过MTS检测(四唑)测定细胞毒性作用，MTS检测是测定活细胞数的比色法。孵育期(对于第0天板为24小时，对于测试和对照板为72小时)后，向每个微量滴定孔添加25μL的MTS+PMS溶液，并在37℃下孵育4小时。然后，将平板从培养箱移出，并置于平板摇床上5分钟(用铝箔覆盖避光)。在分光光度计平板读数器上于490nm下读取光密度。
对于每种测试试剂，由2至4个测定的平均值来计算IC50值。利用SoftMax程序生成回归曲线，然后手动插入50％抑制浓度(mg/mL)。
每种试剂对于每种细胞系的单独IC50值示于表1中。
表1：每种试剂的IC50值(mg/mL)
  细胞系   PM00104   顺铂   SN38   5-FU
  Hs746T   5.34E-06   3.92E-02   5.82E-05   5.46E-03
  AGS   5.21E-06   2.55E-02   5.49E-06   5.32E-04
  HGC-27   3.71E-06   2.56E-02   2.46E-04   4.34E-04
表1(续)：每种试剂的IC50值(mg/mL)
  细胞系   多柔比星   多西他赛   奥沙利铂
  Hs746T   8.97E-03   4.42E-02   8.14E-03
  AGS   1.56E-04   1.99E-03   2.89E-04
  HGC-27   1.77E-04   6.54E-03   1.92E-04
b.在测定的第二组中，按照以下特有IC50浓度的组合，将每种细胞系与PM00104和上文所述的每种试剂联合孵育：
PM00104的IC50       试剂的IC50
100％               0％
75％                25％
70％                30％
60％                40％
50％                50％
40％                60％
30％                70％
25％                75％
0％                 100％
0％                 0％
如上文所述进行细胞培养和细胞接种。如上文所述，以1.0mg/mL的药物浓度制备每种药物的储备溶液。按需要，将这些储备溶液进一步连续稀释以达到起始浓度。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的8×治疗浓度。每孔添加25μL的每种稀释的测试物。
通过上文所述的MTS检测来测定细胞毒性作用。按照下述分析数据：
1.Prism(Graphpad)软件程序被用于将数据相对对照值进行标准化(100％＝无试剂(药物)下的细胞生长；0％＝空白对照)。
2.将标准化的数据作图为x/y图。对每种试剂(药物)，画出连接100％IC50的值的线。显著高于该线的值表示拮抗，低于该线的值表示协同，而在该线上的值表示加成。
对肿瘤细胞的协同细胞毒性是最佳效果，并且表示PM00104与另一药物的联合比任一单独药物更有效。统计学显著的观察要求联合(PM00104+另一药物)吸光度值与两个端点值(单独PM00104和另一药物)之间存在差异。如果大部分的值统计上高于或低于该线(端点)，则分别描述了拮抗或协同，否则模式更符合加成相互作用。
根据该测定，发现：
a.人胃癌细胞中PM00104与顺铂的联合在Hs746T(图1)、AGS(图2)和HGC-27(图3)细胞系中在几乎所有的剂量比下是协同的。
b.Hs746T细胞系(图4)中PM00104与SN38的联合在大部分剂量比下是协同的，并且在AGS细胞系(图5)中在75/25-60/40的剂量比时，在HGC-27细胞系(图6)中在70/30和60/40的剂量比下表现出协同趋势。
c.PM00104与5-FU的联合在Hs746T细胞系(图7)中在75/25-40/60的剂量比下表现出协同趋势，以及在AGS细胞系(图8)中在75/25-60/40的剂量比下表现出协同趋势。在HGC-27细胞系(图9)中，联合表现出加成趋势。
d.PM00104与多柔比星的联合在Hs746T细胞系(图10)中在几乎所有剂量比下表现出协同，并且在AGS(图11)和HGC-27(图12)细胞系中表现出加成趋势。
e.PM00104与多西他赛的联合在Hs746T细胞系(图13)中是协同的，在AGS细胞系(图14)中表现出加成趋势，并且在HGC-27细胞系(图15)中表现出拮抗趋势。
f.PM00104与奥沙利铂的联合在Hs746T(图16)、AGS(图17)和HGC-27(图18)细胞系中表现出加成趋势。
实施例2.测定PM00104与化疗剂联合对人膀胱癌细胞系的作用的体外研究
本研究的目的是测定PM00104增强膀胱癌治疗中所用的化疗剂的抗肿瘤活性的能力。
评价了以下试剂与PM00104的联合：吉西他滨
Figure BPA00001294546600251
和顺铂。该测定所选择的人膀胱癌细胞系如下：5637和UM-UC-3细胞系。5637细胞系生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。UM-UC-3细胞系生长于补充了10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的MEM伊格尔培养基(MEM Eagle’s medium)中。
如实施例1所公开的，以两个部分进行筛查：
a.在测定的第一组中，在每个肿瘤细胞系暴露于药物72小时后，测定每种药物的IC50值。使用与实施例1公开的相同方法。
于100％DMSO中以2.0mg/mL制备PM00104和顺铂的储备溶液。在用于组织培养的无菌水中以2.0mg/mL制备吉西他滨的储备溶液。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的4×治疗浓度。每孔添加50μL每种稀释的测试物。
对于每种测试试剂，由3至4个测定的平均值来计算IC50值。每种试剂对于每种细胞系的单独IC50值示于表2中。
表2：每种试剂的IC50值(mg/mL)
  细胞系   PM00104   吉西他滨   顺铂
  5637   5.6E-06   1.9E-05   2.4E-03
  UM-UC-3   6.9E-06   2.2E-05   5.3E-04
b.在测定的第二组中，按照与实施例1公开相同的剂量比，将每种细胞系与PM00104和上述每种试剂联合孵育：
筛查的该第二部分所用的方法与实施例1公开的相同。
如上文所述，还以2.0mg/mL的药物浓度制备每种药物的储备溶液。按需要，将这些储备溶液进一步连续稀释以达到起始浓度。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的8×治疗浓度。每孔添加25μL的每种稀释的测试物。
根据该测定，发现：
a.人膀胱癌细胞中PM00104与吉西他滨的联合在5637细胞系(图19)中是协同的，并且在UM-UC-3细胞系(图20)中表现出加成趋势。
b.PM00104与顺铂的联合在5637细胞系(图21)中是协同的，并且在UM-UC-3细胞系(图22)中在60/40、30/70和25/75的剂量比下表现出加成趋势。
实施例3.测定PM00104与化疗剂联合对人胰腺癌细胞系的作用的体外研究
本研究的目的是测定PM00104增强胰腺癌治疗中所用的化疗剂的抗肿瘤活性的能力。
评价了吉西他滨
Figure BPA00001294546600261
与PM00104的联合。该测定所选择的人胰腺癌细胞系如下：BxPC-3、PANC-1、MIA PaCA-2和SW1990细胞系。BxPC-3细胞系生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中。PANC-1细胞系生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺的DMEM中。MIA PaCA-2细胞系生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、2.5％马血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。SW1990细胞系生长于补充了10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。
如实施例1所公开的，以两个部分进行筛查：
a.在测定的第一组中，在每个肿瘤细胞系暴露于药物72小时后，测定每种药物的IC50值。使用与实施例1公开的相同方法。
于100％DMSO中以2.0mg/mL制备PM00104的储备溶液。在用于组织培养的无菌水中以2.0mg/mL制备吉西他滨的储备溶液。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的4×治疗浓度。每孔添加50μL每种稀释的测试物。
对于每种测试试剂，由3个测定的平均值来计算IC50值。每种试剂对于每种细胞系的单独IC50值示于表3中。
表3：每种试剂的IC50值(mg/mL)
  细胞系   PM00104   吉西他滨
  BxPC-3   3.6E-05   8.4E-04
  PANC-1   1.5E-05   1.1E-01
  MIA PaCA-2   9.3E-05   7.9E-05
  SW1990   5.1E-06   1.2E-05
b.在测定的第二组中，按照与实施例1公开相同的剂量比，将每种细胞系与PM00104和吉西他滨联合孵育：
筛查的该第二部分所用的方法与实施例1公开的相同。
如上文所述，以2.0mg/mL的药物浓度制备每种药物的储备溶液。按需要，将这些储备溶液进一步连续稀释以达到起始浓度。在无血清RPMI 1640培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的8×治疗浓度。每孔添加25μL的每种稀释的测试物。
根据该测定，发现：人胰腺癌细胞中PM00104与吉西他滨的联合在所有的细胞系(BxPC-3(图23)、PANC-1(图24)、MIA PaCA-2(图25)和SW1990(图26)细胞系)中是协同的。
实施例4.测定人胰腺肿瘤异种移植物中PM00104与厄洛替尼和吉西他滨联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胰腺癌的异种移植物模型来评价PM00104增强厄洛替尼与吉西他滨的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的MIAPaCA-2细胞系。
MIA PaCA-2细胞生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、2.5％马血清和4mM L-谷氨酰胺的DMEM中。利用套管针，在每只动物右侧腹皮下(SC)植入0.2mL的50％基质胶/50％无抗生素的无血清培养基的悬浮液中的来自体外第18代的1×107MIAPaCA-2细胞。基质胶为生物细胞外基质，其在4℃下是液体，在37℃下是固体，并且通过保持细胞在局部区域紧密关联来促进肿瘤生长。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
利用Vernier测径器来进行肿瘤测量。使用计算长椭球体体积的公式，根据2维肿瘤测量来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝[L×W2]÷2，其中L为肿瘤的长度，即最长直径(单位为mm)，并且W为肿瘤宽度，即最短直径(单位为mm)。假定单位密度，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600281
In Life module V 8.0 SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。
在DPI(植入后天数)13时开始治疗。在这些实验中，通过同时共同给予两种药物来治疗联合治疗组，并且不试图将治疗排序。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。厄洛替尼提供为片剂的形式，将其溶于0.5％羧甲基纤维素/0.4％Tween-80/盐水。吉西他滨提供为含有盐酸吉西他滨的固体白色粉末的形式，在0.9％盐水中将其复原。
研究组和治疗方案列于表4中。
表4
IP：腹膜内给药：PO：口服给药；IV；静脉内给药
A：DPI 13、20和27；B：DPI 13-16、19-23、26-30、33-36
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸 q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与厄洛替尼或PM00104与吉西他滨)的平均肿瘤重量与厄洛替尼或吉西他滨的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准如下：
-当联合组的应答大于与联合疗法所用相同安排和剂量下的作为单一试剂(单一疗法)给予的最大活性试剂的最佳应答时，确定增强作用。
-如上文所述，通过比较单一疗法组的肿瘤生长抑制百分比与联合组的肿瘤生长抑制百分比来确定加成性，比较方式如下：
1.对于作为单一疗法以联合中所用的剂量给予的每种药物，以100-％T/C测定肿瘤生长抑制百分比。通过将治疗组(T)的平均肿瘤重量与对照组(C)中的平均肿瘤重量比较来获得％T/C(T/C×100％)。
2.将两个分数相加以确定“预期应答”，如果每种试剂产生与作为单一疗法给予时相同的应答。
3.从对联合治疗组所测定的肿瘤生长抑制百分比中减去该“预期应答”：
a.负数表示联合两种药物的效果小于加成。
b.如果所得的数接近0，则联合两种药物的效果被确定为加成。
c.正数表示联合两种药物的效果大于加成。
因此，联合治疗大于加成的效果对应于协同效果，其中两种药物的联合效果在治疗上优于根据单独给予每种药物时的效果所预期的效果。
表5报道了每种治疗所获得的％T/C值，图27-29示出用不同剂量的对照(媒介物)、PM00104、吉西他滨、PM00104加吉西他滨或PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中MIAPaCA-2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表5
Figure BPA00001294546600301
表6示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和140mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表6
Figure BPA00001294546600311
表7示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和厄洛替尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的厄洛替尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与厄洛替尼的联合的增强作用和加成性程度。
表7
Figure BPA00001294546600312
表8示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和厄洛替尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和50mg/kg/天的厄洛替尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与厄洛替尼的联合的增强作用和加成性程度。
表8
Figure BPA00001294546600321
根据该测定，发现：
a.与对照组相比，PM00104与吉西他滨的联合获得了统计学显著(p≤0.001)的抗肿瘤活性。该联合疗法产生了超过单一试剂组所获得的结果的统计学显著(p＜0.001)的活性增强作用。治疗结束时，该增强作用确定为大于加成。
b.与对照组相比，PM00104与厄洛替尼(在厄洛替尼的两个剂量下)的联合获得了统计学显著(p≤0.001)的抗肿瘤活性，以及超过所获得的结果的统计学显著(p＜0.001)的活性增强作用。该增强作用确定为大于加成。
实施例5.测定人胰腺肿瘤异种移植物中PM00104与吉西他滨联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胰腺癌的异种移植物模型来评价PM00104增强吉西他滨的抗肿瘤活性的能力。
将雌性CB17.SCID小鼠(Charles River Lab.)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的BxPC-3细胞系。
BxPC-3细胞生长于补充了10％FBS和L-谷氨酰胺的无抗生素的完全RPMI 1640中。利用13G套管针和1cc注射器，在每只动物右侧腹SC植入0.2mL的基质胶与RPMI 1640无血清培养基的无抗生素悬浮液中的来自体外第12代的1×107BxPC-3细胞。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600331
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 14开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。吉西他滨提供为含有盐酸吉西他滨的固体白色粉末的形式，在0.9％盐水中将其复原。
研究组和治疗方案列于表9中。
表9
Figure BPA00001294546600332
A：DPI 14、21和28；安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：比较两种试剂联合(PM00104与吉西他滨)的平均肿瘤重量与吉西他滨平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表10报道了每种治疗所获得的％T/C值，图30示出用对照(媒介物)、PM00104、吉西他滨和PM00104加吉西他滨治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表10
Figure BPA00001294546600341
表11示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和180mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表11
Figure BPA00001294546600342
根据该测定，发现：与对照组相比，PM00104与吉西他滨的联合获得了统计学显著(p≤0.05)的抗肿瘤活性。另外，联合疗法产生了大于加成的活性的增强作用。
实施例6.测定人胰腺肿瘤异种移植物中PM00104与厄洛替尼联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胰腺癌的异种移植物模型来评价PM00104增强厄洛替尼的抗肿瘤活性的能力。
将雌性CB17.SCID小鼠(Charles River Lab.)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的BxPC-3细胞系。如实施例5所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600351
In Life moduleV 8.0 SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 9开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。厄洛替尼提供为片剂的形式，将其溶于0.5％羧甲基纤维素/0.4％Tween-80/盐水(CTS)。
研究组和治疗方案列于表12中。
表12
A：周期1＝DPI 9-13；周期2＝DPI 16-20；周期3＝DPI 23-27
B：DPI 9、16和23
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与厄洛替尼)的平均肿瘤重量与厄洛替尼平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表13报道了每种治疗所获得的％T/C值，图31-33示出用不同剂量的对照(媒介物)、PM00104、厄洛替尼和PM00104加厄洛替尼治疗的小鼠中BxPC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表13
Figure BPA00001294546600361
表14示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和厄洛替尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和50mg/kg/天的厄洛替尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与厄洛替尼的联合的增强作用和加成性程度。
表14
Figure BPA00001294546600362
表15示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和厄洛替尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和30mg/kg/天的厄洛替尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与厄洛替尼的联合的增强作用和加成性程度。
表15
Figure BPA00001294546600371
表16示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和厄洛替尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和15mg/kg/天的厄洛替尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与厄洛替尼的联合的增强作用和加成性程度。
表16
Figure BPA00001294546600372
根据该测定，发现：在三个测试剂量下，PM00104与厄洛替尼的联合提供了抗肿瘤活性的大于加成的增强作用。
实施例7.测定人膀胱肿瘤异种移植物中PM00104与顺铂、紫杉醇和吉西他滨联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人膀胱癌的异种移植物模型来评价PM00104增强顺铂、紫杉醇和吉西他滨的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的UM-UC-3细胞系。
UM-UC-3细胞生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的基本必需培养基(Eagle’s)中。利用套管针和1cc注射器，在每只动物右侧腹SC植入0.2mL的50％基质胶/50％无抗生素的无血清培养基的悬浮液中的来自体外第17代的5×106UM-UC-3细胞。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 15开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。吉西他滨提供为含有盐酸吉西他滨的固体白色粉末的形式，在0.9％盐水中将其复原。顺铂和紫杉醇提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表17中。
表17
Figure BPA00001294546600382
A：DPI 15、22和29；B：DPI 15、19和23
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方法评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与顺铂、PM00104与吉西他滨或PM00104与紫杉醇)的平均肿瘤重量与顺铂、吉西他滨或紫杉醇平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表18报道了每种治疗所获得的％T/C值，图34-36示出用对照(媒介物)、PM00104、顺铂、吉西他滨、紫杉醇以及相应的联合治疗的小鼠中UM-UC-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表18
表19示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和顺铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和5mg/kg/天的顺铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与顺铂的联合的增强作用和加成性程度。
表19
Figure BPA00001294546600401
表20示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和180mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表20
Figure BPA00001294546600402
表21示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和15mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表21
根据该测定，发现：
a.PM00104与顺铂的联合获得了统计学显著(p＜0.001)大于加成的抗肿瘤活性的增强作用。
b.与对照组相比，PM00104与吉西他滨的联合获得了统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性。在治疗期结束(DPI 29)时，该增强作用确定为大于加成。
c.与单一疗法对照相比，PM00104与紫杉醇的联合获得了统计学显著(p≤0.001)的抗肿瘤活性的增强作用。在实验结束时，该增强作用确定为加成。
实施例8.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与顺铂和紫杉醇联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌的异种移植物模型来评价PM00104增强顺铂和紫杉醇的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有11只小鼠，第2-4组含有7只小鼠，剩余的组含有8只小鼠。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的Hs746T细胞系。
Hs746T细胞生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺的DMEM中。利用套管针，在每只动物右侧腹SC植入0.2mL的50％基质胶/50％无抗生素的无血清培养基的悬浮液中的来自体外第18代的5×106Hs746T细胞。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600411
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 16开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。顺铂和紫杉醇提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表22中。
表22
Figure BPA00001294546600421
A：DPI 16、23和30；B：DPI 16、26和33；C：DPI 16、20和24
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与顺铂或PM00104与紫杉醇)的平均肿瘤重量与顺铂或紫杉醇的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表23报道了每种治疗所获得的％T/C值，图37-38示出用对照(媒介物)、PM00104、顺铂、紫杉醇以及相应的联合治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表23
Figure BPA00001294546600422
表24示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和顺铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和5mg/kg/天的顺铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与顺铂的联合的增强作用和加成性程度。
表24
Figure BPA00001294546600431
表25示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和10mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表25
Figure BPA00001294546600432
根据该测定，发现：
a.PM00104与顺铂的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，使联合组中肿瘤几乎完全消退。在后续期结束时，该增强作用确定为大于加成。
b.在治疗期间以及后续期结束时，PM00104与紫杉醇的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p≤0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，使肿瘤几乎完全消退。
实施例9.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康和多柔比星联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌的异种移植物模型来评价PM00104增强5-FU、伊立替康和多柔比星的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的Hs746T细胞系。如实施例8所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 15开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。5-FU提供为溶液，随后用注射用水进行稀释。伊立替康提供为含有盐酸伊立替康三水合物的溶液的形式，将其在0.9％无菌盐水中稀释。多柔比星提供为冻干粉末的形式，将其在0.9％盐水中复原。
研究组和治疗方案列于表26中。
表26
Figure BPA00001294546600442
Figure BPA00001294546600451
A：DPI 15、22和29；B：DPI 15；C：DPI 22和29；D：DPI 15、19和23
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与5-FU、PM00104与伊立替康或PM00104与多柔比星)的平均肿瘤重量与5-FU、伊立替康或多柔比星的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表27报道了每种治疗所获得的％T/C值，图39-41示出用对照(媒介物)、PM00104、5-FU、伊立替康、多柔比星以及相应的联合治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表27
Figure BPA00001294546600452
表28示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和5-FU的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和DPI 15时的50mg/kg/天的5-FU及DPI 22和29时的100mg/kg/天的5-FU。另外，提供了所述剂量的PM00104与5-FU的联合的增强作用和加成性程度。
表28
Figure BPA00001294546600461
表29示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和伊立替康的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和20
mg/kg/天的伊立替康。另外，提供了所述剂量的PM00104与伊立替康的联合的增强作用和加成性程度。
表29
表30示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多柔比星的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和6mg/kg/天的多柔比星。另外，提供了所述剂量的PM00104与多柔比星的联合的增强作用和加成性程度。
表30
根据该测定，发现：
a.在治疗期间，PM00104与5-FU的联合获得了抗肿瘤活性的加成增强作用，并且在观察期结束时确定为大于加成。
b.PM00104与伊立替康的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学高度显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用，并且在实验结束时，该增强作用评级为大于加成。
c.PM00104与多柔比星的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，并且在实验结束时，该增强作用评级为大于加成。
实施例10.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与多西他赛和奥沙利铂联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌的异种移植物模型来评价PM00104增强多西他赛和奥沙利铂的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的Hs746T细胞系。如实施例8所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600471
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 14开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。多西他赛提供为用于稀释的浓缩液，随后用注射用水(wfi)中13％乙醇将其稀释。奥沙利铂提供为溶液，随后用5％葡萄糖注射液(USP)进行稀释。
研究组和治疗方案列于表31中。
表31
A：DPI 14、21和28；安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与多西他赛或PM00104与奥沙利铂)的平均肿瘤重量与多西他赛或奥沙利铂的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表32报道了每种治疗所获得的％T/C值，图42-45示出用对照(媒介物)、PM00104、多西他赛、奥沙利铂以及相应的联合治疗的小鼠中Hs746T肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表32
Figure BPA00001294546600491
表33示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多西他赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和16mg/kg/天的多西他赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与多西他赛的联合的增强作用和加成性程度。
表33
Figure BPA00001294546600492
表34示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多西他赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和8mg/kg/天的多西他赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与多西他赛的联合的增强作用和加成性程度。
表34
Figure BPA00001294546600493
Figure BPA00001294546600501
表35示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和奥沙利铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和8mg/kg/天的奥沙利铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与奥沙利铂的联合的增强作用和加成性程度。
表35
Figure BPA00001294546600502
表36示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和奥沙利铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和4mg/kg/天的奥沙利铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与奥沙利铂的联合的增强作用和加成性程度。
表36
Figure BPA00001294546600503
根据该测定，发现：
a.PM00104与多西他赛的联合获得了超过PM00104作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，但未获得超过多西他赛作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著的抗肿瘤活性的增强作用；并且在实验结束时，对于16mg/kg/天的多西他赛，增强作用评级为小于加成，而在实验结束时，对于8mg/kg/天的多西他赛，增强作用评级为大于加成。
b.PM00104与奥沙利铂的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用，并且在实验结束时，该增强作用评级为大于加成。
实施例11.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌的异种移植物模型来评价PM00104增强5-FU的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤碎块进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自DCT肿瘤库的MRI-H-254细胞系。
从供体动物移除MRI-H-254碎块，并清除组织的膜和任何出血及坏死区域，并利用13G套管针，将来自体内第5代的3-4mm3碎块SC植入每个动物的右侧腹。对于研究中用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600511
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 20开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。5-FU提供为注射小瓶的形式，用0.9％无菌盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表37中。
表37
Figure BPA00001294546600521
A：DPI 20、27和34；B：DPI 20、24和28
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与5-FU)的平均肿瘤重量与5-FU的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表38报道了每种治疗所获得的％T/C值，图46-47示出用对照(媒介物)、PM00104、5-FU以及相应的联合治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表38
Figure BPA00001294546600522
表39示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和5-FU的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的5-FU。另外，提供了所述剂量的PM00104与5-FU的联合的增强作用和加成性程度。
表39
表40示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和5-FU的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和50mg/kg/天的5-FU。另外，提供了所述剂量的PM00104与5-FU的联合的增强作用和加成性程度。
表40
Figure BPA00001294546600532
根据该测定，发现：PM00104与5-FU的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，并且在实验结束时，该增强作用评级为大于加成。
实施例12.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与多西他赛和奥沙利铂联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌的异种移植物模型来评价PM00104增强多西他赛和奥沙利铂的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤碎块进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自DCT肿瘤库的MRI-H-254细胞系。如实施例11所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600541
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 20开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。多西他赛提供为用于稀释的浓缩液，随后用注射用水中13％乙醇将其稀释。奥沙利铂提供为溶液，随后用5％葡萄糖注射液(USP)进行稀释。
研究组和治疗方案列于表41中。
表41
A：DPI 20、27和34；安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与多西他赛或PM00104与奥沙利铂)的平均肿瘤重量与多西他赛或奥沙利铂的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表42报道了每种治疗所获得的％T/C值，图48-51示出用对照(媒介物)、PM00104、多西他赛、奥沙利铂以及相应的联合治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表42
Figure BPA00001294546600551
表43示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多西他赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和16mg/kg/天的多西他赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与多西他赛的联合的增强作用和加成性程度。
表43
Figure BPA00001294546600561
表44示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多西他赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和8mg/kg/天的多西他赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与多西他赛的联合的增强作用和加成性程度。
表44
表45示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和奥沙利铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和8mg/kg/天的奥沙利铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与奥沙利铂的联合的增强作用和加成性程度。
表45
Figure BPA00001294546600563
Figure BPA00001294546600571
表46示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和奥沙利铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和4mg/kg/天的奥沙利铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与奥沙利铂的联合的增强作用和加成性程度。
表46
Figure BPA00001294546600572
根据该测定，发现：
a.PM00104与多西他赛的联合获得了统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用。发现该增强作用大于加成。
b.PM00104与奥沙利铂的联合获得了统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用。该增强作用评级为大于加成。
实施例13.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与多柔比星和紫杉醇联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌异种移植物模型来评价PM00104增强多柔比星和紫杉醇的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤碎块进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有11只小鼠，第2-6组含有8只小鼠/组，剩余的组含有9只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自DCT肿瘤库的MRI-H-254细胞系。如实施例11所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600581
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 17开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。多柔比星提供为冻干粉末的形式，将其在0.9％盐水中复原。紫杉醇提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表47中。
表47
Figure BPA00001294546600582
Figure BPA00001294546600591
A：DPI 17、24和31；B：DPI 17、21、25
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与多柔比星或PM00104与紫杉醇)的平均肿瘤重量与多柔比星或紫杉醇的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表48报道了每种治疗所获得的％T/C值，图52-57示出用对照(媒介物)、PM00104、多柔比星、紫杉醇以及相应的联合治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表48
Figure BPA00001294546600592
表49示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多柔比星的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和6mg/kg/天的多柔比星。另外，提供了所述剂量的PM00104与多柔比星的联合的增强作用和加成性程度。
表49
Figure BPA00001294546600601
表50示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多柔比星的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.45mg/kg/天的PM00104和6mg/kg/天的多柔比星。另外，提供了所述剂量的PM00104与多柔比星的联合的增强作用和加成性程度。
表50
Figure BPA00001294546600602
表51示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和多柔比星的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.23mg/kg/天的PM00104和6mg/kg/天的多柔比星。另外，提供了所述剂量的PM00104与多柔比星的联合的增强作用和加成性程度。
表51
Figure BPA00001294546600611
表52示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.90mg/kg/天的PM00104和12.5mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表52
Figure BPA00001294546600612
表53示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.45mg/kg/天的PM00104和12.5mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表53
表54示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.23mg/kg/天的PM00104和12.5mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表54
Figure BPA00001294546600622
根据该测定，发现：
a.PM00104与多柔比星的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。发现该增强作用小于加成。另外，在评价的剂量和安排中，联合导致了某些毒性迹象，动物死亡率为50％。
b.PM00104与紫杉醇的联合获得了统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用。该增强作用评级为小于加成，在较低剂量的PM00104时观察到最佳结果。
实施例14.测定人胃肿瘤异种移植物中PM00104与顺铂、紫杉醇和伊立替康联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人胃癌异种移植物模型来评价PM00104增强顺铂、紫杉醇和伊立替康的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤碎块进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为9只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自DCT肿瘤库的MRI-H-254细胞系。如实施例11所述，使该细胞系生长并将其植入动物。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600631
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 16开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。顺铂和紫杉醇提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。伊立替康提供为含有盐酸伊立替康三水合物的溶液的形式，将其在0.9％无菌盐水中稀释。
研究组和治疗方案列于表55中。
表55
A：DPI 16、23和30；B：DPI 16、20、24
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与顺铂、PM00104与伊立替康或PM00104与紫杉醇)的平均肿瘤重量与顺铂、伊立替康或紫杉醇的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表56报道了每种治疗所获得的％T/C值，图58-63示出用对照(媒介物)、PM00104、顺铂、伊立替康、紫杉醇以及相应的联合治疗的小鼠中MRI-H-254肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表56
表57示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和顺铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和5mg/kg/天的顺铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与顺铂的联合的增强作用和加成性程度。
表57
Figure BPA00001294546600651
表58示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和顺铂的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和3mg/kg/天的顺铂。另外，提供了所述剂量的PM00104与顺铂的联合的增强作用和加成性程度。
表58
Figure BPA00001294546600652
表59示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和伊立替康的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和18mg/kg/天的伊立替康。另外，提供了所述剂量的PM00104与伊立替康的联合的增强作用和加成性程度。
表59
Figure BPA00001294546600661
表60示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和伊立替康的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和10mg/kg/天的伊立替康。另外，提供了所述剂量的PM00104与伊立替康的联合的增强作用和加成性程度。
表60
表61示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和25mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表61
Figure BPA00001294546600663
表62示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和紫杉醇的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和12.5mg/kg/天的紫杉醇。另外，提供了所述剂量的PM00104与紫杉醇的联合的增强作用和加成性程度。
表62
Figure BPA00001294546600672
根据该测定，发现：
a.PM00104与顺铂的联合获得了超过顺铂作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用，但未获得超过PM00104作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著的抗肿瘤活性的增强作用，在实验结束时，增强作用评级为小于加成。
b.PM00104与伊立替康的联合获得了超过伊立替康作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学高度显著(p＜0.001)的抗肿瘤活性的增强作用，但未获得超过PM00104作为单一试剂对照组所获得的结果的统计学显著的抗肿瘤活性的增强作用，在实验结束时，增强作用评级为小于加成。
c.PM00104与紫杉醇的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用，其在紫杉醇剂量为12.5mg/kg/天时是统计学显著的(p＜0.001)。该增强作用评级为小于加成。
实施例15.测定人肝细胞癌异种移植物中PM00104与索拉非尼联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人肝细胞癌的异种移植物模型来评价PM00104增强索拉非尼的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为9只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的HepG2细胞系。
HepG2细胞生长于补充了10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的MEM中。利用13G套管针，在每只动物右侧腹SC植入0.2mL的50％基质胶与50％无抗生素的无血清培养基的悬浮液中的5×106HepG2细胞。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 19开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。索拉非尼提供为片剂的形式，将其溶于Cremophor EL/乙醇/水(CEW)(12.5，12.5，75)最终比例。
研究组和治疗方案列于表63中。
表63
Figure BPA00001294546600682
A：DPI 19、26和33；B：DPI 19-33
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与索拉非尼)的平均肿瘤重量与索拉非尼的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表64报道了每种治疗所获得的％T/C值，图64-67示出用对照(媒介物)、PM00104、索拉非尼以及相应的联合治疗的小鼠中HepG2肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表64
Figure BPA00001294546600692
表65示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和60mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表65
Figure BPA00001294546600701
表66示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和30mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表66
表67示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.6mg/kg/天的PM00104和60mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表67
Figure BPA00001294546600703
表68示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.6mg/kg/天的PM00104和30mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表68
Figure BPA00001294546600711
根据该测定，发现：PM00104与索拉非尼的联合获得了超过索拉非尼对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用。观察到的增强作用评级为小于加成。
实施例16.测定人肝细胞癌异种移植物中PM00104与索拉非尼联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人肝细胞癌的异种移植物模型来评价PM00104增强索拉非尼的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤细胞悬浮液进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的PLC/PRF/5细胞系。
PLC/PRF/5生长于补充了10％FBS和1％L-谷氨酰胺的伊格尔基本必需培养基中。利用13G套管针和1mL注射器，在每只动物右侧腹SC植入0.2mL的50％基质胶与50％无抗生素的无血清MEM培养基的悬浮液中的5×106PLC/PRF/5细胞。将等小份的制备用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600721
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 14开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。索拉非尼提供为片剂的形式，将其溶于Cremophor EL/乙醇/水(CEW)(12.5，12.5，75)最终比例。
研究组和治疗方案列于表69中。
表69
Figure BPA00001294546600722
A：DPI 14、21和28；B：DPI 14-34
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与索拉非尼)的平均肿瘤重量与索拉非尼的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表70报道了每种治疗所获得的％T/C值，图68-71示出用对照(媒介物)、PM00104、索拉非尼以及相应的联合治疗的小鼠中PLC/PRF/5肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表70
Figure BPA00001294546600731
表71示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和60mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表71
Figure BPA00001294546600732
表72示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和30mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表72
Figure BPA00001294546600741
表73示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.45mg/kg/天的PM00104和60mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表73
Figure BPA00001294546600742
表74示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和索拉非尼的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.45mg/kg/天的PM00104和30mg/kg/天的索拉非尼。另外，提供了所述剂量的PM00104与索拉非尼的联合的增强作用和加成性程度。
表74
Figure BPA00001294546600743
Figure BPA00001294546600751
根据该测定，发现：PM00104与索拉非尼的联合获得了超过索拉非尼对照组所获得的结果的统计学显著(p＜0.01)的抗肿瘤活性的增强作用，在两种药物的较低剂量时观察到最佳结果。该最佳增强作用评级为大于加成。
实施例17.测定人卵巢肿瘤异种移植物中PM00104与贝伐珠单抗联合的效果的体内研究
这些研究的目的是通过利用人卵巢癌的异种移植物模型来评价PM00104增强贝伐珠单抗的抗肿瘤活性的能力。
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在用肿瘤碎块进行肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为获自ATCC(Manassas，VA)的SK-OV-3细胞系。
从供体动物移除SK-OV-3碎块，并清除组织的膜和任何出血及坏死区域，并利用13G套管针，将来自体内第2代的3-4mm3碎块SC植入每只动物的右侧腹。对研究中用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600752
In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 14开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。贝伐珠单抗提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表75中。
表75
Figure BPA00001294546600761
A：DPI 14、21和28；B：DPI 14、17、21、24、28和31
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周两次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与贝伐珠单抗)的平均肿瘤重量与贝伐珠单抗的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表76报道了每种治疗所获得的％T/C值，图72-73示出用对照(媒介物)、PM00104、贝伐珠单抗以及相应的联合治疗的小鼠中SK-OV-3肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表76
Figure BPA00001294546600762
表77示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和贝伐珠单抗的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和5mg/kg/天的贝伐珠单抗。另外，提供了所述剂量的PM00104与贝伐珠单抗的联合的增强作用和加成性程度。
表77
Figure BPA00001294546600771
表78示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和贝伐珠单抗的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和2.5mg/kg/天的贝伐珠单抗。另外，提供了所述剂量的PM00104与贝伐珠单抗的联合的增强作用和加成性程度。
表78
Figure BPA00001294546600772
根据该测定，发现：PM00104与贝伐珠单抗的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的抗肿瘤活性的增强作用。在较低的贝伐珠单抗剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
实施例18.测定PM00104与化疗剂联合对人肺癌、乳腺癌和结肠癌细胞系的作用的体外研究
本研究的目的是测定PM00104增强肺癌、乳腺癌和结肠癌治疗中所用的化疗剂的抗肿瘤活性的能力。
评价了以下试剂与PM00104的联合：紫杉醇、顺铂、吉西他滨、多柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康和奥沙利铂。该测定所选择的人癌细胞系如下：A-549(肺癌)、NCI-H460(肺癌)、NCI-H23(肺癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、BT-474(乳腺癌)、MCF-7(乳腺癌)、LoVo(结肠癌)、HCT-116(结肠癌)和HT-29(结肠癌)细胞系。
-A-549、NCI-H460、MDA-MB-231、MCF-7、LoVo和HT-29细胞生长于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。
-NCI-H23细胞生长于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI中。
-BT-474细胞生长于补充了1％ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI中。
-HCT-116细胞生长于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的McCoy’s中。
以两个部分进行筛查：
a.在测定的第一组中，在每个肿瘤细胞系暴露于药物72小时后，测定每种药物的IC50值。
在37℃、5％CO2和98％湿度下，将所有的细胞系保持于它们各自的生长培养基中。平板接种前，用胰酶消化细胞培养物，并利用自动流式细胞仪估计细胞数目。
将细胞收获并以150μL培养基中合适的细胞密度(5,000-10,000个细胞)接种于96孔微量滴定板，并且孵育24小时，以允许细胞在添加药物前贴壁。
在100％DMSO中，以1.0mg/mL制备PM00104、紫杉醇、吉西他滨、多柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)和伊立替康的储备溶液。在用于组织培养的双重灭菌水中，以1.0mg/mL制备顺铂和奥沙利铂的储备溶液。在无血清培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的4×治疗浓度。每孔添加50μL每种稀释的测试物。
通过MTT检测(四唑)测量细胞毒性作用，MTT检测是用于测定活细胞数的比色法。孵育期(72小时)后，向每个微量滴定孔添加50μL的MTT溶液，并在37℃下再孵育8小时。然后，移除培养基，并添加50μL的DMSO以溶解MTT晶体。在分光光度计微板读数器上，于540nm下读取光密度。
对于每种测试试剂，由2至4个测定的平均值来计算IC50值。利用Prism v5.02软件(GraphPad)生成回归曲线，然后自动插入50％抑制浓度。
每种试剂对于每种细胞系的单独IC50值示于表79中。
表79：每种试剂的IC50值(mol/L)
Figure BPA00001294546600791
Figure BPA00001294546600801
b.在测定的第二组中，以下文的特有IC50浓度的组合，将细胞系与PM00104和上文所述的每种试剂联合孵育：
PM00104的IC50   试剂的IC50
100％           0％
75％            25％
70％            30％
60％            40％
50％            50％
40％            60％
30％            70％
25％            75％
0％             100％
如上文所述进行细胞培养和细胞接种。如上文所述，以1.0mg/mL的药物浓度制备每种药物的储备溶液。按需要，将这些储备溶液进一步连续稀释以达到起始浓度。在无血清培养基中制备另外的连续稀释液以达到最终的8×治疗浓度。每孔添加25μL的每种稀释的测试物。
按照上文所述，通过MTT检测测量细胞毒性作用。按照以下分析数据：
1.Prism v5.02软件(Graphpad)程序被用于将数据相对对照值进行标准化(100％＝无试剂(单独媒介物)下的细胞生长；0％＝空白对照)。
2.将标准化的数据作图为x/y图。对每种试剂(药物)，画出连接100％IC50的值的线。显著高于该线的值表示拮抗，显著低于该线的值表示协同，而在该线上的值表示加成。
对肿瘤细胞的协同细胞毒性是最优的效果，并且表示PM00104与另一药物的联合比任何单独的药物更有效。统计学显著的观察要求联合(PM00104+另一药物)细胞存活值百分比与两个端点值(单独PM00104和另一药物)之间存在差异。如果大部分的值统计上高于或低于该线(端点)，则分别描述了拮抗或协同，否则模式更符合加成相互作用。
根据该测定，发现：
a.人肺癌细胞中PM00104与吉西他滨的联合在NCI-H23(图76)细胞系中在60/40、70/30和75/25的剂量比下是协同的；并且在NCI-H460(图75)细胞系中，该联合表现出加成趋势，在75/25的剂量比下具有协同效果。另外，在A549(图74)细胞系中，该联合表现出加成趋势。
b.人肺癌细胞中PM00104与紫杉醇的联合在NCI-H23(图79)细胞系中是协同的；并且在NCI-H460(图78)和A549(图77)细胞系中，该联合表现出加成趋势。
c.人肺癌细胞中PM00104与顺铂的联合在NCI-H460(图81)细胞系中在30/70和50/50剂量比下是协同的。在A549(图80)细胞系中，该联合表现出加成趋势，并且在NCI-H23(图82)细胞系中，该联合表现出拮抗趋势。
d.人乳腺癌细胞中PM00104与吉西他滨的联合在MDA-MB-231(图83)、BT-474(图84)和MCF-7(图85)细胞系中是协同的。
e.人乳腺癌细胞中PM00104与紫杉醇的联合在MCF-7(图88)细胞系中是协同的；并且在MDA-MB-231(图86)和BT-474(图87)细胞系中，该联合表现出加成趋势。
f.人乳腺癌细胞中PM00104与多柔比星的联合在MDA-MB-231(图89)、BT-474(图90)和MCF-7(图91)细胞系中是协同的。
g.结肠癌细胞中PM00104与5-氟尿嘧啶的联合在HT-29(图94)和LoVo(图93)细胞系中在全部或几乎全部剂量比下是协同的；并且，在HCT-116(图92)中，该联合表现出加成趋势。
h.人结肠癌细胞中PM00104与奥沙利铂的联合在LoVo(图96)、HT-29(图97)和HCT-116(图95)细胞系中表现出加成趋势。
i.人结肠癌细胞中PM00104与伊立替康的联合在LoVo(图99)细胞系中是协同的；并且在HT-29(图100)和HCT-116(图98)细胞系中，该联合表现出加成趋势。
实施例19.测定人肺癌异种移植物中PM00104与坦罗莫司和贝伐珠单抗联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
这些研究中所用的肿瘤模型为NCI-H460细胞系，其是获自ATCC(Manassas，VA)的人NSCLC细胞系。NCI-H460细胞生长于补充了10％FBS、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠、4.5g/l葡萄糖、1.5g/l碳酸氢钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。利用装有13G套管针的1ml注射器，将来自体外第7代的细胞SC植入于研究小鼠：5×106细胞/小鼠，所述细胞在0.2ml的50％基质胶/50％无血清或抗生素的NCI-H460的RPMI培养基中。对研究中用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到139±36mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600821
In Life module V8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 9开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。坦罗莫司提供为无水乙醇溶液的形式，随后用含有聚山梨醇酯80(40％w/v)、聚乙二醇400(42.8％w/v)和无水乙醇(dehydratedalcohol)(19.9％w/v)的稀释溶液进行稀释，然后在0.9％盐水中稀释成给药浓度。贝伐珠单抗提供为溶液，随后用0.9％盐水进行稀释。
研究组和治疗方案列于表80中。
表80
Figure BPA00001294546600831
A：DPI 9、16和23；B：DPI 9-13、16-20和23-27；C：DPI 9、13、16、20、23和27
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，分别比较两种试剂联合(PM00104与贝伐珠单抗或PM00104与坦罗莫司)的平均肿瘤重量与贝伐珠单抗或坦罗莫司的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表81报道了每种治疗所获得的％T/C值，图101-104示出用对照、PM00104、贝伐珠单抗、坦罗莫司以及相应的联合治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表81
Figure BPA00001294546600841
表82示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和贝伐珠单抗的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和5mg/kg/天的贝伐珠单抗。另外，提供了所述剂量的PM00104与贝伐珠单抗的联合的增强作用和加成性程度。
表82
Figure BPA00001294546600842
表83示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和贝伐珠单抗的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和2.5mg/kg/天的贝伐珠单抗。另外，提供了所述剂量的PM00104与贝伐珠单抗的联合的增强作用和加成性程度。
表83
Figure BPA00001294546600851
表84示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和坦罗莫司的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和20mg/kg/天的坦罗莫司。另外，提供了所述剂量的PM00104与坦罗莫司的联合的增强作用和加成性程度。
表84
Figure BPA00001294546600852
表85示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和坦罗莫司的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和10mg/kg/天的坦罗莫司。另外，提供了所述剂量的PM00104与坦罗莫司的联合的增强作用和加成性程度。
表85
Figure BPA00001294546600861
根据该测定，发现：PM00104与贝伐珠单抗的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的抗肿瘤活性的增强作用。在两种贝伐珠单抗的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
根据该测定，发现：PM00104与坦罗莫司的联合获得了超过任一单一试剂对照组所获得的结果的抗肿瘤活性的增强作用。在两种坦罗莫司的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
实施例20.测定人肺癌异种移植物中PM00104与吉西他滨联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为9只小鼠/组。
该研究中所用的肿瘤模型为NCI-H460细胞系，其是获自ATCC(Manassas，VA)的人NSCLC细胞系。如实施例19所述，使该细胞系生长并将其植入动物。将来自体外第9代的细胞SC植入研究小鼠。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用In Life moduleV 8.0 SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 8开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。吉西他滨提供为含有盐酸吉西他滨的固体白色粉末的形式，在0.9％盐水中将其复原。
研究组和治疗方案列于表86中。
表86
Figure BPA00001294546600871
A：DPI 8、15和22；安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与吉西他滨)的平均肿瘤重量与吉西他滨的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表87报道了每种治疗所获得的％T/C值，图105-106示出用对照、PM00104、吉西他滨以及相应的联合治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表87
Figure BPA00001294546600872
表88示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和180mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表88
Figure BPA00001294546600881
表89示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和90mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表89
Figure BPA00001294546600882
根据该测定，发现：PM00104与吉西他滨的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。在研究结束时，具有较低剂量的吉西他滨的联合的增强作用评级为加成。
实施例21.测定人肺癌异种移植物中PM00104与吉西他滨联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有13只小鼠，每个治疗组各为9只小鼠/组。
该研究中所用的肿瘤模型为CaLu-6细胞系，其是获自ATCC(Manassas，VA)的人肺癌细胞系。CaLu-6细胞生长于补充了10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的伊格尔基本必需培养基(MEM)中。利用装有13G套管针的1ml注射器，将来自体外第12代的细胞SC植入研究小鼠：5×106细胞/小鼠，所述细胞在0.2ml的50％基质胶/50％无血清或抗生素的CaLu-6的MEM培养基中。对研究中用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到99±17mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600891
In Life module V8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 9开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。吉西他滨提供为含有盐酸吉西他滨的固体白色粉末的形式，在0.9％盐水中将其复原。
研究组和治疗方案列于表90中。
表90
Figure BPA00001294546600892
A：DPI 9、16和23；安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与吉西他滨)的平均肿瘤重量与吉西他滨的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表91报道了每种治疗所获得的％T/C值，图107-108示出用对照、PM00104、吉西他滨以及相应的联合治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表91
Figure BPA00001294546600901
表92示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和180mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表92
Figure BPA00001294546600902
表93示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和吉西他滨的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和90mg/kg/天的吉西他滨。另外，提供了所述剂量的PM00104与吉西他滨的联合的增强作用和加成性程度。
表93
根据该测定，发现：PM00104与吉西他滨的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。在两种吉西他滨的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
实施例22.测定人肺癌异种移植物中PM00104与培美曲赛联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
该研究中所用的肿瘤模型为CaLu-6细胞系，其是获自ATCC(Manassas，VA)的人肺癌细胞系。如实施例21所述，使该细胞系生长并将其植入动物。将来自体外第10代的细胞SC植入研究小鼠。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到86±16mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600912
In Life module V8.0 SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 9开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。培美曲赛提供为含有培美曲赛二钠的固体粉末的形式，将其在0.9％盐水中复原。
研究组和治疗方案列于表94中。
表94
Figure BPA00001294546600921
A：DPI 9、16和23；B：DPI 9-13、16-20和23-27
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与培美曲赛)的平均肿瘤重量与培美曲赛的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表95报道了每种治疗所获得的％T/C值，图109-110示出用对照、PM00104、培美曲赛以及相应的联合治疗的小鼠中CaLu-6肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表95
Figure BPA00001294546600931
表96示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和125mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表96
Figure BPA00001294546600932
表97示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表97
Figure BPA00001294546600941
根据该测定，发现：PM00104与培美曲赛的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。在两种培美曲赛的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
实施例23.测定人肺癌异种移植物中PM00104与培美曲赛联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有14只小鼠，每个治疗组各为9只小鼠/组。
该研究中所用的肿瘤模型为NCI-H460细胞系，其是获自ATCC(Manassas，VA)的人肺细胞系。如实施例19所述，使该细胞系生长并将其植入动物。将来自体外第16代的细胞SC植入研究小鼠。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到118±32mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用
Figure BPA00001294546600942
In Life module V8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 8开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。培美曲赛提供为含有培美曲赛二钠的固体粉末的形式，将其在0.9％盐水中复原。
研究组和治疗方案列于表98中。
表98
Figure BPA00001294546600943
Figure BPA00001294546600951
A：DPI 8、15和22；B：DPI 8-12、15-19和22-26
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与培美曲赛)的平均肿瘤重量与培美曲赛的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表99报道了每种治疗所获得的％T/C值，图111-112示出用对照、PM00104、培美曲赛以及相应的联合治疗的小鼠中NCI-H460肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表99
Figure BPA00001294546600952
表100示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和125mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表100
Figure BPA00001294546600961
表101示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表101
根据该测定，发现：PM00104与培美曲赛的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。在两种培美曲赛的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。
实施例24.测定人间皮瘤异种移植物中PM00104与培美曲赛联合的效果的体内研究
将雌性无胸腺裸小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)用于全部实验。将动物饲养在通气架笼中，自由进食饮水。在肿瘤植入前，将小鼠驯化至少5天。媒介物对照组含有15只小鼠，每个治疗组各为10只小鼠/组。
该研究中所用的肿瘤模型为H-Meso-1细胞系，其是获自DTP(DCTD肿瘤保藏中心)的人间皮瘤细胞系。H-Meso-1细胞生长于补充了10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。利用装有13G套管针的1ml注射器，将细胞SC植入研究小鼠：5×106细胞/小鼠，所述细胞在0.2ml的50％基质胶/50％无血清或抗生素的H-Meso-1的RPMI培养基中。对研究中用于植入的细胞进行细菌培养。所有的培养物在植入后24和48小时都是细菌污染阴性的。
如实施例4公开的进行肿瘤测量。当肿瘤达到175±100mm3(平均值±标准偏差)大小范围的合适体积时，利用In Life moduleV 8.0SP1肿瘤追踪和测量软件，根据肿瘤重量，将小鼠随机分为治疗组和对照组。在DPI 6开始治疗。
PM00104提供为冻干PM00104粉末的小瓶的形式，用注射用水将其复原。培美曲赛提供为含有培美曲赛二钠的固体粉末的形式，将其在0.9％盐水中复原。
研究组和治疗方案列于表102中。
表102
Figure BPA00001294546600972
A：DPI 6、13和20；B：DPI 6-10、13-17和20-24
安慰剂：500mg蔗糖+34mg磷酸钾+磷酸q.s.pH 3.8-4.4
从治疗开始至研究结束，每周2-3次记录肿瘤大小测量。通过以下方式评价肿瘤生长抑制：在检测的不同浓度下，比较两种试剂联合(PM00104与培美曲赛)的平均肿瘤重量与培美曲赛的平均肿瘤重量。
在所有的评价中，测定所有动物组的肿瘤体积的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。对包括研究结束在内的每个测量日的肿瘤体积进行Student t检验，以确定联合治疗组与单一疗法治疗组之间是否存在任何统计学显著差异。
用于评价联合疗法的增强作用和加成性程度的定义和标准与实施例4公开的相同。
表103报道了每种治疗所获得的％T/C值，图113-114示出用对照、PM00104、培美曲赛以及相应的联合治疗的小鼠中H-Meso-1肿瘤的肿瘤体积评价(平均值±标准误差)。
表103
表104示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.9mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表104
Figure BPA00001294546600982
表105示出作为单一试剂及联合给予的PM00104和培美曲赛的肿瘤生长抑制百分比，所用的剂量为0.45mg/kg/天的PM00104和100mg/kg/天的培美曲赛。另外，提供了所述剂量的PM00104与培美曲赛的联合的增强作用和加成性程度。
表105
根据该测定，发现：PM00104与培美曲赛的联合获得了抗肿瘤活性的增强作用。在两种PM00104的剂量下，该增强作用在测定结束时评级为大于加成。

Claims (27)

1.治疗癌症的方法，包括给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐和治疗有效量的另一抗癌药物，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
2.增强抗癌药物在癌症治疗中的治疗功效的方法，包括给予有这样需要的患者治疗有效量的所述抗癌药物和治疗有效量的PM00104或其药学可接受的盐，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中PM00104或其药学可接受的盐和另一抗癌药物构成同一组合物的部分，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中PM00104或其药学可接受的盐和另一抗癌药物提供为用于同时或不同时给药的分别的组合物，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中PM00104或其药学可接受的盐和另一抗癌药物提供为用于不同时给药的分别的组合物，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为抗肿瘤铂配位络合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、BBR3464、沙铂、四铂、奥马铂和异丙铂的抗肿瘤铂配位络合物。
8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为抗代谢物。
9.如权利要求8所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、氟达拉滨、氨基蝶呤、培美曲赛、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁和硫鸟嘌呤的抗代谢物。
10.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为有丝分裂抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨的有丝分裂抑制剂。
12.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为蒽环类。
13.如权利要求12所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹蒽醌和戊柔比星的蒽环类。
14.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为拓扑异构酶I和/或II抑制剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自托泊替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、卢比替康、依托泊苷和替尼泊苷的拓扑异构酶I和/或II抑制剂。
16.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为抗肿瘤单克隆抗体。
17.如权利要求16所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、阿仑珠单抗和吉妥珠单抗的抗肿瘤单克隆抗体。
18.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为酪氨酸激酶抑制剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自厄洛替尼、索拉非尼、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、卡纳替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼和凡他尼布的酪氨酸激酶抑制剂。
20.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为mTOR抑制剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中与PM00104联合的抗癌药物为选自坦罗莫司、西罗莫司、依维莫司和42-(二甲基亚膦酰)西罗莫司的mTOR抑制剂。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所治疗的癌症选自肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肾上腺癌、腮腺癌、头颈癌、宫颈癌、间皮瘤、白血病和淋巴瘤。
23.PM00104或其药学可接受的盐在制备用于权利要求1至22中任一项所述的方法的药物中的用途。
24.抗癌药物在制备用于权利要求1至22中任一项所述的方法的药物中的用途，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
25.用于权利要求1至22中任一项所述的方法的PM00104或其药学可接受的盐。
26.用于权利要求1至22中任一项所述的方法的抗癌药物，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
27.用于治疗癌症的试剂盒，其包含PM00104或其药学可接受的盐的剂型和/或另一抗癌药物的剂型，以及两种药物在权利要求1至22中任一项所述的方法中联合使用的说明书，所述抗癌药物选自抗肿瘤铂配位络合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、抗肿瘤单克隆抗体、mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
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